CN111088170A - 一株日本曲霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)QHT‑40‑U475，于2019年12月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20191050，保藏地址为中国武汉市武汉大学；以及采用所述日本曲霉菌制备红糖低聚果糖的方法。本发明的日本曲霉菌QHT‑40‑U475经发酵产生的果糖基转移酶酶活力达2862U/g(干基)，而且采用本发明的方法制备红糖低聚果糖富含的营养价值以及具有的生理功能，使其成为一种更优于普通的低聚果糖的健康产品。

Description

一株日本曲霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是一株日本曲霉菌QHT-40-U475及其应用。
背景技术
低聚果糖又称寡果糖或蔗果低聚糖，是聚合度为2～9的功能性低聚糖，存在于上千种天然植物中，如香蕉、大蒜、牛蒡、芦笋、小麦、洋葱、马铃薯、雪莲果、菊芋、蜂蜜等。低聚果糖作为应用范围最广的益生元之一，是同时具有超强双歧因子和水溶性膳食纤维的双生理学特性的全天然配料，其性质稳定，不被胃肠道内源酶消化，具有调节肠道内菌群平衡、改善脂质代谢、促进矿物质吸收、增强免疫力等生理作用，被广泛应用于食品、保健、医药、化妆品以及饲料领域。
工业化生产低聚果糖主要是用酶法来生产，它是应用具有催化果糖基转移酶活性的菌体或酶以及其他具有辅助性作用的菌体或酶来生产低聚果糖，微生物作用底物合成低聚果糖的酶类大体可分为两类，果糖基转移酶类和菊粉酶类分别作用于蔗糖和菊粉制备得到。以蔗糖为作用底物，利用微生物发酵生产的β-果糖基转移酶或β-呋喃果糖苷酶，进行分子间果糖转移反应而生成低聚果糖。生产低聚果糖的果糖基转移酶，主要来源于植物和微生物，特别存在于真菌中。黑曲霉、米曲霉、出芽短梗霉和日本曲霉菌株是最常用的产酶菌株。以菊芋为原料，利用微生物产生的菊粉酶，通过内切菊粉酶和外切菊粉酶水解菊粉制取低聚果糖。
随着人们生活水平提高，保健意识、消费观念的改变，以及对食品质量安全的重视，食疗养生已经成为一个热门的话题。红糖是传统食疗的保健品，红糖产品日渐得到众多消费者的关注。现代食品加工技术日益革新，微生物与酶技术的突破对开发新型功能红糖，研发红糖低聚果糖，为改善产品的应用性能带来极大便利与帮助。红糖在生产过程中不添加任何药剂和食品添加剂，采用传统工艺，把甘蔗压榨出汁后，经过物理方法澄清、蒸发、结晶、成型，以及包装处理，生产出来的以蔗糖为主的糖产品。这种方法生产的红糖保留甘蔗原有的风味和营养物质。然而，现有技术中并没有采用微生物发酵制备红糖低聚果糖的方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种采用微生物发酵制备红糖低聚果糖的有效方法，其中采用的微生物是通过筛选、诱变得到的一株日本曲霉菌，其发酵产生的果糖基转移酶酶活力更高。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一株日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)QHT-40-U475，于2019年12月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M20191050，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
其中所述的日本曲霉菌株QHT-40-U475的菌落形态为：质地绒间絮状，分生孢子头黑褐色，初期球形，后期开裂，经rRNA基因序列测定结果鉴定该菌株为日本曲霉Aspergillus japonicus。
作为本发明的另一方面，本发明还提供了上述的日本曲霉菌在制备低聚果糖中的应用。优选地，所述日本曲霉菌用于制备红糖低聚果糖。
本发明还提供了一种制备红糖低聚果糖的方法，包括步骤：以红糖为作用底物，利用上述的日本曲霉菌发酵产生的果糖基转移酶进行酶促反应，生成红糖低聚果糖。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)将日本曲霉菌接种于发酵培养基中，进行发酵培养，然后收集菌丝；
2)将步骤1)所得菌丝或精制酶液加入红糖溶液中，进行转化反应，反应结束后升温糖浆以灭酶；
3)将步骤2)所得糖浆过滤，然后经蒸发浓缩和灭菌后，得到含有所述红糖低聚果糖的糖浆。
优选地，所述发酵培养基为培养液，所述培养液中含有以下质量浓度的成分：蔗糖2～8％、蛋白胨1～3％，酵母膏0.5～2％，KH2PO4 0.1～0.5％，NaNO3 0.1～0.5％，MgSO4·7H2O 0.1～0.5％，FeSO4·7H2O 0.001～0.003％，所述培养液的pH为5.0～7.5，所述培养液的培养温度为28～33℃。
优选地，所述红糖溶液中固形物的质量浓度为40～60％。
优选地，所述步骤2)中菌丝(干基)添加量为红糖质量的0.02～2.0％。其中，干基是指以物料中固体干物质为基准计算。
优选地，所述步骤2)中通过研磨菌丝，离心收集上清得到粗制的酶液，然后经微滤澄清，再经超滤浓缩，并用纯水清洗得到精制酶液；更优选地，所述精制酶液添加量为红糖质量的0.02～2.0％。
优选地，所述步骤2)中转化反应温度为40～60℃，PH为4.0～7.5，在搅拌条件下反应时间为16～24h。
优选地，所述步骤2)中糖浆升温至85℃以上，保温至少15分钟后进行灭酶处理。
优选地，所述步骤3)中将分离过滤后的糖浆浓缩至固形物含量为60～78％。
优选地，所述步骤3)中过滤采用板框或圆盘硅藻土过滤机进行糖浆的分离。
优选地，所述步骤3)中采用高温瞬时灭菌，灭菌温度为121～135℃，维持10～30秒。
作为本发明的又一个方面，本发明提供了采用上述方法制备的红糖低聚果糖。需要说明的是，红糖低聚果糖作为一种新型的功能红糖产品，既保留红糖本身特性，同时具有超强双歧因子和水溶性膳食纤维的特点，是一种更益于世人身体健康的红糖产品，增加了红糖附加值，带动红糖低聚果糖产业链的提速发展。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明通过筛选、诱变得到一株日本曲霉菌株QHT-40-U475，其产生的果糖基转移酶酶活力达2862U/g(干基)；
采用本发明的日本曲霉菌株QHT-40-U475，通过发酵产生果糖基转移酶，然后以红糖为作用底物，进行分子间果糖转移反应而生成红糖低聚果糖；
采用本发明的方法制备红糖低聚果糖富含的营养价值以及具有的生理功能，使其成为一种更优于普通的低聚果糖的健康产品。
附图说明
图1是本发明中日本曲霉QHT-40-U475菌株的菌落照片；
图2是紫外与氯化锂复合诱变第4代菌株的果糖基转移酶酶活力检测结果图；
图3是采用本发明的日本曲霉菌株制备红糖低聚果糖的工艺实施流程图。
生物保藏信息为：
一株日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)QHT-40-U475，于2019年12月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20191050，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
具体实施方式
本发明通过选取土壤样品，以蔗糖作为底物，对产低聚果糖的果糖基转移酶菌株进行分离纯化，筛选出产果糖基转移酶的菌株，通过菌落形态、菌体、孢子观察以及rRNA基因序列测定结果鉴定该菌株为日本曲霉菌株，命名为日本曲霉菌株QHT-40，继而采用紫外线+氯化锂复合诱变等方法处理菌株提高其酶活力，得到一株日本曲霉QHT-40-U475。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本发明中的物质或试剂浓度均为质量浓度。
下述实施例中所用的果糖基转移酶活力测定方法为：果糖基转移酶或产酶菌体作用于蔗糖，首先生成蔗果三糖(1-kestose)；蔗果三糖含量测定方法采用HPLC法，试验方法按GB/T 23528-2009 6.5执行。
酶活力单位定义：在酶供应者标识的最佳酶化反应的条件下，将蔗糖转化为低聚果糖，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需酶量为一个酶活力单位(U)；
Figure BDA0002351294380000051
上式中：
10----10％(w/w)蔗糖溶液中的蔗糖总量，g；
GF2----蔗果三糖的百分含量，％；
0.504----1μmol蔗果三糖＝0.504mg；
t----反应时间，60min；
W----菌丝质量，g。
高效液相色谱(HPLC)检测参数为：氨基柱；流动相：乙腈-水(70％，v/v)；流速:1.0mL/min；示差折光检测器(RI):Waters2414；柱温:40℃；进样体积:10μL。
实施例1
1)菌种的分离、纯化：
日本曲霉菌株分离自广东省江门市礼乐甘蔗种植农场土壤，分离所用培养基为察氏培养基、纯化所用培养基为PDA培养基。
日本曲霉菌株的分离方法：称取10g土壤，加入90mL无菌水中，振荡、摇匀。用移液枪从中吸取1mL悬浊液放入另一支装有9ml无菌水的试管中，配成10-1悬浊液。以此类推配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6悬浊液，混合均匀后，分别从上述试管中吸取200μL悬浊液涂布于察氏培养基中。待平板长出成熟的菌落，挑取带有个体特征的霉菌的单菌落分别接种于PDA培养基斜面中，并接种摇瓶，初筛测定酶活力，根据摇瓶酶活力鉴定并分离纯化得到出发菌株-日本曲霉菌株QHT-40。
分离培养条件为：察氏培养基，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH自然，培养温度28-32℃。
纯化培养条件为：PDA培养基，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，PH自然，培养温度28-32℃。
摇瓶培养条件为：蔗糖5g，蛋白胨1.5g，酵母膏1.0g，KH2PO4 0.2g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H20 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH5.0-7.5，培养温度28-32℃。
2)菌种诱变：
以日本曲霉菌株QHT-40为母本，采用紫外线+氯化锂复合诱变处理菌株，筛选出高产果糖基转移酶菌株QHT-40-U475。具体包括如下步骤：
挑取日本曲霉菌株QHT-40斜面孢子，于无菌水中，将孢子悬液浓度稀释至105个/mL，加入氯化锂使稀释后孢子悬液中氯化锂的质量分数为1％。吸取100μL孢子悬浮液倒入无菌培养皿中，置于距离30w紫外灯25cm处，分别照射0min，1min，3min，5min，7min，10min，13min，15min后取出，加入900μL高渗溶液，黑暗中静置1h，后涂布PDA固体平板，每个稀释度涂布3个平行样，30℃黑暗中静置培养48h，计数算致死率。
3)菌株筛选：
将诱变处理后的菌株30℃培养48h，观察菌落的形态并进行菌落计数，计算诱变致死率。以致死率在70％～85％的照射量为参考，挑取筛选平板上长势旺盛的菌落转接到PDA斜面培养基上，30℃培养48-72h后接种到液体种子培养基中，于28-33℃、200r/min摇床培养48-72h，再以3％的接种量接种到初始发酵培养基中，于28-33℃、200r/min摇床培养48-72h，测定发酵液的酶活。
将上述菌株通过检测果糖基转移酶酶活力进行筛选，得到F1代，
挑取果糖基转移酶酶活力的提高幅度大于30％的F1诱变菌株进行遗传稳定分析，连续7次传代培养，检测诱变菌株的果糖基转移酶酶活力，挑选遗传稳定性最好的F1诱变菌株作为诱变母本；
重复诱变步骤，重复进行1-4轮诱变处理，检测诱变菌株的果糖基转移酶酶活力，紫外与氯化锂复合诱变第4代菌株(即最后一轮诱变处理所得菌株)的果糖基转移酶酶活力检测结果如图2所示，挑选果糖基转移酶酶活力最高的诱变菌株U475作为生产高活力果糖基转移酶的日本曲霉菌株，即日本曲霉(Aspergillus japonicus)QHT-40-U475菌株，酶活力达2862U/g(干基)，该菌株的菌落形态如图1所示。
上述发酵液培养条件为：蔗糖5g，蛋白胨3g，酵母膏1g，KH2PO4 0.2g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H2O 0.1g，FeSO4·7H2O 0.003g，pH5.0-7.5，培养温度28-33℃。
实施例2
本发明中制备红糖低聚果糖的方法的一种实施例，如图3所示，包括如下步骤：
1)挑取日本曲霉QHT-40-U475斜面孢子，接入发酵培养基中(蔗糖5g，蛋白胨2.5g，酵母膏1.5g，KH2PO4 0.3g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H2O 0.1g，FeSO4·7H2O 0.003g，pH5.5)在30℃培养48后，用60目滤布过滤发酵液，收集菌丝，用蒸馏水反复清洗菌丝3次，离心甩干，检测菌株果糖基转移酶酶活力为2830U/g；
2)红糖溶解于去离子水中，配制固形物含量为45％的红糖糖浆；
3)按每公斤红糖添加1g含果糖基转移酶的菌丝，在45℃，PH为5.5，进行搅拌反应22h；
4)转化结束后，将糖浆升温至85℃，保温15分钟进行灭酶处理；
5)采用圆盘硅藻土过滤机过滤糖浆；
6)过滤后的糖浆通过真空浓缩蒸发器浓缩至固形物含量为70％；
7)浓缩后的糖浆再经连续灭菌器在121℃在维持15s，得到低聚果糖含量(占总糖)48％的红糖低聚果糖。
实施例3
本发明中制备红糖低聚果糖的方法的一种实施例，如图3所示，包括如下步骤：
1)红糖溶解于去离子水中，配制固形物含量为55％的红糖糖浆；
2)按每公斤红糖添加1.5g含果糖基转移酶的菌丝(实施例2步骤1发酵的菌丝)，在50℃，PH为6.5，进行搅拌反应18h；
3)转化结束后，将糖浆升温至85℃，保温18分钟进行灭酶处理；
4)采用圆盘硅藻土过滤机过滤糖浆；
5)过滤后的糖浆通过真空浓缩蒸发器浓缩至固形物含量为70％；
6)浓缩后的糖浆再经连续灭菌器在125℃在维持15s，得到低聚果糖含量(占总糖)50％的红糖低聚果糖。
实施例4
本发明中制备红糖低聚果糖的方法的一种实施例，如图3所示，包括如下步骤：
1)精制酶液：收集实施例2步骤1发酵的菌丝，采用砂磨机研磨菌丝，离心收集上清酶液，经1μm微滤膜澄清，再经200Kd超滤膜浓缩，并用纯水清洗，收集浓缩酶液，制得酶活为2971U/ml的精制酶液；
2)红糖溶解于去离子水中，配制固形物含量为50％的红糖糖浆；
3)按每公斤红糖添加0.8ml含果糖基转移酶的精制酶液，在50℃，PH为6.0，进行搅拌反应22h；
4)转化结束后，将糖浆升温至85℃，保温15分钟进行灭酶处理；
5)采用圆盘硅藻土过滤机过滤糖浆；
6)过滤后的糖浆通过真空浓缩蒸发器浓缩至固形物含量为75％；
7)浓缩后的糖浆再经连续灭菌器在121℃在维持20s，得到低聚果糖含量(占总糖)47％的红糖低聚果糖。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一株日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)QHT-40-U475，于2019年12月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20191050，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
2.权利要求1所述的日本曲霉菌在制备红糖低聚果糖中的应用。
3.一种制备红糖低聚果糖的方法，其特征在于，包括步骤：以红糖为作用底物，利用权利要求1的日本曲霉菌发酵产生的果糖基转移酶进行酶促反应，生成红糖低聚果糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将日本曲霉菌接种于发酵培养基中，进行发酵培养，然后收集菌丝；
2)将步骤1)所得菌丝或精制酶液加入红糖溶液中，进行转化反应，反应结束后升温糖浆以灭酶；
3)将步骤2)所得糖浆过滤，然后经蒸发浓缩和灭菌后，得到含有所述的红糖低聚果糖糖浆。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为培养液，所述培养液中含有以下质量浓度的成分：蔗糖2～8％、蛋白胨1～3％，酵母膏0.5～2％，KH2PO4 0.1～0.5％，NaNO3 0.1～0.5％，MgSO4·7H2O 0.1～0.5％，FeSO4·7H2O 0.001～0.003％，所述培养液的pH为5.0～7.5，所述培养液的培养温度为28～33℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述红糖溶液中固形物的质量浓度为40～60％。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中菌丝(干基)或精制酶液添加量为红糖质量的0.02～2.0％。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中转化反应温度为40～60℃，PH为4.0～7.5，在搅拌条件下反应时间为16～24h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中糖浆升温至85℃以上，保温至少15分钟后进行灭酶处理。
10.采用权利要求3～9任一项所述的方法制备的红糖低聚果糖。
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