KR101835724B1

KR101835724B1 - β-갈락토시다제를 이용한 스테비올배당체 혼합물로부터 고수율의 스테비올의 제조 방법

Info

Publication number: KR101835724B1
Application number: KR1020160071428A
Authority: KR
Inventors: 김도만; 탄한; 장태수
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-06-09
Filing date: 2016-06-09
Publication date: 2018-03-07
Also published as: KR20170139229A

Abstract

본 발명은 β-갈락토시다제를 이용한 스테비올배당체 혼합물로부터 고수율의 스테비올의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 스테비올이 스테비오사이드와 같은 정제 산물이 아닌 스테비올배당체 혼합물로부터 직접 생산됨으로써, 스테비올의 제조 공정의 단순화를 도모할 수 있을 뿐만 아니라 스테비올의 생산 수율을 높일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법은 상업적인 규모로 스테비올의 대량생산을 가능하게 한다.

Description

β-갈락토시다제를 이용한 스테비올배당체 혼합물로부터 고수율의 스테비올의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING STEVIOL FROM STEVIOGLYCOSIDE MIXTURE WITH HIGH YIELD USING β-GALACTOSIDASE}

본 발명은 β-갈락토시다제를 이용한 스테비올배당체 혼합물로부터 고수율의 스테비올의 제조 방법에 관한 것이다.

일반적으로 스테비오사이드(stevioside)는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) 식물에 함유된, 설탕의 200배 정도 단맛이 나는 화합물의 총칭으로서 좀더 정확하게는 스테비올배당체(steviol glycoside)를 의미한다. 스테비올 배당체에는 스테비오사이드(stevioside), 레바우디오사이드 A(rebaudioside A), 레바우디오사이드 C(rebaudioside C), 둘코사이드(dulcoside) 등을 함유하며 스테비올은 이러한 화합물에서 당부분을 제외한 비당체(aglycone)이다.

스테비올은 인지적 작용을 향상시키기 위해 사용될 수 있으며(국제특허출원공개 제2009/071277호), 모발생성을 강화하는데 사용할 수 있고(국제특허출원공개 제2011/009863호), 항균작용 및 식물성장 촉진 등의 작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

스테비오사이드로부터의 스테비올을 제조하기 위한 다양한 방법이 시도되었다. 스테비오사이드의 산 가수분해는 산 조건하에 제조된 스테비올이 이소스테비올로 재배열되는 문제가 있어 사용하기 어려운 부분이 있으며(Kohda et al 1976 Phytochemistry 15: 981-983]), 페리오데이트 나트륨을 사용하여 스테비올을 제조하는 다른 방법 (Ogawa et al 1980; Tetrahedron 36: 2641-2648)은 유용한 수율을 달성하기 위해 과량의 값비싼 페리오데이트 나트륨 (약 10 mol 당량 초과) 및 고도로 희석된 시스템을 필요로 하여 경제적이지 않다.

최근 상업적인 대규모 생산을 위해 시판 중인 사이톨라제 PCL5를 사용하여 스테비오사이드로부터 스테비올을 제조하는 방법에 대한 특허(국제특허출원공개 제2011/08903110호, 대한민국특허공개 제2012/0127443호)가 있다. 그러나 이 효소는 펙틴(pectin) 분해를 위해 제조된 효소로서 주성분인 펙티나제(pectinase) 이외의 극소량 효소류가 스테비올 형성에 관여하는 것으로 추정되어, 실제 스테비올 생성을 위한 바람직한 농도는 전체 스테비오사이드의 50% 이상, 바람직하게는 90중량% 초과라고 명시되어 있는 바와 같이 다량의 효소제품 장시간 사용되어야 하는 단점이 있다. 대한민국등록특허 제2012/0138757호는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 사용하여 스테비오사이드로부터 글리코시드 잔기를 분리하여 비당체인 스테비올을 수득하는 스테비올 제조방법을 제시하고 있으나, 스테비올배당체 혼합물로부터 스테비오사이드를 정제 한 이후에 스테비올을 생성함으로써, 복잡한 공정 절차를 가지고 있으며, 또한 스테비올의 제조 수율이 기대에 미치지 못하는 문제가 있다. 따라서, 스테비올의 제조 공정을 단순화하고, 고수율로 스테비올을 제조하여 효율적으로 스테비올을 대량 생산하고자 하는 지속적인 요구가 존재한다.

이에, 본 발명자들은 스테비올배당체 혼합물로부터 직접 스테비올을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력할 결과, 스테비올배당체 혼합물로부터 스테비올로의 전환능이 우수하고, 열안전성이 높으면서 활성이 우수한 스테비올 생성 효소를 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 온도, 스테비오배당체 혼합물의 양 및 효소의 활성을 조절함으로써 스테비올을 높은 수율로 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 β-갈락토시다제를 이용한 스테비올의 제조 방법을 제공하고자 한다. 본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법은

A) 스테비올배당체 혼합물을 준비하는 단계;

B) 상기 스테비올배당체 혼합물을 β-갈락토시다제와 반응시키는 단계; 및

C) 스테비올을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 상기 β-갈락토시다제는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 상기 β-갈락토시다제는 a) 재조합 미생물을 배양하여 β-갈락토시다제를 발현하는 단계; 및 b) 상기 발현된 β-갈락토시다제를 회수하는 단계를 통하여 수득될 수 있다. 상기 재조합 미생물은 E. coli 일 수 있다. 상기 β-갈락토시다제는 염석법, 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피를 통해 회수될 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 b)는 70℃ 내지 95℃의 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 상기 스테비올배당체 혼합물은 40 mg/ml 내지 90 mg/ml의 양으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 상기 β-갈락토시다제는 50 Unit/ml 내지 200 Unit/ml의 활성으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (C)의 스테비올의 양과 단계 (B)의 스테비올배당체 혼합물의 양, β-갈락토시다제의 활성 및 반응 온도 사이에는 하기의 관계식이 성립될 수 있다.

[관계식 1]

Y = -632.93875 + (0.56093 x A) + (0.55839 x B) + (15.22674 x C) + (0.000861874 x AB) + (0.00007272 x AC) + (0.00392689 x BC) - (0.00590172 x A²) - (0.00372086 x B²) - (0.098083 x C²)

Y, 스테비올생산량 (mg/ml); A, 스테비오배당체 혼합물; B, 효소 활성(U/ml); C, 반응 온도(℃).

본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법에 있어서, 최적의 스테비올 제조 방법은

A) 스테비올배당체 혼합물을 준비하는 단계;

B) 상기 스테비올배당체 혼합물 60 mg/ml을 β-갈락토시다제 활성 108 U/ml와 80℃에서 반응시키는 단계; 및

C) 25 mg/ml 이상의 스테비올을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면 스테비올이 스테비오사이드와 같은 정제 산물이 아닌 스테비올배당체 혼합물로부터 직접 생산됨으로써, 스테비올의 제조 공정의 단순화를 도모할 수 있을 뿐만 아니라 스테비올의 생산 수율을 높일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 스테비올의 제조 방법은 상업적인 규모로 스테비올의 대량생산을 가능하게 한다.

도 1은 실시예 1의 인덕션 조건에 따른 발현 효소 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 실시예 2에 따른 효소의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
(lane 1: 단백질 마커; lane 2: 정제된 SSbgal)
도 3은 실시예 2에 따른 스테비올배당체 혼합물과 효소 반응 후 스테비올 생산 결과 데이터를 나타낸다.
Ste: 스테비오사이드 (5%);
lane G: 글루코스 (100 mM);
lane E: 효소(enzyme);
lane R: 루부소사이드,
lane S: 스테비올;
lane R: 8시간 동안 8℃에서 스테비올배당체 0.5 내지 5%와 반응한 β-galactosidase 10% (v/v)의 효소 활성;
Lane M: 스테비올배당체 혼합물;
lane 1, 6, 11, 16: 80℃에서 0.5h, 1h, 2h, 8h에서 5% (w/v) 스테비올배당체와 반응한 1% (v/v) β-galactosidase;
lane 2, 7, 12, 17: 80℃에서 0.5h, 1h, 2h, 8h에서 5% (w/v) 스테비올배당체와 반응한 2.5% (v/v) β-galactosidase;
lane 3, 8, 13, 18: 80℃에서 0.5h, 1h, 2h, 8h에서 5% (w/v) 스테비올배당체와 반응한 5% (v/v) β-galactosidase;
lane 4, 9, 14, 19: 80℃에서 0.5h, 1h, 2h, 8h에서 5% (w/v) 스테비올배당체와 반응한 7.5% (v/v) β-galactosidase;
lane 5, 10, 15, 20: 80℃에서 0.5h, 1h, 2h, 8h에서 5% (w/v) 스테비올배당체와 반응한 10% (v/v) β-galactosidase.
도 4는 실험예 2에 따른 물에 녹인 EGCG (A)와 Ssbgal 처리 후 얻은 스테비올 혼합물 처리 후 물에 녹인 EGCG(B)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않은 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사건이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", "이루어지는" 및 "구성되는"은 제한적이지 않다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 발명은 내열성 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 유전자를 대장균 시스템에서 고발현시키고, 상기 β-갈락토시다제를 이용하여 스테비올배당체 혼합물로부터 스테비올을 고수율로 제조하는 효소적 방법을 제시하기 위한 것이다.

일 구현예에 따르면,

A) 스테비올배당체 혼합물을 준비하는 단계;

C) 스테비올을 회수하는 단계

를 포함하는 스테비올의 제조 방법이 개시된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "스테비아"는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과 숙근(宿根) 다년초 여러해살이풀을 의미한다. 상기 스테비아속은 예를 들면, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana), 스테비아 유파토리아(Stevia eupatoria), 스테비아 오바타(Stevia ovata), 스테비아 플루머라에(Stevia plummerae), 스테비아 살리시폴리아(Stevia salicifolia) 또는 스테비아 세라타(Stevia serrata)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "스베티올배당체(steviol glycoside)"는 스테비아의 잎에 존재하는 화합물로서 단맛을 내는 물질을 의미한다. 상기 스테비아 잎 내의 스테비올배당체는 예를 들면, 스테비오사이드(stevioside), 레바우디오사이드(rebaudioside), 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 C, 둘코사이드(dulcoside) A 뿐만 아니라, 레바우디오사이드 B, D, E, F, 루부소사이드(rubuososide), 스테비올 모노사이드 또는 스테비올 비오사이드를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "스테비올"은 스테비올배당체로부터 당부분을 제외한 비당체(aglycone)을 의미한다. 상기 스테비올배당체의 화학구조는 하기와 같다:

[화학식 1]

R기의 상세한 내용에 대해서는 하기의 표를 참고한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "β-갈락토시다제(β-galactosidase)"는 유당과 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 비환원 말단 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하거나, 갈락토스(Galactose)의 전이반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

상기 β-갈락토시다제는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터 분리된 내열성이 우수한 효소인 것을 특징으로 한다. 상기 설펄로버스 설파타리쿠스로부터 β-갈락토시다제를 수득하는 것은 균주로부터 직접 분리정제하거나, 균주로부터 β-갈락토시다제 유전자를 클로닝하여 재조합 발현벡터에서 발현시키고 이를 정제하여 수득할 수 있다. 상기 설펄로버스 설파타리쿠스로부터 β-갈락토시다제를 얻는 과정은 통상적인 방법에 의한다 (Sambrook, J. and Russell, D.W. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001).

일 예시적인 구현예에 따르면, 상기 β-갈락토시다제는

a) 재조합 미생물을 배양하여 β-갈락토시다제를 발현하는 단계; 및

b) 상기 발현된 β-갈락토시다제를 회수하는 단계를 통하여 수득될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 미생물"은 본 발명에 따른 β-갈락토시다제를 코딩하는 유전자가 염색체 상에 삽입되거나, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 의미한다. 상기 형질전환된 재조합 미생물은 DNA의 도입 효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하다. 본 발명의 실시예에서는 E. coli를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 β-갈락토시다제가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 예를 들면, 상기 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂)침전, 미세주입법(microinjection) 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 β-갈락토시다제의 회수는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들면, 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 구현예에 따르면, 스테비올배당체 혼합물과 β-갈락토시다제와의 반응은 70℃ 내지 95℃의 온도, 바람직하기는 80℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 온도 범위 내에서, 스테비올배당체 혼합물은 상기 β-갈락토시다제 효소에 높은 반응 특이성을 나타낸다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 구현예에 따른 스테비올배당체 혼합물과 β-갈락토시다제와의 반응은 pH 5.5 내지 pH 6.5의 범위, 바람직하기는 pH 6.0에서 수행될 수 있다.

상기 구현예에 따르면, 스테비올배당체 혼합물은 기질로서 40 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하기는 약 90 mg/ml의 양으로 사용될 수 있다.

상기 구현예에 따르면, β-갈락토시다제는 50 Unit/ml 내지 200 Unit/ml, 바람직하기는 약 100 Unit/ml의 활성으로 사용될 수 있다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 내열성 β- galactosidase 인 SSbgal 의 발현

Sulfolobus solfataricus β-galactoside (SSbgal) (amino acid residues 1-489, GenBank accession no. M34696)의 유전자를 합성하고(GenScript, Piscataway, NJ, USA), pET28a(Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝 한 후 polyhistidine tag를 N-terminal 과 C-terminal 에 모두 가지는 SSbgal enzyme을 E. coli Rosetta BL21 (De3)pPlyS를 이용해서 발현하였다. 소량의 발현은 kanamycin(50 ㎍.ml^-1)을 포함하는 100 mL LB 배지에 종균을 접종하고 37℃에서 0.1 mM IPTG 혹은 0.5 mM ~ 10 mM lactose를 이용하여 발현을 유도하였다. 여기서 OD₆₀₀가 0.5일때, 배양한 종균을 첨가하고, 16 시간 동안 발현 유도를 위한 배양을 수행하였다. 배양 후 20mM Bis-Tris buffer(pH 6.0)로 현탁한 후 sonication으로 세포를 분쇄하였다. 원심분리(12,000 x g, 30 min)후에, 세포 파쇄액을 200 mM lactose를 기질로 하여 80℃에서 30 min간 반응 후 활성을 확인 하였다. Large scale 발현은 7-L 발효조(Biotron, Korea)를 이용하였고, 0.5%(w/v) glycerol을 탄소원으로 준비하여 배양하면서, 37℃, 350 rpm, 그리고 aeration rate는 2 vvm으로 하였다. OD₆₀₀ 가 0.5로 되었을 때 최종 10 mM lactose 농도로 발현을 위한 인덕션을 시작하였고, 24 h까지 진행하였다. 발현 후 세포를 20 mM Bis-Tris buffer (pH 6.0)로 현탁하고, sonication으로 세포 파쇄 후 10 mL의 세포 파쇄액을 10 mL 의 Ni-Sepharose resin (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 컬럼을 이용하여 순수 정제를 진행하였다. 이때, 20 mM Tris (pH 7.5), 0.3 M imidazole, 0.2 M NaCl 을 가지는 완충용액으로 용출하였으며, 효소 활성을 가지는 분획을 모아 20mM Bis-Tris buffer (pH 6.0)로 투석하였다. 그 다음, Galactosidase 활성을 ο-nitrophenyl β-D-galactopyranoside를 기질로 확인하였다. 410 nm에서 ο-nitrophenol의 생산 정도를 확인 하였으며, 이를 바탕으로 galactosidase 활성을 결정하였다. 조건은 40mM Bis-Tris buffer (pH 6.0), 효소액, 그리고 ο-nitrophenyl β-D-galactopyranoside (20 mM)를 80℃에서 10 min간 반응 후 Na₂CO₃ (1 M)로 반응을 멈추었다. One unit (U)의 galactosidase 활성을 1분당 1 μM ο-nitrophenol 을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 발효조를 이용하여 생산 된 효소 SSbgal 효소 활성은 26.5 U/mg 이었다. 최종 OD₆₀₀ 는 23이었고, 인덕션 후 18 h에서 얻었다. 정제 된 SSbgal 는 한 번의 Ni-Sepharose column chromatographic step으로 얻었으며, 92.26%의 높은 수율로 얻었다 (표 1). SDS-PAGE analyses를 이용하여 순수한 단백질을 확인하였다. 분자량은 약 60 kDa 이었다. 이를 도 2에 나타내었다.

Step	Purification process	Total volume (ml)	Enzyme activity (U/ml)	Total activity (U)	Total Protein (mg)	Specific activity (U/mg)	Purification fold	Yields (%)
1	Crude enzyme	11	58.35	641.85	26.45	24.27	1	100
2	Ni-NTA chromatography	6	98.7	592.2	6.86	86.33	3.56	92.26

실시예 2: 스테비올배당체 혼합물과 효소 반응 및 효소 반응 산물 분석

재조합 SSbgal 을 10.0 % (w/v) 스테비올배당체 혼합물과 80℃, pH 6.0에서 반응 후 남은 기질의 양을 전개 용매로서 acetonitrile: water [85:15 (v/v)]를 이용하여 TLC [pre-coated silica gel 60 F₂₅₄ plates (Merck, Darmstadt, Germany)]로 결정하였다. TLC 플래이트는 5% (w/v) sulfuric acid와 0.5% (w/v) N-(1-Naphthy)ethylenediamine dihydrochloride를 포함하는 methanol 용액에 dipping 후 120℃에서 10 min간 baking하여 발색하였다. 효소 반응 후 12,000 x g에서 10 min 원심분리 후 상등액은 버리고, pellet을 물로 수 회 washing 후 생산된 스테비올을 phosphomolybdic acid staining solubiton을 이용한 TLC 방법으로 분석하였다. [http://www.chemistry.mcmaster.ca/adronov/resources/Stains_for_Developing_TLC_Plates.pdf]. 15 mg 의 정제된 스테비올은 DMSO-d6에 녹여 NMR spectrum [Unity Inova 500 spectrometer (Varian, Palo Alto, CA, USA)]를 이용하여 구조를 확인 하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

도 3으로부터 알 수 있듯이, 스테비올배당체 혼합물로서 스테비오사이드, 루부소사이드, 스테비올 모노-글리코시드, 스테비올 모노 글리코실에스테르, 스테비올바이오사이드, 레바우디오사이드 A-F 및 둘코사이드가 확인되었다.

실시예 3: 스테비올 생산 조건의 최적화

스테비올배당체 농도(A), 효소 양(B) 및 반응 온도(C)에 따른 스테비올 생산 조건을 확인하였다. CCD(Central composite design)을 위한 3가지 조건의 코드를 표 2에 나타내었다.

조건	Sym bol	코드 레벨
조건	Sym bol	-1	0	+1
스테비올배당체(mg/ml)	A	40	60	80
효소 (U/ml)	B	72	108	144
온도 (℃)	C	70	80	90

실험 설계 및 분석은 Design expert 9.0.1.3 프로그램을 이용하였다. 모든 조건의 평가는 스테비올의 생산량을 바탕으로 진행 하였다. 조건에 따른 스테비올 합성 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

Run number	A: SG mixture (mg/ml)	B: enzyme (U/ml)	C: temperature (℃)	Steviol (mg/ml)
Run number	A: SG mixture (mg/ml)	B: enzyme (U/ml)	C: temperature (℃)	Experimental	Predicted
1	60.00	108.00	80.00	26.60	26.66
2	93.64	108.00	80.00	22.85	17.61
3	40.00	144.00	90.00	17.02	16.52
4	80.00	72.00	90.00	1.10	1.43
5	60.00	108.00	80.00	26.58	26.66
6	40.00	72.00	90.00	4.22	4.54
7	40.00	72.00	70.00	11.27	7.76
8	60.00	108.00	80.00	27.60	26.66
9	60.00	108.00	80.00	26.02	26.66
10	80.00	144.00	90.00	10.59	14.39
11	40.00	144.00	70.00	12.63	13.08
12	60.00	168.54	80.00	21.83	21.66
13	80.00	144.00	70.00	11.93	12.69
14	60.00	108.00	63.18	0.00	-0.69
15	60.00	108.00	80.00	26.10	26.66
16	60.00	108.00	80.00	26.60	26.66
17	80.00	72.00	70.00	2.30	6.39
18	26.36	108.00	80.00	19.28	20.55
19	60.00	47.46	80.00	6.38	6.29
20	60.00	108.00	96.82	0	0

* Reaction pH - 6.0.

상기 표 3의 결과를 바탕으로 3가지 반응 조건에 따른 스테비올 생산량의 관계식을 하기와 같이 도출하였다.

[관계식 1]

Y, 스테비올생산량 (mg/ml); A, 스테비올배당체 혼합물 (mg/ml); B, 효소 활성(U/ml); C, 반응 온도(℃).

상기 관계식 1로부터 추정되는 최대 스테비올 생산량은 26.66 mg/ml으로서, 80℃의 온도에서 108 Unit SSbgal/ml 및 60 mg/ml 스테비올배당체 혼합물을 반응시키는 것이다. 이는 실제 실험 수치 26.58 mg/ml와 매우 유사한 결과임이 확인되었다.

Variables	Optimum levels
스테비올배당체 혼합물 (mg/ml)	60
효소 활성 (U/ml)	108
반응온도 (℃)	80
반응	예상치	실험치
스테비올 양 (mg/ml)	26.66	26.58

<실험예>

실험예 1: 스테비올 배당체를 이용한 EGCG 수용화 비교

본 발명자는 난용성 물질의 수용성을 개선시키기 위해 스테비올 배당체를 이용하여 이에 대한 특허를 출원하였다. 상기 실시예에 의해 만들어진 스테비올의 수용화 능력을 실험하기 위해 폴리페놀의 일종인 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate; EGCG)의 수용성 개선 효과를 실험하였다. 100 mg 스테비올 혼합물과 10 mg EGCG를 10:1 (w/w) 비율로 섞은 후 1 mL absolute ethanol을 넣고 15 min간 강하게 섞어 혼합액을 만들었다. 만들어진 혼합액을 12,000 rpm으로 10 min간 원심분리하고 상등액을 다른 eppendorf tube로 옮겨주고, 상기 tube에서 에탄올을 증발시킨 후 최종 얻은 EGCG-M(스테비올 배당체 혼합물)은 각각1 mL 로 녹였다. 그리고 다시 12,000 rpm으로 10 min간 원심분리 후 상등액에 있는 각 성분의 양을 확인했다. acetonitrile/water 85:15 (v/v)를 전개용매로 사용하고, EGCG는 TLC plate 상에서 UV 254 nm로 확인했으며, 표준액은 DMF에 녹인 0.25 mg.ml^-1 - 12 mg.ml^-1을 사용해 수용성 증가를 확인해 표 5에 나타내었다.

	EGCG를 물에 녹인 경우	EGCG를SSbgal처리 후 얻은 스테비올배당체에 혼합하여 물에 녹인 경우
수용화된 EGCG	20mg/mL	341.5mg/mL

표 5에서와 같이 스테비올 배당체 혼합물을 처리한 EGCG의 수용화는 17배 증가하는 것이 확인되어 본 발명에 의한 스테비올은 수용화 증가 능력을 부여하는 것으로 나타났다.

실험예 2: 수용화 EGCG 의 항산화능 비교

실험에 사용된 DPPH (2, 2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl)와 아스코르브 산(ascorbic acid)은 sigma에서 구입하였다. 실험에 사용한 DPPH의 hydrazyl은 질소원자가 불안정한 상태에 있으므로 쉽게 수소원자를 받아들이는 성질을 가지고 있어 항산화성 물질과 반응하여 수소원자를 받아들임으로써 자체의 청색성을 잃는 것을 이용하였다.

DPPH는 100 ? 로 에탄올에 녹였고, 100 ul의 DPPH에 100 ?의 농도별로 시료를 더하여 총 200?로 실험을 진행하였다. 최종 EGCG의 농도는 0.1 ~ 100 ? 이었다. 37℃ 암실에서 30분간 반응시킨 후, molecular devices M3 reader를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(sample)으로 하여 다음 식에 의해 각 시료의 DPPH 저해율과 SC₅₀치(DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 mg/ml)로 나타내었다. 양성 대조군으로 아스코르브산을 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 ug/ml로 조제하여 진행해 도 4와 표 6에 나타내었다.

	EGCG를 물에 녹인 경우	EGCG를SSbgal처리 후 얻은 스테비올배당체에 혼합하여 물에 녹인 경우
EGCG의 DPPH radical scavenging 활성(SC₅₀)	5.32 ?	2.54 ?

도 4 및 표 6에서와 같이 SSbgal 처리로 생성된 스테비올 배당체에 의해 수용화된 EGCG는 항산화 능력도 2.1배 향상 되었으며 이를 통해 SSbgal 처리를 통해 생산된 스테비올 배당체가 EGCG를 수용화시켜 항산화 능력을 개선하는 것으로 나타났다.

실험예 3: 지카바이러스 NS2B - NS3 의 활성저해 효과 비교

본 발명의 적용 가능성을 확인하기 위해 재조합 지카 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제에의 활성 억제에 대한 상기 SSbgal의 기여를 확인하였다. 지카 바이러스(Zika virus)는 1952년 Alexander Haddow에 의해 원숭이에서 발견한 뒤 1953년에 인간 감염이 확인된 바이러스로 감염사례가 많지 않았으나 감염 지역이 지속적으로 확대되었다. 이후 2015년 브라질에서 이루어진 역학(epidemiology) 조사에서 급증한 소두증과의 연관관계를 제기했으며, 2016년에 세계보건기구(WHO)는 지카 바이러스의 유행에 "질병의 국제적 전파에 따라 타 국가에 공중보건 위험을 초래할 수 있어 국제적 대응과 공조가 필요한 예외적인 사태"로 간주해 국제 공중보건 비상사태(Public Health Emergency of International Concern, PHEIC)를 선언할 정도로 지카 바이러스 감염은 세계적인 이슈가 된 상태이다.

재조합 pET28a(+)-NS2B-NS3pro DNA(4μg)를 넣고 조심스럽게 혼합한 후 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 그 후 42℃에서 1분 30초동안 열충격을 가하고 카나마이신(Kanamycin, 50ug/ml)이 첨가된 LB 고체배지 (0.5%(w/v) 효모 추출액, 1%(w/v) 트립톤, 1%(w/v) 염화나트륨)에서 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양된 형질전환 균주를 LB 액체배지(0.5%(w/v) 효모 추출액, 1%(w/v) 트립톤, 1%(w/v) 염화나트륨)에서 37℃에서 12시간 배양하였다. 배양액을 LB 액체배지에 1% 접종한 후 OD600이 0.5가 되도록 배양하였다. 그 후 0.5mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 넣어주어 16℃에서 12시간 배양하였다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 세포만 얻은 후 50mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer에 현탁하였다. 초음파를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 그 후 다시 원심분리하여 상등액만 얻어 효소를 생산하였다. 본 발명에 따른 재조합 지카 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제는 발린을 시작으로 244개의 아미노산으로 구성되며, N-말단 및 C-말단에는 각각 6개의 히스티딘 태크(histidine tag)가 붙어있어 단백질 정제가 용이하다. 얻어진 재조합 지카 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제를 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 정제하였다. Lysis buffer(50mM Tris-HCl, 30mM NaCl, 10mM imidazole (pH 8.0))로 컬럼을 씻어준 후에 NS2B-NS3 프로테아제와 혼합시켜 컬럼과 히스티딘 태그가 붙은 NS2B-NS3 프로테아제를 결합시켰다. 그 후 Washing buffer(50mM Tris-HCl, 30mM NaCl, 20mM imidazole (pH 8.0))를 사용하여 충분히 씻어준 후, Elution buffer(50mM Tris-HCl, 30mM NaCl, 500mM imidazole (pH 8.0))로 NS2B-NS3 프로테아제를 정제하였다.

지카 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 분석에 이용되는 기질은 형광 펩타이드(fluorogenic peptide) DABCYL-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu-Edans(Bachem, 스위스)이다. 재조합 지카 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제의 활성을 확인하기 위하여, 기질은 최종농도 26μM 농도로 사용하였다. NS2B-NS3 프로테아제를 각각의 최종 농도 46μM EGCG를 녹인스테비올로 처리 혼합물을 25℃에서 30분 반응시킨 후, 반응 산물은 형광 마이크로 플레이트 리더 SpectraMax M3 (Molecular Devices, USA) 기기를 이용하여 형광세기(흡수(excitation) 355nm, 방출(emission) 538nm)를 측정하여 모니터하였다. 지카 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제에 의해 기질이 분해됨에 따라 형광 세기가 증가하게 되는데 이를 이용하여 수용화된 EGCG의 50% 저해농도(IC₅₀)를 확인하였다.

	EGCG를 물에 녹인 경우	EGCG를 SSbgal처리 후 얻은 스테비올배당체에 혼합하여 물에 녹인 경우
지카바이러스 NS2B-NS3 단백질분해효소의 활성억제율 (46μg/mL)	78.9% (IC₅₀ = 30.7 μg/mL)	74.5% (IC₅₀ = 21.3 μg/mL)

표 7에서와 같이 EGCG를 물에 녹인 경우는 지카 바이러스의 NS2B-NS3 protease의 50% 활성을 억제하는데 30.7 μg/mL이 필요한 반면, SSbgal 처리로 생성된 스테비올 배당체에 의해 수용화된 EGCG는 21.3 μg/mL 만이 요구되는 것으로 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

A) 스테비올배당체 혼합물을 준비하는 단계;
B) 상기 스테비올배당체 혼합물을 β-갈락토시다제와 반응시키는 단계; 및
C) 스테비올을 회수하는 단계를 포함하는 스테비올의 제조 방법에 있어서,
상기 단계 b)는 80℃의 온도에서 수행되고,
상기 스테비올배당체 혼합물은 60 mg/ml의 양으로 사용되고,
상기 β-갈락토시다제는 108 Unit/ml의 활성으로 사용되며,
상기 단계 (C)의 스테비올의 양과 단계 (B)의 스테비올배당체 혼합물의 양, β-갈락토시다제의 활성 및 반응 온도 사이에는 하기의 관계식 1이 성립하는 것인
스테비올의 제조 방법.
[관계식 1]
Y = -632.93875 + (0.56093 x A) + (0.55839 x B) + (15.22674 x C) + (0.000861874 x AB) + (0.00007272 x AC) + (0.00392689 x BC) - (0.00590172 x A²) - (0.00372086 x B²) - (0.098083 x C²)
Y, 스테비올생산량 (mg/ml); A, 스테비오배당체 혼합물; B, 효소 활성(U/ml); C, 반응 온도(℃).
제1항에 있어서,
상기 β-갈락토시다제는 설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터 유래한 것인, 스테비올의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 β-갈락토시다제는
a) 재조합 미생물을 배양하여 β-갈락토시다제를 발현하는 단계; 및
b) 상기 발현된 β-갈락토시다제를 회수하는 단계를 통하여 수득되는 것인, 스테비올의 제조 방법.
제3항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 E. coli인 것인, 스테비올의 제조 방법.
제3항에 있어서,
상기 β-갈락토시다제는 염석법, 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피를 통해 회수되는 것인, 스테비올의 제조 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 스테비올은 단 맛의 증가, 감미료의 대체 및 수용화 증가를 포함하는 용도에 사용되는 것인, 스테비올의 제조 방법.
제1항에 있어서,
A) 스테비올배당체 혼합물을 준비하는 단계;
B) 상기 스테비올배당체 혼합물 60 mg/ml을 β-갈락토시다제 활성 108 U/ml와 80℃에서 반응시키는 단계; 및
C) 25 mg/ml 이상의 스테비올을 회수하는 단계
를 포함하는 스테비올의 제조 방법.