CN114369543B - 一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及酶工程领域，公开了一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌及其应用。本发明筛选了一种表达环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌WahahaMZJ‑1（Alkalihalobacillus oshimensis），保藏编号为CGMCC No.23164。用其获得酶进行酶反应生成葡萄糖基甜菊糖苷，与现有商用同类酶相比，转化产物中RebD、RebD同分异构体、RebM、RebM同分异构体的含量高，意味着更好的口感；同时具有反应方法简便、低能耗、物料成本低、转化效率高等优点，为工业化放大生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程领域，尤其涉及一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌及其应用。
背景技术
近几年来，天然甜味剂甜菊糖苷因其高甜度(为蔗糖的200-350倍)、低热值(仅为蔗糖的1/300)等特性越来越受到消费者和食品制造商的关注。然而，市售的甜菊糖苷在口感上存在强烈的苦味及涩味，且呈味比蔗糖慢，严重影响了其市场份额。甜菊糖苷是从甜叶菊中提取分离出的含种不同成分的双萜糖苷混合物，它们均具有相同甙元或配基——甜菊醇，这一典型贝壳杉烷型四环二萜结构的甜菊醇配基上C13位羟基和C19位羧基上分别具备两个活泼氢，能与糖配合物的环状半缩醛羟基进行分子间脱水和成苷反应，形成-O-糖苷型的各种糖苷化合物，其结构只是各成分C13和C19位糖苷键上结合糖的种类数量和构成型式不同。之前有研究表明，连接在甜菊糖苷分子的C13位及C19位上的葡萄糖基的数目对其口感有着重要影响。其中，甜菊苷(Stevioside，Stev)最早被人们发现，是甜菊叶中主要甜味成分，通常占总苷的9.1％，但甜菊苷具有较强的后苦味。一般来说，糖基化的甜菊苷味质较好，比如瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A，RebA，在甜菊苷C13的槐糖基上通过β-1，3键连接了一个葡萄糖单元)，甜度和口感均佳，且不含任何不良余味，但甜味持久；瑞鲍迪苷D(Rebaudioside D，RebD，在RebA C19的葡萄糖基上通过β-1，2键连接了一个葡萄糖单元)和瑞鲍迪苷M(Rebaudioside M，RebM，在RebD C19的槐糖基上通过β-1，3键连接了一个葡萄糖单元)味质口感均较好。因此，糖基化甜菊苷是改善甜菊糖苷品质的关键。
改善甜菊糖苷苦味风味的方法有很多，比如化学修饰法、环状糊精包埋法、与其他物质的混用、酶促改性。其中，酶促改性法更环保，更安全，也是在食品领域中使用最广泛的一种手段。将甜菊糖苷转化为糖基化甜菊苷的酶主要为环糊精葡萄糖基转移酶。而市场上目前被广泛使用的环糊精葡萄糖基转移酶种类较少，且价格较高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌及其应用，本发明筛选了一种表达环糊精葡萄糖基转移酶的芽孢杆菌，用该酶进行酶反应生成葡萄糖基甜菊糖苷，与现有商用同类酶相比，转化产物中RebD、RebD同分异构体、RebM、RebM同分异构体的含量高，意味着更好的口感；同时具有反应方法简便、低能耗、物料成本低、转化效率高等优点，为工业化放大生产奠定基础。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌，其命名为WahahaMZJ-1，已在2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.23164，微生物分类命名为大岛盐碱芽孢杆菌Alkalihalobacillus oshimensis。该菌株是从山东省诸城市浩天药业有限公司甜叶菊种植基地土壤中经平板菌落特征初筛，采用摇瓶培养，经胞外酶液酶促反应产物的HPLC测定，比较甜菊糖苷到葡萄糖基甜菊糖苷的转化率而得到。
如背景技术部分所述的，连接在甜菊糖苷分子的C13位及C19位上的葡萄糖基的数目对其口感有着重要影响。其中，甜菊苷(Stev)是甜菊叶中主要甜味成分，但甜菊苷具有较强的后苦味。一般来说，糖基化的甜菊苷味质较好，比如瑞鲍迪苷D(RebD)和瑞鲍迪苷M(RebM)味质口感均较好。本发明菌株发酵后可获得环糊精葡萄糖基转移酶，该酶作用于甜菊糖苷和可溶性淀粉，可高效地将甜菊糖苷中的Stev、RebA等转化为RebD、RebD同分异构体、RebM或RebM同分异构体。
虽然目前已有关于芽孢杆菌可表达环糊精葡萄糖基转移酶的不少报道，且也有商用环糊精葡萄糖基转移酶在售。但是，一方面，目前尚未有关于大岛盐碱芽孢杆菌可表达环糊精葡萄糖基转移酶的报道。本发明首次报道了大岛盐碱芽孢杆菌可表达环糊精葡萄糖基转移酶，且其产酶能力较强。另一方面，一般由野生型菌株直接获得的粗酶液中环糊精葡萄糖基转移酶的表达量较低且组成不够理想，其对于甜菊苷的糖基化转化率较低(环糊精葡萄糖基转移酶是一类酶的总称，其具体组成直接影响转化率)。因此，现有的商用环糊精葡萄糖基转移酶大部分是通过序列优化、异源表达的方式获取，工艺复杂，成本相对较高。而本发明菌株的发酵产物中获得的天然环糊精葡萄糖基转移酶组成较为理想，可以直接用于甜菊苷的糖基化，转化率高，尤其是RD、RD同分异构体、RM、RM同分异构体的含量较高。
综上，本发明筛选了一种表达环糊精葡萄糖基转移酶的芽孢杆菌，用该酶进行酶反应生成葡萄糖基甜菊糖苷，与现有商用同类酶相比，转化产物中RD、RD同分异构体、RM、RM同分异构体的含量高，意味着更好的口感；同时具有反应方法简便、低能耗、物料成本低、转化效率高等优点，为工业化放大生产奠定基础。
此外，本发明菌株胞外粗酶液的有效催化温度可以从30-50℃、pH可以从4-8，见图2、3。
第二方面，本发明提供了一种含有上述盐碱芽孢杆菌的菌体培养物。
作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
第三方面，本发明提供了一种发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，采用上述大岛盐碱芽孢杆菌为出发菌株，经液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶。
作为优选，所述液体深层发酵的培养基成分包括：可溶性淀粉8-12g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉3-7g/L，磷酸氢二钾0.8-1.2g/L，七水合硫酸镁0.1-0.3g/L，碳酸钠3-7g/L。其中碳酸钠先配制成30％(w/v)的母液单独灭菌后再加入培养基中，121℃高压灭菌20分钟。
作为优选，发酵过程中的培养条件为：25-30℃，摇瓶转速200-250rpm；培养时间为48-72h。
第四方面，本发明提供了一种上述盐碱芽孢杆菌在制备葡萄糖基甜菊糖苷中的应用，具体包括以下步骤：以所述盐碱芽孢杆菌为出发菌株，经液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶，并以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂生产葡萄糖基甜菊糖苷。
作为优选，以甜菊糖苷和可溶性淀粉为底物，加入发酵所得粗酶液或浓缩酶液，在150-220rpm的摇床中，pH为5.0-6.0、温度为40-50℃条件下进行反应20-30h，得到葡萄糖基甜菊糖苷；所述甜菊糖苷的终浓度为10-80g/L；所述可溶性淀粉的终浓度为20-40g/L；所述粗酶液或浓缩酶液以酶的添加量计，添加量为21.2mg/L。
作为优选，所述甜菊糖苷是甜菊苷(Stev)、瑞鲍迪苷A(RebA)、瑞鲍迪苷或它们的混合物。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明首次筛得了一株可表达环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌，其具有更为出色的产环糊精葡萄糖基转移酶能力。
(2)与现有的菌株发酵产物以及商用同类酶相比，本发明菌株发酵所得的环糊精葡萄糖基转移酶组成较为理想，无需后续人为组配，可直接用于甜菊苷的糖基化，转化率高，尤其是RD、RD同分异构体、RM、RM同分异构体的含量较高，意味着更好的口感；同时具有反应方法简便、低能耗、物料成本低、转化效率高等优点，为工业化放大生产奠定基础。
附图说明
图1为实施例1筛得的菌落形态图；
图2为不同温度条件下甜菊糖苷的转化数据对比图；
图3为不同pH条件下甜菊糖苷的转化数据对比图；
图4为最适反应条件下甜菊糖苷的转化数据图；
图5为实施例8的甜菊糖苷的转化数据图；
图6为实施例9的甜菊糖苷的转化数据图；
图7为实施例10的甜菊糖苷的转化数据图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌，其命名为WahahaMZJ-1，已在2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.23164，微生物分类命名为大岛盐碱芽孢杆菌Alkalihalobacillus oshimensis。
一种含有上述盐碱芽孢杆菌的菌体培养物。作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
一种发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，采用上述大岛盐碱芽孢杆菌为出发菌株，经液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶。所述液体深层发酵的培养基成分包括：可溶性淀粉8-12g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉3-7g/L，磷酸氢二钾0.8-1.2g/L，七水合硫酸镁0.1-0.3g/L，碳酸钠3-7g/L。其中碳酸钠先配制成30％(w/v)的母液单独灭菌后再加入培养基中，121℃高压灭菌20分钟。发酵过程中的培养条件为：25-30℃，摇瓶转速200-250rpm；培养时间为48-72h。
一种制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，具体包括以下步骤：以所述盐碱芽孢杆菌为出发菌株，经液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶，以甜菊糖苷(甜菊苷(Stev)、瑞鲍迪苷A(RebA)、瑞鲍迪苷或它们的混合物)和可溶性淀粉为底物，加入发酵所得粗酶液或浓缩酶液，在150-220rpm的摇床中，pH为5.0-6.0、温度为40-50℃条件下进行反应20-30h，得到葡萄糖基甜菊糖苷；所述甜菊糖苷的终浓度为10-80g/L；所述可溶性淀粉的终浓度为20-40g/L；所述粗酶液或浓缩酶液以酶的添加量计，添加量为5-80mg/L(最优选21.2mg/L)。
实施例1：菌种筛选
从山东省诸城市浩天药业有限公司甜叶菊种植基地土壤，按“五点取样法”采取土样10份，从中分离菌株。称取样品5g加入装有45ml无菌生理盐水的小三角瓶中，28℃，150rpm摇床振荡1h，吸取0.5ml土壤菌悬液置于4.5ml无菌生理盐水中，混合均匀，并梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5 5个梯度。从各稀释梯度的菌悬液中吸取100μL涂布于分离筛选平板上，28℃和37℃培养箱中分别恒温培养2d。选取平板上产生黄色透明圈的菌株作为生产CGTase的菌株。挑取单菌落进行4次平板划线。之后将筛选得到的菌纯化后，在28℃进行液体发酵培养48h，取培养液离心后收集上清。配制2％(w/v)的甜菊糖苷+2％(w/v)可溶性淀粉溶液，加入粗酶液，40℃反应24h。所得反应液经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC的测定，选择能够产生葡萄糖基甜菊糖苷的粗酶液所对应的菌株即为产转糖基酶菌株。纯化的菌株接种于平板分离培养基上，4℃保藏，保藏编号为CGMCC 23164，保藏机构为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌落形态见图1。
平板分离培养基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母粉5，磷酸氢二钾1，七水合硫酸镁0.2，碳酸钠5，酚酞0.3，甲基橙0.1，其中碳酸钠先配制成30％(w/v)的母液单独灭菌后再加入培养基中，121℃高压灭菌20min。
发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母粉5，磷酸氢二钾1，七水合硫酸镁0.2，碳酸钠5，其中碳酸钠先配制成30％(w/v)的母液单独灭菌后再加入培养基中，121℃高压灭菌20min。自然pH，28℃，摇瓶转速220rpm，发酵时间2d。
实施例2：发酵产酶
(1)发酵培养：将实施例1中筛选得到的菌株接种于发酵培养基中，在28℃下培养2-3d后，离心收集上清液即为粗酶液。发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母粉5，磷酸氢二钾1，七水合硫酸镁0.2，碳酸钠5，其中碳酸钠先配制成30％(w/v)的母液单独灭菌后再加入培养基中，12l℃高压灭菌20min。自然pH。
(2)产物鉴定：配制2％(w/v)的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)+2％(w/v)可溶性淀粉溶液，加入粗酶液(培养液10000rpm，离心20min，取上清)，28-50℃反应24-48h。所得反应液经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC的测定，选择能够产生葡萄糖基甜菊糖苷的粗酶液所对应的菌株即为产转糖基酶菌株。色谱条件如下：Agilent1200HPLC色谱仪，Agilent自动进行器，SB-C18液相柱(4.6mm×250mm)，DAD检测器；流速1ml/min；柱温室温；液相程序见表1。
表1-液相程序
实施例3：粗酶液的浓缩
将实施例2中获得的酶液用超滤离心管Millipore 15ml/10kd进行酶液浓缩(浓缩100倍)，并交换buffer(＞1000倍)除去培养基成分，使酶处于超纯水中，避免后续反应中引入杂质。
实施例4：转化甜菊糖苷温度条件的优化生产工艺：在反应器中投入终浓度为20g/L的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)、20g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系(pH＝6-7)，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化情况(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：将样品沸水浴5min终止反应，12000rpm离心10min，取上清稀释10倍后用0.22μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Agilent1200HPLC色谱仪，Agilent自动进行器，Hypersil NH2柱(4.6mm×300mm)，DAD检测器；流动相为20％缓冲液【0.0125％(v/v)醋酸、0.0125％醋酸铵(w/v)】+80％乙腈；流速1.5ml/min；柱温室温；进样量12μL；210nm检测。结果见图2，转化甜菊糖苷的最适温度为40℃。
实施例5：转化甜菊糖苷pH条件的优化生产工艺：在反应器中投入终浓度为20g/L的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)、20g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系，pH分别为4、5、6、7、8，在40℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化情况(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见图3，转化甜菊糖苷的最适pH为6。
实施例6：最适反应条件下转化甜菊糖苷生产工艺：在反应器中投入终浓度为20g/L的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)、20g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系，pH＝6，在40℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化情况(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见表2，葡萄糖基甜菊糖苷对Stev的摩尔转化率达65％以上。
表2-实施例6下甜菊糖苷的转化率
| 实施例 | 葡萄糖基甜菊糖苷对Stev转化率(％) | 葡萄糖基甜菊糖苷对RebA转化率(％) |
| 6 | 68.4％ | 46.3％ |
HPLC检测葡萄糖基甜菊糖苷的生成(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：将样品沸水浴5min终止反应，12000rpm离心10min，取上清用0.22μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Waters ALLIANCE e2695液相色谱仪，Waters自动进行器，Hypersil NH2柱(4.6mm×300mm)，PAD检测器；流速1.0ml/min；柱温35℃。
表3-液相程序
结果见图4，在大岛盐碱芽孢杆菌胞外酶液的催化下，产生了多种葡萄糖基化的甜菊糖苷，其中含量较多的是单/双葡萄糖基甜菊糖苷。且从图4中可以看出，与诺维信Toruzyme 3.0L相比，产生的产物亦有差异。鉴于RD、RD同分异构体、RM、RM同分异构体为目前公认的口感较好的成分，
为了进一步证明两者产物的差异性，我们通过UPLC-ESI-MS检测对其含量进行了粗略定量分析。
将实施例6中获得的葡萄糖基甜菊糖苷进行UPLC-ESI-MS检测，液质联用仪：Waters ACQUITY UPLC-XevoTQ MS，液相色谱条件：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)；柱温：40℃；样品管理器温度：10℃。
表4-梯度洗脱条件
质谱参数：ES(-)模式，全扫描(Full Scan)模式；毛细管电压：3.5kv；锥口电压：19V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：550℃；脱溶剂气流量：700L/Hr；锥孔反吹气：60L/H。
结果见表5，所产生产物主要为RD、RD的同分异构体、RM、RM的同分异构体，各成分比例与诺维信Toruzyme 3.0L有显著差异。
表5-实施例6下葡萄糖基甜菊糖苷的ESI-MS检测结果
虽然从紫外检测器检测结果来看诺维信Toruzyme 3.0L和Alkalihalobacillusoshimensis胞外酶液催化产生的产物峰差异不够肉眼可见的显著，但由表5可见，我们可以发现两者产物的质谱响应存在较大差异，这说明两者产物之间存在显著差异。由表中数据(m/z 1289.5和m/z 1127.5)可知，Alkalihalobacillus oshimensis胞外酶液催化产生的RD、RD的同分异构体、RM、RM的同分异构体的质谱峰要明显高于诺维信Toruzyme 3.0L。需要注意的是：在质谱过程中存在葡萄糖丢失的情况(比如RM及同分异构体丢失1个葡萄糖会变成RD及同分异构体)，因此上表结果存在一定误差，但申请人认为数据总体上仍然可以在一定程度上反应出Alkalihalobacillus oshimensis胞外酶液催化产生的产物中RD、RD的同分异构体、RM、RM的同分异构体含量相较于商业酶诺维信Toruzyme 3.0L更高。
实施例7：胞外酶液在底物甜菊糖苷浓度提高的条件下进行转化生产工艺：在反应器中分别投入终浓度为20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、80g/L的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)、20g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系，pH6，在40℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化情况(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见表6，随着甜菊糖苷浓度的提高，葡萄糖基甜菊糖苷对Stev和RebA的转化率均有所降低，且RebA转化率的降低尤为明显，当甜菊糖苷浓度提高到80g/L时，葡萄糖基甜菊糖苷对Stev转化率降低至50％以下。
表6-实施例7下甜菊糖苷的转化率
实施例8：降低底物甜菊糖苷浓度进一步提高转化率
生产工艺：在反应器中投入终浓度为10g/L的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)、20g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系，pH6，在40℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化率(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。
结果见表7，底物甜菊糖苷浓度降低后，转化率有了明显提高。葡萄糖基甜菊糖苷对Stev的摩尔转化率达75％以上，对RebA转化率达65％以上。
表7-实施例8下甜菊糖苷的转化率
| 实施例 | 葡萄糖基甜菊糖苷对Stev转化率(％) | 葡萄糖基甜菊糖苷对RebA转化率(％) |
| 8 | 76.6％ | 67.4％ |
HPLC检测葡萄糖基甜菊糖苷的生成(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见图5，与图4相比，降低底物甜菊糖苷浓度并未对产物种类产生明显影响，产物中含量较多的仍然是单/双葡萄糖基甜菊糖苷。
实施例9：提高淀粉浓度可提高甜菊糖苷转化率生产工艺：在反应器中投入终浓度为15g/L的甜菊糖苷(诸城浩天药业有限公司SG90)、40g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系，pH6，在40℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化率(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。
结果见表8，提高底物淀粉浓度后，转化率有了明显提高。葡萄糖基甜菊糖苷对Stev的摩尔转化率达75％以上，对RebA转化率达70％以上。
表8-实施例9下甜菊糖苷的转化率
| 实施例 | 葡萄糖基甜菊糖苷对Stev转化率(％) | 葡萄糖基甜菊糖苷对RebA转化率(％) |
| 9 | 79.3％ | 70.4％ |
HPLC检测葡萄糖基甜菊糖苷的生成(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见图6，提高底物淀粉浓度并未对产物种类产生明显影响，产物中含量较多的仍然是单/双葡萄糖基甜菊糖苷。且从图中可以看出，与诺维信Toruzyme 3.0L相比，产生的产物亦有差异，其中RD、RD同分异构体、RM、RM同分异构体含量高于诺维信Toruzyme 3.0L。
实施例10：转化其他来源的甜菊糖苷底物生产工艺：在反应器中投入终浓度为15g/L的甜菊糖苷(浙江天草生物科技股份有限公司RA50％)、40g/L的可溶性淀粉，加入实施例3中获得的浓缩酶液(蛋白添加量21.2mg/L)，1ml体系，pH6，在40℃，220rpm的摇床中反应24h。对照组为反应结束后加入酶液。
HPLC检测甜菊糖苷的转化率(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见表9，葡萄糖基甜菊糖苷对Stev的摩尔转化率达80％以上，对RebA转化率达70％以上。
表9-实施例10下甜菊糖苷的转化率
| 实施例 | 葡萄糖基甜菊糖苷对Stev转化率(％) | 葡萄糖基甜菊糖苷对RebA转化率(％) |
| 10 | 82.7％ | 73.5％ |
HPLC检测葡萄糖基甜菊糖苷的生成(参考葡萄糖基甜菊糖苷GB2760文件)：同上。结果见图7，改变甜菊糖苷底物来源并未对产物种类产生明显影响，产物中含量较多的仍然是单/双葡萄糖基甜菊糖苷。且从图中可以看出，与诺维信Toruzyme 3.0L相比，大岛盐碱芽孢杆菌胞外酶液对来自浙江天草生物科技股份有限公司RA50％的Stev转化率更高；与诺维信Toruzyme 3.0L相比，产生产物的种类亦有差异，其中RD、RD同分异构体、RM、RM同分异构体含量高于诺维信Toruzyme 3.0L。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1. 一种产环糊精葡萄糖基转移酶的大岛盐碱芽孢杆菌，其特征在于：所述大岛盐碱芽孢杆菌命名为WahahaMZJ-1，已在2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.23164，微生物分类命名为大岛盐碱芽孢杆菌Alkalihalobacillus oshimensis。
2.一种含有如权利要求1所述盐碱芽孢杆菌的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
3.一种发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，采用权利要求1所述大岛盐碱芽孢杆菌为出发菌株，经液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体深层发酵的培养基成分包括：可溶性淀粉8-12 g/L，蛋白胨3-7 g/L，酵母粉3-7 g/L，磷酸氢二钾0.8-1.2 g/L，七水合硫酸镁0.1-0.3 g/L，碳酸钠3-7 g/L。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，发酵过程中的培养条件为：25-30℃，摇瓶转速200-250rpm；培养时间为48-72h。
6.如权利要求1所述盐碱芽孢杆菌在制备葡萄糖基甜菊糖苷中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：以所述盐碱芽孢杆菌为出发菌株，经液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶，并以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂生产葡萄糖基甜菊糖苷。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，以甜菊糖苷和可溶性淀粉为底物，加入发酵所得粗酶液或浓缩酶液，在150-220rpm的摇床中，pH为5.0-6.0、温度为40-50℃条件下进行反应20-30h，得到葡萄糖基甜菊糖苷；所述甜菊糖苷的终浓度为10-80g/L；所述可溶性淀粉的终浓度为20-40g/L；所述粗酶液或浓缩酶液以酶的添加量计，添加量为5-80 mg/L。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甜菊糖苷是甜菊苷、瑞鲍迪苷A或它们的混合物。
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|---|
| 产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选、鉴定与应用研究;孙涛;江波;潘蓓蕾;Rebaone Letsididi;;食品工业科技(第10期);全文 * |
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