CN107532189B - 甜菊醇糖苷的酶修饰的方法、由此可获得的修饰的甜菊醇糖苷及其作为甜味剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明通常涉及甜菊醇糖苷的产生。提供了酶促地提供修饰的甜菊醇糖苷的方法，包括在蔗糖和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株180的葡聚糖蔗糖酶GTF180或其具有期望的转糖基化活性的突变体的存在下，孵育甜菊醇糖苷底物。还提供了通过本发明的方法能够获得的修饰的甜菊醇糖苷，以及其作为低血糖甜味剂的用途。
Description
本发明一般涉及甜菊醇糖苷的产生。特别地，本发明涉及将甜菊醇糖苷经酶修饰成为新型甜菊醇糖苷的方法，以及所述新型甜菊醇糖苷作为甜味剂的用途。
甜味剂作为食品、饮料或糖果工业中最常用的成分是众所周知的。甜味剂可以在生产过程中掺入最终的食品产品中，或者可以独立使用，例如，当进行适当的稀释或作为餐桌甜味剂时。甜味剂包括诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、槭糖浆和蜂蜜的天然甜味剂，以及诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖的人造甜味剂。
草本植物甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)(一种菊科[Asteraceae/Compositae]家族的根茎型多年生灌木)的叶含有很多种天然甜味化合物，即甜菊醇糖苷(Brandle等人，1998)。甜菊苷(干燥叶的5％w/w-10％w/w)和瑞鲍迪甙(Rebaudioside)A(干燥叶的2％w/w-4％w/w)是最丰富的，并且它们的味道比蔗糖(0.4％水溶液)甜约200倍–300倍。因此，可以将它们视为蔗糖和人造(合成)甜味剂的“生物”替代物(Geuns 2003；Goyal等人，2010；Puri等人，2011)。
除了甜味之外，一些甜菊醇糖苷在较高剂量和规律的消耗下，具有多种多样的药理性质，例如抗氧化、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、胃保护(止泻)的性质，并且它们似乎对肾功能、血压和血糖水平具有积极效果(Chatsudthipong和Muanprasat 2009；Madan等人，2010；Brahmachari等人，2011；Lemus-Mondaca等人，2012；Shivanna等人，2013)。它们可以对患有肥胖、糖尿病、高血压、苯丙酮尿症、心脏疾病和龋齿的人有益处(Yadav和Guleria2012)。甜菊醇糖苷是无热量的、非致癌的、非遗传毒性的，并且与人的任何生殖毒性/发育毒性无关(European Food Safety Authority,2010)。
在结构上，甜菊醇糖苷具有对映-13-羟基贝壳杉-16-烯-19-酸作为糖苷配基，但是在碳水化合物组成上不同(参见图1)。
13-叔羟基处的葡萄糖单元数与19-羧基处的葡萄糖单元数的比似乎与甜菊醇糖苷的甜味以及味道品质有关(Darise等人，1984)。例如，瑞鲍迪甙A比甜菊苷苦味更小。甜菊苷的酶促葡萄糖基化研究显示，糖苷键特异性也影响甜菊醇糖苷的感官性质。Fukunaga等人(1989)发现，甜菊苷在C-13位的单-(α1→4)-葡萄糖基化和双-(α1→4)-葡萄糖基化均得到了在甜味的强度和品质上均有显著改善的产物。然而，在C-19位的单-(α1→4)-葡萄糖基化和双-(α1→4)-葡萄糖基化均导致了增强的苦味和较低的甜味强度(Fukunaga等人，1989)。另一方面，α-连接的葡萄糖与C-19位的葡萄糖单元的C-6羟基的连接导致了味道品质的显著改善(Lobov等人，1991)。明显地，糖苷键的端基异构(anomericity)不会大程度地影响甜味和苦味，因为若干最近的研究显示，瑞鲍迪甙D和瑞鲍迪甙M(分别在19-O-葡萄糖基部分额外有一个和两个β-连接的葡萄糖单元的两种瑞鲍迪甙A衍生物)均具有比瑞鲍迪甙A和许多其他甜菊醇糖苷更理想的味道特征(Hellfritsch等人，2012；US2013/00771521A1；WO2014/122227；Prakash等人，2014)。与瑞鲍迪甙A相比，瑞鲍迪甙D在水和碳酸饮料基质中具有增强的甜味和减弱的苦味。与瑞鲍迪甙A相比，瑞鲍迪甙M在水溶液中显示出减弱的苦味，但显示出类似的甜味强度。在酸化的水中，与瑞鲍迪甙A相比，感觉到减弱的苦味和增强的甜味(Prakash等人，2014)。此外，(α1→2)-(瑞鲍迪甙E)-或(β1→2)-(瑞鲍迪甙E)-连接的葡萄糖与甜菊苷的C-19位的葡萄糖单元的C-2羟基的连接改进了甜菊苷的感官产物，产生具有类似甜味但具有减弱的苦味的化合物(Ye等人，2013)。
阻碍甜菊甜味剂成功商业化的主要缺点是其轻微的苦味和涩味(特别是甜菊苷)。这些不期望的性质可以通过修饰甜菊醇糖苷的糖基部分来减少或消除。
甜菊醇糖苷的化学修饰已经以改善这些化合物的味道品质的目的进行。例如，可以通过由(钠磺基)丙基[(CH2)3SO3Na]部分替代19-O-葡萄糖基残基来改善甜菊苷和瑞鲍迪甙A(DuBois等人，1981；DuBois和Stephenson 1985)。此外，已经通过将C-19-O-β-D-葡萄糖基部分替代为另一种单糖(例如β-D-Xyl，α-L-Ara，α-D-Man或α-L-Rha)或者用单糖(α-L-Rha或α-L-Qui)延长C-19β-D-葡萄糖基部分来合成若干甜菊苷的类似物。然而，通常认为应用化学方法来修饰甜菊醇糖苷是不切实际的，因为在选择性保护-脱保护合成策略中需要多步操作。此外，有机溶剂和金属盐的使用将引起食品工业中接受所获得的衍生物的问题。为了克服这些问题，生物催化剂替代物是更加优选的，同时也具有“绿色”化学的目的。
使甜菊醇糖苷经受酶促转糖基化的反应从而将新的单糖残基引入分子是具有前景的程序。根据单糖残基的数量、位置和端基异构，化合物的味道品质和效力会改变。
为改善味道，通过使用不同的酶系统进行了对甜菊醇糖苷的碳水化合物部分的酶修饰，所述酶系统尤其是UDP-葡萄糖基转移酶(UGT酶)(WO2013/176738A9；WO 2014/122227)和环糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)(Darise等人，1984；Li等人，2013；US2014/0227421A1)。UGT酶是具有高的区域特异性的有效的酶，其催化α-连接的葡萄糖或β-连接的葡萄糖在特异性位点转移。然而，UGT酶需要昂贵的核苷酸活化的糖作为糖基供体，这使得它们在工业应用上吸引力较小。CGT酶催化了将葡萄糖残基从淀粉或环糊精转移至受体分子的偶联反应和歧化反应。由于CGT酶的受体特异性，预计分子间的转葡萄糖基化反应仅在甜菊醇糖苷的非还原端葡萄糖残基的C-4-羟基发生。虽然常获得高收率，但CGT酶具有差的C-13/C-19区域特异性，产生的甜菊醇糖苷主要是在C-13处α-D-葡萄糖基延长的化合物与在C-19处α-D-葡萄糖基延长的化合物的混合物。此外，由CGT酶引入的(α1→4)-键在人的口中通过唾液中存在的淀粉水解酶迅速地水解，从而增加了甜菊醇糖苷的热含量。因此，引入α-淀粉酶抗性的糖苷键(例如(α1→6)键和(α1→3)键)是更加理想的，因为其响应了消费者对于低卡路里和零卡路里食品产品的需求。
因此，本发明人的目的为用于提供酶修饰的甜菊醇糖苷的新手段和方法。特别地，他们着手研发产生显示出与未修饰的甜菊醇糖苷相比减弱的苦味和/或增强的甜味的化合物的酶方法。优选地，所述方法在工业规模在经济上是有吸引力的，并且优选地不需要昂贵的核苷酸活化的糖作为糖基供体。
为此，本发明人筛选了不同乳酸杆菌的葡聚糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶的葡萄糖基化潜力，所述乳酸杆菌中多数成员具有公认为安全的(GRAS)状态，例如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。葡聚糖蔗糖酶是细胞外酶，仅报导其存在于乳酸菌中。本发明人由廉价的供体底物蔗糖合成了α-葡聚糖聚合物。根据葡聚糖蔗糖酶，将不同的糖苷键(糖苷键的混合物)引入其葡聚糖产物，即(α1→2)-键、(α1→3)-键、(α1→4)-键和(α1→6)-键(Leemhuis等人，2013)。葡聚糖蔗糖酶使用的葡萄糖基供体底物蔗糖的低成本是其工业应用的主要优点。最重要的是，由葡聚糖蔗糖酶引入的(α1→2)-键、(α1→3)-键和(α1→6)-键在口中不被唾液中存在的淀粉水解酶水解。针对由来自不同罗伊氏乳杆菌菌株的具有不同产物特异性的野生型和突变型葡聚糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶组成的超过100种酶，筛选了它们使甜菊醇糖苷瑞鲍迪甙A葡萄糖基化的能力。瑞鲍迪甙A葡萄糖苷通过半制备型NP-HPLC来分离，并且其结构通过MALDI-TOF质谱和1D/2D 1H/13C NMR光谱来说明。进行感官评价以确定新型瑞鲍迪甙A葡萄糖苷的味道属性。
意外地发现，仅有来自罗伊氏乳杆菌180的葡聚糖蔗糖酶GTF180(GenBank收录号AY697430)能够使瑞鲍迪甙A葡萄糖基化。瑞鲍迪甙A葡萄糖基化产物的NMR结构分析显示，GTF180特异性地且仅在C-19β-连接的葡萄糖残基处使瑞鲍迪甙A葡萄糖基化。有趣的是，若干GTF180点突变体对瑞鲍迪甙A表现出高得多的转葡萄糖基化活性。一种突变体，Q1140E，甚至显示出约96％的瑞鲍迪甙A转化率。对于甜菊苷的修饰，观察到了类似的结果。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了酶促地提供修饰的甜菊醇糖苷的方法，包括在葡萄糖供体以及罗伊氏乳杆菌菌株180的葡聚糖蔗糖酶GTF180或其具有期望的转糖基化活性的突变体存在时孵育甜菊醇糖苷底物。
据我们所知，仅存在一篇使用葡聚糖蔗糖酶将甜菊苷葡萄糖基化的报导。Musa等人报导了在甜菊苷生物转化中通过来自明串珠菌(Leuconostoc citreum)SK24.002的交替蔗糖酶的酶修饰以完全或部分去除甜菊苷的苦味。在优化的反应条件下，用甜菊苷实现了43.7％的最大转葡萄糖基化收率。得到了连接有1个至3个α-葡萄糖单元的甜菊苷糖苷。在后续的研究中，产物的结构表征为13-{[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}对映-贝壳杉-16-烯-19-酸β-D-吡喃葡萄糖基酯(Musa等人，2014)。因此，Musa等人的方法使用了不同的酶，显示出较低的收率，并且导致了不同类型的修饰，即在C-13位点α-葡萄糖基化，而不是在C-19位点。
在本发明的一个实施方案中，用至少一个α-葡萄糖残基在C-19β-连接的葡萄糖残基处修饰甜菊醇糖苷。例如，经由(α1→6)糖苷键、(α1→3)糖苷键或其组合向甜菊醇糖苷提供一个或多个葡萄糖。在一个具体方面，修饰涉及经由(α1→6)糖苷键(β-异麦芽糖)或(α1→3)糖苷键(β-黑曲霉糖)添加一个葡萄糖(图5A)。在另一个具体方面，修饰涉及经由(α1→6)糖苷键在β-连接的葡萄糖添加葡萄糖基-葡萄糖单元。在所述单元内，葡萄糖残基可以经由(α1→6)糖苷键(异麦芽糖)或(α1→3)糖苷键(黑曲霉糖)连接(图5B和图5C)。
可以在多个位置修饰甜菊醇糖苷。例如，可以在甜菊醇糖苷配基的C-13位和/或C-19位发生修饰。考虑到瑞鲍迪甙D和瑞鲍迪甙M的有吸引力的味道特性，优选地至少在甜菊醇糖苷的C-19位点修饰甜菊醇糖苷。
更优选地，修饰的甜菊醇糖苷仅在甜菊醇糖苷的C-19位点修饰。例如，在一个实施方案中，本发明提供了用于酶促产生修饰的甜菊醇糖苷的方法，所述修饰的甜菊醇糖苷仅在甜菊醇糖苷配基的C-19位用单个葡萄糖残基修饰。在一个实施方案中，修饰包括在C-19β-连接的葡萄糖残基处添加单个(α1→6)葡萄糖。
甜菊醇糖苷底物可以是任何类型。例如，其选自甜菊苷；甜茶甙；瑞鲍迪甙，包括瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙C、瑞鲍迪甙D和瑞鲍迪甙E；以及杜尔可甙(Dulcoside)化合物。在一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物在甜菊醇糖苷的C-19位具有至少一个单糖部分。
在一个具体的实施方案中，甜菊醇糖苷底物是瑞鲍迪甙。本发明人假设瑞鲍迪甙A在C-19位点的α-葡萄糖基化可以因此产生瑞鲍迪甙D和瑞鲍迪甙M端基异构体，其具有与瑞鲍迪甙D和瑞鲍迪甙M类似或甚至更好的味道特征。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了用于瑞鲍迪甙A[13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基酯]的酶修饰的方法。
在另一个具体实施方案中，甜菊醇糖苷底物是甜菊苷，其存在于甜菊提取物中最丰富并且是味道最苦的甜菊醇糖苷之一。
通常，基于干重，甜菊叶中存在的四种主要甜菊醇糖苷是杜尔可甙A(0.3％)、瑞鲍迪甙C(0.6％-1.0％)、瑞鲍迪甙A(2％-4％)和甜菊苷(5％-10％)。在甜菊提取物中以合理量鉴定的其他糖苷包括瑞鲍迪甙B、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E和瑞鲍迪甙F、甜菊醇双糖苷以及甜茶甙。其中，目前仅甜菊苷和瑞鲍迪甙A在商业规模上可用。
可以使用本领域已知的方法从叶中提取甜菊醇糖苷，所述方法通常包括水或有机溶剂提取。也描述了超临界流体提取和蒸汽蒸馏方法。使用超临界CO2、膜技术以及水或诸如甲醇和乙醇的有机溶剂从甜菊(Stevia rebaudiana)回收二萜甜味糖苷的方法也可以使用。
US2014/343262公开了纯化甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：a.使甜菊醇糖苷的溶液通过多柱系统，所述多柱系统包括用吸附树脂填充的多个柱，以提供至少一个具有吸附的甜菊醇糖苷的柱；以及b.从至少一个含有吸附的甜菊醇糖苷的柱洗脱具有低的瑞鲍迪甙X(之后被称为瑞鲍迪甙M(US 2014/0227421；Prakash等人，2014))含量的级分，以提供包含甜菊醇糖苷的洗脱溶液。
瑞鲍迪甙A通常可以以≦80％的纯度获得。主要杂质包括甜菊苷、甜菊醇双糖苷、瑞鲍迪甙B、瑞鲍迪甙C、瑞鲍迪甙D、杜尔可甙A、瑞鲍迪甙F以及其他甜菊醇糖苷。许多研究专注于以高回收率回收高纯度的瑞鲍迪甙A。US 5,962,678公开了使用无水甲醇溶液将瑞鲍迪甙A重结晶以得到80％纯的瑞鲍迪甙A。通过用无水甲醇重复多次重结晶，瑞鲍迪甙A的纯度可以提升至超过95％。US 2006/0083838公开了通过用包含乙醇和4％至15％的水的溶剂重结晶来纯化瑞鲍迪甙A。第55-23756号日本专利申请公开了通过从乙醇(>70％)水溶液中结晶使瑞鲍迪甙A和甜菊苷纯化的方法，以得到80％纯的瑞鲍迪甙A。US 2007/0082103公开了通过从乙醇水溶液重结晶使瑞鲍迪甙A纯化的方法，声称从粗制瑞鲍迪甙(60％)的两步重结晶导致以97％收率形成至少98％纯的瑞鲍迪甙A。US 8,791,253仅使用单一的重结晶步骤提供了基本上纯的瑞鲍迪甙A组成。
本发明的方法中甜菊醇糖苷底物的浓度可以根据例如底物类型、期望的修饰等变化。通常，反应混合物包含至少20mM待修饰的甜菊醇糖苷，优选至少30mM，更优选至少50mM，例如60mM、70mM、80mM、90mM至100mM。最大浓度尤其取决于底物在水性反应介质中的溶解度。例如，使用50mM至100mM瑞鲍迪甙A或甜菊苷作为底物获得了良好的结果。
本发明的方法使用蔗糖作为葡萄糖供体。蔗糖是廉价且广泛可得的。当蔗糖以至少50mM、优选至少100mM、更优选至少500mM的浓度使用时，得到了良好的结果。例如，反应混合物包含至少500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M的蔗糖。可以使用甚至更高的浓度，例如高达2M或3M。在反应起始时，葡萄糖供体可以以其总量添加。在一些实施方案中，以分批的方式添加蔗糖是有利的。例如，在起始、1.5小时后和3小时后，以分批方式添加蔗糖，直至最终量为至少1M，更优选至少2M。
通常以约20℃至70℃的温度，在3-7的pH进行反应。优选地，使用约37℃的温度。
使反应进行直至产生了期望量的修饰的甜菊醇糖苷。通常，以约1小时至过夜的时间进行孵育。
技术人员将能够确定待使用的GTF180葡聚糖蔗糖酶的量，以在给定的反应条件下得到期望的酶修饰程度。例如，可以使用1U/mL至50U/mL。优选地，使用至少3U/mL。出于经济原因，使用高达35U/mL可以是有利的。在一个实施方案中，使用5U/mL至30U/mL。将一个酶单位(U)定义为在37℃下于含有25mM乙酸钠(pH 4.7)、1mM CaCl2和1M蔗糖的反应混合物中每分钟产生1μmol单糖所需的酶的量。
在一个实施方案中，使用了来自罗伊氏乳杆菌菌株180的野生型GTF180葡聚糖蔗糖酶(GenBank收录号AY697430)。在另一个实施方案中，使用了突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶。如本文所用，突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶是指与野生型氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸插入的酶。
在优选的实施方案中，用于本发明的甜菊醇糖苷的酶修饰的GTF180突变体包含在位置S1137、Q1140、L981和/或W1065(编号基于GenBank序列AY697430)的取代突变。优选地，所述突变是非保守的取代，即突变导致氨基酸改变，使得具有与原始氨基酸不同的性质。例如，所述突变体具有以下氨基酸取代的一种或多种：S1137Y、Q1140E、L981A、W1065L/E/Q/F。
在另一个实施方案中，突变体GTF180是缺失突变体或截短的变体，其中将至少10个氨基酸的片段从N-末端和/或C-末端移除。一方面，截短突变体是包含残基742-1772的GTF180-ΔN，其中N-末端可变结构域已删除。例如，用GTF180-ΔN得到了良好的结果，所述GTF180-ΔN是GTF180全长野生型蛋白质的117kDa N-末端截短(741个残基)的片段。GTF180-ΔN是完全活性的，并且产生了具有与全长酶类似的大小和键分布的α-葡聚糖聚合物(Kralj等人，2004a)。瑞鲍迪甙A葡萄糖基化产物的NMR结构分析显示，GTF180-ΔN特异地且仅在C-19β-连接的葡萄糖残基处使瑞鲍迪甙A葡萄糖基化。有趣的是，若干GTF180-ΔN取代突变体对瑞鲍迪甙A表现出比GTF180-ΔN高得多的转葡萄糖基化活性。与通过GTF180-ΔN的约55％的瑞鲍迪甙A转化率相比，一个突变体(Q1140E)甚至显示出约96％的瑞鲍迪甙A转化率(图3和图4)。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法使用了具有一个或多个氨基酸取代的GTF180-ΔN，例如在位置Q1140、S1137、L981和/或W1065。具体的示例性突变体酶包括GTF180-ΔNQ1140E、GTF180-ΔNQ1140F、GTF180-ΔNQ1140N、GTF180-ΔNQ1140Y、GTF180-ΔNQ1140R、GTF180-ΔNS1137Y、GTF180-ΔN L981A、GTF180-ΔN W1065L、GTF180-ΔN W1065E、GTF180-ΔN W1065Q和GTF180-ΔN W1065F。
另一方面，截短突变体是GTF180-ΔNΔV，其中N-末端可变结构域和N-末端结构域V片段(对应于在前的793个N-末端氨基酸)、以及结构域V C-末端片段(对应于最后的136个C-末端氨基酸)均已删除(Meng等人，2015a)，以便得到由氨基酸794–1636组成的GTF180突变体。这种GTF180-ΔNΔV截短突变体(可以认为是“催化核心”)与全长GTF180野生型相比具有约50％的尺寸减小，其为完全活性的，产生与GTF180野生型类似的糖苷键分布，但是在高分子量多糖合成中是严重受损的。
本发明的截短突变体可以另外含有取代突变，例如以改善其催化性能。在一个实施方案中，突变体是GTF180-ΔNΔV，此外其还包含在位置S1137、Q1140、L981和/或W1065的取代突变。例如，所述突变体具有以下氨基酸取代中的一种或多种：S1137Y、Q1140E、L981A、W1065L/E/Q/F。具体的示例性突变体酶包括GTF180-ΔNΔVQ1140E、GTF180-ΔNΔVQ1140F、GTF180-ΔNΔVQ1140N、GTF180-ΔNΔVQ1140RGTF180-ΔNΔVQ1140Y、GTF180-ΔNΔVS1137Y、GTF180-ΔNΔVL981A、GTF180-ΔNΔV W1065L、GTF180-ΔNΔV W1065E、GTF180-ΔNΔV W1065Q和GTF180-ΔNΔV W1065F。
突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶已经由例如Van Leeuwen等人描述，报导了GTF180-ΔN酶的特定氨基酸残基的突变发生，这得到了由蔗糖产生修饰的胞外多糖(mEPS)的12种突变体酶(van Leeuwen等人，2009)。本发明人发现，与通过GTF180-ΔN的约55％的瑞鲍迪甙A转化率相比，单突变体中的两种，即GTF180-ΔN的Q1140E和S1137Y，对瑞鲍迪甙A表现出比GTF180-ΔN高得多的转葡萄糖基化活性，分别显示出约96％和约73％的瑞鲍迪甙A转化率(图3和图4)。突变体Q1140E主要产生单-α-葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A，而GTF180-ΔN和突变体S1137Y产生多-α-葡萄糖基化的形式，其DP高达至少8。α-葡萄糖基化产物的NMR结构分析显示，GTF180-ΔN以及突变体Q1140E和S1137Y特异地且仅在C-19位点使瑞鲍迪甙A葡萄糖基化。所述三种酶专一地使用(α1→6)-连接的葡萄糖在C-19β-连接的葡萄糖处将瑞鲍迪甙A葡萄糖基化，得到RebAG1。GTF180-ΔN和突变体S1137Y的二葡萄糖基化瑞鲍迪甙A产物均为由在末端α-葡萄糖残基偶联的(α1→3)-连接的葡萄糖(约75％)或另一种(α1→6)-连接的葡萄糖(约25％)对RebAG1的延长。因此，特别优选的突变体包括GTF180-ΔN的Q1140E和S1137Y。
GTF180-ΔN突变体L981A和W1065L/E/Q/F(Meng等人，2015b)能够使瑞鲍迪甙A进行α-葡萄糖基化，但是几乎不显示出聚合(即，低聚糖和葡聚糖形成)活性。这是在下游处理过程中的明显优点，所述下游处理为从单糖和二糖、低聚糖和葡聚糖中对延长的瑞鲍迪甙A产物的纯化。通过消除α-葡聚糖合成(最重要的副反应)，对于瑞鲍迪甙A得到了较高的糖基化收率。在200mM蔗糖和1.5小时孵育时间下，这些突变体对瑞鲍迪甙A具有与GTF180-ΔN以及突变体Q1140E和S1137Y类似或甚至更高的转葡萄糖基化活性。如使用瑞鲍迪甙A作为受体分子所观察到的，突变体Q1140E也主要将甜菊苷转化成为一种单-α-葡萄糖基化的产物。因此，在一个实施方案中，突变体酶包括突变L981A和/或W1065L、W1065E、W1065Q、W1065F。
本文还提供了具有期望的转糖基化活性的罗伊氏乳杆菌菌株180的葡聚糖蔗糖酶GTF180或其突变体以增强或改善甜菊醇糖苷的感官性质的用途，例如，以完全增强甜菊醇糖苷(优选瑞鲍迪甙A或甜菊苷)的甜味，部分去除其苦味和/或余味。
在用于修饰瑞鲍迪甙A的取代突变体的筛选中，观察到包含不能使瑞鲍迪甙A进行α-葡萄糖基化的非活性突变体或酶的反应混合物由于瑞鲍迪甙A及时地逐渐沉淀而变浑浊，而那些包含能够使瑞鲍迪甙A进行α-葡萄糖基化的活性酶的反应混合物保持澄清。不希望受理论束缚，将葡萄糖部分添加至瑞鲍迪甙A提高了其溶解度。这种现象允许通过评估反应混合物的外观来快速选择活性突变体，优选在最终瑞鲍迪甙A的浓度至少为50mM的情况下孵育约6小时后以及在最终瑞鲍迪甙A的浓度至少为30mM的情况下孵育约16小时后。例如，当反应在微量滴定板或其他类型的透明容器中进行时，仅目测检查便可足以鉴定一种或多种突变体，以进一步表征。
因此，本发明还提供了鉴定能够修饰甜菊醇糖苷、优选瑞鲍迪甙A或甜菊苷的葡聚糖蔗糖酶的方法，包括以下步骤：
a)生成一组罗伊氏乳杆菌菌株180的GTF180的突变体；
b)在允许甜菊醇糖苷糖基化的条件下，在存在葡萄糖供体的情况下，将各个突变体与甜菊醇糖苷在水性反应混合物中孵育；以及
c)通过确定至少部分防止反应混合物变浑浊的能力，选择只少一种能够修饰甜菊醇糖苷的罗伊氏乳杆菌180的GTF180的突变体；
d)任选地，进一步确定修饰的甜菊醇糖苷的结构，并且选择能够修饰所述甜菊醇糖苷的C-19位点的罗伊氏乳杆菌180的突变体GTF180。
优选地，由截短的GTF180酶，例如缺乏N-末端可变结构域的截短的变体(GTF180-ΔN)和/或缺乏N-末端和C-末端结构域V片段的截短的变体(GTF180-ΔNΔV)起始，以制备突变体组。
在一个实施方案中，突变体组包含不同的取代突变体，优选非保守取代突变体。例如，筛选方法包括产生一组在Q1140位置有不同的(非保守)氨基酸取代的GTF180(截短)突变体，并且对所有的Q1140突变体测试甜菊醇糖苷α-葡萄糖基化。参见下文的图8。
本发明的另一方面涉及可通过本发明的方法获得的修饰的甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，使用至少一个葡萄糖残基修饰甜菊醇糖苷。在一个具体的方面，修饰涉及经由(α1→6)糖苷键(β-异麦芽糖)添加一个葡萄糖(图5A)。在另一个具体的方面，修饰涉及经由(α1→6)糖苷键在β-连接的葡萄糖添加葡萄糖基-葡萄糖单元。在所述单元内，葡萄糖残基可以经由(α1→6)糖苷键(异麦芽糖)或(α1→3)糖苷键(黑曲霉糖)连接(图5B和图5C)。
本发明优选地提供在甜菊醇糖苷的C-19位点修饰的甜菊醇糖苷。更优选地，修饰的甜菊醇糖苷仅在该甜菊醇糖苷的C-19位点修饰。例如，在一个实施方案中，本发明提供了修饰的甜菊醇糖苷，其仅在甜菊醇糖苷的C-19位点用单个α-葡萄糖残基修饰。在一个实施方案中，使用单个(α1→6)连接的葡萄糖修饰C-19位点。
本发明示例性的修饰的甜菊醇糖苷选自：
(i)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯(图5A)
(ii)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯(图5B)
(iii)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯(图5C)。
为了确定在瑞鲍迪甙A的19-O-葡萄糖基部分的(α1→6)葡萄糖基化对瑞鲍迪甙A的甜味和苦味的影响，进行了味道评估，其中将新型瑞鲍迪甙A葡萄糖苷之一，即(i)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯，与瑞鲍迪甙A比较。为此，在盲法测试中，要求12名能够感觉到甜菊醇糖苷的苦味的测试人员以0至5的评级评价甜味和苦味，得分为0表明无甜味/无苦味，并且得分为5表明非常甜/非常苦。观察到了明显的趋势，与瑞鲍迪甙A相比，显示出新型瑞鲍迪甙A葡萄糖苷具有增强的且更自然的甜味以及减弱的苦味(图7)。
还提供了本发明的修饰的甜菊醇糖苷作为低血糖甜味剂的用途，以及使消耗品变甜的方法，包括使所述消耗品中包含有效量的修饰的甜菊醇糖苷，任选地结合有其他可食用的成分、甜味剂和/或甜味增强剂。
另一方面涉及包含至少一种本文提供的修饰的甜菊醇糖苷的增甜组合物。在某些实施方案中，甜味剂组合物是适合用于烹饪或由消费者加入饮料或其他食品的餐桌甜味剂。此类甜味剂组合物可以包装并且散装出售。或者，在某些实施方案中，甜味剂组合物以单份包形式包装，以便在消费者使用时打开。根据某些实施方案，甜味剂组合物中的至少一种其他可食用成分可以是，例如，食用香料(例如，低于、处于或略高于其阈值感知水平的食用香料，或者以容易被消费者感知的量的食用香料)、流动剂、着色剂、膨化剂(在使用了所述甜味剂组合物的饮料和其他食品中提供操作的容易性和/或改善的口感)和/或其他适合的成分，或者它们中的任意两种或更多种的组合。在某些实施方案中，膨化剂可以通过增强由甜味剂组合物提供的靠前的甜味来提供改善的甜味分布。在某些实施方案中，至少一种其他可食用成分是赤藓醇、D-塔格糖、和/或D-阿洛酮糖，例如甜味剂组合中包含那些成分中的两种或更多种的组合，例如赤藓醇与D-塔格糖，或者赤藓醇与D-阿洛酮糖，或者D-塔格糖与D-阿洛酮糖。
还提供了消耗品，其包含至少一种本发明的修饰的甜菊醇糖苷，任选地结合有另一种甜味剂和/或甜味增强剂。例如，消耗品选自饮料、食料、口腔护理产品、烟草产品、药物产品和营养产品。
通常，食料包含增甜量的本发明的修饰的甜菊醇糖苷，以及至少一种其他的食品成分。如本文使用的，术语“食品成分”意指任何适于提供味道、营养、颜色、膨松性(bulk)、质地或其他的口感、稳定性、酸性、稠度、抗结块等的可食用物质，或者这些物质中任意两种或更多种的组合。如下文进一步讨论的，适合用于本文公开的新型食品产品的示例性食品成分包括谷物组分；碳酸化或非碳酸化的水；其他甜味剂，例如，增甜量的至少一种营养甜味剂；调味剂；酸化剂；着色剂；膨化剂等。在某些示例性(即，非限制性)实施方案中，食品产品以单份的量包装。本公开的此方面的食品产品包括，例如，固体食品、凝胶、饮料等。
适合的甜味剂和甜味增强剂的实例包括蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆、玉米糖浆、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖和糖精，以及其混合物；三叶苷；橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷；柚皮苷二氢查耳酮；罗汉果苷，包括罗汉果苷V、Luo Han Guo提取物、甜茶甙、悬钩子属提取物、菝葜苷、异罗汉果苷V、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果新苷；无患子倍半職苷(mukurozioside)lib；(+)-贺兰甜精(hernandulcin)；4β-羟基贺兰甜精；白云参苷；弗米索苷I；泻根甜苷；bryoside bryonoside；相思子苷A-E；青钱柳苷A；cyclocaryoside I；合欢皂苷A-E；甘草皂苷；阿拉伯甘草皂苷(araboglycyrrhizin)；巴西甘草甜素l-V；蝶卡苷A和B；欧亚水龙骨甜素；聚宝多苷(polypodoside)A和B；夜来香苷(telosmoside)A8-18；叶甘素；huangqioside E新落新妇苷；莫那甜；3-乙酰氧基-5,7-二羟基-4'-甲氧基黄烷酮；2R,3R-(+)-3-乙酰氧基-5,7,4'-三羟基黄烷酮；(2R.3R)-二氢槲皮素3-O-乙酸酯；二氢槲皮素3-O-乙酸酯4-甲基醚；甜味蛋白；仙茅甜蛋白；马槟榔甜蛋白；应乐果甜蛋白；neoculin；潘塔亭(pentadin)；奇异果甜蛋白；以及其组合。一些以上列出的化合物是已知的甜味增强剂以及甜味剂。当用作甜味增强剂时，它们通常在其甜味检测阈值以下使用。
饮料包括，例如，原汁饮料(例如，包含一种或多种水果汁和/或一种或多种蔬菜汁的饮料)、水化饮料、碳酸软饮料(CSD)、冷冻饮料、冷冻碳酸饮料、低热量饮料或其他减少卡路里的饮料等。本领域技术人员将认识到，在这些类别之间存在重叠。如本文使用的，“减少卡路里的饮料”意指与富含卡路里的饮料(通常是之前已经商业化的富含卡路里饮料，例如其中基本上所有甜味来自营养性甜味剂，例如蔗糖、HFCS等)相比，每8oz.份量的饮料减少至少25％卡路里的饮料。在至少一些实施方案中，与富含卡路里的饮料相比，减少卡路里的饮料每8oz.份量减少约50％的卡路里。如本文使用的，“低卡路里饮料”每8oz.份量的饮料具有少于40卡路里。如本文使用的，“零卡路里”或“低热量(diet)”意指每份(例如每8oz.)饮料具有少于5卡路里。
根据另一个方面，提供饮料产品，其包含：水；以及包含至少一种酸的酸化剂组分；包含至少一种调味成分的调味剂组分；以及包含增甜量的修饰的甜菊醇葡萄糖苷、并且任选地包含增甜量的一种或多种其他甜味剂的甜味剂组分。在本方面的饮料产品的某些示例性实施方案中，饮料产品是具有高于3.0且低于4.0的pH的即饮型饮料。此类即饮型饮料可以是，例如，水化饮料，也被称为运动饮料，其含有添加的电解质。在其他示例性实施方案中，即饮型饮料是碳酸软饮料，例如减少卡路里的可乐饮料或低热量可乐饮料。在本方面的饮料产品的某些示例性实施方案中，饮料产品是适于稀释的糖浆，例如，通过与碳酸化或非碳酸化的水以1加5投料来产生即饮型饮料。
根据某些实施方案，本发明的修饰的甜菊醇糖苷提供了消耗品的总体增甜的至少10％，所述消耗品例如本公开的低热量可乐糖浆、即饮型低热量可乐饮料、另一种饮料产品、或另一种食品产品。根据某些实施方案，其提供了总体增甜的至少20％、或者总体增甜的至少30％、或者总体增甜的至少40％、或者总体增甜的至少一半、或者总体增甜的至少60％、或者总体增甜的至少70％、或者的总体增甜的至少80％、或者总体增甜的至少90％。任选地每一种另外的甜味剂成分是有机甜味剂。任选地每一种甜味剂成分是天然甜味剂。任选地每一种甜味剂成分是甜菊醇糖苷。任选地每一种成分是有机和/或天然的成分，使得减少卡路里的(例如，低热量)碳酸可乐饮料产品相应地是有机和/或天然的饮料产品。
优选地，消耗品包含至少一种选自图5所示的那些物质的修饰的瑞鲍迪甙A。
例如，饮料可以包含浓度约30ppm–约750ppm(例如，约50ppm直至350ppm)的修饰的瑞鲍迪甙A。然而，添加的量主要取决于期望的甜味水平，并且可以取决于其他成分的存在。例如，果汁包含糖并且由此有助于甜味水平。在一个实施方案中，修饰的瑞鲍迪甙A是添加至调味饮料的唯一的甜味剂。在另一个实施方案中，修饰的瑞鲍迪甙A可以结合其他的甜味剂和/或甜味增强剂。在优选的实施方案中，修饰的瑞鲍迪甙A结合罗汉果苷，如罗汉果苷V。
附图说明
图1.甜菊苷、瑞鲍迪甙A和瑞鲍迪甙B、以及甜菊醇双糖苷的化学结构。[Glc1]等表示NMR归属的葡萄糖残基。
图2.瑞鲍迪甙A和蔗糖浓度对使用0.12mg/mL纯化的酶的转葡萄糖基化(实心柱)和水解(阴影柱)活性的影响：(A)GTF180-ΔN，(B)GTF180-ΔN突变体S1137Y以及(C)GTF180-ΔN突变体Q1140E。
图3.10U/mL GTF180-ΔN(WT)、突变体S1137Y和突变体Q1140E与50mM瑞鲍迪甙A(*)和1M蔗糖(**＝RebAG1)的4小时孵育的NP-HPLC产物分布。
图4.瑞鲍迪甙A利用(虚线)以及使用10U/mL酶通过α-葡萄糖基化的RebAG1形成(实线)的时间进程：(A)GTF180-ΔN，(B)GTF180-ΔN突变体S1137Y以及(C)GTF180-ΔN突变体Q1140E，分别显示出55％、73％和96％的转化率。
图5.通过GTF180-ΔN和突变体GTF180-ΔN S1137Y以及GTF180-ΔN Q1140E产生的修饰的瑞鲍迪甙A葡萄糖苷的结构：(A)RebAG1＝13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯，(B)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯，(C)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯，(D)在D2O中于334K下记录的GTF180-ΔN(a)和突变体Q1140E(b)以及S1137Y(c)的RebAG1产物的500-MHz 1H NMR光谱。
图6.在存在和不存在20U/ml Q1140E的情况下，将50mM甜菊苷和50mM瑞鲍迪甙A与100mM蔗糖进行1小时孵育获得的产物在用1M NaOH碱皂化之前和之后的TLC分析。
图7.多种甜味剂的感官评价(n＝12)：甜菊苷(250mg/L)，瑞鲍迪甙A(300mg/L)，RebAG1(350mg/mL)，以及蔗糖(60g/L)。评价的味道属性是甜味(阴影柱)和苦味(实心柱)。得分0＝无甜味/无苦味，得分5＝非常甜/非常苦。
图8.50mM瑞鲍迪甙A和200mM蔗糖与GTF180-ΔNΔV(Q)、GTF180-ΔNΔV Q1140氨基酸取代突变体Q1140G/S/I/V/W/D/M/C/E/L/K/T/P/R/F/N/Y、或GTF180-ΔN Q1140E(E*)进行2小时孵育获得的产物的TLC分析。
图9.来自罗伊氏乳杆菌180的葡聚糖蔗糖酶GTF180的氨基酸序列。组(A)全长蛋白质；组(B)N-末端截短的突变体GTF180-ΔN；组(C)N-末端截短的且结构域V截短的突变体GTF180-ΔNΔV。
实验部分
以下的部分例示了有利地使用罗伊氏乳杆菌菌株180的葡聚糖蔗糖酶GTF180-ΔN及其衍生的单氨基酸取代突变体使瑞鲍迪甙A进行α-葡萄糖基化。GTF180-ΔN和衍生的突变体酶特异性地在C-19位点使瑞鲍迪甙A葡萄糖基化，引入了(α1→6)糖苷键和(α1→3)糖苷键，其对于通过唾液中存在的淀粉水解酶的水解具有抗性。若干GTF180-ΔN突变体比GTF180-ΔN对瑞鲍迪甙A表现出高得多的转葡萄糖基化活性。有趣的是，一种突变体，Q1140E，显示出接近100％的瑞鲍迪甙A转化率，并且主要在瑞鲍迪甙A的C-19位点连接单个的(α1→6)-葡萄糖。
所产生的新型瑞鲍迪甙A葡萄糖苷是非常有趣的，其特异性地在C-19β-连接的葡萄糖处携带一个和两个(α1→6)-连接的葡萄糖单元。单-α-葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A产物(RebAG1)，与瑞鲍迪甙A相比，具有增强的且更自然的甜味以及减弱的苦味。本发明的这些改善的新型甜菊醇糖苷作为功能性食品成分引起了很大的兴趣。
材料和方法
甜菊醇糖苷底物
瑞鲍迪甙A(2)和甜菊苷(1)从Sigma Aldrich购得。
葡聚糖蔗糖酶
所有的葡聚糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶如Meng等人(2014)所描述地产生，并且如Kralj等人(2004b)所描述地纯化。GTF180-ΔN是GTF180全长蛋白质的117kDa N-末端截短(741个残基)片段(Kralj等人，2004a)。在Meng等人(2015a)中描述了由GTF180酶的氨基酸794–1636组成的截短突变体GTF180-ΔNΔV的构建。由van Leeuwen等人(2009)、Meng等人(2015a)以及Meng等人(2015b)产生了GTF180-ΔN突变体酶。如Meng等人(2015b)所描述产生截短突变体GTF180-ΔNΔV中的氨基酸取代。
酶活性测定
在37℃下，在25mM乙酸钠(pH 4.7)；1mM CaCl2；以及0.12mg/mL纯化的GTF180-ΔN酶或GTF180-ΔN突变体酶中含有或不含有50mM瑞鲍迪甙A的情况下，在100mM和1000mM蔗糖下进行酶活性测定。每30秒取100μL的样品，持续4min，并且通过用20μL1000mM NaOH孵育30min来立即终止反应。将灭活的样品在去离子水中稀释两次，并且在10μL经稀释的样品中，通过使用如之前描述的(Mayer 1987)己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/磷酸葡萄糖异构酶测定(Roche)监测NADP的还原来酶促测定葡萄糖和果糖浓度。从蔗糖释放葡萄糖和果糖的定量测定允许对葡聚糖蔗糖酶的活性的评估(van Geel-Schutten等人，1999)。果糖释放对应于总酶活性，而葡萄糖释放对应于水解活性。可以通过从总活性中减去水解活性来得到转糖基化活性。将一个单位(U)的酶定义为在37℃下于含有25mM乙酸钠(pH 4.7)、1mMCaCl2和1000mM蔗糖的反应混合物中每分钟产生1μmol单糖所需的酶的量。
甜菊醇糖苷的酶促糖基化
在37℃下，在25mM乙酸钠(pH 4.7)、1mM CaCl2、50mM至1,000mM蔗糖、50-100mM甜菊醇糖苷以及2U/mL-30U/mL纯化的GTF180-ΔN酶或GTF180-ΔN突变体酶中进行孵育反应，持续15min至24小时。通过加热灭活(100℃持续15min)终止反应。将250uL灭活样品与1000ul的10mM邻苯二酚(内标)混合，然后通过使用Strata-X 33u聚合物反相柱(Phenomenex)的固相萃取来纯化。为了HPLC分析，将20μL经纯化的样品注射在Luna 10μmNH2色谱柱(250mm x 4.6mm；Phenomenex)上。以1mL/min的流速，在梯度洗脱条件下分离反应组分，所述梯度洗脱条件以2min 70％溶剂A的等度步骤开始，然后历经9min从70％至55％溶剂A的线性梯度(溶剂A＝乙腈；溶剂B＝0.025％乙酸)。瑞鲍迪甙A以及单-α-葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A产物的浓度通过NP-HPLC、使用它们相应的1.56mM至50mM的校正曲线来测定。使用邻苯二酚作为内标将所有数据归一化。反应的标准偏差小于5％。所有的NP-HPLC分析在装备有Endurance自动进样器(Spark Holland,The Netherlands)的UltiMate 3000色谱系统(ThermoFischer Scientific,Amsterdam,The Netherlands)上进行。
α-葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A产物的定量合成
为了使用GTF180-ΔN及其衍生突变体进行α-葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A产物的定量合成，在5mL 25mM乙酸钠(pH 4.7)、1mM CaCl2、50mM甜菊醇糖苷、连同两批1,000mM当量的蔗糖供体(t＝0和3h)(总计2,000mM蔗糖)中，使用10U/mL酶在37℃下进行孵育，持续24小时。通过使用Strata-X 33u聚合物反相柱(Phenomenex)的固相萃取，从孵育混合物纯化产物。在Luna 10μm NH2半制备型色谱柱(250mm x 10mm,Phenomenex)上分离产物，并且以4.6mL/min的流速手动收集，以2min 80％溶剂A的等度步骤开始，然后历经38min从80％至50％溶剂A的线性梯度(溶剂A＝乙腈；溶剂B＝0.025％乙酸)。将收集的级分的溶剂在氮气流下蒸发，并且将干燥的材料溶解于去离子水。
薄层色谱
将样品点在TLC板(Merck Kieselgel 60F254,20x20cm)上，将其用正丁醇:乙酸:水＝2:1:1展开。通过苔黑酚/硫酸染色使斑点可视化，并且与同时运行的标准化合物比较。
碱皂化
为了释放19-O-连接的糖基部分，将4mg的每一种甜菊醇糖苷产物溶解于1M NaOH(1mL)并且在80℃下加热2.5h。
质谱
使用装备有氮激光器(337nm,3ns脉冲宽度)的AximaTM质谱仪(Shimadzu KratosInc.,Manchester,UK)进行基体-辅助激光脱附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)实验。使用反射器模式以5000FWHM分辨率和延迟提取(450ns)记录了正离子模式光谱。加速电压为19kV，栅极电压为75.2％。镜面电压比为1.12，并且采集质量范围是200Da-6000Da。通过将1μL样品溶液与1μL 10％2,5-二羟基苯甲酸在作为基质溶液的70％ACN中混合来制备样品。
NMR光谱
在Bruker DRX-500光谱仪(Bijvoet Center,Department of NMR Spectroscopy,Utrecht University)上以334K的探头温度在D2O中记录分辨率增强的1D/2D 500-MHz 1HNMR光谱。使用Bruker Topspin 2.1来完成数据采集和加工。在分析前，将样品在D2O(99.9原子％D,Cambridge Isotope Laboratories,Inc.,Andover,MA)中交换两次，将中间体冻干，然后溶解于0.6mL D2O中。通过对1D NMR实验应用WEFT(水峰消除傅立叶变换)脉冲序列，并且通过在2D实验中于驰豫延迟期间1s的预饱和来实现氘化水信号(在4.40ppm的HOD)的抑制。使用MLEV-17(由Levitt等人设计的复合脉冲(1982))混合序列，以40ms-200ms的自旋-锁定时间来记录2D TOCSY光谱。使用标准Bruker XWINNMR软件以200ms的混合时间来记录2D ROESY光谱。载波频率设置在光谱的低场边界以便使自旋-锁定期间的TOCSY转移最小化。在1H FID的采集期间不去耦的情况下记录天然丰度2D 13C-1HHSQC实验(1H频率500.0821MHz，13C频率125.7552MHz)。对于1D光谱通过洛伦兹-高斯转换，或者对于2D谱通过乘以由π/(2.3)偏移的平方-钟型函数项来进行光谱的分辨率增强，并且当必要时，进行五阶多项式基线校正。化学位移(δ)以ppm表示，参考内部的丙酮(δ2.225对于1H，并且δ31.07对于13C)。
瑞鲍迪甙A的新型α-葡萄糖基化产物的感官评价
进行了味道评估，其中将瑞鲍迪甙A的新型α-葡萄糖基化产物(350mg/L)与蔗糖(60g/L)、瑞鲍迪甙A(300mg/L)和甜菊苷(250mg/L)比较。在盲法测试中，要求12名能够感觉到甜菊醇糖苷的苦余味的测试人员以0至5的评级评价甜味和苦味，0表明无甜味/无苦味，而5表明非常甜/非常苦。
结果
筛选用于瑞鲍迪甙A的α-葡萄糖基化的葡聚糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶
将主要来自于罗伊氏乳杆菌的超过100种葡聚糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶野生型和突变体酶对于瑞鲍迪甙A的α-葡萄糖基化进行筛选。为此，将酶在50mM瑞鲍迪甙A(图1)和1000mM蔗糖中孵育3小时。反应混合物的HPLC和TLC分析显示，仅GTF180-ΔN酶和GTF180-ΔN的突变体酶能够使瑞鲍迪甙A葡萄糖基化(表1)。有趣的是，两种单一GTF180-ΔN突变体(S1137Y和Q1140E)，作为接近于稳定残基D1136的过渡状态的单氨基酸取代(van Leeuwen等人，2009)，比GTF180-ΔN对瑞鲍迪甙A表现出好得多的转葡萄糖基化活性。GTF180-ΔN突变体L981A和W1065L(Meng等人，2015b)同样能够使瑞鲍迪甙A进行α-葡萄糖基化(表1)，但几乎不显示出聚合(即，由蔗糖形成低聚糖和葡聚糖)活性(数据未示出)。在下游处理过程中，即从单糖和二糖、低聚糖和葡聚糖中对α-葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A产物的纯化，这是明显优点。通过消除α-葡聚糖合成(最重要的副反应)，对于瑞鲍迪甙A得到了更高的糖基化收率。在较低的蔗糖浓度(200mM)时，这些突变体对瑞鲍迪甙A具有与GTF180-ΔN以及突变体S1137Y和Q1140E类似的或甚至更高的转葡萄糖基化活性(数据未示出)。
为优化对于瑞鲍迪甙A的葡萄糖基化的反应条件，确定了瑞鲍迪甙A和蔗糖对于GTF180-ΔN以及突变体S1137Y和Q1140E的转葡萄糖基化活性的影响。为此，在含有和不含有50mM瑞鲍迪甙A的情况下，在使用100mM和1000mM蔗糖下进行酶活性测定。所有的三种酶在低蔗糖浓度时水解更多(图2)。两种突变体酶在100mM蔗糖时几乎完全水解。然而，当将50mM瑞鲍迪甙A添加至反应或者当将蔗糖浓度升高至1000mM时，所有三种酶的转葡萄糖基化活性显著提高，在1M蔗糖和50mM瑞鲍迪甙A时显示出最高的总活性和最高的转葡萄糖基化与水解的比。更详细地，这些反应条件用于通过GTF180-ΔN以及突变体S1137Y和Q1140E进行瑞鲍迪甙A的α-葡萄糖基化。
与通过GTF180-ΔN使约55％的瑞鲍迪甙A葡萄糖基化相比，当使用50mM瑞鲍迪甙A、1000mM蔗糖以及10U/mL酶时，突变体S1137Y和Q1140E分别使约73％和约96％的瑞鲍迪甙A葡萄糖基化(图4)。令我们意外的是，突变体Q1140E主要产生单葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A(RebAG1)，由50mM瑞鲍迪甙A得到约35mM RebAG1(图3和图4)。突变体S1137Y产生了与GTF180-ΔN酶类似量的RebAG1(约13mM)(图3)，但合成了更高量的多糖苷(图3)。
在所有测试的葡聚糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶中，突变体GTF180-ΔN Q1140E显示出了最高的瑞鲍迪甙A葡萄糖基化活性，并且表现出主要将瑞鲍迪甙A进行单葡萄糖基化。因此，除了突变Q1140 E/A/H以外，在突变体GTF180-ΔNΔV中还产生了另外在位置Q1140的氨基酸取代，并且测试了瑞鲍迪甙A葡萄糖基化(图8)。为此，在缓冲液(25mM乙酸钠(pH4.7)、1mM CaCl2)中，将1mg/ml的酶与50mM瑞鲍迪甙A和200mM蔗糖在37℃下孵育2小时。通过TLC分析孵育混合物(图8)。在这些条件下，若干Q1140取代突变体(例如Q1140 F/N/Y)显示出了甚至比突变体Q1140E更高的瑞鲍迪甙A葡萄糖基化，尽管后者(突变体Q1140E)仍然具有最高的单葡萄糖基化收率。一些突变(例如Q1140D)对瑞鲍迪甙A葡萄糖基化具有轻微的负面作用。有趣的是，突变体Q1140R对蔗糖显示出几乎无活性，尽管所述突变几乎不影响瑞鲍迪甙A葡萄糖基化。似乎蔗糖主要用于瑞鲍迪甙A的葡萄糖基化，并且不用于副反应，例如低聚糖形成。
由GTF180-ΔN以及GTF180-ΔN突变体S1137Y和Q1140E产生的瑞鲍迪甙A葡萄糖苷的α-葡萄糖基化产物的分离和表征
参见瑞鲍迪甙A的分子结构(图1)，存在4种Glcp残基(Glc1、Glc2、Glc3和Glc4)，总计14个游离羟基，其可以用作转葡萄糖基化的受体。
GTF180-ΔN将蔗糖转化成低聚糖和多糖，催化Glcp残基在(α1→3)-键和(α1→6)-键中的转葡萄糖基化(van Leeuwen等人，2008)，瑞鲍迪甙A中存在3个可能的(1→3)位点和4个可能的(1→6)位点用于Glc残基的第一次连接。
为了分离瑞鲍迪甙A葡萄糖苷的α-葡萄糖基化产物用于结构表征，使用10U/mL酶与50mM瑞鲍迪甙A和1000mM蔗糖完成孵育。3小时后，将另外的1000mM蔗糖加入反应混合物，并且再孵育21小时。使用半制备型NP-HPLC从反应混合物分离葡萄糖苷。有趣的是，单-α-葡萄糖基化产物的NMR结构分析和甲基化分析显示，GTF180-ΔN以及突变体S1137Y和Q1140E特异性地并且仅在C-19β-连接的葡萄糖处将瑞鲍迪甙A葡萄糖基化，连接(α1→6)-连接的葡萄糖(100％)，得到RebAG1(也参见图5A)。
GTF180-ΔN和突变体S1137Y的二葡萄糖基化的瑞鲍迪甙A产物均为RebAG1的结构用(α1→3)-连接的葡萄糖(约75％)(图5C)或用另一种(α1→6)-连接的葡萄糖(约25％)(图5B)的直链延长。图5D组(a)、(b)和(c)示出了分别由GTF180-ΔN、GTF180-ΔN Q1140E和GTF180-ΔNS1137Y产生的RebAG1的500-MHz 1H NMR光谱。
为了证实通过GTF180-ΔN经由转葡萄糖基化的额外的Glcp残基的引入仅发生在瑞鲍迪甙A的C-19β-葡萄糖基部分上，使分离的级分经受碱皂化以特异性地水解19-羧基-葡萄糖基酯键(图1和图6)。从瑞鲍迪甙A和瑞鲍迪甙A的α-葡萄糖基化产物得到了完全相同的产物，根据TLC、MALDI-TOF-MS(m/z 826[M+H]+)和NMR光谱，其为在C-19缺失完整的葡萄糖基部分的瑞鲍迪甙A。得到的结构被称为瑞鲍迪甙B(3)(图1)。
通过GTF180-ΔN突变体Q1140E对甜菊苷的C-19-位点特异性α-葡萄糖基化
为商业目的，希望改善整个甜菊醇糖苷叶提取物的甜味并减弱其苦味。因为甜菊苷(干燥叶的约5-10％w/w)是最丰富的，并且是味道最苦的甜菊醇糖苷之一，我们的目的还在于增强甜菊苷的味道特征。因此，也使用GTF180-ΔN及其衍生的取代突变体，以甜菊苷作为受体分子进行葡萄糖基化反应。所有三种酶也能够使甜菊苷α-葡萄糖基化。正如以瑞鲍迪甙A作为受体分子所观察到的，突变体Q1140E主要将甜菊苷转化成单一的单-α-葡萄糖基化产物(数据未示出)。为了确定是否GTF180-ΔN突变体Q1140E也特异性地在C-19位点使甜菊苷葡萄糖基化，使用1M NaOH使由Q1140E产生的甜菊醇葡萄糖苷经受19-羧基-葡萄糖基酯键的碱皂化，以特异性地去除C-19部分。如果Q1140E甜菊醇葡萄糖苷的碱皂化产生甜菊醇双糖苷(4)(图1)(即，甜菊苷减去C-19部分)，则葡萄糖基化特异性地在甜菊苷的C-19位点发生。在甜菊苷与Q1140E的1小时孵育中，在TLC板上可以观察到多重甜菊醇葡萄糖苷(图6)。然而，当用1M NaOH处理孵育混合物时，仅观察到了一个斑点，并且其迁移的高度与甜菊苷阳性对照的皂化处理后形成的产物相同。使用MALDI-TOF分析，检测到了665.59的分子量，对应于甜菊醇双糖苷的钠加成物。这些结果显示出GTF180-ΔN Q1140E也特异性地在C-19β-连接的葡萄糖基部分使甜菊苷α-葡萄糖基化。
新合成的瑞鲍迪甙A的α-葡萄糖基化产物的味道评估
为了确定在瑞鲍迪甙A的19-O-葡萄糖基部分的(α1→6)葡萄糖基化对于甜味和苦味的影响，进行了味道评估，其中将瑞鲍迪甙A的新型α-葡萄糖基化产物之一，RebAG1，与瑞鲍迪甙A比较。为此，在盲法测试中，要求12名能够感觉到甜菊醇糖苷的苦味的测试人员以0至5的评级评价甜味和苦味，0表明无甜味/无苦味，并且5表明非常甜/非常苦。观察到了明显的趋势，与瑞鲍迪甙A相比，显示出新型RebAG1具有增强的且更自然的甜味以及减弱的苦味(图7)。
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Claims (19)
1.酶促地提供修饰的甜菊醇糖苷的方法，所述修饰的甜菊醇糖苷仅在C-19位点被转糖基化，所述方法包括在作为葡萄糖供体的蔗糖以及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)菌株180的葡聚糖蔗糖酶GTF180的突变体的存在下，孵育甜菊醇糖苷底物，其中所述突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶是缺乏N-末端可变结构域的截短的变体GTF180-ΔN、或缺乏N-末端和C-末端结构域V片段的截短的变体GTF180-ΔNΔV，所述截短的变体GTF180-ΔN的氨基酸取代发生在S1137Y、Q1140E、L981A或W1065L，并且所述截短的变体GTF180-ΔNΔV的氨基酸取代发生在Q1140E/F/N/Y，其中所述截短的变体基于GenBank序列AY697430进行编号并且具有期望的转糖基化活性，
其中GTF180-ΔN由残基742-1772构成，并且GTF180-ΔNΔV由氨基酸794–1636构成。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的甜菊醇糖苷由至少一个葡萄糖残基修饰。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述修饰的甜菊醇糖苷由一个或多个葡萄糖经由(α1→6)糖苷键、(α1→3)糖苷键或其组合修饰。
4.如权利要求1所述的方法，其中仅在所述C-19位点由单个葡萄糖残基修饰所述修饰的甜菊醇糖苷。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷底物是瑞鲍迪甙A[13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基酯]，或者甜菊苷(13-{[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基酯)。
6.如权利要求1所述的方法，其中将所述蔗糖以分批的方式添加。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶为GTF180-ΔN的S1137Y、Q1140E、L981A或W1065L突变，或者GTF180-ΔNΔV的Q1140E/F/N/Y突变。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶选自GTF180-ΔNQ1140E、GTF180-ΔNS1137Y、GTF180-ΔN L981A、GTF180-ΔN W1065L、GTF180-ΔNΔVQ1140E、GTF180-ΔNΔVQ1140F、GTF180-ΔNΔVQ1140N和GTF180-ΔNΔVQ1140Y。
9.通过权利要求1至8中任一项所述的方法获得的修饰的甜菊醇糖苷。
10.修饰的甜菊醇糖苷，选自：
(i)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯；
(ii)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯；以及
(iii)13-({β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-]β-D-吡喃葡萄糖基}氧基)对映-贝壳杉-16-烯-19-酸α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯。
11.如权利要求9或10所述的修饰的甜菊醇糖苷作为低血糖甜味剂的用途。
12.增甜组合物，包含至少一种如权利要求9或10所述的修饰的甜菊醇糖苷。
13.消耗品，包含至少一种如权利要求9或10所述的修饰的甜菊醇糖苷。
14.如权利要求13所述的消耗品，选自饮料、食料、口腔护理产品、烟草产品、药物产品。
15.使消耗品变甜的方法，包括使所述消耗品包含有效量的权利要求9或10所述的修饰的甜菊醇糖苷。
16.具有期望的转糖基化活性的罗伊氏乳杆菌菌株180的突变体葡聚糖蔗糖酶GTF180增强甜菊醇糖苷的甜味和/或减弱其苦味的用途，其中所述突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶是缺乏N-末端可变结构域的截短的变体GTF180-ΔN、或缺乏N-末端和C-末端结构域V片段的截短的变体GTF180-ΔNΔV，和/或其中所述突变体GTF180葡聚糖蔗糖酶为GTF180-ΔN的S1137Y、Q1140E、L981A或W1065L突变，或者GTF180-ΔNΔV的Q1140E/F/N/Y突变，
其中GTF180-ΔN基于GenBank序列AY697430进行编号并且由残基742-1772构成，并且GTF180-ΔNΔV基于GenBank序列AY697430进行编号并且由氨基酸794–1636构成。
17.如权利要求16所述的用途，其完全或部分地去除甜菊醇糖苷的苦味和/或余味。
18.鉴定能够修饰瑞鲍迪甙A的葡聚糖蔗糖酶的方法，包括以下步骤：
a)产生罗伊氏乳杆菌菌株180的GTF180的取代突变体的组；
b)在允许所述瑞鲍迪甙A的糖基化的条件下，在水性反应混合物中存在葡萄糖供体的情况下，将每一种突变体与瑞鲍迪甙A孵育；以及
c)通过确定突变体至少部分地防止所述反应混合物变浑浊的能力，选择至少一种能够修饰所述瑞鲍迪甙A的罗伊氏乳杆菌180的GTF180的突变体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述方法还包括确定所述修饰的瑞鲍迪甙A的结构，并且选择能够修饰所述瑞鲍迪甙A的C-19位点的罗伊氏乳杆菌180的突变体GTF180。
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