CN112300231A - 一种提取高纯度甜菊糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，包括采用氨基苯硼酸对含甜菊糖苷的待提取液进行选择性吸附反应，得到含甜菊糖苷‑苯硼酸络合物的提取液；将所述含甜菊糖苷‑苯硼酸络合物的提取液通过装填有大孔阳离子交换树脂的色谱柱进行纯化，得到高纯度甜菊糖苷。本发明通过氨基苯硼酸对含甜菊糖苷的待提取液进行选择性吸附反应，之后利用大孔阳离子交换树脂对甜菊糖苷‑苯硼酸络合物的高吸附选择性实现纯化，最终制备出纯度达98％以上的甜菊糖苷产品。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域，尤其涉及一种提取高纯度甜菊糖苷的方法。
背景技术
甜菊糖苷是一种天然、高甜度、低热量不致龋甜味剂，是从甜叶菊的叶子和根茎中提取精制得到。甜菊糖苷的主要用途是替代蔗糖、高果糖浆、阿斯巴甜、三氯蔗糖等甜味剂，用于食品增甜。甜菊糖苷具有非发酵性、非着色性，不引起美拉德反应，不影响食品的粘稠性和凝固性，广泛用于饮料、乳制品、糖果、巧克力、蛋糕粉、果酱、饼干、口香糖等食品。
目前从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖苷，它们分别是：①甜菊苷(stevioside)(STV)，分子量804，熔点196-198℃，在甜叶菊干叶中含量为2-16％，相对蔗糖的甜度倍数为250-300；②甜菊醇双糖苷(steriolbioside)，分子量642，熔点189-192℃，在甜叶菊干叶中含量低于1％，相对蔗糖的甜度倍数为10-50；③莱包迪苷A(rebaudiosideA)(RA)，分子量967，熔点242-244℃，在甜叶菊干叶中含量为2-12％，相对蔗糖的甜度倍数为250-450；④莱包迪苷B(rebaudiosideB)(RB)，分子量804，熔点193-195℃，在甜叶菊干叶中含量低于1％，相对蔗糖的甜度倍数为200-300；⑤莱包迪苷C(rebaudiosideC)(RC)，分子量951，熔点215-217℃，在甜叶菊干叶中含量为0.4-2％，相对蔗糖的甜度倍数为50-100；⑥莱包迪苷D(rebaudiosideD)(RD)，分子量1129，熔点283-286℃，在甜叶菊干叶中含量低于1％，相对蔗糖的甜度倍数为150-250；⑦莱包迪苷E(rebaudiosideE)(RE)，分子量967，熔点205-207℃，在甜叶菊干叶中含量低于1％，相对蔗糖的甜度倍数为100-150；⑧杜尔可苷(dulcosideA)(DA)，分子量788，熔点193-195℃，在甜叶菊干叶中的含量为0.6-1.5％，相对蔗糖的甜度倍数为50-120。
近年来，国内外有很多关于甜菊糖苷尤其是甜菊苷(STV)和莱鲍迪苷A(RA)的分离纯化研究，利用了许多新型分离、制备方法，但主要还是以树脂吸附分离为主，原理是利用大孔吸附树脂对甜菊糖苷的高吸附选择性对其进行脱色纯化。甜菊糖苷的制备工艺一般包括提取、絮凝沉淀、大孔树脂吸附甜菊糖苷、解吸液浓缩、干燥等步骤。但是以现有的树脂吸附法进行甜菊糖苷的提取分离，只能得到纯度为90％以下的产品。如何进一步提高甜菊糖苷产品的纯度，一直是困扰生产厂家的一个严重问题。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，通过氨基苯硼酸对含甜菊糖苷的待提取液进行选择性吸附反应，之后利用大孔阳离子交换树脂对甜菊糖苷-苯硼酸络合物的高吸附选择性实现纯化，最终制备出纯度达98％以上的甜菊糖苷产品。
本发明提出的一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：
S1、采用氨基苯硼酸对含甜菊糖苷的待提取液进行选择性吸附反应，得到含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液；
S2、将所述含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液通过装填有大孔阳离子交换树脂的色谱柱进行纯化，得到高纯度甜菊糖苷。
优选地，所述含甜菊糖苷的待提取液为甜叶菊水提液；
优选地，所述甜叶菊水提液是通过将甜叶菊水提后，再絮凝除杂得到。
优选地，所述甜叶菊水提液中，甜菊糖苷纯度达到20％以上。
优选地，步骤S1具体包括：向含甜菊糖苷的待提取液中加入碱性调节剂，调节pH值为8-11，再加入氨基苯硼酸在30-50℃下搅拌反应，得到所述含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液。
优选地，所述大孔阳离子交换树脂为丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂；
优选地，所述丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂为型号D113，110、D151、D152或D155树脂中的至少一种。
优选地，步骤S2具体包括：将所述含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液通过装填有大孔阳离子交换树脂的色谱柱先进行吸附，再用洗脱剂进行解析，即得到所述高纯度甜菊糖苷。
优选地，所述洗脱剂为体积比为15-20:1的乙醇-乙酸混合溶剂。
优选地，所述提取液的流速控制为0.5-2BV/h；所述洗脱剂的用量控制为4-6BV，流速控制为2-4BV/h。
优选地，所述高纯度甜菊糖苷的纯度为98％以上。
本发明通过利用氨基苯硼酸对含有邻位顺式羟基结构的甜菊糖苷具有特异性的亲和吸附效应，如此将二者结合生成含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液；此后将该含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液通过大孔阳离子交换树脂，利用甜菊糖苷-苯硼酸络合物上的氨基与大孔阳离子交换树脂上的羧基之间具有强烈的酸碱作用，因而增强了填充有大孔阳离子交换树脂的色谱柱对甜菊糖苷的吸附能力，如此即可实现甜菊糖苷与杂质的有效分离，获得的甜菊糖苷纯度可达98％以上，回收率也达80％以上。
具体实施方式
下述实施例中，甜菊糖苷特指莱鲍迪苷A(RA)和甜菊苷(STV)两种甜菊糖苷，其回收率按照
计算，其中C是RA和STV的浓度之和(mg/mL)(由HPLC分析确定)，V是解吸液的体积(mL)，W是甜叶菊水提液中RA和STV的质量之和(mg)；纯度按照
计算，C是RA和STV的浓度之和(mg/mL)(由HPLC分析确定)，V是解吸液的体积(mL)，M是V体积的解吸液于烘箱中80℃干燥至恒重后干燥物质的质量(mg)。
实施例1
一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)将甜叶菊干叶粉碎至30目后，按照料液比1:5加入500mL去离子水中，室温下(25℃)超声辅助提取12min(超声功率360W，每工作10s，停5s)，过滤，滤渣拧干后重复提取两次，合并滤液，得到茶褐色提取液；向上述茶褐色提取液中加入壳聚糖醋酸水溶液(1重量份的壳聚糖粉末溶于100重量份的3wt％的醋酸水溶液中得到)，加入量为每克干叶0.2mL，在50℃下搅拌30min，静止30min后，离心分离得到上清液，即为甜叶菊水提液，测定该甜叶菊水提中的甜菊糖苷纯度为24.8％；
(2)向上述甜叶菊水提液中加入NaOH，调节体系pH值为10.5，再加入0.05mol/L氨基苯硼酸的乙醇溶液，加入量为每克干叶2.5mL，在40℃下搅拌反应60min，冷却至室温后，蒸除乙醇，得到含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液；
(3)将80mL含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液以1BV/h的流速通入装填有5g大孔阳离子交换树脂的色谱柱(装填树脂具体为D113型丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂)进行吸附，控制柱温为25℃，吸附结束后先用0.5BV去离子水以2BV/小时的流速水洗柱，再用5BV的乙醇-乙酸混合溶剂(18/1，v/v)以3BV/h的流速进行解吸，收集解吸液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为99.1％，回收率为86.5％。
实施例2
一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)将甜叶菊干叶粉碎至30目后，按照料液比1:5加入500mL去离子水中，室温下(25℃)超声辅助提取12min(超声功率360W，每工作10s，停5s)，过滤，滤渣拧干后重复提取两次，合并滤液，得到茶褐色提取液；向上述茶褐色提取液中加入壳聚糖醋酸水溶液(1重量份的壳聚糖粉末溶于100重量份的3wt％的醋酸水溶液中得到)，加入量为每克干叶0.2mL，在50℃下搅拌30min，静止30min后，离心分离得到上清液，即为甜叶菊水提液，测定该甜叶菊水提中的甜菊糖苷纯度为24.8％；
(2)向上述甜叶菊水提液中加入NaOH，调节体系pH值为9，再加入0.05mol/L的氨基苯硼酸的乙醇溶液，加入量为每克干叶2.5mL，在50℃下搅拌反应60min，冷却至室温后，蒸除乙醇，得到含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液；
(3)将80mL含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液以0.5BV/h的流速通入装填有5g大孔阳离子交换树脂的色谱柱(装填树脂为110型丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂)进行吸附，控制柱温为25℃，吸附结束后先用0.5BV去离子水以2BV/小时的流速水洗柱，再用4BV的乙醇-乙酸混合溶剂(20/1，v/v)以4BV/h的流速进行解吸，收集解吸液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为98.2％，回收率为84.8％。
实施例3
一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)将甜叶菊干叶粉碎至30目后，按照料液比1:5加入500mL去离子水中，室温下(25℃)超声辅助提取12min(超声功率360W，每工作10s，停5s)，过滤，滤渣拧干后重复提取两次，合并滤液，得到茶褐色提取液；向上述茶褐色提取液中加入壳聚糖醋酸水溶液(1重量份的壳聚糖粉末溶于100重量份的3wt％的醋酸水溶液中得到)，加入量为每克干叶0.2mL，在50℃下搅拌30min，静止30min后，离心分离得到上清液，即为甜叶菊水提液，测定该甜叶菊水提中的甜菊糖苷纯度为24.8％；
(2)向上述甜叶菊水提液中加入NaOH，调节体系pH值为11，再加入0.05mol/L氨基苯硼酸的乙醇溶液，加入量为每克干叶2.5mL，在30℃下搅拌反应60min，冷却至室温后，蒸除乙醇，得到含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液；
(3)将80mL含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液以2BV/h的流速通入装填有5g大孔阳离子交换树脂的色谱柱(装填树脂具体为D152型丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂)进行吸附，控制柱温为25℃，吸附结束后先用0.5BV去离子水以2BV/小时的流速水洗柱，再用6BV的乙醇-乙酸混合溶剂(15/1，v/v)以2BV/h的流速进行解吸，收集解吸液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为99.3％，回收率为81.2％。
对比例1
一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)将甜叶菊干叶粉碎至30目后，按照料液比1:5加入500mL去离子水中，室温下(25℃)超声辅助提取12min(超声功率360W，每工作10s，停5s)，过滤，滤渣拧干后重复提取两次，合并滤液，得到茶褐色提取液；向上述茶褐色提取液中加入壳聚糖醋酸水溶液(1重量份的壳聚糖粉末溶于100重量份的3wt％的醋酸水溶液中得到)，加入量为每克干叶0.2mL，在50℃下搅拌30min，静止30min后，离心分离得到上清液，即为甜叶菊水提液，测定该甜叶菊水提中的甜菊糖苷纯度为24.8％；
(2)将80mL甜叶菊水提液以1BV/h的流速通入装填有5g大孔阳离子交换树脂的色谱柱(装填树脂具体为D113型丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂)进行吸附，控制柱温为25℃，吸附结束后先用0.5BV去离子水以2BV/小时的流速水洗柱，再用5BV的乙醇-乙酸混合溶剂(18/1，v/v)以3BV/h的流速进行解吸，收集解吸液，经测定其中的甜菊糖苷纯度为39.7％，回收率为37.2％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用氨基苯硼酸对含甜菊糖苷的待提取液进行选择性吸附反应，得到含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液；
S2、将所述含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液通过装填有大孔阳离子交换树脂的色谱柱进行纯化，得到高纯度甜菊糖苷。
2.根据权利要求1所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，所述含甜菊糖苷的待提取液为甜叶菊水提液；
优选地，所述甜叶菊水提液是通过将甜叶菊水提后，再絮凝除杂得到。
3.根据权利要求2所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，所述甜叶菊水提液中，甜菊糖苷纯度达到20％以上。
4.根据权利要求1-3任一项所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：向含甜菊糖苷的待提取液中加入碱性调节剂，调节pH值为8-11，再加入氨基苯硼酸在30-50℃下搅拌反应，得到所述含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液。
5.根据权利要求1-4任一项所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，所述大孔阳离子交换树脂为丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂；
优选地，所述丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂为型号D113，110、D151、D152或D155树脂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，步骤S2具体包括：将所述含甜菊糖苷-苯硼酸络合物的提取液通过装填有大孔阳离子交换树脂的色谱柱先进行吸附，再用洗脱剂进行解析，即得到所述高纯度甜菊糖苷。
7.根据权利要求6所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，所述洗脱剂为体积比为15-20:1的乙醇-乙酸混合溶剂。
8.根据权利要求6或7所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，所述提取液的流速控制为0.5-2BV/h；所述洗脱剂的用量控制为4-6BV，流速控制为2-4BV/h。
9.根据权利要求1-8任一项所述提取高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于，所述高纯度甜菊糖苷的纯度为98％以上。
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Denomination of invention: A method for extracting high-purity steviol glycosides Granted publication date: 20221213 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Wuhe County Branch Pledgor: BENGBU HUADONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980005085 |
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