KR100851610B1

KR100851610B1 - 감미료 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100851610B1
Application number: KR1020020056452A
Authority: KR
Inventors: 기타즈메마사토; 가타바미다다시
Original assignee: 디아이씨 가부시끼가이샤
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-09-17
Publication date: 2008-08-12
Also published as: US7267835B2; KR20030025822A; CN1408262A; DE60200749T2; US20030138538A1; DE60200749D1; EP1295533A1; EP1295533B1; CN100455209C

Abstract

본 발명은 스테비아 감미료의 높은 감미도를 남기면서 설탕에 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리가 양호하며, 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛을 저감시킨 감미료 및 그 제조 방법을 제공한다. 감미료는 스테비올 배당체를 함유하고 또한 하기 식 (1) 및 식 (2)를 만족시킨다:

〔(GRA + RA)/(X)〕≥ 0.4 (1)

〔(GRA)/(RA)〕≥ 1.0 (2)

〔상기 식에서, GRA는 감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%를 나타내고, RA는 감미료 중에 포함되는 레바우디오사이드 A의 중량%를 나타내고, X는 감미료 중에 포함되는 스테비올 배당체의 중량%를 나타냄〕.

감미료, β-1,4-갈락토실, 레바우디오사이드, 스테비오사이드, 전이 효소, 스테비올 배당체

Description

감미료 및 그 제조 방법 {SWEETENER AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

도 1은 실시예 1의 감미료의 고속 액체 크로마토그래피.

도 2는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 박층 크로마토그래피.

본 발명은 높은 감미도와 우수한 감미질을 가지며, 여러 가지 음식물의 감미제로서 유용한 레바우디오사이드 A와 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 주성분으로서 함유하는 감미료 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

설탕(자당)은 종래부터 음식물의 감미료로서 널리 이용되고 있다. 특히 캔 커피를 비롯한 커피 음료나 탄산 음료 등의 청량 음료수에는 다량의 설탕이 사용되고 있다. 그러나 최근, 건강을 지향하거나 또는 저칼로리를 지향하는 것에 영향을 받아 비만, 당뇨병, 충치의 원인이 되는 설탕의 양을 줄이거나 설탕 대신에 고감미도의 감미료가 이용되는 경향이 나타나고 있다.

이러한 감미도 높은 감미료로는 남미 파라과이를 원산지로 하는 국화과의 다년생 식물인 스테비아ㆍ레바우디아나ㆍ베르토니(Stevia rebaudiana BERTONI)의 추출물 유래의 스테비아 감미료를 들 수 있다.

스테비아 식물의 추출물(이하, 스테비아 추출물이라고 함)로부터 얻어지는 스테비아 감미료는 설탕의 수백배 우수한 감미도를 갖지만, 설탕에 비교하여 감미의 발현이 느리다고 하는 특징, 이른바 감미의 상승이 느리다고 하는 특징과, 뒷맛(後味)으로서 감미가 비교적 오래 남는다고 하는 특징, 이른바 감미의 마무리가 나쁘다고 하는 특징이 있다. 또, 상기 스테비아 감미료에 다량 포함되는 스테비오사이드에는 감미와는 별도로 뒷맛에 독특한 떫은 맛이나 쓴 맛을 수반하는 결점이 있어, 커피 음료나 청량 음료수에 이용하면 명확히 위화감을 느낀다.

이로 인하여 스테비아 감미료의 감미질 개선을 위해 여러 가지 연구가 이루어져 왔다. 예를 들면, 일본 특개소58-094367호 공보에는 스테비오사이드를 주성분으로 한 스테비아 추출물과 β-1,4-갈락토실 당(糖)화합물을 포함하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시켜 스테비오사이드에 갈락토실기를 β-1,4- 결합시킨 β-1,4-글루코실스테비오사이드를 주성분으로 하는 감미료의 제조 방법이 개시되어 있다.

이 제조 방법에 의하면, 순한 감미로 개선되고 또 감미의 마무리도 비교적 좋아지고 쓴 맛이나 떫은 맛도 저감되었지만, 감미질의 개선 효과는 충분하지 않고, 특히 커피 음료나 청량 음료수에 사용하기에는 아직 불충분했다.

또, 일본 특개평9-107913호 공보 등에는, 레바우디오사이드 A를 주성분으로 한 스테비아 추출물에 글루코오스를 α-부가 반응시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나 효소반응이 진행되면 레바우디오사이드 A에 부가된 글루코오스로부터 긴 사슬의 글루코오스 사슬이 형성되고, 얻어지는 α-글루코실레바우디오사이드 A의 감미도는 레바우디오사이드 A와 비교하여 45% 정도나 저하되어 버린다는 문제가 있었다.

이와 같이, 종래의 당 부가 스테비아 감미료는 당 부가에 의해 어느 정도 감미질은 개선되지만 감미도는 저하되고, 또 스테비아 감미료 특유의 결점인 감미의 상승이 지연되는 점이나 뒷맛에 쓴 맛이나 떫은 맛을 수반하는 점의 개선은 아직 충분하지 않고 커피 음료나 청량 음료수 등에 사용할 경우에 위화감이 남아 있었다.

본 발명의 목적은 스테비아 감미료가 높은 감미도를 남기면서, 설탕과 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리가 양호하며, 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛을 저감시킨 감미료 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 다음과 같은 사실을 발견했다.

(A) 감미료 중에 포함되는 β-1,4-갈락토실기를 1분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%(GRA)와, 감미료 중에 포함되는 레바우디오사이드 A의 중량%(RA)와, 감미료 중에 포함되는 스테비올 배당체(配糖體)의 중량%(X)가 특정한 관계에 있는 감미료는 설탕과 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리도 양호하며, 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛이 저감된 감미료이다.

(B) β-1,4-갈락토실기를 1분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A는 레바우디오사이드 A에 부가된 갈락토실기에 추가로 갈락토실기가 부가중합하지 않기 때문에 감미도의 저하가 레바우디오사이드 A의 30% 정도로 제한된다.

(C) 상기 감미료는 레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 및 상기 스테비아 추출물 고형분 중량의 5∼20배량의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 발견에 기초하여 완성되었다.

즉, 본 발명은 스테비올 배당체를 함유하고, 또한 하기 식 (1) 및 식 (2)를 만족시키는 것을 특징으로 하는 감미료를 제공하는 것이다.

〔(GRA + RA)/(X)〕≥ 0.4 (1)

〔(GRA)/(RA)〕≥ 1.0 (2)

〔상기 식에서, GRA는 감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%를 나타내고, RA는 감미료 중에 포함되는 레바우디오사이드 A의 중량%를 나타내며, X는 감미료 중에 포함되는 스테비올 배당체의 중량%를 나타낸다.〕

또, 본 발명은 레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 및 상기 스테비아 추출물 고형분 중량의 5∼20배량의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하 는 감미료의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 이하에 기재되는 바와 같은 효과를 나타낸다.

본 발명의 감미료는 감미료 중에 포함되는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%(GRA)와, 감미료 중에 포함되는 레바우디오사이드 A의 중량%(RA)의 합계(GRA + RA)의 스테비올 배당체의 함유 비율(X)에 대한 비가 0.4 이상이고, 또한 RA에 대한 GRA의 비가 1.0 이상이라는 관계를 가지는 것에 의해, 설탕과 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리도 양호하며 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛도 저감되어 있다.

그리고, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A는 레바우디오사이드 A에 부가한 갈락토실기에 추가로 갈락토실기가 부가 중합하지 않기 때문에 감미도의 저하가 레바우디오사이드 A의 30% 정도로 제한된다.

또한, 본 발명의 감미료의 제조 방법은 레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 및 상기 스테비아 추출물의 중량의 5∼20배의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시킨다고 하는 용이한 제조 방법이며, 본 발명의 설탕과 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리도 양호하며, 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛도 저감한 감미료를 적합하게 제조할 수 있다.

본 발명의 감미료는 스테비올 배당체를 함유하며, 또한 상기 식 (1) 및 식 (2)를 만족시키는 것이면 되지만, 그중에서도 보다 순한 감미로 되는 것을 고려할 때, 하기 식 (3) 및 (4)를 만족시키는 것이 바람직하고, 또 하기 식 (5)를 만족시 키는 것이 더욱 바람직하다.

0.95 ≥〔(GRA + RA)/(X)〕≥ 0.5 (3)

10.0 ≥〔(GRA)/(RA)〕 ≥ 1.1 (4)

〔(GRA + RA)/(GST + ST)〕≥ 1.0 (5)

〔식에서, GRA 및 RA는 상기와 동일하다. 또, GST는 감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼2개 가지는 β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 중량%를 나타내고, ST는 감미료 중에 포함되는 스테비오사이드의 중량%를 나타낸다.]

또, 특히 순한 감미로 되는 것을 고려할 때, 상기 식 (3)과 함께 하기 식 (6) 및 식 (7)을 만족시키는 것이 가장 바람직하다.

5.0 ≥ [(GRA)/(RA)〕≥ 1.1 (6)

〔(GRA + RA)/(GST + ST)〕≥ 1.5 (7)

(식에서, GRA, RA, GST 및 ST은 상기와 동일하다.)

본 발명의 감미료를 얻는 방법으로는, 특별히 한정되지 않지만, 그중에서도 레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 및 상기 스테비아 추출물 고형분 중량의 5∼20배량의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액에, β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시킨다고 하는 상기 본 발명의 제조 방법이, 상기 식 (1) 및 식 (2)를 만족시키는 감미료로서 설탕과 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리도 양호하며 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛이 저감된 감미료를 용이하게 얻을 수 있는 점에서 바람직하다.

스테비아 추출물로서 레바우디오사이드 A를 40중량% 미만의 범위로 함유하는 스테비아 추출물을 이용한 제조 방법에서는, β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A(이하, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A라 칭함)의 중량%와 레바우디오사이드 A의 중량%와의 합계(GRA + RA)가 낮아지고, 동시에 β-1,4- 결합갈락토실기를 1분자 중에 1∼2개 가지는 β-1,4-갈락토실스테비오사이드(이하, β-1,4-갈락토실스테비오사이드라 칭함)의 중량 %와 스테비오사이드의 중량%와의 합계(GST + ST)가 높아지는 것을 고려할 때, 상기 식 (1) 및 식 (2)를 만족시키는 감미료로 만드는 것이 어려워지고, 순한 감미질이 저하되고 감미의 상승이 느리고 감미의 마무리도 악화되고 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛을 수반하게 되는 점에서 바람직하지 않다.

스테비아 추출물에는, 통상 스테비오사이드, 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 C, 주르코사이드 A 등의 스테비올 배당체로 이루어지는 감미 성분이 함유되어 있고, 스테비오사이드는 이하의 구조를 가지는 것이다.

또, 레바우디오사이드 A는 상기 스테비오사이드의 구조 중의 13-G1으로 표기되는 글루코오스 잔기에 추가로 글루코오스가 결합한 하기 구조를 갖는 것이다.

상기 본 발명의 제조 방법에서 이용하는 β-1,4-갈라토실당 화합물의 대표예로서는 갈락토오스와 글루코오스가 결합한 2당류, 예를 들면 유당(락토오스), α- D-갈락토오스 등을 들 수 있다. 이것들은 하기 구조를 갖는 것이다.

본 발명의 감미료에 함유되는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A로서는 예를 들면 레바우디오사이드 A의 스테비올 골격의 13 위치에 결합한 글루코오스 잔기(13-G1이라 칭함), 상기 스테비올 골격의 13 위치에 결합한 글루코오스 잔기에 결합한 2개의 글루코오스 잔기(13-G2, 13-G3이라 칭함), 및 스테비올 골격의 19 위치에 결합한 글루코오스 잔기(19-G1이라 칭함)의 4개의 글루코오스 잔기 중 1∼3개의 글루코오스 각각에 1개의 갈락토실기가 β-1,4- 결합으로 결합되어 있는 것 등을 들 수 있다.

레바우디오사이드 A의 글루코오스 잔기 중에서도 β-1,4-갈락토실 전이 효소의 작용에 의해 갈락토실기가 β-1,4- 전이되기 쉬운 것은 13-G2, 13-G3 및 19-G1인 3개의 글루코오스 잔기인 것으로 추정된다. 실제로 후기하는 실시예에 제시한 바와 같이, 고속 액체 크로마토그래피에 의한 분석에서는 레바우디오사이드 A에 3개까지의 갈락토실기가 결합한 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 피크가 확인되어 있다.

그러한 갈락토실기는 입체 장애로 인해 상기 13-G2, 13-G3 및 19-G1인 3개의 글루코오스 잔기에 각각 1개씩 β-1,4- 결합되어 있고, 효소 반응의 진행에 수반하여 레바우디오사이드 A에 1개의 β-1,4-갈락토실기가 결합한 것(β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A)으로부터 다음으로 2개의 β-1,4-갈락토실기가 결합한 것(β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A), 나아가서 3개의 β-1,4-갈락토실기가 결합한 것(β-1,4-트리갈락토실레바우디오사이드 A)이 차례로 생성되는 것으로 추정되고, 본 발명에서 제공하는 감미료 중의 β-1,4-갈락토실레바우디오사이트 A는 그러한 복수의 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 혼합물로 이루어진다.

단, 본 발명에서 제공하는 감미료에는 β-1,4-갈락토실 전이 효소의 작용에 의해 β-1,4-갈락토실 당화합물로부터 갈락토실기를 레바우디오사이드 A로 전이시켜 얻어지는 갈락토실레바우디오사이드 A이라면, 상기한 주된 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 이외에 예를 들면 상기 13-G1에 갈락토실기가 β-1,4- 부가된 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A나 기타 소량의 갈락토실레바우디오사이드 A가 포함되어 있어도 무관하다.

또, 전술한 본 발명의 감미료의 제조 방법에서 사용하는 스테비아 추출물로서는 레바우디오사이드 A를 40 중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물인 것이 필수적이지만, 그중에도 순한 감미질이고 감미의 느껴짐이 신속하고 감미의 마무리도 양호하며, 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛이 저감된 감미료를 더욱 쉽게 얻을 수 있는 점에서 레바우디오사이드 A를 50 중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물인 것이 바람직하고, 레바우디오사이드 A를 70∼95 중량% 포함하는 스테비아 추출물인 것이 더욱 바람직하다. 또한 본 발명의 제조 방법에서 사용하는 스테비아 추출물로서는 스테비오사이드에 대해 1.5 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 스테비아 추출물인 것이 특히 바람직하다. 이것은 β-1,4-갈락토실 전이 효소에 의해 레바우디오사이드 A에 갈락토실기가 전이된 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 감미도는 원래의 레바우디오사이드 A보다 저하되지만, 그 감미도 저하율은 스테비오사이드에 갈락토실기가 결합한 β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 감미도의 저하율보다 상당히 작은 것에 기인하는 것으로 생각된다. 또한, 스테비아 추출물 중의 레바우디오사이드 A의 함량 비율이 40 중량% 미만이면 얻어지는 감미료의 감미도와 감미질이 저하되어 감미질이 좋지 않게 되므로 바람직하지 않다.

상기 조건을 만족시키는 스테비아 추출물을 얻는 방법으로서는 이하에 제시하는 두 가지 방법이 일반적이지만 이들 방법에 한정되는 것은 아니다.

제1 방법은 레바우디오사이드 A를 40 중량% 이상 포함하고, 스테비오사이드에 대해 1.5 중량배 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana BERTONI)의 식물체 또는 건조엽(乾燥葉)을 물 또는 함수 메탄올, 함수 에탄올 등의 함수 유기 용매로 추출하고, 얻어진 추출액으로부터 감미 아닌 성분을 제거하는 방법이다.

제2 방법은 스테비오사이드에 대해 임의의 비율로 레바우디오사이드 A를 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니의 식물체 또는 건조엽을 물 또는 함수 메탄올, 함수 에탄올 등의 함수 유기 용매로 추출하고, 얻어진 추출액으로부터 감미 아닌 성분을 제거한 후에 레바우디오사이드 A를 40 중량% 이상 포함하고 레바우디오사이드 A가 스테비오사이드에 대해 1.5 중량배 이상이 되도록 재결정이나 칼럼 정제 등의 일반적인 방법으로 분리ㆍ정제하여 취득하는 방법이다. 이들 제1 및 제2 방법은 조합하여 실시할 수도 있다.

이들 제1 및 제2 방법에서, 감미 아닌 성분을 제거하는 방법으로는 예를 들면, 스테비아 추출액을 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지로 이온성 불순물을 제거한 후, 흡착 수지에 감미 성분을 흡착시키고 메탄올, 에탄올 등의 친수성 유기 용매로 용리하여 용리액을 감압 농축하는 방법, 역으로 흡착 수지에 감미 성분을 흡착시키고 메탄올, 에탄올 등의 친수성 유기 용제로 용리 후, 용리액을 감압 농축하여 그 유기 용매를 제거하고, 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지로 이온성 불순물을 제거하는 방법 등의 일반적인 정제 방법 등을 들 수 있다.

상기 양이온 교환수지로서는 예를 들면 암버라이트 IR-120B(오르가노 가부시키가이샤 제품) 등을 들 수 있고, 음이온 교환수지로서는 오르가노 가부시키가이샤제인 암버라이트 IRA-93 등을 들 수 있다. 흡착 수지로서는 예를 들면 오르가노 가부시키가이샤제인 암바라이트 XAD-2 등을 들 수 있다.

또, 상기 제2 방법에서, 추출액으로부터 감미가 아닌 성분을 제거한 후에, 레바우디오사이드 A를 40 중량% 이상 포함하고, 레바우디오사이드 A가 스테비오사이드에 대해 1.5 중량배 이상이 되도록 분리ㆍ정제하는 공업적인 방법으로는 예를 들면 감미 아닌 성분을 제거한 스테비아 추출물을 메탄올, 에탄올 등의 친수성 유기 용매에 포화 농도로 될 때까지 용해하고, 농축, 냉각 등의 수단에 의해 레바우 디오사이드 A를 선택적으로 석출시킨 후, 여과 등의 방법에 의해 결정을 분리하는 재결정 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에서 이용하는 β-1,4-갈락토실 당화합물은 β-1,4-갈락토실 전이 효소의 기질이 되고 상기 β-1,4-갈락토실 당화합물로부터 β-1,4-갈락토실기를 레바우디오사이드 A로 전이할 수 있는 것이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 유당(락토오스)이 가장 바람직하다.

본 발명에서 이용하는 β-1,4-갈락토실 전이 효소로서는 β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소이면 되고, 예를 들면 β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소를 산생하는 미생물 유래의 효소를 들 수 있고, 그중에서도 상기 미생물을 배양한 배양균체로부터 추출된 효소가 취급이 용이하므로 바람직하지만, 이와 같은 β-1,4-갈락토실 전이 효소 대신에 β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소를 산생하는 미생물을 배양한 균체 현탁액을 그대로 이용할 수도 있고, 상기 미생물을 고정한 고정화 균체를 이용할 수도 있다. 상기 배양균체로부터 추출된 효소로서는 유당을 가수분해하는 락타아제, 예를 들면 야마토가세이사(大和化成株式會社) 제품인 비오락타 등을 들 수 있다.

상기 β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소를 산생하는 미생물로서는 로도토룰라속 미생물이 바람직하게 이용되고, 특히 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta) IFO-1540, 로도토룰라 마리나(Rhodotorula marina) IFO-1421, 로도토룰라 락토사(Rhodotorula lactosa) IFO-1424가 바람직하다.

또, 바실루스속 미생물도 바람직하게 이용할 수 있고, 특히 바실루스 서큘란 스(Bacillus circulans)가 바람직하게 이용된다. 또한, 상기 β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소를 산생하는 미생물로서는 병원성 등의 음식물로서 바람직하지 않은 성질을 갖지 않는 한, β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소를 산생하는 미생물이면 상기 이외의 속이나 종에 속하는 미생물일 수도 있다.

이들 미생물은 통상의 미생물 생육에 적합한 배지, 예를 들면 탄소원으로서는 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 글리세린 등을, 질소원으로서는 황산암모늄, 질산암모늄, 요소, 아세트산암모늄 등을, 함질소 천연물로서는 효모 추출물, 콘 스티프 리커(corn steep liquor) 등을, 무기염류로서는 인산칼륨, 인산칼슘, 염화나트륨, 황산마그네슘 등을 함유하고 또한 비타민류, 미량 금속염 등을 함유한 배지에서 성육함으로써 얻어진다.

β-1,4-갈락토실 당화합물로부터의 레바우디오사이드 A로의 갈락토실기의 전이와 β-1,4- 부가 반응은 레바우디오사이드 A를 포함하는 스테비아 추출물과 β-1,4-갈락토실 당화합물을 함유하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 첨가함으로써 진행된다.

본 발명의 제조 방법에서 이용하는 레바우디오사이드 A를 40 중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물과 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액은, 상기 스테비아 추출물과 그 스테비아 추출물 고형분 중량의 5∼20배량의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하면 되지만, 그중에서도 6∼16배량의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 갖는 것이 바람직하다.

전술한 수용액 중의 스테비아 추출물 고형분 농도는 통상 0.1∼15 중량%이면 되지만, 경제성을 고려하면 1∼5 중량%가 바람직하다. 또, 상기 수용액 중 β-1,4-갈락토실 당화합물의 농도는 통상 0.1∼30 중량%이면 되지만, 경제성과 생산성을 고려하면 5∼20 중량%가 바람직하다.

β-1,4-갈락토실 전이 효소의 사용량은 β-1,4-갈락토실 전이 효소가 작용하여 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 생성시키는 양이면 제한되지 않지만, 반응 효율이 양호한 것과 경제적인 것을 감안하여 스테비아 추출물 고형분 1g당 1∼1000 유닛(U)을 사용하는 것이 바람직하고, 5∼500U을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 여기서 1 유닛(U)이란 1 μmol의 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(이하, ONPG라 함)와 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 반응시킨 후, 상기 ONPG 중의 β-갈락토시드 결합을 가수분해하여, 1 μmol의 o-니트로페놀을 1분간에 생성하는 데 필요한 상기 갈락토실 전이 효소의 양을 말한다.

β-1,4-갈락토실 전이 효소의 유닛의 측정은 농도 5 mmol/l의 ONPG 수용액 2.5 ml와 농도 100 mmol/l의 인산칼륨ㆍ나트륨 완충액(pH 7.25) 4.9 ml를 혼합한 용액에 효소액 0.1 ml를 가하여 40℃에서 10분간 반응시킨 후, 농도 1.0 mol/l의 탄산나트륨(Na₂CO₃) 수용액 2.5 ml를 가하여 반응을 정지시키고, 필요할 경우 적량의 순수로 희석하여 생성된 o-니트로페놀의 파장 420 nm에서의 흡수를 측정하고, 얻어진 흡광도로부터 상기 니트로페놀의 생성량을 정량한 후, 그 생성량을 10으로 나누어 1분간에 생성한 상기 니트로페놀의 양을 구함으로써 실행되었다.

상기 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시킬 때의 계의 pH는 β- 1,4-갈락토실 전이 효소가 작용하여 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 생성시킬 수 있는 조건이면 특별이 제한되지 않지만, 통상 pH 3∼10이고, 그중에서도 효소 반응 효율이 뛰어난 점에서 pH 4∼7이 바람직하다. 이 때의 온도도 β-1,4-갈락토실 전이 효소가 작용하여 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 생성시킬 수 있는 조건이면 특별히 제한되지 않지만, 통상 20∼70℃이고, 그중에서도 효소 반응 효율이 뛰어난 점에서 40∼60℃가 바람직하다. 상기 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시키는 시간은 통상 3∼48시간이지만 경제성과 생산성을 고려하면 9∼24시간이 바람직하다.

β-1,4-갈락토실 전이 효소의 작용에 의한 β-1,4-갈락토실 당화합물로부터의 갈락토실기의 레바우디오사이드 A로의 β-1,4- 전이는 β-1,4-갈락토실 당화합물로부터의 갈락토실기의 절단과 β-1,4- 전이가 동시에 일어나는 것으로, 한번 레바우디오사이드 A의 글루코오스 잔기로 전이된 갈락토실기의 4위치의 수산기에는 새로운 갈락토실기는 β-1,4- 전이할 수 없고, α-1,4-글루코시다아제나 글루코실트라스페라아제와 같이 앞서 전이된 글루코오스 잔기의 4위치의 수산기에 추가로 새로운 글루코실기가 잇달아 α-1,4- 부가 중합하여 긴 사슬의 글로코오스 사슬을 형성하여 얻어지는 감미료의 감미도를 저하시키지 않는다고 하는 이점을 갖는다.

스테비아 추출물과 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시킨 후의 수용액은 그대로 감미료로서 사용할 수도 있으나, 통상은 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 가열 실활시킨 후(단, β-1,4-갈락토실 전이 효소 대신에 β-1,4-갈락토실 전이 활성을 갖는 효소를 산생하는 미생물을 배 양한 균체 현탁액 등을 사용한 경우는 그 미생물의 가열 살균도 행한 후), 스티렌디비닐벤젠계 합성 흡착수지, 예를 들면 다이아이온 HP-21(미쓰비시가가쿠 가부시키가이샤 제품), 암버라이트 XAD-2(오르가노 가부시키가이샤 제품)나, 양이온 교환수지, 음이온 교환수지 등을 이용하여 불순물을 제거한 후, 농축하여 시럽 상태의 감미료로 만들거나, 건조하여 분말 상태의 감미료로서 사용한다. 이 경우, 농축, 건조, 분말화 수단은 공지 관용의 방법, 예를 들면 감압농축, 막농축, 동결건조, 분무건조 등의 여러 가지 방법을 채용할 수 있다.

본 발명의 감미료나 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 감미료는 단독으로 사용할 수도 있으나, 솔비톨, 멀티톨, 환원 물엿, 크실리톨, 트레할로오스, 에리스리톨 등의 설탕보다 감미도가 낮은 저칼로리 감미료와 병용할 수 있고, 이들 감미료의 특성을 해치지 않고 더욱 강한 단 맛을 부여할 수 있어 양질의 저칼로리 감미료 제제로 만들 수 있다.

또, 본 발명의 감미료나 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 감미료의 건조물은 담황색∼백색을 나타내는 무취의 분말이다. 이 때문에 상기 감미료는 예를 들면, 건조물 단독 또는 희석제로서 설탕, 과당, 포도당, 유당, 이성화당, 물엿, 덱스트린, 전분 등의 당질계 감미료와 병용한 상태로 적절히 사용할 수도 있다. 또한, 감초 추출물, 사카린, 아스파르탐, 아세설팜칼륨, 수클라로오스 등의 비당질계 고감미도 감미료와 조합하여 적절히 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 상기 식 (1) 및 (3)에서 이용하는 X〔감미료 중에 포함되는 스테비올 배당체의 중량%〕은 일본 식품첨가물협회의 화학적 합성품 이외의 식품첨가물 자주규격(自主規格)(제2판, 1993년 10월 1일 발행) 제119∼121쪽 "효소처리 스테비아"에 기재된 정량법〔(1) 스테비올 정량법, (2) 배당체 중의 당 정량법 및 (4) 함량의 계산〕에 의거하여 측정한 중량 비율(%)이다.

또한, "효소처리 스테비아"에 기재된 정량법은 α-글루코실스테비오사이드 등의 글로코오스 부가반응물을 대상으로 한 정량법으로, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 등의 갈락토오스 부가반응물을 대상으로 한 정량법은 아니지만 본 발명에서는 이 방법에 의거하여 X를 측정했다.

또, 상기 식 (1)∼(7)에서 이용하는 RA〔감미료 중에 포함되는 레바우디오사이드 A의 중량%〕 및 상기 식 (5)와 (7)에서의 ST〔감미료 중에 포함되는 스테비오사이드의 중량%〕은 모두 일본 식품첨가물협회의 화학적 합성품 이외의 식품첨가물 자주규격(제2판, 1993년 10월 1일 발행) 제122∼123쪽 "스테비아 추출물"에 기재된 정량법 및 상기 "효소처리 스테비아"에 기재된 정량법〔(3) 미반응 스테비올 배당체 정량법〕에 의거하여 측정한 중량 비율(%)이다.

또한, 상기 식 (1)∼(7)에서 이용하는 GRA〔감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1 분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%〕 및 GST〔감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1 분자 중에 1∼2개 가지는 β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 중량%〕은 측정 방법이 일본 식품첨가물협회의 화학적 합성품 이외의 식품첨가물 자주규격에 기재되어 있지 않지만, 상기 RA 및 ST를 측정하는 것과 동시에 측정했다.

본 발명에서는 X, RA, ST, GRA, GST의 각 중량%는 전술한 "효소처리 스테비아" 및 "스테비아 추출물"에 기재된 정량법에 의거하고 있으나 하기의 점에서 변경되어 있다. 변경점과 그 이유를 이하에 제시한다.

"효소처리 스테비아"의 "(1) 스테비올 정량법"에서의 변경점:

(1)-① 시료의 건조처리 공정

"(1) 스테비올 정량법"에서는 시료의 건조에 관한 기재는 없으나 엄밀한 분석을 행하기 위해서 표준품과 동일하게 105℃에서 2시간의 건조를 행했다.

(1)-② 스테비올의 중량% 계산식

"(1) 스테비올 정량법"에서는 스테비올 함유율의 계산은 표준품 스테비오사이드의 순도는 고려하지 않지만, 엄밀하게 스테비올의 함유율을 계산하기 위해서 사용한 표준품의 스테비오사이드의 순도를 고려하여 이하의 식을 이용해서 스테비올의 중량%를 구했다.

A = (As×S×표준품의 스테비오사이드의 순도×100×K)/(Ast×X) … 식 (8)

여기서,

A: 시료의 스테비올의 중량 비율(%),

As: 검사액의 이소스테비올메틸에스테르의 스타왈란에 대한 면적비,

Ast: 표준액의 이소스테비올메틸에스테르의 스타왈란에 대한 면적비,

S: 스테비오사이드 채취량(mg),

X: 시료 채취량(mg),

K: 스테비올로의 환산 계수 318.46/804.88 = 0.3957이다.

"효소처리 스테비아"의 "(2) 배당체 중의 당 정량법"에서의 변경점:

(2)-① 시료액의 조제

"(2) 배당체 중의 당 정량법"에서 시료의 조제 방법은 이하와 같다. 즉, 시료 약 1.0 g을 정밀하게 달아 물 50 ml에 용해한다. 이 용액을 효소처리 스테비아용 흡착수지 50 ml를 사용하여 만든 직경 약 2.5 cm의 수지 칼럼에 붓고 1분간 3 ml 이하의 속도로 유출시키고, 이어서 물 250 ml로 세정한다. 다음에 50 v/v% 에탄올(에탄올과 물의 혼합 용액 100 ml 중의 에탄올의 함유량이 50 ml인 혼합 용액) 또는 90 v/v% 메탄올(메탄올과 물의 혼합 용액 100 ml 중의 메탄올의 함유량이 90 ml인 혼합 용액) 250 ml를 1분간 3 ml 이하의 속도로 통액하고, 흡착되는 성분을 용출한다. 이 액을 회전식 증발기로 농축 건고하여 잔류물을 얻는 처리 조작을 행한 후, 상기 잔류물에 물을 가하여 용해하고 전량을 정확히 500 ml가 되도록 하여 이것을 시료액으로 한다.

그러나 전술한 시료의 조제 방법은 효소처리 스테비아에 당류가 첨가되어 있는 것에 대해 상기 당류를 제거한 시료를 조제하기 위한 방법이다. 본 발명에서는 효소처리한 스테비아에 당류를 첨가하지 않기 때문에 전술한 시료의 조제 방법에서 상기 처리 조작을 행하지 않고, 시료 약 1.0 g을 정밀하게 달아 물을 가하여 용해하고 전량을 정확히 500 ml로 만들어 이것을 시료액으로 했다. 또한 엄밀한 측정을 행하기 위해서 시료는 105℃, 2시간의 조건으로 건조처리했다.

"스테비아 추출물"에서의 변경점:

① 시료의 건조 처리 공정

"스테비아 추출물"에 기재된 정량법에서는 시료의 건조에 대한 기재는 없지 만 본 발명에서는 엄밀한 분석을 하기 위해서 표준품과 동일한 105℃, 2시간의 건조를 행했다.

② 액체 크로마토그래피의 이동상

"스테비아 추출물"에 기재된 정량법에서는 액체 크로마토그래피의 이동상으로서 아세토니트릴ㆍ물 혼합액(80:20)(체적비)을 사용하고 있다. 이 용매 조겅은 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A의 정량을 목적으로 규정되어 있고, 스테비오사이드의 피크의 유지 시간은 10분 전후, 레바우디오사이드 A의 피크의 유지 시간은 20분 전후와 30분 이내에서 이들 성분이 용출된다.

그러나, 상기 이동상 조성으로 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 조성물을 분석하면 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 피크의 유지 시간은 170분 전후가 되어 당 부가성분 전체의 용출에 3시간 이상이 걸리기 때문에 분석 방법으로서 현실적이 아니다.

이 때문에 본 발명에서는 액체 크로마토그래피의 효율화를 위해 이동상으로서 아세토니트릴ㆍ수 혼합액(78:22)(체적비)를 사용했다. 이 이동상을 이용하면 스테비오사이드의 피크의 유지 시간은 5분 전후, 레바우디오사이드 A의 피크의 유지 시간은 8분 전후, 가장 느린 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 피크의 유지 시간은 45분 전후로 되어 당 부가성분 전체의 용출은 1시간 이내에 완료된다.

③ 중량%의 계산

"스테비아 추출물"에 기재된 정량법에서는 사용하는 표준품(스테비오사이드, 레바우디오사이드)의 순도는 고려되어 있지 않지만, 엄밀한 정량을 행하기 위해 사 용한 표준품의 순도를 고려하여 표준품의 채취량에 순도를 곱하였다. 이것은 후술하는 β-1,4-갈락토실스테비오사이드, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A에 관해서도 동일하다.

④ β-1,4-갈락토실스테비오사이드, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%의 산출.

β-1,4-갈락토실스테비오사이드, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량 %는 "스테비아 추출물"에 기재된 정량법 및 분자량 환산법을 조합하여 축정하였다. β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 중량%는 스테비오사이드를 표준물질로 하고, 스테비오사이드의 중량%를 구하는 계산식에서 검사액의 스테비오사이드의 피크 면적 대신에 β-1,4-갈락토실스테비오사이드인 β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드, β-1,4-디갈락토실스테비오사이드 각각의 피크 면적을 이용하고, 또한 스테비오사이드의 중량%를 구하는 계산식에 상기 표 1에 나타낸 스테비오사이드 및 β-1,4-갈락토실스테비오사이드 각 성분의 분자량비를 곱하여 산출했다.

[표 1]

성분명	분자량	분자량 환산 계수
스테비오사이드	804.9	1.00
β-1,4-모노갈락토실 스테비오사이드	967.0	1.20
β-1,4-디갈락토실 스테비오사이드	1129.2	1.40

β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%는 레바우디오사이드 A를 표준물질로 하고, 레바우디오사이드 A의 중량%를 구하는 계산식에서 검사액의 레바우디오사이드 A의 피크 면적 대신에 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A인 β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A, β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A, β-1,4-트리갈락토실레바우디오사이드 A 각각의 피크 면적을 이용하고, 또한 레바우디오사이드 A의 중량%를 구하는 계산식에 하기 표 2에 제시한 레바우디오사이드 A와 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 각 성분의 분자량비를 곱하여 산출하였다.

[표 2]

성분명	분자량	분자량 환산 계수
레바우디오사이드 A	967.0	1.00
β-1,4-모노갈락토실 레바우디오사이드 A	1129.2	1.17
β-1,4-디갈락토실 레바우디오사이드 A	1291.3	1.34
β-1,4-트리갈락토실 레바우디오사이드 A	1453.5	1.50

상기 "스테비아 추출물"에 기재된 정량 방법에서, 스테비오사이드, 레바우디오사이드 A, β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드, β-1,4-디갈락토실스테비오사이드, β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A, β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A, β-1,4-트리갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%를 측정하기 위해서는 액체 크로마토그래피로 얻어지는 전술한 스테비오사이드, β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드 등 각 성분의 피크를 특정할 필요가 있기 때문에 본 발명에서는 이하의 조건에 의한 액체 크로마토그래피(HPLC)를 행하여 피크 유지시간을 얻은 후, 하기 표 3에 제시한 실시예 1의 측정 결과와 같이 피크 유지시간마다 차례로 각 성분을 특정하였다.

측정 조건

칼럼: 입자 직경 5 ㎛의 NH₂기 결합 실리카(Unisil Q NH₂ 지에루사이언스 가부시키가이샤제)

칼럼 관: 내경 4.6 mm, 길이 150 mm

칼럼 조(槽) 온도: 40℃

이동상: 아세토니트릴ㆍ수 혼합액 (78:22)

유 속: 2.0 ml/분

주입량: 5 ㎕

측정파장: 210 nm

[표 3]

피크 유지시간(분)	성분명
4.662	스테비오사이드
8.070	레바우디오사이드 A
8.722	β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드
9.138	β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A
13.093	β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드
14.412	β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A
15.517	β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A
23.298	β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A
25.428	β-1,4-디갈락토실스테비오사이드
29.568	β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A
31.582	β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A
44.917	β-1,4-트리갈락토실레바우디오사이드 A

또한 이들 측정의 구체예는 본 명세서에 실시예 1로서 예시되어 있다.

[실시예]

이하에 참고예, 실시예, 비교예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 예에서 "%"는 사전 양해가 없는 한 중량 기준이다. 또한 사용한 스테비아 추출물 A1, 스테비아 추출물 A2, 스테비아 추출물 B 중의 각각의 스테비오사이드 중량%, 레바우디오사이드 A 중량%는 일본 식품첨가물협회의 화학적 합성품 이외의 심품첨가물 자주규격(제2판, 1993년 10월 1일 발행) 제122∼123쪽 "스테비아 추출물"에 기재된 정량법에 의거하여 측정한 중량 비율(%)이다.

참고예 1 (β-1,4-갈락토실 전이 효소를 산생하는 미생물을 배양한 균체 현탁액의 조제)

인산2수소칼륨 0.4%, 황산암모늄 0.5%, 황산마그네슘 0.06%, 황산아연 0.001%, 황산제1철 0.005%, 효모 추출물 0.1%, 글루코오스 1.0%, 및 락토오스 0.5%의 배지 조성으로 이루어지는 액체 배지(pH 5.2) 3리터를 용량 10리터의 자 퍼멘터(jar fermenter)에 투입하고, 가압 증기 멸균하였다. 방냉 후, 로도토룰라 마리나균을 접종하고, 30℃에서 24시간 통기 교반 배양하여 균체를 생산했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 포집하고, 농도 0.05 mol/l의 인산 완충액으로 균체를 2회 세정한 후, 동 완충액 600 ml에 현탁하여 균체 현탁액을 조제하였다. 이 균체 현탁액의 β-1,4-갈락토실 전이 효소의 총활성은 3420U이었다.

참고예 2 (β-1,4-갈락토실 전이 효소의 조(粗)효소액의 조제)

참고예 1과 동일한 액체 배지 3리터를 용량 10리터의 자퍼멘터에 투입하고, 가압 증기 멸균하였다. 방냉 후, 바실러스 서큘란스균을 접종하고 30℃에서 24시 간 통기 교반 배양하여 균체를 생산했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 포집하고, 농도 0.05 mol/l의 인산 완충액으로 균체를 2회 세정한 후, 동 완충액 100 ml에 현탁하여 균체 현탁액을 조제하였다. 이것을 초음파 파쇄에 의해 균체를 파쇄한 후에 원심분리하여 균체 파쇄물을 제거하고, 상청액을 황산암모늄 70% 포화로 염석(鹽析)하여 생성된 침전물을 원심분리에 의해 회수하였다. 회수된 침전물을 농도 0.05 mol/l의 인산 완충액 100 ml에 현탁하여 조효소액을 조제하였다. 이 조효소액의 β-1,4-갈락토실 전이 효소의 총활성은 2988U이었다.

실시예 1

스테비아 추출물 A1(스테비오사이드의 중량% 26.8%, 레바우디오사이드 A의 중량% 58.5%) 10.0 g과 갈락토실 당화합물로서 유당 100 g을 순수 500 ml로 가온 용해한 후 실온까지 방냉하고, 농도 1 mol/l의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 6.0으로 조정하였다. 이것에 참고예 1에서 얻은 β-1,4-갈락토실 전이 효소 활성을 갖는 균체 현탁액 100 ml를 가하고 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후 이 반응액을 95℃에서 30분간 유지하여 효소를 가열 실활시켰다.

상기 액을 여과하여 부유 고형물을 제거한 후, 여과액을 스티렌디비닐벤젠계 합성 흡착수지(다이아이온 HP-21) 500 ml를 충전한 칼럼에 통액하여 감미 성분을 흡착시켰다. 고정상을 충분히 수세하고 본 반응에서 사용한 유당을 제거한 후, 농도 80%의 함수 메탄올 1000 ml을 통액하고 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 포함하는 감미 성분을 용출시키고, 용출액을 감압 농축, 건조하여 담황색 분말상의 감미료(이하, 감미료 1이라 함) 11.2 g을 얻었다.

다음에, 전술한 일본 식품첨가물협회의 화학적 합성품 이외의 식품첨가물 자주규격(제2판, 1993년 10월 1일 발행) 122∼123쪽 "스테비아 추출물"에 의거하여 감미료 1 중의 레바우디오사이드 A의 중량%(RA), β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%(GRA), 스테비오사이드의 중량%(ST) 및 β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 중량%(GST)를 측정했다. 구체적인 방법을 이하에 제시한다.

감미료 1을 105℃에서 2시간 건조하고, 그 중 1.52205 g을 순수에 녹여 정확히 100 ml로 만들어 검사액을 조제하였다. 스테비오사이드 표준품으로서 와코쥰야쿠사(和光純藥工業株式會社) 제품인 순도 99.4%의 스테비오사이드를 사용하여 그 스테비오사이드를 105℃에서 2시간 건조하고 그 중 52.26 mg을 이동상에 녹여 정확히 100 ml로 만들어 스테비오사이드 표준액을 조제하였다.

동일하게 레바우디오사이드 A 표준품으로서 와코쥰야쿠사 제품인 순도 99.6%의 레바우디오사이드 A를 사용하여 그 레바우디오사이드 A를 105℃에서 2시간 건조하고 그 중 50.78 mg을 이동상에 녹여 정확히 100 ml로 만들어 레바우디오사이드 A 표준액을 조제하였다.

다음에, 검사액 및 표준액에 이어 다음의 조작 조건에서 액체 크로마토그래피법에 의한 분석을 행하였다.

검출기: 자외부 흡수 검출기(측정 파장 210 nm)

칼럼: 입자 직경 5㎛의 NH₂기 결합 실리카 (Unisil Q NH₂ 지에루사이언스 가부시키가이샤제)

칼럼 관: 내경 4.6 mm, 길이 150 mm

칼럼 조 온도: 40℃

이동상: 아세토니트릴ㆍ물 혼합액 (78:22)

유 속: 2.0 ml/분

주입량: 5㎕

액체 크로마토그래피법에 의한 분석을 행하여 얻어진 검사액의 고속 액체 크로마토그램을 도 1에 제시하고, 상기 액체 크로마토그램 중의 각 피크의 유지 시간과 성분명과의 관계를 표 4에 제시한다. 또, 검사액 중의 각 성분의 피크 면적과 표준액의 스테비오사이드, 표준품의 레바우디오사이드 A의 피크 면적을 측정한 결과를 표 5에 제시한다.

[표 4]

[표 5]

		표준액		검사액
		스테비오사이드 (순도 99.4%)	레바우디오사이드A (순도 99.6%)	효소처리 스테비아 A1
농도 (g/100 ml)		0.05226	0.05078	1.52205
면 적	스테비오사이드	361605	-	1429012
	레바우디오사이드 A	-	324814	1923081
	β-1,4-모노갈락토실 스테비오사이드	-	-	670704
	β-1,4-디갈락토실 스테비오사이드	-	-	76874
	β-1,4-모노갈락토실 레바우디오사이드 A	-	-	1346498
	β-1,4-디갈락토실 레바우디오사이드 A	-	-	802268
	β-1,4-트리갈락토실 레바우디오사이드 A	-	-	162466

다음에, 표 5의 각 성분의 면적과 다음 식을 이용하여 감미료 1 중 각 성분의 중량%(ST, ST-G1, ST-G2, RA, RA-G1, RA-G2, RA-G3)를 산출했다. 구체적인 계산예를 이하에 제시한다. 또한, ST-G1은 β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드의 중량%, ST-G2는 β-1,4-디갈락토실스테비오사이드의 중량%, RA-G1은 β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%, RA-G2는 β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%, RA-G3은 β-1,4-트리갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%를 각각 나타낸다.

ST = (스테비오사이드 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 스테비오사이드의 피크 면적×100) ÷ (시료의 채취량(g)×표준액의 스테비오사이드의 피크 면적)

=(0.05226×0.994×1429012×100)÷(1.52205×361605) = 13.5(%)

ST-G1 = (스테비오사이드 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 β-1,4-모노갈락토실스테비오사이드의 피크 면적×분자량 환산계수×100)÷(시료의 채취량(g)×표준액의 스테비오사이드의 피크 면적)

=(0.05226×0.994×670704×1.20×100)÷(1.52205×361605) = 7.6(%)

ST-G2 = (스테비오사이드 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 β-1,4-디갈락토실스테비오사이드의 피크 면적×분자량 환산계수×100)÷(시료의 채취량(g)×표준액의 스테비오사이드의 피크 면적)

=(0.05226×0.994×76874×1.40×100)÷(1.52205×361605) = 1.0(%)

RA = (레바우디오사이드 A 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 레바우디오사이드 A의 피크 면적×100)÷(시료의 채취량(g)×표준액의 레바우디오사이드 A의 피크 면적)

=(0.05078×0.996×1923081×100)÷(1.52205×324814) = 19.7(%)

RA-G1 = (레바우디오사이드 A 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 β-1,4-모노갈락토실레바우디오사이드 A의 피크 면적×분자량 환산계수×100)÷(시료의 채취량(g)×표준액의 레바우디오사이드 A의 피크 면적)

=(0.05078×0.996×1346498×1.17×100)÷(1.52205×324814)=16.1(%)

RA-G2 = (레바우디오사이드 A 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 β-1,4-디갈락토실레바우디오사이드 A의 피크 면적×분자량 환산계수×100)÷(시료의 채취량(g)×표준액의 레바우디오사이드 A의 피크 면적)

=(0.05078×0.996×802268×1.34×100)÷(1.52205×324814) = 11.0(%)

RA-G3 = (레바우디오사이드 A 표준품의 채취량(g)×표준품의 순도×검사액의 β-1,4-트리갈락토실레바우디오사이드 A의 피크 면적×분자량 환산계수×100)÷(시료의 채취량(g)×표준액의 레바우디오사이드 A의 피크 면적)

=(0.05078×0.996×162466×1.50×100)÷(1.52205×324814) = 2.5(%)

다음에, 전술한 일본 식품첨가물협회의 화학적 합성품 이외의 심품첨가물 자주규격(제2판, 1993년 10월 1일 발행) 119∼121쪽 "효소처리 스테비아"에 의거하여 감미료 1 중 스테비올 배당체의 중량% X를 측정하였다.

(1) 감미료 1 중 스테비올의 중량%의 정량

감미료 1을 105℃에서 2시간 건조하고, 110.1 mg을 플라스크에 달고, 20 v/v%의 황산(황산과 물의 혼합 용액 100 ml 중의 황산의 함유량이 20g인 혼합 용액) 10 ml를 가하고, 환류 냉각기를 부착하여 수욕 상에서 2시간 가열하고 유수 중에서 냉각 후 내용물을 분액 깔때기에 옮기고 플라스크는 물 10 ml로 세척하여 분액 깔때기에 가했다. 플라스크는 다시 에테르 30 ml씩 3회 세척하고, 세척액을 분액 깔때기에 합치고 잘 흔들어 섞은 후 정치하였다. 수층을 제거하고 에테르층을 물 20 ml씩 2회 세정한 후 수층을 제거했다. 이어서 에테르층을 별도의 플라스크에 옮기고 분액 깔때기는 에테르 10 ml씩 2회 세척하여 세척액은 플라스크에 합치 고 황산 나트륨(무수) 15 g을 가하여 잘 흔들어 섞은 후, 기울여 에테르층을 또 다른 플라스크에 옮겼다. 남은 황산나트륨은 에테르 10 ml씩 2회 세척하고 세척액을 플라스크에 합쳤다. 에테르를 증류 제거한 후, 잔류물에 에틸아세테이트 10 ml를 가하여 녹이고 2 w/v% 디아조메탄ㆍ에테르 용액(디아조메탄과 에테르의 혼합 용액 100 ml 중의 디아조메탄의 함유량이 2 g인 혼합 용액) 3 ml를 가하고 마개를 막아 가끔 흔들어 섞고 20분간 방치하였다.

이 액에 아세트산 0.5 ml를 가하여 잘 흔들어 섞은 후, 스타왈란ㆍn-부탄올 시험액(스타왈란 2.5 g을 n-부탄올에 용해하고 최종적으로 n-부탄올로 200ml가 되도록 한 것) 2ml를 정확히 가하여 검사액으로 하였다.

별도로 와코쥰야쿠사 제품인 순도 99.4%의 스테비오사이드를 105℃에서 2시간 건조하여 42.1 mg을 플라스크에 달고 감미료 1의 경우와 동일한 조작을 행하여 표준액을 조제했다.

검사액 및 표준액에 이어 다음의 조작 조건에서 가스크로마토그래피법에 의한 분석을 행했다.

검출기: 수소 불꽃 이온화 검출기

칼럼 충전제: 액상은 담체에 대해 2%인 50% 페닐메틸실리콘 폴리머이고, 담체는 177∼250 ㎛의 가스크로마토그래피용 규조토〔Silicone OV-17 2% Chromosorb WAW-DMCS 60/80(지에루사이언스 가부시키가이샤제)〕

칼럼 관: 3.2 mmΦ× 2.1 m의 유리관

칼럼 조 온도: 245℃

주입구 온도: 260℃

캐리어 가스: 질소 가스

유 속: 50 ml/분

주입량: 2 ㎕

검사액의 스쿠왈란, 이소스테비올메틸에스테르의 피크 면적 및 표준액의 스쿠알란, 이소스테비올메틸에스테르의 피크 면적을 측정한 결과를 표 6에 제시한다.

[표 6]

	표준액(순도 99.4%)	검사액
시료량	42.10 mg	110.0 mg
스쿠알란의 피크 면적	3926785	3887140
이소스테비올메틸에스테르 의 피크 면적	3082803	5168502

얻어진 피크 면적과 다음 식에 의해 감미료 1 중의 스테비올의 중량%를 구했다.

A = (As×S×표준품 스테비오사이드의 순도×100×K)/(Ast×X) …식 (8)

상기 식에서,

A: 시료의 스테비올의 중량 비율(%),

S: 스테비오사이드 채취량(mg),

X: 시료 채취량(mg),

K: 스테비올로의 환산 계수 318.46/804.88=0.3957이다.

본 실시예에서, As=5168502/3887140=1.330, Ast=3082803/3926785=0.785이다. 따라서 스테비올의 중량%는 (1.330×42.1×0.994×100×0.3957)/(0.785× 110.1 )=25.5%이다.

(2) 스테비올 배당체 중 당의 중량%의 정량

감미료 1을 105℃에서 2시간 건조하고, 1.0074 g을 달아 물 500 ml에 용해하여 시료액을 조제했다.

안트론 200 mg을 달아 황산 100 ml에 녹이고, 이것을 빙냉하면서 물 20 ml 중에 서서히 가하여 혼합하고, 안트론 시험액을 조제했다. 시료액을 물로 50배 희석하여 검사액으로 만들었다. 검사액을 2 ml를 정확히 마개있는 시험관에 취하고 이것을 얼음물 중에서 냉각하면서 안트론 시험액 6 ml를 정확히 가하고, 두 액이 완전히 혼합할 때까지 잘 흔들어 섞었다. 이어서 비등수욕(沸騰水浴) 속에서 정확히 16분간 가열했다. 얼음 냉각 후, 물을 대조로 하여 파장 620 nm의 흡광도를 측정한 바 0.313이었다.

다음에, 미리 제조한 글루코오스 검량선으로부터 검사액의 글루코오스 농도(㎍/ml)를 구했다. 글루코오스 검량선은 글루코오스 10.96 ㎍/ml, 32.88 ㎍/ml, 및 54.80 ㎍/ml의 용액에 대해 검사액과 동일하게 조작하여 얻어진 각각의 흡광도와 농도로부터 만들었다. 본 실시예에서 사용한 글루코오스 검량선의 글루코오스 농도와 흡광도를 표 7에 제시한다.

[표 7]

글루코오스 농도 (㎍/ml)	흡광도
10.96	0.137
32.88	0.362
54.80	0.593

검량선은 식: 당 농도(㎍/ml) = 96.31×흡광도-2.15로 표기된다. 검사액의 파장 620 nm에서의 흡광도(0.313)와 검량선으로부터 검사액 중의 당 농도를 구했다.

검사액의 당 농도(㎍/ml) = 96.31×0.313-2.15 = 28.0

또한, 다음 식에 의해 스테비올 배당체 중 당의 중량%를 구했다.

배당체 중 당의 중량 비율(%) = 〔검량선으로부터 구한 당 농도(㎍/ml)×0.9×50×500×100〕÷〔시료 채취량(g)×1000×1000〕

= (28.0×0.9×50×500×100)÷(1.0074×1000×1000) = 62.5%

(3) 스테비올 배당체의 중량%의 계산

스테비올의 중량%와 배당체 중 당의 중량%의 값의 합을 취하여 스테비올 배당체의 중량%로 한다. 감미료 1 중의 스테비올 배당체의 중량%는 25.5 + 62.5 = 88.0(%)이었다.

감미료 1 중 각 성분의 중량%(ST, RA, ST-G1, ST-G2, RA-G1, RA-G2, RA-G3 및 X), 〔(GRA+RA)/(X)〕의 값 및 〔(GRA)/(RA)〕의 값을 표 8에 제시한다.

실시예 2

스테비아 추출물 A1(스테비오사이드의 중량% 26.8%, 레바우디오사이드 A의 중량% 58.5%) 10.0 g과 갈락토실 당화합물로서 유당 100 g을 순수 500 ml에 가온 용해한 후 실온까지 방냉하고, 농도 1 mol/l의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 6.0으로 조정하였다. 이것에 참고예 2에서 얻은 β-1,4-갈락토실 전이 효소 활성을 갖는 조효소액 전량을 가하고 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 이 반응액을 95℃에서 30분간 유지하여 효소를 가열 실활시켰다.

반응액을 여과하여 부유 고형물을 제거한 후, 반응 여과액을 스티렌디비닐벤젠계 합성 흡착수지(다이아이온 HP-21) 500 ml를 충전한 칼럼에 통액하여 감미 성분을 흡착시켰다. 고정상을 충분히 수세하고 본 반응에서 사용한 유당을 제거한 후, 농도 80%의 함수 메탄올 1000 ml을 통액하고 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 포함하는 감미 성분을 용출시키고, 용출액을 감압 농축 및 건조하여 담황색 분말인 감미료(이하, 감미료 2라 함) 11.1 g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 감미료 2 중 각 성분을 정량하였다. 그 결과를 표 8에 제시한다.

실시예 3

고도로 정제하여 레바우디오사이드 A를 90 중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 A2(스테비오사이드의 중량% 1.1 중량%, 레바우디오사이드 A의 중량% 91.3 중량%) 10.0 g과 갈락토실 당화합물로서 유당 100 g을 순수 500 ml에 가열 용해한 후, 실온까지 방냉하고, 농도 1 mol/l의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 6.0으로 조절하였다. 이것에 β-1,4-갈락토실 전이 효소 활성을 갖는 효소 제제〔비오락타 N5, 야마토가세이사 제품〕를 1.0 g(2477U) 가하고 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 이 반응액을 95℃에 30분간 유지하여 효소를 가열 실활시켰다.

반응액을 여과하여 부유 고형물을 제거한 후, 반응 여과액을 스티렌디비닐벤젠계 합성 흡착 수지(다이아이온 HP-21) 500 ml를 충전한 칼럼에 통액하여 감미 성분을 흡착시켰다. 고정상을 충분히 수세하여 본 반응에서 사용한 유당을 제거한 후, 농도 80%의 함수 메탄올 1000 ml를 통액하고, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 포함하는 감미 성분을 용출시키고 용출액을 감압 농축하고 건조하여 담황색 분말인 감미료(이하, 감미료 3이라 함) 10.4 g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 감미료 3 중 각 성분의 정량을 행했다. 그 결과를 표 8에 제시한다.

비교예 1

스테비아 추출물 B(스테비오사이드의 중량% 79.7%, 레바우디오사이드 A의 중량% 11.1%) 10.0 g과 갈락토실 당화합물로서 유당 100 g을 순수 500 ml에 가열 용해한 후, 실온까지 방냉하고, 농도 1 mol/l의 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 6.0으로 조절하였다. 이것에 참고예 1에서 얻은 β-1,4-갈락토실 전이 효소 활성을 갖는 균체 현탁액 100 ml를 가하고 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 이 반응액을 95℃에 30분간 유지하여 효소를 가열 실활시켰다.

반응액을 여과하여 부유 고형물을 제거한 후, 반응 여과액을 스티렌디비닐벤젠계 합성 흡착 수지(다이아이온 HP-21) 500 ml를 충전한 칼럼에 통액하여 감미 성 분을 흡착시켰다. 고정상을 충분히 수세하여 본 반응에서 사용한 유당을 제거한 후, 농도 80%의 함수 메탄올 1000 ml를 통액하고, β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A를 포함하는 감미 성분을 용출시키고 용출액을 감압 농축하고 건조하여 담황색 분말인 감미료(이하, 감미료 1'이라 함) 11.0 g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 감미료 1' 중 각 성분의 정량을 행했다. 그 결과를 표 8에 제시한다.

[표 8]

		실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1
	감미료	1	2	3	1'
중 량 비 율 (%)	ST	13.5	14.1	0.8	42.6
	RA	19.7	23.6	32.4	4.2
	ST-G1	7.6	9.0	0.2	23.2
	ST-G2	1.0	1.1	0.0	3.4
	GST	8.6	10.1	0.2	26.6
	RA-G1	16.1	18.0	27.4	6.4
	RA-G2	11.0	12.8	17.0	2.8
	RA-G3	2.5	3.6	3.3	0.5
	GRA	29.6	34.4	47.7	9.7
	X	88.0	87.8	86.5	89.9
(GRA+RA)/X		0.56	0.66	0.92	0.15
GRA/RA		1.50	1.46	1.47	2.31

시험예 1∼3 및 비교 시험예 1∼4 (감미도의 평가)

감미료 1, 감미료 2, 감미료 3, 감미료 1', 원료로서 사용한 스테비아 추출물 A1, 스테비아 추출물 A2 및 스테비아 추출물 B를 이용하여 감미도의 평가를 행 했다.

감미도의 평가

설탕의 8% 농도 수용액을 만들어 이것을 설탕 표준 수용액으로 삼았다. 감미료 1, 감미료 2, 감미료 3, 감미료 1', 원료로서 사용한 스테비아 추출물 A1, 스테비아 추출물 A2 및 스테비아 추출물 B의 0.025∼0.080% 농도의 수용액을 0.005% 단계 농도로 8종류의 시료 수용액을 만들고, 각각의 수용액과 표준 수용액을 비교하여 감미도를 측정했다. 시험은 시료 수용액과 설탕 표준 수용액의 2점 비교법으로 20인의 심사원에 의해 실온 25℃에서 행했다. 그 결과를 표 9 및 표 10에 제시한다.

[표 9]

	시험예									비교시험예
	1			2			3			1
시료농도	감미료 1			감미료 2			감미료 3			감미료 1'
시료농도	진 함	같 음	옅 음	진 함	같 음	옅 음	진 함	같 음	옅 음	진 함	같 음	옅 음
0.040%	0	0	20	0	0	20	0	0	20	0	0	20
0.045%	0	0	20	0	0	20	0	2	18	0	0	20
0.050%	0	2	18	0	2	18	4	12	4	0	0	20
0.055%	0	8	12	2	13	5	9	11	0	0	2	18
0.060%	5	12	3	2	15	3	19	1	0	2	9	9
0.065%	9	8	3	10	9	1	20	0	0	2	15	3
0.070%	14	6	0	17	3	0	20	0	0	10	9	1
0.075%	17	3	0	19	1	0	20	0	0	17	3	0
0.080%	20	0	0	20	0	0	20	0	0	20	0	0

[표 10]

비교 시험예	2			3			4
	스테비아 추출물 A1			스테비아 추출물 A2			스테비아 추출물 B
시료농도	진 함	같 음	옅 음	진 함	같 음	옅 음	진 함	같 음	옅 음
0.025%	0	0	20	0	0	20	0	0	20
0.030%	0	0	20	0	4	16	0	0	20
0.035%	0	3	17	1	15	4	0	0	20
0.040%	2	9	9	12	8	0	0	4	16
0.045%	6	10	4	18	2	0	7	9	4
0.050%	17	3	0	20	0	0	10	10	0
0.055%	19	1	0	20	0	0	18	2	0
0.060%	20	0	0	20	0	0	20	0	0

표 9 및 표 10에 제시된 결과로부터, 설탕 농도 8%에 상당하는 농도는 감미료 1은 0.060%(감미도 133배), 감미료 2는 0.0575%(감미도 139배), 감미료 3은 0.0525%(감미도 152배), 감미료 1'은 0.0650%(감미도 123배)였다. 또, 스테비아 추출물 A1은 0.0425%(감미도 188배), 스테비아 추출물 A2는 0.0350%(감미도 229배), 스테비아 추출물 B는 0.0475%(감미도 168배)였다.

이러한 결과로부터 갈락토실기를 β-1,4 결합시킨 감미료의 감미도는 원료인 스테비아 추출물 A1, 스테비아 추출물 A2, 스테비아 추출물 B 각각의 감미도의 70% 정도를 유지하고 있어 높은 감미도를 갖는 것이 밝혀졌다.

시험예 4∼6 및 비교 시험예 5 (감미질의 평가)

감미료 1, 감미료 2, 감미료 3 및 감미료 1'를 사용하여 감미질의 평가를 행했다.

전술한 설탕 농도 8% 수용액에 상당하는 농도의 각 감미료 수용액을 조제하고, 감미질로서 주로 앞맛(前味)으로서 느껴지는 부드러움 및 뒷맛으로서 느껴지는 쓴 맛이나 떫은 맛 등의 혐미(嫌味), 나아가서 감미의 상승, 마무리 및 예리함에 관해서 동등한 감미도를 갖는 설탕과 비교해서 평가하였다. 그 결과를 표 11에 제시한다.

[표 11]

시험예		시험예 1			시험예 2			시험예 3			비교시험예 5
		감미료 1			감미료 2			감미료 3			감미료 1'
		좋 음	같 음	나 쁨	좋 음	같 음	나 쁨	좋 음	같 음	나 쁨	좋 음	같 음	나 쁨
감 미 질	부드러움	2	17	1	0	19	1	3	17	0	0	9	11
	쓴 맛	1	16	3	0	16	4	0	18	2	0	2	18
	감미의 상승	1	15	4	3	15	2	1	19	0	0	6	14
	감미의 마무리	2	16	2	2	16	2	3	16	1	0	6	14
	감미의 예리함	2	15	3	3	15	2	3	16	1	1	14	5
	설탕과의 총합비교	2	17	1	1	18	1	2	17	1	1	8	11

표 11에 나타낸 결과로부터 감미료 1'에서는 감미질의 예리함은 거의 동등한 평가였으나, 쓴 맛, 감미의 마무리, 감미의 상승 항목에서는 낮은 평가이고, 미질의 개선 효과가 적은 것이 밝혀졌다. 이에 반해 감미료 1, 감미료 2 및 감미료 3은 감미료 1'에 비해 주로 앞맛의 부드러움이 개선되고, 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛 등의 혐미를 더욱 억제할 수 있고 전체로서 설탕에 유사한 양호한 감미질로 개선되었다.

응용예 1

과립화당 30 g, 이성화당 170 g, 시트르산 3.0 g, 시트르산나트륨 0.20 g, 사이더 에센스 0.20 g, 감미료 1 0.22 g, 및 탄산수를 혼합하여 2리터의 사이더를 조제했다. 20명의 심사원에 의한 음미 시험 결과 감미료 1을 사용한 사이더는 깔끔한 단 맛이며 맛의 마무리가 양호한 사이더였다.

비교 응용예 1

감미료 1을 0.22 g 사용하는 대신에 감미료 1'을 0.30 g 사용한 것 이외에는 응용예 1과 동일한 방법으로 사이더를 만들었다. 응용예 1과 동일하게 음미 시험을 행한 결과, 감미의 상승이나 마무리가 나쁘게 느껴지는 사이더였다.

응용예 2

과립화당 11 g, 이성화당 141 g, 분말 커피 20 g, 탈지분유 76 g, 감미료 1 0.26 g, 및 온수를 혼합하여 2리터의 커피를 조제했다. 20명의 심사위원에 의한 음미 시험 결과, 커피의 쓴 맛과 어울리는 양호한 감미를 가지는 커피였다.

비교 응용예 2

감미료 1을 0.26g 사용하는 대신에 감미료 1'을 0.30 g 사용한 것 이외에는 응용예 2와 동일한 방법으로 커피를 만들었다. 응용예 2와 동일하게 미각 시험을 행한 결과, 커피의 쓴 맛과 단 맛이 느껴지는 타이밍이 일치되지 않고 부자연스러움이 느껴지는 커피였다.

참고예 3(β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 존재의 확인)

실시예 1의 액체 크로마토그래피법에 의한 분석과 동일한 조건에서, 감미료 3을 액체 크로마토그래피법으로 분획하여 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 추정 피크 유분을 단리(單離)하였다. 이것들은 분말화하고 순수에 용해하여 2% 수용액을 만들었다. 이 용액 1 ml를 시험관에 담고 이것에 β-D-갈락토시다아제(와코쥰야쿠 고교가부시키가이샤 제품)를 10 유닛/ml가 되도록 첨가한 후, 30℃에서 24시간 반응시켰다.

얻어진 β-D-갈락토시다아제 처리물을 실리카겔 플레이트 60F254 TLC 플레이트(메르크사 제품)에 점적하고, 대조로서 스테비오사이드, 레바우디오사이드 A, 분취한 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 및 D-갈락토오스를 점적하였다. 이 플레이트를 클로로포름:메탄올:물 = 30:20:4(체적비)의 전개 용매에 전개했다. 충분히 기류 건조 후, 0.2% 아니스알데히드를 함유시킨 진한 황산을 분무하고 100℃에서 10분간 가열하여 발색시켰다. 이 박층 크로마토그램을 도 2에 제시한다.

도 2의 (a)는 스테비오사이드를 점적한 것, (b)는 레바우디오사이드 A를 점적한 것, (c)는 분취한 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 추정 성분을 점적한 것, (d)는 분취한 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 β-D-갈락토시다아제 처리물을 점적한 것, 그리고 (e)는 D-갈락토오스를 점적한 것을 각각 전개한 것을 나타낸다.

도 2에 나타낸 바와 같이, HPLC 분취한 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 추정 피크 유분을 점적한 (c)는 Rf값 0.35 부근으로부터 0.53 부근까지의 연속한 발색 스폿이 관찰된 것에 반해, β-D-갈락토시다아제 처리하여 얻어진 시료를 점적한 (d)는 Rf값 0.35 부근으로부터 0.53 부근까지의 연속한 발색 스폿이 거의 소실되고, 겨우 Rf값 0.48의 잔존 스폿과 새로 레바우디오사이드 A의 발색 스폿 (b)와 일치하는 Rf값 0.55의 스폿과, D-갈락토오스의 발색 스폿 (e)와 일치하는 Rf값 0.25의 스폿이 출현하였다.

이상의 결과로부터 Rf값 0.35 부근으로부터 0.53 부근까지의 연속한 발색 스폿이 레바우디오사이드 A와 D-갈락토오스가 결합되어 있는 물질, 즉 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A 유도체인 것으로 확인할 수 있었다.

본 발명에 따르면 스테비아 감미료가 높은 감미도를 남기면서, 설탕과 유사한 순한 감미질이고 감미의 상승이 빠르고 감미의 마무리가 양호하며, 스테비아 감미료 특유의 뒷맛의 쓴 맛이나 떫은 맛을 저감시킨 감미료가 제공된다.

Claims

스테비올 배당체를 함유하고, 또한 하기 식 (1) 및 식 (2)를 만족시키는 것을 특징으로 하는 감미료:

〔(GRA + RA)/(X)〕≥ 0.4 (1)

〔(GRA)/(RA)〕≥ 1.0 (2)

〔상기 식에서, GRA는 감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼3개 가지는 β-1,4-갈락토실레바우디오사이드 A의 중량%를 나타내고, RA는 감미료 중에 포함되는 레바우디오사이드 A의 중량%를 나타내고, X는 감미료 중에 포함되는 스테비올 배당체의 중량%를 나타냄〕
제1항에 있어서,

하기 식 (3) 및 (4)를 만족시키는 감미료:

0.95 ≥〔(GRA + RA)/(X)〕≥ 0.5 (3)

10.0 ≥〔(GRA)/(RA)〕≥ 1.1 (4)
제1항 또는 제2항에 있어서,

하기 식 (5)를 만족시키는 감미료:

〔(GRA + RA)/(GST + ST)〕≥ 1.0 (5)

〔상기 식에서, GST는 감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼2개 가지는 β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 중량%를 나타내고, ST는 감미료 중에 포함되는 스테비오사이드의 중량%를 나타냄〕
제1항에 있어서,

하기 식 (3), (6) 및 (7)을 만족시키는 감미료:

0.95 ≥〔(GRA + RA)/(X)〕≥ 0.5 (3)

5.0 ≥ [(GRA)/(RA)〕≥ 1.1 (6)

〔(GRA + RA)/(GST + ST)〕≥ 1.5 (7)

(상기 식에서, GST는 감미료 중에 포함되는 β-1,4- 결합 갈락토실기를 1분자 중에 1∼2개 가지는β-1,4-갈락토실스테비오사이드의 중량%를 나타내고, ST는 감미료 중에 포함되는 스테비오사이드의 중량%를 나타냄)
레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 및 상기 스테비아 추출물 고형분 중량의 5∼20배량의 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액에 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 감미료의 제조 방법.
제5항에 있어서,

상기 수용액 중의 레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물 고형분 농도가 1∼5중량%이며, 또한 β-1,4-갈락토실 전이 효소를 상기 스테 비아 추출물 고형분 1g에 대하여 1∼1000유닛 사용하는 감미료의 제조 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서,

상기 레바우디오사이드 A를 40중량% 이상 포함하는 스테비아 추출물이 스테비오사이드에 대하여 1.5중량배 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 스테비아 추출물인 감미료의 제조 방법.
제7항에 있어서,

상기 β-1,4-갈락토실 당화합물이 유당인 감미료의 제조 방법.
제7항에 있어서,

상기 β-1,4-갈락토실 전이 효소가 바실루스속 미생물 유래의 효소인 감미료의 제조 방법.