CN113301810B - 甜菊醇糖苷的转葡糖基化方法及其甜菊醇糖苷组合物 - Google Patents
甜菊醇糖苷的转葡糖基化方法及其甜菊醇糖苷组合物 Download PDFInfo
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Abstract
一种用于甜菊醇糖苷的转葡糖基化方法和其甜菊醇糖苷组合物。甜味剂组合物包含至少95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷。
Description
技术领域
本发明涉及用于天然甜味剂领域的甜菊醇糖苷组合物的制备,更具体地涉及用于甜菊醇糖苷(steviol glycoside)的转葡糖基化(transglycosylation)方法和由该方法制备的甜菊醇糖苷组合物,并且进一步涉及它们在各种食品和饮料、化妆品和药物产品中作为低热量甜味剂和风味改良剂(flavor modifier)的用途。
背景技术
高甜度甜味剂的甜度是蔗糖的许多倍。它们基本上是无热量的并且广泛用于制造降低热量型食品和糖尿病患者食品。它们中的一些还具有各种体系中的风味改良特性。
甜味剂绝不是糖的简单复制品。它们无法复制食品制造商用来控制其产品的颜色、香气、质地和保质期的糖的广泛功能特性;这限制了它们在许多产品中的应用。一些甜味剂会对味道产生不利影响,而另一些甜味剂在储存或烹饪时不稳定;有些未能通过人类食用的安全试验。然而,与糖相比,甜味剂可能具有一些成本和功能优势。在软饮料行业中,在允许使用和生产它们的国家以及在糖价估价过高的国家,各种糖和非糖甜味剂之间的竞争非常激烈。
目前全世界大约有十二种高甜度甜味剂在使用。这些是安赛蜜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、甘草甜素、新橙皮苷二氢查尔酮(Neo-DHC)、糖精、三氯蔗糖、索马甜、纽甜、罗汉果苷和各种甜菊醇糖苷,例如甜菊苷(stevioside)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)和它们的混合物。
甜味剂可以分为几代。以甜蜜素、甘草甜素和糖精为代表的第一代甜味剂在食品应用中历史悠久。第二代甜味剂包括安赛蜜、阿斯巴甜、Neo-DHC和索马甜。阿力甜、纽甜、三氯蔗糖、甜菊苷和Reb A属于第三代甜味剂。
高甜度甜味剂在全球范围内被使用。最常用的是阿斯巴甜、甜蜜素和糖精。安赛蜜、甘草甜素和甜菊苷次之。已知阿力甜、NHDC和索马甜的消耗量非常小。
另一方面,“天然的(natural)”和“有机的”食品及饮料已经成为食品行业的“最热门领域(hottest area)”。消费者的愿望、食品技术的进步、将饮食与疾病和疾病预防联系起来的新研究的结合,为通过饮食和生活方式来解决公共卫生问题创造了前所未有的机会。
越来越多的消费者意识到可以通过改善其目前的健康和/或防范未来的疾病来控制其健康。这创造了对具有增强特性和相关健康益处的食品的需求,特别是向“整体健康解决方案(whole health solutions)”生活方式发展的食品和消费市场趋势。术语“天然的(natural)”在甜味剂界是非常感性的词语,连同“全谷物(whole grains)”、“心脏健康(heart-healthy)”和“低钠(low-sodium)”已被确定为关键的信任之一。术语“天然的”与“更健康”密切相关。
在这方面,衍生自甜叶菊(Stevia rebaudiana)的甜味剂具有毋庸置疑的商业价值。
甜叶菊(S.rebaudiana)是菊科(Asteraceae)的多年生灌木,原产于南美洲的某些地区(巴拉圭和巴西)。数百年来,其叶片在巴拉圭和巴西传统上一直被用来为当地的茶和药物增甜。
甜菊糖苷(Stevia)是由一系列甜味的二萜苷(diterpene glycoside)组成的混合物,这些二萜苷都具有单一基团-甜菊醇(steviol),但因其C13和C19位置的碳水化合物残基不同而不同,其含量约为总干重的5%-20%,比蔗糖甜约30-450倍。通常,在甜叶菊叶中发现的四种主要糖苷是杜尔可苷A(Dul A)、莱鲍迪苷C(Reb C)、莱鲍迪苷A(Reb A)和甜菊苷。在甜叶菊提取物中鉴定出的其他糖苷包括Reb B、D、E、F、G、I、H、L、K、J、M、N和Reb O、甜菊醇双糖苷和甜茶苷(图1)。
除了是零卡路里甜味剂外,甜菊醇糖苷还表现出多种药理活性,例如抗高血糖(anti-hyperglycemic)、抗高血压、抗炎、抗肿瘤、止泻、利尿和免疫调节活性,增加胰岛素敏感性,并对血糖和胰岛素水平具有有益作用,即它们可能在食物摄入调节中起作用。高纯度甜叶菊提取物在全球范围内被批准用作甜味剂。
采用水或大量有机溶剂如甲醇和乙醇从甜叶菊植物中回收二萜糖苷的方法描述于美国专利号4,361,697;美国专利号4,082,858;美国专利号4,892,938;美国专利号5,972,120和美国专利号5,962,678中。
单个糖苷(Individual glycoside)可以从甜叶菊生物质提取物中被纯化或通过美国专利中描述的各种方法被合成,例如美国专利4,353,889;美国专利4,381,402;美国专利4,454,290;美国专利7,838,044;美国专利7,807,206;美国专利7,862,845;美国专利申请2006/0083838;美国专利申请2007/0128311;美国专利申请2008/0300402;美国专利申请2010/009985;美国专利申请201110087011;美国专利申请201110070172。
然而,即使高度纯化形式的甜菊醇糖苷也有残留的苦味和余味(aftertaste),这会影响它们的味质(taste characteristic)。使用各种酶进行分子间转葡糖基化会显著增强它们的口感(taste profile)。该反应允许在C13和C19位置添加新的碳水化合物。上述位置中碳水化合物单元的数量决定了组分甜味的质量和程度,如使用各种酶的甜菊苷、Reb A和甜茶苷所证实的那样,例如,在美国专利4,219,571;美国专利4,590,160;美国专利7,838,044;美国专利7,807,206;美国专利7,267,835;美国专利申请2003/0236399;美国专利2006/013429中所描述的。
普鲁兰酶(Pullulanase)、异麦芽糖酶(Lobov S.V.,Jasai R.,Ohtani K.,TanakaO.Yamasaki K.(1991)Enzymatic production of sweet stevioside derivatives:transglycosylation by glucosidases.Agric.Biol.Chem.55:2959-2965),β-半乳糖苷酶(Kitahata S.,Ishikawa S.,Miyata T.,Tanaka O.(1989)Production of rubusosidederivatives by transglycosylation of various
-galactosidase.Agric.Biol.Chem.53:2923-2928)和葡聚糖蔗糖酶(YamamotoK.,Yoshikawa K.,Okada S.(1994)Effective production of glucosyl-stevioside by-1,6-transglucosylation of dextran dextranase.Biosci.Biotech.Biochem.58:1657-1661)已被用作转葡糖基化酶(transglycosylating enzyme),以及普鲁兰多糖、麦芽糖、乳糖和部分水解的淀粉分别用作糖苷残基的供体。需要注意的是,每种酶都有其自己的碳水化合物来源。
甜菊醇糖苷的转葡糖基化也通过各种微生物如嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)(美国专利号4,219,571和7,807,206)产生的环糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)的作用进行,结果形成了聚合度(degree of polymerization)高达10的α-1,4-葡糖基衍生物。
美国专利号4,219,571公开了一种用于生产甜味剂的方法,包括使葡糖基转移酶与甜菊苷在水溶液中反应,从而将甜菊苷转化为α-葡糖基-甜菊苷(α-glycosyl-stevioside),因此通过改变甜菊苷的结构改善甜菊苷的味质(quality of taste)。
美国专利号8,318,232公开了通过与嗜热脂肪芽孢杆菌产生的CGT酶作用,将剩余的麦芽糊精转化成为果糖末端的寡糖,同时使甜菊醇糖苷混合物转葡糖基化的方法。此外,将葡糖基化混合物在大孔树脂上纯化并去离子化至高纯度。该产品可用于各种应用。
使用由普通嗜热放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)和嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halophilus)产生的CGT酶也成功地进行了转葡糖基化(美国专利号7,838,044)。
莱鲍迪苷C(Reb C)在嗜热脂肪芽孢杆菌CGT酶的作用下,以木薯淀粉作为葡萄糖单位来源进行葡糖基化。反应混合物经活性炭处理,去离子化并喷雾干燥。该产品含有至少20%的葡糖基化Reb C、不大于20%的未改性的Reb C和约20%的糊精(美国专利申请2013/0287894)。
莱鲍迪苷B(Reb B)也可以使用木薯淀粉作为葡萄糖单位来源,通过嗜热脂肪芽孢杆菌CGT酶的作用进行葡糖基化。反应混合物用活性炭处理,并且剩余的非葡糖基化Reb B通过调节pH沉淀,并通过过滤除去。将滤液去离子化,用大孔树脂纯化并喷雾干燥。该产品含有约90%的总糖苷,苦味显著降低(美国专利申请2015/0030725)。
类似地,对莱鲍迪苷M(Reb M)进行葡糖基化,产品的口感(taste profile)得到了改善(美国专利申请2016/0316803)。
美国专利申请2015/0305380涉及通过用CGT酶处理甜茶苷和麦芽糊精的混合物来进行甜茶苷的葡糖基化。然而,转葡糖基化程度仅在35-78%的范围内。口感有一些改善。
转葡糖基化反应在微波(microwave)(Cai et al.,2010)和超声(ultrasound)条件(Jaitak et al.,2009;2010)下显著加速。
葡糖基化链的缩短结果可以使口感改善。它可以通过β-淀粉酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(glucoamylase)处理转葡糖基化产物来实现。层析法(chromatographically)纯化的混合物的主要组分是单葡糖基化和二葡糖基化的糖苷(Kasai et al.,1981;Tanaka,1987;Miyata et al.,1991a;1991b;Kitahata,2001;Toyo Sugar Refining,2011;美国专利申请2012/0214751;美国专利申请2017/0303572;美国专利申请2017/0208847;美国专利8,257,948)。
葡糖基衍生物的口感和甜度很大程度上取决于附加的葡糖基衍生物的数量,即α-1,4-葡糖基链的聚合度。α-1,4-葡糖基残基数量的增加改善了味质,但同时降低了甜度水平(Tanaka,1997)。
关于口感,当将C13位的糖苷链构建到四个单元而C19位不变时,会获得最佳结果。将葡糖基单元添加到C19位会导致味质变差。单葡糖基化和二葡糖基化衍生物是优异的糖替代品,在所有的糖苷及其衍生物中具有最佳的味质(Fukunaga et al.,1989)。
许多葡糖基甜菊糖苷产品含有高达20%的残留糊精和杂质,例如各种多酚、黄酮类化合物及其葡糖基衍生物等。这些混合物不具备显著的功能特性,降低了产品中甜菊醇糖苷的含量,并且它们中的一些成分会影响最终制品的口感。
高含量的未改性糖苷会产生更高的甜味效力,但是同时会导致口感劣化。
所得产品的甜度水平在50-120之间,但最终产品含有约20%的麦芽低聚糖。
此外,来自各批次的葡糖基化甜菊醇糖苷(glucosylated steviol glycoside)在没有适当的后处理和纯化时,各批次之间难以将衍生物和未改性糖苷的比例保持在狭窄限度的范围内。因此,它会导致不一致的甜度、甜味曲线和风味改良能力(flavor modifyingability)。
另一方面,可以改变反应条件以显著提高转葡糖基化的程度,从而产生较少量的未改性糖苷。它可以在更短的反应时间下提高葡糖基化的选择性和最终产物的产量。此外,它可以使工业过程的经济贡献最大化。
因此,高度纯化的葡糖基化甜菊醇糖苷具有可控葡糖基化选择性、低含量的未改性糖苷和碳水化合物部分,以及一致的化合物比例的特征,可以满足降低热量、低热量和/或无热量甜味剂的持续需要,并且以甜菊醇糖苷为基础的风味改良剂,具有减少的苦味或/没有苦味,没有不良风味,并且甜度曲线接近天然的热量甜味剂,或这些特性的组合。
发明内容
本发明提供了包含由受控选择性葡糖基化产生的α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷(α-1.4-glucosylated steviol glycoside)的组合物,其中组合物含有低含量的未改性糖苷和残余碳水化合物(carbohydrate)。该组合物具有改进的特性,作为低热量甜味剂和风味改良剂这些特性适用于各种食品和饮料、化妆品和药物产品。
本发明的组合物还可包含其他成分,例如一种或多种填充剂(bulking agent)、调味剂、其他高甜度和/或降低热量和/或有热量甜味剂、维生素、氨基酸和其他味道调节剂(taste modulator)。本发明还涉及将组合物加入食品和饮料、化妆品和药物产品中。
本发明的一个方面提供了一种用于生产α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷的方法。在一个实施方案中,该方法包括:
提供甜菊醇糖苷和葡糖基残基(glucosyl residue)的供体,其中二者按预定比例混合得到反应溶液;
向反应溶液中加入用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶;其中将反应溶液在预定温度下温育预定时间段;
使反应溶液通过填充有足量的特定极性大孔聚合物吸附剂的层析柱;
洗涤柱以除去杂质;和
用有机溶剂溶液洗脱吸附的未改性甜菊醇糖苷和葡糖基化甜菊醇糖苷;和
去除有机溶剂,浓缩,并干燥以产生包含α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷的纯化的甜味剂组合物。
在该方法的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷由下式I表示:
其中化合物名称和相应的R1和R2结构如下所列出:
在该方法的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷选自由以下组成的组:甜菊苷、莱鲍迪苷A(Reb A)、莱鲍迪苷B(Reb B)、莱鲍迪苷C(Reb C)、莱鲍迪苷D(Reb D)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(Reb F)、莱鲍迪苷M(Reb M)、杜尔可苷A、甜菊醇双糖苷和甜茶苷。
在该方法的另一个实施方案中,葡糖基残基的供体是部分水解的淀粉、麦芽低聚糖(maltooligosaccharide)或部分水解的淀粉和麦芽低聚糖的混合物。
在该方法的另一个实施方案中,部分水解的淀粉通过以下方法制备:
将预定量的淀粉悬浮在蒸馏水或去离子水中以获得淀粉悬浮液;和
向淀粉悬浮液中加入用于淀粉液化的CGT酶,并将悬浮液在75-80℃范围内的温度下温育0.5-2小时,优选0.8-1.2小时范围内的时间段。
在该方法的另一个实施方案中,淀粉悬浮液含有浓度在20-40%,优选25-33%范围内的淀粉。
在该方法的另一个实施方案中,用于淀粉液化的CGT酶在1-5单位/克淀粉的范围内,优选2-3单位。
在该方法的另一个实施方案中,液化的淀粉混合物具有10-25,优选12-16的葡萄糖当量(dextrose equivalent)。
在该方法的另一个实施方案中,部分水解淀粉进一步包括:
将液化淀粉混合物冷却至50-55℃;和
以0.3-0.9单位/克淀粉,优选0.5-0.7单位范围内的量加入普鲁兰酶;其中反应持续3-8小时,优选4-6小时的时间段。
在该方法的另一个实施方案中,其中当使用部分水解的淀粉时,在CGT酶和普鲁兰酶不灭活的情况下使用淀粉溶液。
在该方法的另一个实施方案中,其中甜菊醇糖苷与葡糖基残基的供体的预定比例在0.1-1.0w/w的范围内,优选0.5-1.0w/w。
在该方法的另一个实施方案中,其中用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶的量在7-15单位/克淀粉,优选8-11单位的范围内;预定温度在50-75℃的范围内;且预定时间段在18-72小时的范围内。
在该方法的另一个实施方案中,其中在利用添加的用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶的反应进行1-2小时后,向反应混合物中添加一定量的可混溶或不可混溶的有机溶剂以达到2-20v/v%,优选7-15%范围内的最终浓度,且反应在50-75℃下再持续18-72小时。
在该方法的另一个实施方案中,其中有机溶剂是乙醇、甲醇或异丙醇。
在该方法的另一个实施方案中,其中在CGT酶灭活后,将反应溶液用β-淀粉酶在45-50℃下处理5-7小时;其中β-淀粉酶在5-15单位/克总糖苷(total glycoside)的范围内。
在该方法的另一个实施方案中,其中极性大孔聚合物吸附剂是Diaion HP-20、Amberlite XAD-7和Amberlite XAD-4或LX-T28。
在该方法的另一个实施方案中,其中洗涤包括至少三体积的反渗透(RO)水、至少两体积的0.3-0.5%的NaOH、至少三体积的RO水、至少两体积的8-10%的乙醇、至少两体积的0.3-0.5%的HCl,然后用RO水洗涤至pH 5.5-7.0。
在该方法的另一个实施方案中,其中洗脱是用2-3体积的52-70%的乙醇。
本发明的另一方面提供了一种甜菊醇糖苷组合物,包含不少于95%的无水的总葡糖基化甜菊醇糖苷(total glycosylated steviol glycoside),其中葡糖基化甜菊醇糖苷由下式II表示:
其中R1=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R2=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R3=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R4=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R5=β-1.2-(Glu)n=0-2;
R6=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R7=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R8=β-1.2-(Glu或Rha)n=0-2;
其中C13-G1为Glu;
C13-G2为β-Glu;β-Xyl或α-Rha;
C19-G1为Glu;
其中Glu为葡萄糖残基;
Xyl为木糖残基;
Rha为鼠李糖残基。
在甜菊醇糖苷组合物的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于5%的残留糊精、不大于10%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于40%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在甜菊醇糖苷组合物的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于4%的残留糊精、不大于8%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于50%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在甜菊醇糖苷组合物的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于3%的残留糊精、不大于6%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于60%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在甜菊醇糖苷组合物的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于3%的残留糊精、不大于4%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于70%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在甜菊醇糖苷组合物的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于2%的残留糊精、不大于2%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于80%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在甜菊醇糖苷组合物的另一个实施方案中,甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于1%的残留糊精、不大于1%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于85%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
本发明的另一方面提供了包含甜味剂组合物的消费品,其中消费品选自由以下组成的组:碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料、零热量饮料、运动饮料、可乐味碳酸软饮料、水果味碳酸软饮料、浆果味碳酸软饮料、调味茶、果蔬汁、果汁饮料、乳制品饮料、酸奶饮料、酒精饮料、粉状饮料、烘焙产品、曲奇、饼干、烘焙混合物、谷物、蜜饯、糖果、巧克力、太妃糖、口香糖、乳制品、调味牛奶、酸奶、调味酸奶、发酵乳、酱油和其他大豆基础产品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉类产品、鱼肉制品、瓶装和罐装食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜、药物或药物制品、化妆品、牙膏、漱口水、止咳糖浆、咀嚼片、喉糖和维生素制品。
在另一个实施方案中,消费品进一步包含选自由以下组成的组的至少一种食品成分:酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、调质剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂及其组合。
本发明的另一方面提供了包含甜味剂组合物的食品、饮料、化妆品或药物产品。
应当理解,前述一般描述和以下详细描述都是示例性和解释性的,并且旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。
附图说明
包括附图用以提供对本发明的进一步理解。附图图示了本发明的实施方案并且与附图说明(the description)一起用于解释本发明的实施方案的原理。
图1显示了已知甜菊醇糖苷的结构。
图2显示了甜菊苷、Reb A、Reb D和Reb M的结构,其中阴影环显示在C4位置(R1-R4)进行转葡糖基化的葡萄糖单元。
图3显示了通过CGT酶作用的甜菊苷和Reb A的α-葡糖基化衍生物的示例性结构。
图4显示了通过CGT酶作用的Reb D的α-葡糖基化衍生物的示例性结构。
图5显示了甜菊醇糖苷和转葡糖基化甜菊醇糖苷的一般结构,其中R1、R3和R6是接受通过CGT酶的转葡糖基化的位置,其余R位置是天然或可能被修饰的位置。如果在R2、R4、R5、R7和R8位置有更多的葡萄糖、木糖或鼠李糖单元,且在C4处为游离羟基,则在该情况下转葡糖基化点的数量将相应增加。
具体实施方式
从下文给出的详细描述中,本发明的优点将变得更加明显。然而,应当理解,详细说明和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方案,仅供举例说明,因为从该详细描述中在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
本发明提供了一种用于生产α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷的方法,其中该方法包括甜菊醇糖苷的转葡糖基化和α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷的纯化。
在环状或线性麦芽低聚糖或淀粉存在下,CGT酶催化分子间转葡糖基化反应以将α-葡糖基单元从碳水化合物转移到甜菊醇糖苷的C13和C19位置(α-l,4-转葡糖基化)。
为了制备本发明实施例中的甜味剂(即,α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷),使用通过HB-Natural Ingredients(HBNI,Hong Kong)公司商业化的甜菊醇糖苷混合物或纯度不低于95%的单一成分的甜菊醇糖苷(individual steviol glycoside)。然而,可以使用通过沉淀、结晶或/和层析法分离以及通过微生物、酶和/或化学合成或者通过它们的组合来产生的各种来源的甜菊醇糖苷。
甜菊醇糖苷可以是甜菊苷、莱鲍迪苷A(Reb A)、莱鲍迪苷B(Reb B)、莱鲍迪苷C(Reb C)、莱鲍迪苷D(Reb D)、莱鲍迪苷E(Reb E)、莱鲍迪苷F(Reb F)、莱鲍迪苷M(Reb M)、杜尔可苷A、甜菊醇双糖苷、甜茶苷,以及在甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)植物中发现的其他甜菊醇糖苷。
现在参照图1,提供了甜菊醇糖苷结构的概述。图2显示了甜菊苷、Reb A、Reb D和Reb M的结构,其中阴影环显示在C4位置(R1-R4)进行转葡糖基化的葡萄糖单元。如图1所示,甜菊醇糖苷的基本结构由式I表示:
其中化合物名称和相应的R1和R2结构如下所列出:
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使用由Novozymes(Denmark)生产的以Turozyme为商品名的CGT酶进行酶转葡糖基化。然而,原则上任何类型的CGT酶可以被应用。
CGT酶可以通过提供令人满意的酶活性和稳定性的任何方法来固定化。
酶可以原样(as is)使用或纯化后使用。
各种来源的淀粉,例如来自小麦、玉米、马铃薯、木薯、大米和西米的淀粉可用作葡糖基残基的供体。
各种麦芽低聚糖也是葡糖基残基的合适供体。麦芽低聚糖可以是线性的、支链的或环状的;示例性的一种包括麦芽糊精和环糊精。
在某些实施方案中,甜菊醇糖苷的转葡糖基化包括提供葡糖基残基的供体和转葡糖基化的甜菊醇糖苷。
获得葡糖基残基的供体的步骤:
在某些实施方案中,葡糖基残基的供体通过使淀粉液化和水解制备。
为了使淀粉液化,将预定量的淀粉悬浮在蒸馏水或去离子水中,将用于淀粉液化的CGT酶添加到悬浮液中,以及升高温度到75-80℃条件下进行淀粉液化0.5-2小时、优选0.8-1.2小时范围内的时间段。
在某些实施方案中,淀粉悬浮液中的淀粉浓度可建立在约20-40%,优选25-33%。
在某些实施方案中,用于淀粉液化的CGT酶的量在1-5单位/克淀粉的范围内,优选2-3单位。
在某些实施方案中,液化淀粉混合物的葡萄糖当量可以在10-25,优选12-16的范围内。
为了水解液化的淀粉混合物,将液化淀粉混合物冷却至50-55℃,并以0.3-0.9单位/克淀粉,优选0.5-0.7单位范围内的量加入普鲁兰酶,并且使反应持续3-8小时,优选4-6小时的时间段。在某些实施方案中,使用Promozyme-400L(Novozymes)。然而,可以使用能够水解淀粉中的α-1.6-键(link,连接)的任何类型的普鲁兰酶。在本发明中使用普鲁兰酶是基于发明人的以下发现:虽然CGT酶不能分解淀粉的1.6-键,但普鲁兰酶的加入增加了淀粉的可利用量(available quantity)和生成的转葡糖基化速率和程度。
在某些实施方案中,葡萄糖单元的供体是麦芽低聚糖;因此,无需进行液化阶段。
在某些实施方案中,葡萄糖单元的供体是部分水解的淀粉和麦芽低聚糖的混合物。
甜菊醇糖苷转葡糖基化步骤:
在某些实施方案中,将甜菊醇糖苷与葡糖基残基的供体以0.1-1.0w/w,优选0.5-1.0w/w范围内的量混合;搅拌混合物直至获得均匀溶液。葡糖基残基的供体可以是部分水解的淀粉、麦芽低聚糖或它们的混合物。在某些实施方案中,在不灭活CGT酶和普鲁兰酶的情况下使用淀粉溶液。
在某些实施方案中,将用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶以7-15单位/克淀粉,优选8-11单位范围内的量添加到甜菊醇糖苷和葡糖基残基的供体的溶液中,并在50-75℃下温育18-72小时。
在某些实施方案中,添加用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶的反应进行1-2小时后,将可混溶或不可混溶的有机溶剂如乙醇、甲醇或异丙醇等以一定量添加到反应混合物中,以达到2-20v/v%,优选7-15%的最终浓度,并且使反应在50-75℃下再继续18-72小时。
在某些实施方案中,更大量的酶提高了转葡糖基化产物的产量并缩短了酶促反应的持续时间。此外,较高的温度缩短了反应时间。在55℃和60℃下,反应时间分别为46-52小时和30-32小时。在75℃下,反应在12-14小时内完成。
在某些实施方案中,在较高浓度的原料下,即低水含量,转葡糖基化程度较高,反之亦然。在任何情况下,最小化水含量会产生更高程度的转葡糖基化。
在某些实施方案中,将反应混合物在90-95℃下加热15-25分钟以使酶失活。
在某些实施方案中,在包括CGT酶的酶灭活后,用大麦、大豆或微生物来源的β-淀粉酶处理反应混合物。酶的量可以是约5-15个单位/克总糖苷。在45-50℃下反应时间为5-7小时。在反应完成后,通过将反应混合物在例如90-95℃的温度下温育例如20-30分钟使β-淀粉酶失活。
在表1中概述了一些数据。
表1.
在某些实施方案中,转葡糖基化的甜菊醇糖苷的纯化包括以下步骤。
脱色步骤:将所得反应混合物用1.0-4.0w/v%的活性炭处理。
从脱色的反应混合物中纯化转葡糖基化的甜菊苷的步骤:
在某些实施方案中,为了在反应过程中不使用有机溶剂来进行甜菊苷的转葡糖基化,使反应混合物通过填充有足够量的特定极性大孔聚合物吸附剂如Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Corp,Japan)、每小时为0.2-1.0床体积(Bed Volume,BV)的流速范围内的层析柱,随后用至少三体积的反渗透(RO)水、至少两体积的0.3-0.5%的NaOH,至少三体积的RO水,至少两体积的8-10%的乙醇,至少两体积的0.3-0.5%的HCl洗涤树脂,然后用RO水洗涤至pH 5.5-7.0。对吸附的糖苷的解吸附,用2-3体积的52-70%的乙醇以BV=1.0-1.5小时-1进行。能够吸附甜菊醇糖苷及其衍生物的任何类型的大孔树脂都适用于该阶段,例如Amberlite XAD-7和Amberlite XAD-4(通过Rohm&Haas Co.,Germany公司商品化)、LX-T28(Sunresin,China)等。对于糖苷的解吸附,可使用甲醇或其他低链醇代替乙醇。将混合的(combined)糖苷乙醇溶液在20-30℃下用溶液总体积的1.0-3.0%的活性炭连续搅拌处理30-45分钟。将活性炭分离后,通过蒸馏除去乙醇,使用真空蒸发装置或纳滤浓缩并喷雾干燥。可以使用任何其他合适的装置来浓缩和固化混合物。该产品含有大于95%的总甜菊醇糖苷和0.5-5%的残留糊精。未改性的甜菊苷含量约为6-8%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在40-45%的范围内(例如,SAMPLE-1)。
在某些实施方案中,在5-20%乙醇存在下,以SAMPLE-1类似的方法处理甜菊苷转葡糖基化的反应混合物。该产品含有大于95%的总甜菊醇糖苷和0.5-5%的残留糊精。未改性甜菊苷的含量约为3-4%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在45-55%的范围内(例如,SAMPLE-2)。
在某些实验中,为了在反应过程中不使用有机溶剂进行甜菊苷的转葡糖基化,将反应混合物通过一系列填充有足够量的特定极性大孔聚合物吸附剂如Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Corp,Japan)、每小时为0.2-1.0床体积(BV)的流速范围内的层析柱,然后用5-6体积的RO水洗涤树脂。层析柱的数量可为4至12个,优选为5至8个。然后,每根柱分别用至少两体积的0.3-0.5%的NaOH、至少三体积的RO水、至少两体积的8-10%的乙醇、至少两体积的0.3-0.5%的HCl洗涤,然后用RO水洗涤至pH5.5-7.0。对吸附的糖苷的解吸附,用2-3体积的52-70%的乙醇以BV=1.0-1.5小时-1进行。能够吸附甜菊醇糖苷及其衍生物的任何类型的大孔树脂都适用于该阶段,例如Amberlite XAD-7和Amberlite XAD-4(通过Rohm&Haas Co.,Germany公司的商品化产品)、LX-T28(Sunresin,China)等。对于糖苷的解吸附,可使用甲醇或其他低链醇代替乙醇。对每根柱子分别实现解吸附并单独收集。将糖苷的乙醇溶液在20-30℃下用溶液总体积的1.0-3.0%的活性炭连续搅拌处理30-45分钟。在活性炭分离后,通过蒸馏除去乙醇,使用真空蒸发装置或纳滤浓缩并喷雾干燥。可以使用任何其他合适的装置来浓缩和固化混合物。来自第一个柱和最后一个柱的产物分别含有更高量的未改性糖苷和聚合度更深的葡糖基化糖苷(deeper glycosylatedglycoside),将它们循环到转葡糖基化阶段去。中间部分的柱的产品可以混合使用,或者可以单独使用。来自中间柱的组合产物包含大于95%的总甜菊醇糖苷和0.2-1.0%的残留糊精。未改性的甜菊苷含量约为0.5-1.0%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在50-60%的范围内(例如,SAMPLE-3)。
在某些实施方案中,在5-20%的乙醇存在下,以SAMPLE-3类似的方法处理甜菊苷转葡糖基化的反应混合物。来自中间柱的组合产物包含大于95%的总甜菊醇糖苷和0.2-1.0%的残留糊精。未改性甜菊苷的含量约为0.5-1.0%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在55-65%的范围内(例如,SAMPLE-4)。
在另一个实施方案中,甜菊苷的转葡糖基化与SAMPLE-1的转葡糖基化类似地进行,不添加任何有机溶剂。在β-淀粉酶灭活和过滤后,将反应混合物按照SAMPLE-1的情况进行纯化。产物含有大于95%的总甜菊醇糖苷和0.5-5%的残留糊精。未改性的甜菊苷含量约为10-12%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在55-65%的范围内(例如,SAMPLE-5)。
在某些实施方案中,在5-20%的乙醇存在下,与SAMPLE-3类似的方法处理甜菊苷转葡糖基化的反应混合物。该产品含有大于95%的总甜菊醇糖苷和0.5-5%的残留糊精。未改性的甜菊苷含量约为8-10%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在60-70%的范围内(例如,SAMPLE-6)。
在某些实施方案中,SAMPLE-6反应混合物采用类似于SAMPLE-3的方法在串联柱(series of columns)上纯化。来自中间柱的组合产物包含大于95%的总甜菊醇糖苷和0.2-1.0%的残留糊精。未改性的甜菊苷含量约为0.5-1.0%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在75-85%和更大的范围内(例如,SAMPLE-7)。
在某些实施方案中,甜菊苷的转葡糖基化是根据SAMPLE-7的方法使用β-环糊精和/或γ-环糊精以及淀粉作为葡萄糖单元的供体来实现的。来自中间柱的组合产物包含大于95%的总甜菊醇糖苷和0.2-1.0%的残留糊精。未改性甜菊苷的含量约为0.5-1.0%。低聚合度葡糖基化化合物如单葡糖基化化合物、二葡糖基化化合物和三葡糖基化化合物的总量在70-88%和更大的范围内(例如,SAMPLE-8)。
在某些实施方案中,转葡糖基化以类似于SAMPLES-1-8的方法进行,但使用Reb A代替甜菊苷(例如,SAMPLE-9-16)(参见表2)。
在某些实施方案中,转葡糖基化以类似于SAMPLES-1-8的方法进行,但使用Reb D代替甜菊苷(例如,SAMPLE-17-24)(参见表3)。
在某些实施方案中,转葡糖基化以类似于SAMPLES-1-8的方法进行,但使用Reb M代替甜菊苷(例如,SAMPLE-25-32)(参见表4)。
图3显示了通过CGT酶作用的甜菊苷和Reb A的α-葡糖基化衍生物的示例性结构。
图4显示了通过CGT酶作用的Reb D的α-葡糖基化衍生物的示例性结构。
现在参照图5,提供了甜菊醇糖苷和转葡糖基化的甜菊醇糖苷的一般结构,其中R1、R3和R6是接受通过CGT酶作用的转葡糖基化的位置,其余R位点是天然或可能被修饰的位置。如果在R2、R4、R5、R7和R8位置有更多的葡萄糖、木糖或鼠李糖单元,且在C4处带有游离羟基,则在该情况下转葡糖基化点的数量将相应增加。如图5所示,葡糖基化甜菊醇糖苷的基本结构由式II表示:
其中R1=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R2=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R3=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R4=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R5=β-1.2-(Glu)n=0-2;
R6=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R7=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R8=β-1.2-(Glu或Rha)n=0-2;
其中C13-G1为Glu;
C13-G2为β-Glu;β-Xyl或α-Rha;
C19-G1为Glu;
其中Glu为葡萄糖残基;
Xyl为木糖残基;
Rha为鼠李糖残基。
本发明还提供了通过本发明的方法制备的甜味剂组合物。所述甜味剂组合物包含残留糊精、未改性甜菊醇糖苷和不同聚合程度的葡糖基化甜菊醇糖苷。
在某些实施方案中,甜味剂组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于5%的残留糊精、不大于10%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于40%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在某些实施方案中,甜味剂组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于4%的残留糊精、不大于8%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于50%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在某些实施方案中,甜味剂组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于3%的残留糊精、不大于6%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于60%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在某些实施方案中,甜味剂组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于3%的残留糊精、不大于4%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于70%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在某些实施方案中,甜味剂组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于2%的残留糊精、不大于2%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于80%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
在某些实施方案中,甜味剂组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于1%的残留糊精、不大于1%的未改性甜菊醇糖苷,和不小于85%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
对于Reb D和Reb M,它们在没有麦芽低聚糖的情况下不能完全溶解,并且通过过滤分离沉淀物。麦芽低聚糖可以以相对于糖苷1:1mol/mol的量使用。
甜菊醇糖苷葡糖基化衍生物的分离可以通过任何合适的方式实现,例如使用合适的流动相,如线性梯度的乙腈和水的硅胶液相色谱法或3-氨基丙基官能化硅胶或其他合适载体上的制备HPLC,如之前描述的(Starratt A.N.,Kirby C.W.,Pocs R.,Brandle J.E.(2002)Rebaudioside F,a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana.Phytochemistry.59.367-370;Kohda H,Kasi R,Yamasaki K,Murakami K,Tanaka O(1976)New sweetditerpene glucosidefrom Stevia rebaudiana.Phytochemistry(Oxford).15.981-983;Chaturvedula V.S.P.,Upreti M.and I.Prakash(2011)Structures of the novel-glucosyl linked diterpene glycosides from Stevia rebaudiana.Carb.Res.346(13).2034-2038)方法等。
此外,本发明的发明人发现,由于存在溶解性的问题,Reb D、Reb M和Reb B的有效的转葡糖基化仅在麦芽低聚糖存在下是可能的。
由于空间位阻的存在,Reb D只有三个葡萄糖残基,即13-G1、13-G2和19-G2在CGT酶的作用下易于发生α-l,4-转葡糖基化。在Reb M的情况下,葡萄糖单元13-G1、13-G2、19-G1和19-G2比13-G3和19-G3更容易发生转葡糖基化。在Reb A中,葡糖基化主要可以发生在13-G1、13-G2和19-G1。甜菊苷的所有葡萄糖单元都可以以几乎相同的速率进行转葡糖基化(图2)。
在使用淀粉作为葡糖基单元来源的情况下,转葡糖基化的效率更高;然而,在麦芽低聚糖的情况下,就口感而言,最理想的单葡糖基化衍生物和二葡糖基化衍生物的含量更高。在有机溶剂和较高浓度反应混合物存在的情况下,反应时间较短并且转葡糖基化程度较高。作为甜菊醇糖苷转葡糖基化的首次应用,加入普鲁兰酶可以使转葡糖基化程度提高约5-7%。
根据本发明的CGT酶的活性通过以下测定法确定。将10μL的酶和0.2%的直链淀粉溶液在0.2M缓冲液中的混合物在50℃下温育10分钟。通过加入1mL的0.5M的乙酸和0.5mL的0.02%I2/0.2%KI溶液来终止反应。混合物体积用蒸馏水定容至10mL,并在700nm下测定消光。酶活性单位被认为是在1分钟使蓝色强度降低10%的酶质量。
β-淀粉酶活性单位(1AUN)被定义为在以下条件下每分钟释放100μg的还原糖(以葡萄糖当量表示)的活性:将1mL的酶溶液与5mL的1.2%淀粉溶液(pH 5.5,M/20醋酸盐缓冲液)混合,并在40℃下保持20分钟。
未改性甜菊醇糖苷的HPLC分析在Agilent 1100系列(USA)色谱仪上实现。在Zorbax NH2(150x 4.6mm;5μm)色谱柱上进行甜菊醇糖苷的分离。流速为1.0mL/min,且流动相为80:20(v/v)的乙腈-水(含0.025%的乙酸)混合物。使用UV检测器在210nm下的进行鉴定。用于甜菊醇糖苷定量的标准品是来自Chromadex Inc.(USA)公司的标准品。甜菊醇糖苷通过它们的保留时间、通过外标法计算的浓度以及以干重为基础报告的浓度来进行鉴定。
在一些实验中,对未改性糖苷进行鉴定,是通过使用配备有Ameritech Luna C-18(250x4.6mm;5μm)色谱柱的Agilent Technologies 1100系列(USA)的HPLC进行的,梯度流动相为磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH 2.6)和乙腈-磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH 2.6)混合物(50:50,v/v),梯度从60:40(v/v)到40:60(v/v),在40℃下作用60分钟,使用UV检测器在210nm下进行鉴定。
使用配备有Zorbax NH2(150x4.6 mm;5μm)柱的Agilent Technologies1100系统(USA),使用80:20(v/v)(2分钟)至50:50(v/v)的乙腈-水梯度流动相持续70分钟,以及在210nm下进行UV检测来实现转葡糖基化产物的HPLC分析。
通过在大孔树脂Diaion HP-20上吸附/解吸附来实现总甜菊醇糖苷和葡糖基化衍生物总含量的测定。
样品的感官评估由22名评委(panelist)使用水溶液来进行。根据对甜味剂的甜味能力的初步测试结果,制备表现出与5%蔗糖水溶液相当的甜味的水溶液。最理想和最不理想的样品是基于总体接受程度选择的(表1-表4)。
表1.葡糖基化甜菊苷(glycosylated stevioside)的评估
表2.葡糖基化Reb A的评估
表3.葡糖基化Reb D的评估
表4.葡糖基化Reb M的评估
从表1-4中的结果可以明显看出,通过上述方法生产的所有样品都具有高可接受性和极好的口感,没有苦味。轻微的苦味仅在具有较高含量的未改性的甜菊苷(样品5和6)和未改性的Reb A(样品13和14)的制品的情况下提到了,所述样品在未经串联柱分离的情况下通过用β-淀粉酶或葡糖淀粉酶处理而生产的。
最理想的样品是在10%乙醇存在下生产、用β-淀粉酶处理并在层析柱上分离的产品。它被选择用于进行所有糖苷的转葡糖基化,即甜菊苷(样品7和8)、Reb A(样品15和16)、Reb D(样品23和24)和Reb M(样品31和32)。因此,这些样品的甜味质量被评为最优秀。
总体而言,与具有残留的未改性糖苷的样品相比,具有低含量的未改性糖苷的样品,即从中间柱通过层析分离制备的产品(样品3、4、11、12、19、20、27和28)具有更好的口感。然而,它们的甜度较弱。
最理想的制品是使用环糊精生产的。最可能的原因是,在存在环糊精的情况下,C13处的转葡糖基化占主导地位。
在所有实施方案中,与仅在水体系中生产的样品相比,在乙醇存在下制备的样品由于具有更高的转葡糖基化程度,从而具有更好的口感。
产品可以通过单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和/或三葡糖基化衍生物的含量、它们的总量,通过总甜菊醇糖苷、未反应的糖苷的含量或通过甜度水平来标准化。
根据本发明生产的葡糖基化衍生物可单独用作甜味剂或调味剂(flavor agent),或与以下物质组合用作甜味剂或调味剂:其他天然存在的甜味剂或人工的高甜度甜味剂或增量甜味剂(bulk sweetener,填充型甜味剂)、甜味剂抑制剂、鲜味增强剂、氨基酸及其衍生物、多元醇或糖醇、降低热量的甜味剂、各种碳水化合物、各种生理活性物质或功能成分、天然或人工来源的调味剂、香味形成化合物、有机酸和无机酸及其盐、苦味化合物、味道改性剂、苦味屏蔽剂、维生素、膳食纤维,多酚等。
这些化合物单独或与其他物质组合可用于各种食品和饮料产品、化妆品和药物组合物中。
食品和饮料产品的非限制性实例包括碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料、零热量饮料、运动饮料、茶、果蔬汁、果汁饮料、乳制品饮料、酸奶饮料、酒精饮料、粉状饮料、烘焙产品、曲奇、饼干、烘焙混合物、谷物、蜜饯、糖果、巧克力、太妃糖、口香糖、乳制品、调味牛奶、酸奶、调味酸奶、发酵乳、酱油和其他大豆基础产品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉类产品、鱼肉制品、瓶装和罐装食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜。
此外,该组合物可用于药物或药物制剂和化妆品,包括但不限于牙膏、漱口水、止咳糖浆、咀嚼片、喉糖、维生素制剂等。
组合物可以“原样”(as-is)使用或与其他甜味剂、调味剂和食品成分组合使用。
甜味剂的非限制性实例包括甜菊醇糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A、甜菊醇双糖苷、甜茶苷,以及在甜叶菊植物中发现的其他甜菊醇糖苷及其混合物、甜叶菊提取物,罗汉果提取物、罗汉果苷、高果糖玉米糖浆、玉米糖浆、转化糖、低聚果糖、菊粉、低聚菊糖,偶联糖(coupling sugar,偶合糖)、麦芽低聚糖、麦芽糊精、玉米糖浆固体、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖、糖醇。
调味剂的非限制性实例包括柠檬调味剂、橙味调味剂、水果味调味剂、香蕉调味剂、葡萄调味剂、梨调味剂、菠萝调味剂、苦杏仁调味剂、可乐调味剂、肉桂调味剂、糖调味剂、棉花糖调味剂、香草调味剂。
其他食品成分的非限制性实例包括调味剂、酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、调质剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂。
以下实施例说明了本发明的各种实施方案。应当理解,本发明不限于实施例中给出的材料、比例、条件和程序,这些仅是示例性的。
实施例1
组合物的制备
将100克的木薯淀粉悬浮在200mL的蒸馏水(pH 6.5-7.0)中,加入60单位的由Novozymes(Denmark)生产的商品名为Turozyme的CGT酶,并在75-80℃下进行淀粉的液化约一小时,至葡萄糖当量约为10-20。在冷却至55℃后,以0.5单位/克淀粉的量加入普鲁兰酶(普鲁兰酶-400L,Novozymes)并继续反应另外5小时。
加入100克的由HBNI(China)商品化的纯度为95%的甜菊苷并混合直至获得均匀溶液。将300单位的CGT酶(Novozymes,Denmark)加入到该溶液中,并在65℃下连续搅拌24小时以实现转葡糖基化。将反应混合物在95℃下加热15分钟以灭活酶,用0.5%(w/v)的活性炭脱色。滤液在环境温度下以0.5小时-1的床体积(BV)通过填充有特定极性大孔聚合物吸附剂Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Corporation,Japan)的层析柱(5.0×50cm),然后用五体积的RO水、两体积的0.5%NaOH、三体积的RO水、两体积的10%乙醇、两体积的0.5%HCl洗涤,然后用RO水洗涤至pH 5.5-7.0。吸附的糖苷的解吸附采用3体积的52%的乙醇以BV=1.0小时-1的条件进行。将混合的糖苷的乙醇溶液用溶液总体积1.0%的活性炭在25℃下连续搅拌处理30分钟。通过过滤分离使用的活性炭,通过蒸馏去除乙醇,并将所得精制溶液浓缩和干燥以产生152克的总甜菊醇糖苷含量为97.2%的甜味剂组合物,该组合物包含7.2%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为44%,以及3.4%的碳水化合物部分(以干基计)。甜味剂组合物对应于SAMPLE-1,以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约160倍。
实施例2
组合物的制备
将100克的木薯淀粉悬浮在200mL的蒸馏水(pH 6.5-7.0)中,加入60单位的由Novozymes(Denmark)生产的商品名为Turozyme的CGT酶,在75-80℃下进行淀粉液化约一小时,至葡萄糖当量约为15。在冷却至55℃后,以0.5单位/克淀粉的量加入普鲁兰酶(普鲁兰酶-400L,Novozymes)并继续反应另外5小时。
加入100克的由HBNI(China)商品化的纯度为95%的甜菊苷,并混合至均质溶液。将300单位的CGT酶(Novozymes,Denmark)加入到该溶液中,并在65℃下连续搅拌2小时以实现转葡糖基化。将40mL的10%终浓度的无水乙醇加入到反应混合物中,并且反应继续进行22小时。根据实施例1的程序对反应混合物的进行进一步处理。甜味剂组合物产量为158克,总甜菊醇糖苷含量为97.6%,组合物包括3.7%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物的总量为52%,以及3.1%的碳水化合物部分(以干基计)。甜味剂组合物对应于SAMPLE-2,以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约140倍。
实施例3
组合物的制备
甜菊苷与淀粉之间的反应根据实施例1的程序进行。将酶灭活,反应混合物用活性炭处理后,以0.5小时-1的BV通过五个平行连接的柱(2x 30cm),柱含有20mL的特定极性大孔聚合物吸附剂Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Corporation,Japan),然后用五体积的RO水洗涤。然后,每根柱分别用两体积的0.5%的NaOH、三体积的RO水、两体积的10%的乙醇、两体积的0.5%的HCl洗涤,然后用RO水洗涤至pH 5.5-7.0。对吸附的糖苷的解吸附,单独采用3体积的52%乙醇以BV=1.0小时-1的条件进行。
来自第一个柱和最后一个柱的产物分别含有更高量的未改性葡糖基化糖苷和聚合度更深的葡糖基化糖苷。它们被回收到转葡糖基化阶段。将来自柱2-4的产物混合,并将混合的糖苷溶液在连续搅拌下用溶液总体积1.0%的活性炭在25℃下处理30分钟。通过过滤分离使用的活性炭,通过蒸馏除去乙醇,并且将所得精制溶液浓缩并干燥以产生142g的对应于SAMPLE-3的甜味剂组合物。
所述甜味剂组合物含有98.4%的总甜菊醇糖苷,包括0.9%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为77%,以及0.5%的碳水化合部物分(以干基计)。以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约130倍。
实施例4
组合物的制备
该实验根据实施例3的程序进行,但与实施例2中操作一样,在10%的乙醇存在下制备。来自柱2-4的组合产物的量为148g,含有98.6%的总甜菊醇糖苷,包括0.7%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为82%,以及0.5%的碳水化合物部分(以干基计)。以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约130倍。甜味剂组合物对应于SAMPLE-4。
实施例5
组合物的制备
根据实施例1的程序进行甜菊苷的转葡糖基化。在酶灭活后,将反应混合物温度降至50℃,并用2000单位的大豆来源β-淀粉酶Nokozyme SBA-80(Noke Biotech.,China)处理6小时。将反应混合物在95℃下加热15分钟以使β-淀粉酶失活并根据实施例1进行纯化。甜味剂组合物的产量为121g,对应于SAMPLE-5。它含有95.5%的总甜菊醇糖苷,包括11.2%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为62.5%,以及4.1%的碳水化合物部分(以干基计)。以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约170倍。
实施例6
组合物的制备
在10%乙醇存在下,以与SAMPLE-5类似的方法处理甜菊苷的转葡糖基化的反应混合物。组合产物的量为126g,含有96.4%的总甜菊醇糖苷,包括10.8%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为64.5%,以及3.8%的碳水化合物部分(以干基计)。以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约170倍。甜味剂组合物对应于SAMPLE-6。
实施例7
组合物的制备
在类似于实施例3的串联柱上纯化实施例-6的反应混合物。来自柱2-4的组合产物的量为115g,含有98.8%的总甜菊醇糖苷,包括0.6%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为85%,以及0.5%的碳水化合物部分(以干基计)。以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约120倍。甜味剂组合物对应于SAMPLE-7。
实施例8
组合物的制备
将160克的γ-环糊精和100克的甜菊苷(1:1,mol/mol)悬浮在600mL的蒸馏水(pH6.5-7.0)中,并将混合物在60℃在持续搅拌下温育60分钟直至获得澄清溶液。将其冷却至环境温度并与100g的淀粉混合。然后,在10%的乙醇存在下,根据实施例6的方法进行液化和转葡糖基化反应,并用β-淀粉酶处理。反应混合物在填充有大孔树脂的串联柱上纯化。来自柱2-4的组合产物的量为118g,含有98.8%的总甜菊醇糖苷,包括0.5%的未改性甜菊苷,单葡糖基化衍生物、二葡糖基化衍生物和三葡糖基化衍生物总量为86%,以及0.5%的碳水化合物部分(以干基计)。以5%的蔗糖水溶液为对照,甜度约120倍。甜味剂组合物对应于SAMPLE-8。
与淀粉相比,施用环糊精作为葡糖基残基的供体会产生含量更高的单葡糖基化衍生物和二葡糖基化衍生物。此外,随着环糊精的量的增加,未反应的糖苷浓度降低。
实施例9-16
组合物的制备
根据实施例1-8的方法,使用Reb A代替甜菊苷制备样品。数据在表2中概述。
实施例17-24
组合物的制备
根据实施例1-8的方法,使用Reb D代替甜菊苷制备样品。数据在表3中概述。
实施例25-32
组合物的制备
根据实施例1-8的方法,使用Reb M代替甜菊苷制备样品。数据在表4中概述。
在实施例24和32中,使用α-或β-环糊精来溶解Reb D和Reb M。γ-环糊精以相对于糖苷为1:1,mol/mol的量使用,且对于1mol的糖苷β-环糊精为2mol。在一些实验中,在与淀粉混合之前,通过在65℃下用CGT酶处理10%水溶液12小时,可将β-环糊精转化为α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的混合物。
实施例33
低热量橙汁饮料
橙汁浓缩物(35%)、柠檬酸(0.38%)、抗坏血酸(0.05%)、苯甲酸钠(0.02%);橙红色素(orange red color)(0.01%)、橙味调味剂(0.20%)和根据实施例1、8、9、16、24和32获得的甜味剂(0.06%);然而,其他样品也可以使用、共混并完全溶解在水中(至100%)并巴氏杀菌。
样品的感官评价在表5中概述。具有低含量的未改性糖苷和深聚合度葡糖基化衍生物的所有样品均表现出优异的甜味,并且可用于制备优质低热量橙汁。
表5
通过同样的方式可以应用于其他水果,如苹果、柠檬、杏、樱桃、菠萝等制备果汁。
实施例34
低热量碳酸饮料
饮料的配方如下:
成分 | 量,% |
可乐调味剂 | 0.340 |
磷酸(85%) | 0.100 |
柠檬酸钠 | 0.310 |
苯甲酸钠 | 0.018 |
柠檬酸 | 0.018 |
甜味剂 | 0.030 |
苏打水 | 至100 |
将用不同甜味剂制备的饮料交给10位评委进行比较。表6显示了结果。
表6
上述结果表明,使用8号、16号、24号和32号样品制备的饮料余味突出并且具有良好的感官特性。
实施例35
冰柠檬茶
饮料的配方如下:
成分 | 量,% |
甜味剂 | 0.08 |
苯甲酸钠 | 0.02 |
柠檬酸 | 0.27 |
抗坏血酸 | 0.01 |
茶提取物 | 0.03 |
柠檬调味剂 | 0.10 |
水 | 至100 |
将所有成分共混并溶解在水中,并进行巴氏杀菌。
含有所有样品例如1号、8号、9号、16号、24号、32号的产品均具有优异的味道和风味。而8号、16号、24号和32号样品由于具备更饱满的口感提供了稍微更好的口感。
实施例36
酸奶
将根据实施例2、3、4或5制备的4.0克甜味剂溶解在5kg的脱脂牛奶中,在82℃下巴氏杀菌20分钟后,将牛奶冷却至40℃。加入150克的量的发酵剂(starter,促酵剂),并将混合物在37℃下温育6小时。然后,将发酵物质在10-15℃下保持12小时。
含有1号、8号、9号、16号、24号和32号样品的产品是低热量且低致龋性酸奶,没有异味和臭味。
应当理解,上述描述和本文中所示的具体实施方案仅是对本发明的最佳方式及其原理的说明,并且本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以容易地进行修改和添加,因此应将其理解为仅受所附权利要求的范围限制。
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Claims (33)
1.一种用于生产α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷的方法,所述方法包括:
提供甜菊醇糖苷和葡糖基残基的供体,其中二者按预定比例混合得到反应溶液;
向所述反应溶液中加入用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶;其中将所述反应溶液在预定温度下温育预定时间段;
使所述反应溶液通过填充有足量的能够吸附未改性甜菊醇糖苷和葡糖基化甜菊醇糖苷的极性大孔聚合物吸附剂的层析柱;
洗涤所述柱以除去杂质;和
用有机溶剂溶液洗脱吸附的未改性甜菊醇糖苷和葡糖基化甜菊醇糖苷;和
去除有机溶剂,浓缩,并干燥以产生包含α-1.4-葡糖基化甜菊醇糖苷的纯化的甜味剂组合物;
其中所述葡糖基残基的供体是部分水解的淀粉、麦芽低聚糖或部分水解的淀粉和麦芽低聚糖的混合物;
其中所述部分水解的淀粉通过以下方法制备:
将预定量的淀粉悬浮在蒸馏水或去离子水中以获得淀粉悬浮液;和
向所述淀粉悬浮液中加入用于淀粉液化的CGT酶,并将所述悬浮液在75-80℃范围内的温度下温育0.5-2小时范围内的时间段;
其中部分水解淀粉进一步包括:
将液化淀粉混合物冷却至50-55℃;和
以0.3-0.9单位/克淀粉范围内的量加入普鲁兰酶;其中反应持续3-8小时的时间段。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述甜菊醇糖苷由下式I表示:
其中化合物名称和相应的R1和R2结构列于下面:
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述甜菊醇糖苷选自由以下组成的组:甜菊苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、杜尔可苷A、甜菊醇双糖苷和甜茶苷。
4.根据权利要求1所述的方法,其中将所述悬浮液在75-80℃范围内的温度下温育0.8-1.2小时范围内的时间段。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述淀粉悬浮液含有浓度在20-40%范围内的淀粉。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述淀粉悬浮液含有浓度在25-33%范围内的淀粉。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述用于淀粉液化的CGT酶在1-5单位/克淀粉的范围内。
8.根据权利要求1所述的方法,其中液化淀粉混合物具有10-25的葡萄糖当量。
9.根据权利要求1所述的方法,其中
以0.5-0.7单位/克淀粉范围内的量加入普鲁兰酶;其中反应持续4-6小时的时间段。
10.根据权利要求1所述的方法,其中当使用所述部分水解的淀粉时,在不灭活CGT酶和普鲁兰酶的情况下使用淀粉溶液。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述甜菊醇糖苷与所述葡糖基残基的供体的预定比例在0.1-1.0w/w的范围内。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶的量在7-15单位/克淀粉的范围内;所述预定温度在50-75℃的范围内;且所述预定时间段在18-72小时的范围内。
13.根据权利要求1所述的方法,其中在利用添加的所述用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶的反应进行1-2小时后,向反应混合物中添加一定量的可混溶或不可混溶的有机溶剂以达到2-20v/v%范围内的最终浓度,且反应在50-75℃下再持续18-72小时。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述有机溶剂是乙醇、甲醇或异丙醇。
15.根据权利要求1所述的方法,其中在CGT酶灭活后,将所述反应溶液用β-淀粉酶在45-50℃下处理5-7小时;其中所述β-淀粉酶在5-15单位/克总糖苷的范围内。
16.根据权利要求1所述的方法,其中所述洗涤包括至少三体积的RO水、至少两体积的0.3-0.5%的NaOH、至少三体积的RO水、至少两体积的8-10%的乙醇、至少两体积的0.3-0.5%的HCl,然后用RO水洗涤至pH 5.5-7.0。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述洗脱是用2-3体积的52-70%的乙醇。
18.根据权利要求1所述的方法,其中所述用于淀粉液化的CGT酶在2-3单位/克淀粉的范围内。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述液化淀粉混合物具有12-16的葡萄糖当量。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述甜菊醇糖苷与所述葡糖基残基的供体的预定比例在0.5-1.0w/w的范围内。
21.根据权利要求12所述的方法,其中所述用于甜菊醇糖苷转葡糖基化的CGT酶的量在8-11单位/克淀粉的范围内。
22.根据权利要求13所述的方法,其中最终浓度在7-15%范围内。
23.一种由权利要求1所述的方法生产的甜菊醇糖苷组合物,包含不少于95%的无水总葡糖基化甜菊醇糖苷,其中所述葡糖基化甜菊醇糖苷由下式II表示:
其中R1=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R2=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R3=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R4=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R5=β-1.2-(Glu)n=0-2;
R6=α-1.4-(Glu)n=0-4;
R7=β-1.3-(Glu)n=0-2;
R8=β-1.2-(Glu或Rha)n=0-2;
其中C13-G1为Glu;
C13-G2为β-Glu;β-Xyl或α-Rha;
C19-G1为Glu;
其中Glu为葡萄糖残基;
Xyl为木糖残基;
Rha为鼠李糖残基。
24.根据权利要求23所述的甜菊醇糖苷组合物,其中所述甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于5%的残留糊精、不大于10%的未改性甜菊醇糖苷和不小于40%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
25.根据权利要求23所述的甜菊醇糖苷组合物,其中所述甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于4%的残留糊精、不大于8%的未改性甜菊醇糖苷和不小于50%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
26.根据权利要求23所述的甜菊醇糖苷组合物,其中所述甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于3%的残留糊精、不大于6%的未改性甜菊醇糖苷和不小于60%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
27.根据权利要求23所述的甜菊醇糖苷组合物,其中所述甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于3%的残留糊精、不大于4%的未改性甜菊醇糖苷和不小于70%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
28.根据权利要求23所述的甜菊醇糖苷组合物,其中所述甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、不大于2%的残留糊精、不大于2%的未改性甜菊醇糖苷和不小于80%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
29.根据权利要求23所述的甜菊醇糖苷组合物,其中所述甜菊醇糖苷组合物包含不小于95%的总葡糖基化甜菊醇糖苷、小于1%的残留糊精、不大于1%的未改性甜菊醇糖苷和不小于85%的由单葡糖基化甜菊醇糖苷、二葡糖基化甜菊醇糖苷和三葡糖基化甜菊醇糖苷组成的低聚合度葡糖基化甜菊醇糖苷。
30.一种包含由权利要求1所述的方法生产的甜味剂组合物的消费品,其中所述消费品选自由以下组成的组:碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料、零热量饮料、运动饮料、调味茶、果蔬汁、果汁饮料、乳制品饮料、酸奶饮料、酒精饮料、粉状饮料、烘焙产品、饼干、烘焙混合物、谷物、蜜饯、糖果、巧克力、乳制品、酱油和其他大豆基础产品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉类产品、瓶装和罐装食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜、药物或药物制剂、化妆品、牙膏、漱口水、咀嚼片、喉糖和维生素制剂。
31.根据权利要求30所述的消费品,进一步包含选自由以下组成的组的至少一种食品成分:酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、调质剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂及其组合。
32.根据权利要求30所述的消费品,其中所述消费品选自由以下组成的组:可乐味碳酸软饮料、水果味碳酸软饮料、浆果味碳酸软饮料、太妃糖、口香糖、调味牛奶、酸奶、发酵乳、鱼肉制品和止咳糖浆。
33.一种包含由权利要求1所述的方法生产的甜味剂组合物的食品、饮料、化妆品或药物产品。
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