CN105753917A

CN105753917A - 一种甘草苷的分离纯化方法

Info

Publication number: CN105753917A
Application number: CN201610229840.4A
Authority: CN
Inventors: 骆俊才; 王长江; 张阳; 于晓丽; 苏旺平
Original assignee: QINGHAI QINGHAIHU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: QINGHAI QINGHAIHU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: CN105753917B

Abstract

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种甘草苷的分离纯化方法。其包括：(1)富集：称取氨化母液霜于烧杯中，加一号提取液提取，滤液蒸干后，再加二号提取液提取，滤液加一号有机溶剂进行沉淀，过滤得固体，然后用二号有机溶剂溶解得甘草苷富集溶液；(2)纯化：在所得溶液中加硅胶，得拌样硅胶；加空白硅胶于层析柱中，再加拌样硅胶，采用洗脱剂冲洗；TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全，甘草苷洗脱流分经浓缩后加入三号有机溶剂，结晶、过滤。所述工艺路线简单，所用溶剂和洗脱剂都能循环使用，是一种低成本，高纯度，易于生产放大和操作的制备工艺，方法利用率高、周期短、重现性好，所得甘草苷为白色固体，纯度不低于90％。

Description

一种甘草苷的分离纯化方法

技术领域

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种甘草苷的分离纯化方法。

背景技术

甘草苷是甘草中一种重要的黄酮类成分，同时也是一种结合一分子葡萄糖的糖苷类成分，所以甘草苷既有黄酮类的一些功效又可作为甜味剂使用，其主要功效包括以下几个方面：国内外研究人员研究发现甘草苷在一定程度上可以延缓谷氨酸损伤的BV2细胞的凋亡，从而达到抗抑郁作用；杨云等通过考察甘草苷诱导海马神经元轴突延长的作用和流式细胞术检测其对海马神经干细胞分化为胆碱能神经元作用观察其神经营养作用，发现甘草苷对Aβ_25-35导致的大鼠原代神经细胞损伤具有神经保护作用，同时对原代海马神经元有营养作用；陈云华等通过建立并验证醋氨酚人肝细胞损伤模型，以20mmol·L^-1醋氨酚作用HL-7702正常人肝细胞3h，以四氮溴盐(MTT)为考察指标，通过阳性药物双环醇验证该细胞模型并获得量效参考值，进而研究不同质量浓度甘草苷对人肝细胞损伤的保护作用，发现其具有护肝作用，且最低有效浓度为0.4μmol·L^-1，保肝的最大效能为22.9％，达到最大效能的浓度为2μmol·L^-1；除上述药理作用外，其还具有止咳、祛痰，抗过敏、抗溃疡作用以及黄酮类抗氧化防晒等功能。上述功能的存在使甘草苷在保健品、食品、药品以及化妆品中均有广泛的应用。

甘草苷的提取方法有很多种，主要包括(1)加热回流提取法：王振辉等采用加热回流提取法从甘草中提取甘草苷，通过正交试验设计确定出最佳提取条件，即10倍量70％乙醇，回流提取2次，每次3h，此方法提取甘草苷效率高，为工业化生产提供了实验依据；(2)超声波辅助提取法：马稳等采用超声波辅助提取法对甘草中的甘草苷提取工艺进行研究，以甘草苷得率为考察指标，通过正交试验设计确定出超声波强化提取的最佳工艺条件：料液比为1:14(g/mL)，乙醇浓度为60％，超声温度为50℃，超声时间40min，与传统加热回流的提取方法相比，超声提取时间短、温度低、甘草苷的提取率较高；(3)微波辅助提取法：马稳等采用微波辅助提取法对甘草中的甘草苷提取工艺进行研究，以甘草苷得率为考察指标，通过正交试验设计确定出微波提取的最佳工艺条件：微波辐射时间40min、料液比为1:12(g/mL)、乙醇浓度为40％、微波功率640W，与传统回流提取方法相比，微波辅助提取快速，甘草苷的提取率较高；(4)高压脉冲电场法：赵景辉等采用高压脉冲电场法对甘草中的甘草苷提取工艺进行研究，以甘草苷得率为考察指标，通过正交试验设计，确定出最佳工艺条件：为电场强度20kv/cm^-1，脉冲数为10，料液比1:10(g/mL)，此法提取甘草中的甘草苷达4.5％，得膏率达17.982％，此提取工艺可行，经济、省时、回收率高，为工业化生产提供依据；(5)亚临界水提取法：Ju-YoungBaek等采用亚临界水提取法，通过不同温度、不同时间对比甘草苷提取率确定出最佳实验条件，即温度300℃，时间60min甘草苷提取率最高，此法可以提高甘草苷的提取率，为工业化生产提供依据。

现如今广泛应用的甘草苷纯化方法包括有机溶剂法、大孔树脂法、模拟移动床色谱法。其中，(1)有机溶剂法：赵镭等通过对甘草中甘草酸和甘草苷的提取纯化工艺研究，确定出甘草苷的纯化方法，即用乙酸乙酯多次萃取，甘草苷被转移到乙酸乙酯层，大部分甘草酸保留在水层。测定甘草苷平均含量>15％，总转移率为67％。(2)大孔树脂法：张宇燕等通过大孔吸附树脂，并以甘草酸和甘草苷的提取率为指标，优化提取纯化工艺，甘草活性部位的得率为4.18％，其中含甘草酸78.40％，甘草苷17.51％。(3)模拟移动床色谱法：丛景香等采用模拟移动床色谱技术提纯甘草苷，确定出最佳实验条件，可实现甘草苷的精细分离。此技术制备的甘草苷纯度可达99％。

综上所述，现有技术存在耗时长、无法大规模生产、且生产成本高、附加值低、未对原材料进行充分有效利用等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高纯度甘草苷的分离纯化方法。

本发明采用如下技术方案：

一种甘草苷的分离纯化方法，其包括以下步骤：

(1)富集：称取氨化母液霜于烧杯中，加一号提取液提取，滤液蒸干后，再加二号提取液提取，滤液加一号有机溶剂进行沉淀，过滤得固体，然后用二号有机溶剂溶解得甘草苷富集溶液；

(2)纯化：在步骤(1)所得甘草苷富集溶液中加硅胶，得拌样硅胶；加空白硅胶于层析柱中，再加上述拌样硅胶，采用洗脱剂冲洗；TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全，甘草苷洗脱流分经浓缩后加入三号有机溶剂，结晶、过滤得类白色固体甘草苷。

其中，甘草酸粉制备单铵盐生产过程中的滤液经喷雾得到所述氨化母液霜。

所述一号提取液为40％-100％体积浓度的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，料液质量比为1:5～1:30；二号提取液为体积比1:1～15:1的二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇，料液质量比为1:1～1:15。

所述步骤(1)中一号有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合溶液，体积用量为滤液的5～20倍。

所述步骤(1)中二号有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合溶剂。

所述步骤(1)中加提取液提取时间均为0.5～4h。

所述步骤(2)洗脱剂为溶剂A与溶剂B按体积比1:1～20:1进行混合，溶剂A为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯，溶剂B为甲醇、乙醇、丙醇或丙酮。

优选地，所述步骤(2)中洗脱剂为体积比1:1～20:1的二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇。

所述步骤(2)中三号有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合溶剂。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1)利用率高，降低成本：利用生产上通过甘草酸粉制备单铵盐后的母液霜为原材料，进行甘草苷的分离与纯化，该母液霜原为单铵盐生产废弃物，通过进一步回收甘草苷等有效成分，不仅可以提高废物利用率，增加附加值，而且还减少环境污染，降低生产成本。

2)周期短：本发明从原料母液霜到制备得到高纯度甘草苷产品，只需1天时间。

3)样品纯度高：本发明通过先提取，再沉淀，后过柱析晶的工艺方法，整个工艺流程均使用工业试剂，过柱后甘草苷流分通过一步析晶即可达到甘草苷纯度在90％以上。

4)重现性好：本发明工艺简单，对设备及试剂要求低，可以保证甘草苷分离制备的重现性和稳定性。

5)适合大规模工业生产：工艺容易实现标准化、自动化，适应于进行产业大规模生产。

附图说明

图1为甘草苷富集流程图；

图2为甘草苷纯化流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步解释：

实施例1

(1)富集：称取母液霜于烧杯中，加40％甲醇，料液质量比为1:5的条件下，搅拌提取1h，取滤液蒸干，加二号提取液(二氯甲烷：甲醇＝10:1)，料液质量比为1:15，搅拌提取1h，取滤液加5倍乙酸乙酯沉淀，过滤得固体，然后用乙醇溶解得甘草苷富集溶液；

(2)纯化：在步骤(1)所得甘草苷富集溶液中加硅胶，得拌样硅胶。加空白硅胶于层析柱中，再加上述拌样硅胶，以二氯甲烷-甲醇20:1洗脱，TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全。浓缩后加入甲醇，搅拌，结晶，过滤，甲醇洗涤，得类白色固体甘草苷，含量为91.2％，重量收率为2.3％。

实施例2

(1)富集：称取母液霜于烧杯中，加75％乙醇，料液质量比为1:10的条件下，搅拌提取2h，取滤液蒸干，加二号提取液(乙酸乙酯：乙醇＝5:1)，料液质量比为1:10，搅拌提取2h，取滤液加15倍丙酮沉淀，过滤得固体，然后用乙酸乙酯溶解得甘草苷富集溶液；

(2)纯化：在步骤(1)所得甘草苷富集溶液中加硅胶，得拌样硅胶。加空白硅胶于层析柱中，再加上述拌样硅胶，以二氯甲烷-乙醇10:1洗脱，TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全。浓缩后加入乙酸乙酯，搅拌，结晶，过滤，乙酸乙酯洗涤，得类白色固体甘草苷，含量为94.3％，重量收率为2.1％。

实施例3

(1)富集：称取母液霜于烧杯中，加95％甲醇，料液质量比为1:15的条件下，搅拌提取4h，取滤液蒸干，加二号提取液(乙酸乙酯：甲醇＝2:1)，料液质量比为1:5，搅拌提取4h，取滤液加20倍二氯甲烷沉淀，过滤得固体，然后用乙酸乙酯和甲醇(体积比为3:1)溶解得甘草苷富集溶液；

(2)纯化：在步骤(1)所得甘草苷富集溶液中加硅胶，得拌样硅胶。加空白硅胶于层析柱中，再加上述拌样硅胶，以乙酸乙酯-乙醇5:1洗脱，TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全。浓缩后加入乙醇，搅拌，结晶，过滤，乙醇洗涤，得类白色固体甘草苷，含量为92.7％，重量收率为2.3％。

实施例4

(1)富集：称取母液霜于烧杯中，加二氯甲烷，料液质量比为1:20的条件下，搅拌提取1h，取滤液蒸干，加二号提取液(二氯甲烷：乙醇＝15:1)，料液质量比为1:1，搅拌提取3h，取滤液加8倍异丙醇沉淀，过滤得固体，然后用二氯甲烷和乙醇(体积比为2:1)溶解得甘草苷富集溶液；

(2)纯化：在步骤(1)所得甘草苷富集溶液中加硅胶，得拌样硅胶。加空白硅胶于层析柱中，再加上述拌样硅胶，以乙酸乙酯-甲醇12:1洗脱，TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全。浓缩后加入二氯甲烷，搅拌，结晶，过滤，二氯甲烷洗涤，得类白色固体甘草苷，含量为93.3％，重量收率为2.5％。

实施例5

(1)富集：称取母液霜于烧杯中，加80％异丙醇，料液质量比为1:30的条件下，搅拌提取0.5h，取滤液蒸干，加二号提取液(二氯甲烷：甲醇＝8:1)，料液质量比为1:12，搅拌提取1h，取滤液加12倍一号有机溶剂(三氯甲烷：甲醇＝10：1)沉淀，过滤得固体，然后用二号有机溶剂(乙酸乙酯：乙醇＝4：1)溶解得甘草苷富集溶液；

(2)纯化：在步骤(1)所得甘草苷富集溶液中加硅胶，得拌样硅胶。加空白硅胶于层析柱中，再加上述拌样硅胶，以二氯甲烷-甲醇2:1洗脱，TLC检测收集组分，至甘草苷收集完全。浓缩后加入三号有机溶剂(二氯甲烷：甲醇＝6:1)，搅拌，结晶，过滤，用该有机溶剂洗涤，得类白色固体甘草苷，含量为93.9％，重量收率为2.5％。

Claims

1.一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，甘草酸粉制备单铵盐生产过程中的滤液经喷雾得到所述氨化母液霜。

3.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述一号提取液为40％-100％体积浓度的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，料液质量比为1:5～1:30；二号提取液为体积比1:1～15:1的二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇，料液质量比为1:1～1:15。

4.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中一号有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合溶液，体积用量为滤液的5～20倍。

5.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中二号有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合溶剂。

6.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中加提取液提取时间均为0.5～4h。

7.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)洗脱剂为溶剂A与溶剂B按体积比1:1～20:1进行混合，溶剂A为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯，溶剂B为甲醇、乙醇、丙醇或丙酮。

8.根据权利要求7所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中洗脱剂为体积比1:1～20:1的二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇。

9.根据权利要求1所述的一种甘草苷的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中三号有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合溶剂。