CN1408262A - 甜味料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种甜味料及其制备方法，上述甜味料含有甜菊醇糖苷且满足下式(1)和式 (2)。〔(GRA+RA)/(X)〕≥0.4 (1)〔(GRA)/(RA)〕≥1.0 (2)〔式中GST表示甜味料中的在每个分子中含有1至3个β－1，4－键半乳糖基的β－1，4－半乳糖基新甜菊苷A的重量比，RA表示甜味料中含有的新甜菊苷A的重量比，X表示甜味料中含有的甜菊醇糖苷的重量比例〕，上述甜味料既保持斯特维亚甜味料的高甜度，且具有类似于砂糖的圆润甜度，甜味感来得快，甜味余感良好，并减少斯特维亚甜味料特有的后苦味或后涩味的甜味料。

Description

甜味料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种主要成分为新甜菊苷A和β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的甜味料及其制备方法，该甜味料具有高甜度和优质甜味，并可作为各种饮食品甜味剂应用。
背景技术
砂糖(蔗糖)作为饮食品的甜味料，一直应用很广泛。特别在以罐装咖啡作为代表的咖啡饮料等或碳酸饮料等清凉饮料中需要使用大量的砂糖。但是，近年来，受到健康意向或低热量意向的影响，出现的倾向是减少砂糖的使用量以避免肥胖、糖尿病、虫牙等或替代砂糖使用高甜度甜味料。
上述具有高甜度的甜味料可以举例为由原产地在南美巴拉圭的菊科多年生植物即斯特维亚菊新甜菊Bertoni(Stevia rebaudiana BERTONI)萃取物得来的斯特维亚菊甜味料。
由斯特维亚菊植物的萃取物(以下称斯特维亚菊萃取物)得来的斯特维亚菊甜味料具有相当于砂糖数百倍的优良甜度，但与砂糖相比有甜味感滞后的特点，即所谓的甜味感来得迟的特点和作为后味甜感较长时间残留的特点即所谓的甜味的余感差的特点。另外，上述斯特维亚菊甜味料中大量存在的甜菊苷除了甜味之外在后味上伴有独特的涩味或苦味，所以如果使用于咖啡饮料或清凉饮料中时明显有不调和的感觉。
因此，为了改善特维亚菊甜味料的甜味质量，进行了各种研究。例如在特开昭58-094367号公报中提出了在含有以甜菊苷作为主要成分的斯特维亚菊萃取物和β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中加入β-1，4-半乳糖转移酶，制备出在甜菊苷上以β-1，4键结合半乳糖基后的β-1，4糖基甜菊苷作为主要成分的甜味料的制备方法。
根据上述方法，能够改善甜味的圆润感，并且甜味的余感也较好，也减少了苦味和涩味，但是甜味质量的改善效果并不充分，特别是使用于咖啡饮料或清凉饮料时，仍然欠佳。
另外，在特开平9-107913号公报等中，提出在新甜菊苷A作为主要成分的斯特维亚菊萃取物上α-加成反应葡萄糖的方法。但是，随酶反应的进行，结合到新甜菊苷A上的葡萄糖形成长长的葡萄糖链，而得到的α-葡萄糖基新甜菊苷A的甜度比新甜菊苷A甜度降低45％左右。
如上述，以往的糖结合斯特维亚菊甜味料是通过糖的结合在一定程度上改善了甜味质量，但甜度降低，并且对斯特维亚甜味料特有的缺陷即甜味来得慢，后味伴有苦味或涩味这一点的改善上还不够充分，所以使用于咖啡饮料或清凉饮料时留下不调和之感。
发明内容
本发明的目的是提供一种既保持斯特维亚菊甜味料的高甜度，且具有类似于砂糖的圆润甜质，并甜味来得快，甜味余感良好，减少斯特维亚菊甜味料特有的后苦味或后涩味的甜味料及其制备方法。
本发明者等进行锐意研究的结果得出了下述结论。
(A)甜味料中含有的每个分子中含有1至3个β-1，4-半乳糖基的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的重量比例(GRA)、甜味料中含有的新甜菊苷A的重量比例(RA)以及甜味料中含有的甜菊醇糖苷的重量比例(X)满足特定关系的甜味料就是具有类似于砂糖的圆润甜味，甜味开始时间快，甜味余感良好的减少斯特维亚菊甜味料特有的后苦味或后涩味的甜味料。
(B)每个分子中含有1至3个β-1，4-半乳糖基的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A，因为结合到新甜菊苷A的半乳糖基上没有进一步加聚半乳糖基，所以甜度的下降控制在新甜菊苷A的30％左右。
(C)通过在含有新甜菊苷A组分占40重量％以上的斯特维亚菊的萃取物和上述斯特维亚菊的萃取物固形物重量的5至20倍量的β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中作用β-1，4-半乳糖转移酶的方法而容易制得上述甜味料。
本发明是基于上述结论完成的。
即本发明提供了含有甜菊醇糖苷且满足下式(1)和(2)的甜味料。
〔(GRA+RA)/(X)〕≥0.4             (1)
〔(GRA)/(RA)〕≥1.0               (2)
〔式中GST表示甜味料中含有的在每个分子中含有1至3个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的重量比例，RA表示甜味料中含有的新甜菊苷A的重量比例，X表示甜味料中含有的甜菊醇糖苷的重量比例。〕
另外本发明提供甜味料制备方法，其特征在于，在含有新甜菊苷A组分占40重量％以上的斯特维亚菊的萃取物和上述斯特维亚菊的萃取物固形物重量的5至20倍量的β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中作用β-1，4-半乳糖转移酶。
本发明具有以下效果。
本发明通过使甜味料中含有的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的重量比(GRA)和甜味料中含有的新甜菊苷A的重量比(RA)之和(GRA+RA)与甜味料中含有的甜菊醇糖苷的重量比例(X)的比值大于0.4且使GRA/RA比值大于1.0，可使上述甜味料具有类似于砂糖的圆润甜质，且使甜味开始时间快，甜味余感良好，并减少斯特维亚菊甜味料特有的后苦味或后涩味。
另外，β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A，因为结合到新甜菊苷A的半乳糖基上没有进一步加聚半乳糖基，所以甜度的下降控制在新甜菊苷A的30％左右。
另外本发明的甜味料制备方法是，在含有新甜菊苷A组分占40重量％以上的斯特维亚菊的萃取物和上述斯特维亚菊萃取物重量的5至20倍量的β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中作用β-1，4-半乳糖转移酶的简单制备方法，并能够合适地制备具有类似于砂糖的圆润甜质，甜味开始时间快，甜味余感良好的减少斯特维亚甜味料特有的后苦味或后涩味的甜味料。
附图说明
图1为实施例1的甜味料1的高效液相色谱图。
图2为β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的薄层层析图。
具体实施方式
本发明的甜味料可以是含有甜菊醇糖苷且满足上述式(1)和式(2)的甜味料，但为了具有更为圆润的甜味，理想的是满足下述式(3)和(4)，如果还进-步满足下式(5)将更理想。
0.95≥〔(GRA+RA)/(X)〕≥0.5       (3)
10.0≥〔(GRA)/(RA)〕≥1.1         (4)
〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≥1.0        (5)〔式中，GRA和RA的表示如上所述，GST表示甜味料中含有的在每个分子中含有1至2个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基甜菊苷的重量比，ST表示甜味料中含有的甜菊苷的重量比。〕
另外，为了得到特别圆润的甜味，最理想是同时满足上式(3)、下式(6)以及式(7)。
 5.0≥〔(GRA)/(RA)〕≥1.1              (6)
〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≥1.5             (7)(式中，GRA、RA、GST以及ST表示的含义同前所述。)
对获得本发明甜味料的方法，没有特别的限定，但是通过上述本发明的制备方法即在含有新甜菊苷A占40重量％以上的斯特维亚菊的萃取物和上述斯特维亚菊的萃取物固形物重量的5至20倍量的β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中作用β-1，4-半乳糖酶的方法，因为能够容易得到满足上式(1)和式(2)的甜味料，即具有类似砂糖圆润的甜味质量且迅速感知甜味、甜味余感良好的减少斯特维亚菊甜味料特有的后苦味或后涩味的甜味料，所以是理想的。
如果使用新甜菊苷A组分含量小于40重量％范围的斯特维亚菊萃取物的制备方法，则因为在每个分子中含有1至3个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A(以下称β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A)的重量比和新甜菊苷A的重量之和(GRA+RA)变小，同时在每个分子中含有1至2个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基甜菊苷(以下称β-1，4-半乳糖基甜菊苷)的重量比和甜菊苷重量比之和(GRA+ST)变大，所以很难得到满足上式(1)和式(2)的甜味料，并且甜味的圆润质量下降、甜味开始时间变慢和甜味余感变差、且伴有斯特维亚菊甜味料特有的后苦味或涩味，从而不理想。
斯特维亚菊萃取物中通常含有由甜菊苷、新甜菊苷A、新甜菊苷C以及卫矛醇苷A(Dulcoside)等甜菊醇糖苷所组成的甜味成分，而甜菊苷的结构如下。
Figure A0214249000081
另外，在上述甜菊苷结构中，用13-G1所表示的葡萄糖残基上进一步结合葡萄糖后得到新甜菊苷A，其结构式如下。
Figure A0214249000082
用于上述本发明的制备方法中的β-1，4-半乳糖基糖化合物的代表例是半乳糖和葡萄糖结合的二元糖类、例如乳糖，α-D-半乳糖等。它们的结构如下。
本发明的甜味料所含有的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A可以是例如在新甜菊苷A的甜菊醇骨架的13位上结合的葡萄糖残基(称为13-G1)，在上述甜菊醇骨架的13位上结合的葡萄糖残基上结合的2个葡萄糖残基(称作13-G2、13-G3)以及在甜菊醇骨架的19位上结合的4个葡萄糖残基(称作19-G1)中的1至3个葡萄糖残基上分别以β-1，4键结合1个半乳糖基后得到物质等。
推断出在新甜菊苷A的葡萄糖残基中，通过β-1，4-半乳糖转移酶的作用，使半乳糖基容易向β-1，4-转移的残基是13-G2、13-G3以及19-G1的3个葡萄糖残基。实际上，在后述的实施例中通过高效液相色谱分析确认在新甜菊苷A中结合1至3个半乳糖基后的产物β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的峰。
我们推断，由于空间阻碍效应，在上述13-G2、13-G3以及19-G1的3个葡萄糖残基上以β-1，4-键形式分别结合1个上述葡萄糖基，随着酶反应的进行，依次形成在新甜菊苷A上结合1个β-1，4-半乳糖基后的化合物(β-1，4-一半乳糖基新甜菊苷A)，接着结合2个β-1，4-半乳糖基后的化合物(β-1，4-二半乳糖基新甜菊苷A)，接着结合3个β-1，4-半乳糖基后的化合物(β-1，4-三半乳糖基新甜菊苷A)，而本发明提供的甜味料中的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A是由上述多个β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的混合物组成。
但是，在本发明中使用的甜味料中，只要主要成分是通过β-1，4-半乳糖转移酶的作用，将β-1，4-半乳糖基糖化合物中的半乳糖基转移到新甜菊苷A后得到的半乳糖基新甜菊苷A，那么除上述主要成分β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A之外例如含有在上述13-G1中结合β-1，4后的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A或者是含有少量的其它半乳糖基新甜菊苷A也可以。
另外，作为用于本发明的甜味料制备方法中的斯特维亚菊萃取物，必须含有40重量％以上的新甜菊苷A组分，特别为了能够更容易地得到具有圆润的甜味质量且迅速感知甜味、余感良好的甜味，并降低斯特维亚菊甜味料特有的后苦味或涩味的甜味料，理想的是在斯特维亚菊萃取物中含有50重量％以上的新甜菊苷A组分，而更理想的是斯特维亚菊萃取物中含有70至95重量％以上的新甜菊苷A组分。另外，作为本发明的制备方法中使用的斯特维亚菊萃取物最好是其中的新甜菊苷A重量为甜菊苷重量1.5倍以上。这可能是因为通过β-1，4-半乳糖转移酶的作用，半乳糖基转移到新甜菊苷A后得到的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的甜度，虽然不如原来的新甜菊苷A，但其甜度下降率与在甜菊苷上结合半乳糖基后得到的β-1，4-半乳糖基甜菊苷相比较非常微小的缘故。另外，如果斯特维亚菊萃取物中新甜菊苷A的含量小于40重量％，则得到的甜味料的甜度和甜味质量下降，并且甜味质量也不太好，所以不理想。
获得满足上述条件的斯特维亚菊萃取物的方法，通常是下述的2种方法，但并不限定于下述方法。
第1种方法是，利用水或含水甲醇、含水乙醇等含水有机溶剂萃取新甜菊苷A含量大于40重量％且新甜菊苷A重量为甜菊苷重量1.5倍的新甜菊苷BERTONI的植物体或干燥叶，然后从得到的萃取液中去除非甜味组分的方法。
第2种方法是，利用水或含水甲醇、含水乙醇等含水有机溶剂萃取相对甜菊苷以任意比例含有新甜菊苷A的新甜菊苷BERTONI的植物体或干燥叶，然后从得到的萃取液中去除非甜味组分，最后通过再结晶或柱层析等-般方法分离、精制萃取液，得含有40重量％以上的新甜菊苷A，且新甜菊苷A重量为甜菊苷重量的1.5倍以上。也可以组合上述方法1和方法2实施。
在上述方法1和方法2中，除去非甜味组分的方法有例如用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂除去斯特维亚菊萃取液中以离子形式存在的杂质，然后用吸附树脂吸附甜味组分，接着用甲醇和乙醇等亲水性有机溶剂洗脱，最后减压浓缩洗脱液的方法。与上述方法相反的，有先用吸附树脂吸附甜味组分，然后用甲醇和乙醇等亲水性有机溶剂洗脱，接着通过减压浓缩洗脱液除去上述有机溶剂，最后用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂除去以离子形式存在的杂质方法等一般的精制方法。
上述阳离子交换树脂可以举例为阿姆伯拉特(Amberlite)IR-120B(olgano株式会社产品)等，阴离子交换树脂可以举例为olgano株式会社制造的阿姆伯拉特IRA-93等。吸附树脂可以举例为如olgano株式会社制造的阿姆伯拉特XAD-2等。
另外，在上述第2种方法中，从萃取液中去除非甜味成分后，为了含有40重量％以上的新甜菊苷A且使新甜菊苷A重量为甜菊苷重量的1.5倍以上而进行的分离和精制工业方法可以举例为再结晶方法，即将除去非甜味成分的斯特维亚菊萃取物溶解于甲醇和乙醇等亲水性有机溶剂中，使其达到饱和浓度，然后通过浓缩、冷却等方法选择性地析出新甜菊苷A，最后通过过滤等方法分离结晶。
对本发明所使用的β-1，4-半乳糖基糖化合物的要求是，只要能够成为β-1，4-半乳糖转移酶的底物，且把β-1，4-半乳糖基从β-1，4-半乳糖基糖化合物转移到新甜菊苷A的就可以，虽然没有特别的限定，但从来源方便的角度考虑最理想的是乳糖。
作为本发明中所使用的β-1，4-半乳糖转移酶，只要具有β-1，4-半乳糖转移活性的酶就可以，可以例举，由产生β-1，4-半乳糖转移活性酶的微生物生产出来的酶，其中，因为从培养上述微生物的培养菌体中提取的酶的操作简单，所以是理想的，也可以代替β-1，4-半乳糖转移酶，直接使用培养产生β-1，4-半乳糖转移酶的微生物的菌体悬浮液，或者是固定上述微生物的固定化菌体。从上述培养菌体中提取出的酶例举为水解乳糖的乳糖酶，如大和化成株式会社制的biolacto等。
作为生产上述β-1，4-半乳糖转移酶的微生物理想的是，红酵母属微生物，特别是红酵母minuta(Rhodotorula minuta)IFO-1540、红酵母marina(Rhodotorula marina)IFO-1421、红酵母lactosa(Rhodotorula lactosa)IFO-1424。
另外，使用芽孢杆菌属微生物也是理想的，特别理想是使用环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。另外，作为生产上述β-1，4-半乳糖转移活性酶的微生物，只要是不象病原菌等具有对饮食物不好的性质，能够生产出β-1，4-半乳糖转移活性酶的微生物就可以使用，并非局限于上述属或种类微生物。
上述微生物是通过在适合-般微生物生长的培养基例如作为碳源含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油等，作为氮源含有硫酸铵，硝酸铵、尿素、乙酸铵等，作为含氮天然物含有酵母提取液、玉米浆等，作为无机盐含有磷酸钾、磷酸钙、氯化钠、硫酸镁等，还含有维生素类、微量金属盐等的培养基中进行培养而得到。
从β-1，4-半乳糖基糖化合物向新甜菊苷A的半乳糖基转移和β-1，4加成反应是通过在含有含新甜菊苷A的斯特维亚菊萃取物和β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中加入β-1，4-半乳糖基转移酶而进行。
本发明的制备方法中所使用的含有含新甜菊苷A40重量％以上的斯特维亚菊萃取物和β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液，理想的是含有上述斯特维亚菊萃取物和相当于上述斯特维亚菊萃取物固形物重量的5至20倍的β-1，4-半乳糖基糖化合物，而更为理想的是含有6至16倍量的β-1，4-半乳糖基糖化合物。
上述水溶液中的斯特维亚菊萃取物固形物浓度通常可以是0.1至15重量％，从经济角度考虑，较好是1至15重量％，并且上述溶液中的β-1，4-半乳糖基糖化合物浓度通常可以是0.1至30重量％，但从经济角度和生产率角度考虑，5至20重量％是理想的。
β-1，4-半乳糖基转移酶的使用量，只要是通过β-1，4-半乳糖基转移酶作用，生成β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的量就可以，但是从良好反应效率和经济角度考虑，理想的是对应每克斯特维亚菊萃取物固形物，加入1～1000单位(U)酶即可，优选5至500单位。这里的1个单位(U)是指当1μmol的o-硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(以下，成为ONPG)和β-1，4-半乳糖基转移酶反应时，水解上述ONPG中的β-半乳糖苷键而每分钟生成1μmol的o-硝基苯所需的上述半乳糖基转移酶量。
测定β-1，4-半乳糖基转移酶酶单位方法如下，将2.5ml的浓度为5mmol/l的ONPG水溶液和4.9ml的浓度为100mmol/l的磷酸钙·磷酸钠缓冲溶液(pH7.25)混合，然后将0.1ml酶液加入到上述混合液中，并在40℃下反应10分钟，最后加入2.5ml浓度为1.0mol/l的碳酸钠(Na2CO3)水溶液，停止反应，根据需要用适量的纯水稀释，在420nm波长下测定生成的o-硝基苯酚的吸光度，并从得到的吸光度，定量上述o-硝基苯酚的生成量，然后用10除以上述生成量求出上述硝基苯酚的每分钟生成量。
β-1，4-半乳糖基转移酶作用于上述水溶液时的系统PH值只要是β-1，4-半乳糖基转移酶发生作用而生成β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的就可以，没有特别的限定，通常上述PH值为3至10，得到高酶反应效率的理想PH值为4至7。这时的温度也是只要β-1，4-半乳糖基转移酶发生作用而生成β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的温度就可以，通常的温度是20℃～70℃，得到高酶反应效率的理想温度范围是40℃～60℃。β-1，4-半乳糖基转移酶作用于上述水溶液的时间通常是3～48小时，但考虑到经济性和生产率，理想的是9～24小时。
通过β-1，4-半乳糖基转移酶作用，半乳糖基由β-1，4-半乳糖基糖化合物向新甜菊苷A进行半乳糖基的β-1，4转移时，β-1，4-半乳糖基糖化合物中的半乳糖基的断裂和β-1，4转移同时发生，所以向新甜菊苷A的葡萄糖残基转移-次的半乳糖基的第4位羟基上不能再发生新的半乳糖基的β-1，4转移，而象α-1，4-葡萄糖酶或转葡萄糖苷酶，则在转移一次的葡萄糖残基的第4位羟基上，进一步有新的葡萄糖基依次按α-1，4-加聚，形成长链葡萄糖链，从而不会降低得到的甜味料的甜度的优点。
在含有斯特维亚菊萃取物和β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中作用β-1，4-半乳糖基转移酶后的水溶液是能够直接作为甜味料而使用，通常，加热使β-1，4-半乳糖基转移酶失去活性之后(但是，替代β-1，4-半乳糖基转移酶而使用培养生产β-1，4-半乳糖基转移酶的微生物的菌体悬浮液等时是加热灭菌上述微生物之后)，利用苯乙烯二乙烯基苯系合成吸附树脂，例如甲醛系树脂HP-21(三菱化学株式会社制品)、阿姆伯拉特树脂XAD-2(orugano株式会社制品)或阳离子交换树脂或阴离子交换树脂，除去杂质之后，浓缩成果汁状的甜味料或者是干燥做成粉末状的甜味料。这时的浓缩、干燥、粉末化方法可以使用传统的方法，如减压浓缩、膜浓缩、冷冻干燥以及喷雾干燥等各种方法。
本发明的甜味料或用本发明的制备方法获得的甜味料，可以单独使用，但也可以与三梨醇、麦牙醇、还原糖稀、木糖醇、海藻糖、赤藓醇等甜度低于砂糖的低热量甜味料组合使用，从而能够制得不损坏上述甜味料的特性且能够赋予更强甜度的优质低热量甜味料制剂。
另外，本发明的甜味料或者是通过本发明的制备方法而制得的甜味料的干燥物是呈淡黄色～白色的无味粉末。所以，上述甜味料能够以单独的干燥物状态或者是可以与稀释剂如与砂糖、果糖、葡萄糖、乳糖、异构化糖、糖稀、糊精以及淀粉等糖类甜味料组合的状态下适用。另外，还可以与甘草萃取物、糖精、天冬甜素、丁磺氨钾以及Scurarose等非糖类高甜度甜味料组合适用。
另外，在本发明中，在上式(1)以及(3)中所使用的X〔甜味料中含有的甜菊醇糖苷的重量比〕是，根据日本食品添加剂协会的不包括化学合成品的食品添加剂独立规格(第二版，1993年5年10月1日发行)第119～121〔酶处理斯特维亚菊〕中记载的〔(1)甜菊醇的定量法、(2)糖苷中的糖定量法以及(4)含量的计算〕而测定的重量比例(％)。
另外，〔酶处理斯特维亚菊〕中所记载的定量法是α-葡萄糖基甜菊苷等的葡萄糖加成反应物作为对象的定量法，虽然不是β-1，4-半乳糖新甜菊苷A等的半乳糖加成反应物作为对象的定量法，但在本发明中以上述方法为基准测定了X。
另外，在上式(1)～(7)使用的RA〔甜味料中含有的新甜菊苷A的重量比例〕以及上式(5)和(7)中的ST〔甜味料中含有的甜菊苷的重量比例〕都是根据日本食品添加剂协会的不包括化学合成品的食品添加剂独立规格(第二版，平成5年10月1日发行)第122～123〔斯特维亚菊〕中记载的定量法以及上述〔酶处理理斯特维亚菊〕中记载的定量法〔(3)未反应甜菊醇糖苷的定量法〕而测定的重量比例(％)。
另外，虽然在日本食品添加剂协会的不包括化学合成品的食品添加剂独立规格中没有记载，在上式(1)～(7)中使用的GRA〔在每个分子中具有1～3 β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖新甜菊苷A在甜味料中的重量比例〕以及GST〔在每个分子中具有1～2 β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖新甜菊苷在甜味料中的重量比例〕的测定方法，但测定上述RA和ST时同时测定GRA和GST。
在本发明中，X，RA，ST，GRA，GST的各重量比例是根据上述〔酶处理斯特维亚菊〕以及〔斯特维亚菊萃取物〕中所记载的定量法，但改变以下几点。在下面说明改变点和其理由。〔酶处理斯特维亚菊〕的〔(1)甜菊醇定量法〕中的改变点。(1)-①试样的干燥处理工序在〔(1)甜菊醇定量法】中对样品的干燥没有说明，但为了进行精确的分析，与标准品一同，在105℃下干燥2小时。
(1)-②甜菊醇重量比例的计算式〔(1)甜菊醇定量法〕中，计算甜菊醇含量时，没有考虑标准品的甜菊苷纯度，但为了精确地计算甜菊醇含量，所以考虑所使用的标准品的甜菊苷纯度，并利用下式计算甜菊醇重量比例。A＝(As×S×标准品的甜菊苷纯度×100×K)/(Ast×X)        式(8)其中，A：样品中甜菊醇重量比例(％)As：检测液中异甜菊醇甲酯与三十碳六烯的面积比Ast：标准液中异甜菊醇甲酯与三十碳六烯的面积比S：甜菊苷取样量(mg)K：与甜菊醇的换算系数318.46/804.88＝0.3957〔酶处理斯特维亚菊〕的〔(2)糖苷中的糖定量法〕中的改变点。(2)-①样品液的制备〔(2)糖苷中的糖定量法〕中，样品的制备方法如下。即，精确称量约1.0g样品，加入50ml水溶解。将上述溶液注射到直径约2.5cm的填充50ml用于吸附酶处理斯特维亚菊的吸附树脂的树脂柱内，每分钟以3ml以下的流速流出，然后用250ml水洗涤。接着，以每分钟3ml以下的流速通入50v/v％乙醇(在100ml乙醇和水的混合溶液中，乙醇含量为50ml的混合溶液)或者是90v/v％甲醇(在100ml甲醇和水的混合溶液中，甲醇含量为90ml的混合溶液)溶液250ml，用于洗脱吸附的组分。将洗脱下来的组分用旋转蒸发器浓缩干固，得到残留物，然后将上述残留物加水溶解，并定量为500ml，把该定量溶液作为样品溶液。
但是，上述的样品制备方法是为了从含有糖类的酶处理斯特维亚菊中除掉上述糖类而采用的制备样品的方法。本发明中，因为在酶处理后的斯特维亚菊中并没有加入糖类，所以在上述样品的制备方法中，不进行上述操作，直接精确称量约1.0g的样品，加水溶解后准确定量为500ml，并把上述定容液作为样品溶液。并且，为了精确的测定，样品在105℃，干燥2小时。
〔斯特维亚菊萃取物〕中的变更点
①样品的干燥处理工序
在〔斯特维亚菊萃取物〕中记载的定量法中对样品的干燥没有说明，但为了进行精确的分析，与标准品一同，在105℃下干燥2小时。
②液相色谱中的流动相
〔斯特维亚菊萃取物〕中所记载的定量法中，作为液相色谱的流动相使用了乙腈和水的混合溶液(80∶20)(体积比)。上述溶剂组成是为了定量甜菊苷和新甜菊苷A而设定的，甜菊苷的出峰时间为10分钟左右，而新甜菊苷A的出峰为20分钟左右，所以在30分钟之内流出上述2个组分。
但是，如果利用上述流动相组成分析β-1，4-半乳糖新甜菊苷A组合物，则β-1，4-半乳糖新甜菊苷A出峰时间在170分钟左右，而洗脱全部的糖结合组分需要3小时以上，所以作为分析方法是不现实的。
为此，在本发明中，为了提高液相色谱的效率，使用乙腈和水的混合溶液(78∶22)(体积比)作为流动相。如果使用该流动相，则甜菊苷的出峰时间在5分钟左右，新甜菊苷A的出峰时间在8分钟左右，出峰时间最长的β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A的出峰时间变成45分钟左右，而全部糖结合组分的洗脱时间在1小时之内。
③重量比例的计算
在〔斯特维亚菊萃取物〕中记载的定量法中，没有考虑标准品(甜菊苷、新甜菊苷)的纯度，但为了进行精确的定量，所以考虑所使用标准品纯度，在标准品的使用量上乘以纯度。这一点对于后述的β-1，4-半乳糖甜菊苷和β-1，4-半乳糖新甜菊苷A也适用。
④β-1，4-半乳糖甜菊苷和β-1，4-半乳糖新甜菊苷A重量比例的计算
结合〔斯特维亚菊萃取物〕中记载的定量法和分子量换算法测定β-1，4-半乳糖甜菊苷和β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的重量比例。β-1，4-半乳糖甜菊苷的重量比是以甜菊苷作为标准物，在求出甜菊苷重量的计算式中，替代检测液的甜菊苷的峰面积，使用了β-1，4-半乳糖甜菊苷的即β-1，4-单半乳糖甜菊苷、β-1，4-二半乳糖甜菊苷各自的峰面积，然后在求甜菊苷重量比例的计算式中乘下述表1所示的甜菊苷和β-1，4-半乳糖甜菊苷各个组分的分子量比而算出。
                     表1
组分名  分子量 分子量换算系数
甜菊苷  804.9  1.00
β-1，4-单半乳糖甜菊苷  967.0  1.20
β-1，4-二半乳糖甜菊苷  1129.2  1.40
β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的重量比例是以新甜菊苷A作为标准物，在求出新甜菊苷A的计算式中，替代检测液中新甜菊苷A的峰面积，使用了β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的即β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A、β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A以及β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A各自的峰面积，然后在求新甜菊苷A重量比例的计算式中乘下述表2所示的新甜菊苷A和β-1，4-半乳糖新甜菊苷A各个组分的分子量比而算出。
                     表2
组分名  分子量  分子量换算系数
新甜菊苷A  967.0  1.00
β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A  1129.2  1.17
β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A  1291.3  1.34
β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A  1453.5  1.50
在上述〔斯特维亚菊萃取物〕中记载的定量法中，测定甜菊苷、新甜菊苷A、β-1，4-单半乳糖甜菊苷、β-1，4-二半乳糖甜菊苷、β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A、β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A以及β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A的重量比例时，因为必须确定通过液相色谱得到的上述甜菊苷、β-1，4-单半乳糖甜菊苷等各组分的峰，本发明是按照下述条件进行液相色谱(HPLC)操作，得到峰保留时间之后，与下述表3中所示的实施例1的测定结果相同，按照每个峰的保留时间依次确定各组分。
测定条件
柱：粒径为5μm的NH2结合基二氧化硅(Unisil Q NH2 jielusaienshi株式会社制造)
柱管：内径4.6mm，长度150mm
柱槽温度：40℃
流动相：乙腈和水的混合溶液(78∶22)
流速：2.0ml/分
注射量：5μl
测定波长：210nm
                    表3
峰的保留时间(分)  组分名
4.662  甜菊苷
8.070  新甜菊苷A
8.722  β-1，4-单半乳糖甜菊苷
9.138  β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A
13.093  β-1，4-单半乳糖甜菊苷
14.412  β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A
15.517  β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A
23.298  β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A
25.428  β-1，4-二半乳糖甜菊苷
29.568  β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A
31.582  β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A
44.917  β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A
上述测定的具体例，在本说明书中以实施例1形式给出。
实施例
下面，例举参考例、实施例和比较例具体说明本发明。如果没有特别的说明，例中的(％)均表示重量百分比。并且，使用的斯特维亚菊萃取物A1，斯特维亚菊萃取物A2、斯特维亚菊萃取物B中的甜菊苷重量比例和新甜菊苷重量比例是根据日本食品添加剂协会的不包括化学合成品的食品添加剂独立规格(第二版，1993年10月1日发行)第122～123〔斯特维亚菊萃取物〕中记载的定量法测定的重量比例(％)。
参考例1(用于培养生产β-1，4-半乳糖转移活性酶的微生物的菌体悬浮液的制备)
将培养基组成为磷酸二氢钾0.4％，硫酸铵0.5％，硫酸镁0.06％，硫酸锌0.001％，硫酸亚铁0.005％，酵母膏0.1％，葡萄糖1.0％以及乳糖0.5％的液体培养基(pH5.2)3升，装入体积为10升的发酵罐中，进行加压蒸气灭菌。待冷却后接红酵母marina菌种，在30℃下通气搅拌培养24小时，生产菌体。将得到的培养液离心分离，收集菌体，然后用浓度为0.05mol/l的磷酸缓冲溶液洗涤菌体2次，最后悬浮于600ml上述缓冲溶液中，制得菌体悬浮液。该粗酶液中β-1，4-半乳糖转移酶的总酶活性为3420U。
参考例2(β-1，4-半乳糖转移酶的粗酶液的制备)
将与参考例1相同的培养基3升，装入体积为10升的发酵罐中，进行加压蒸汽灭菌。待冷却后接环状芽孢杆菌种，在30℃下通气搅拌培养24小时，生产菌体。将得到的培养液离心分离，收集菌体，然后用浓度为0.05mol/l的磷酸缓冲溶液洗涤菌体2次，最后悬浮于100ml上述缓冲溶液中，制得菌体悬浮液。接着通过超声波破碎，破碎菌体，然后离心分离，除去菌体破碎物，用饱和度为70％的硫酸铵盐析上清液，通过离心分离回收生成的沉淀物。将回收的沉淀物悬浮于浓度为0.05mol/l的磷酸缓冲溶液100ml，制得粗酶液。该粗酶液中β-1，4-半乳糖转移活性酶的总酶活性为2988U。
实施例1
用500ml纯水加温溶解10.0g的斯特维亚菊萃取物A1(甜菊苷的重量比例为26.8％，新甜菊苷A的重量比例为58.5％)和100g作为半乳糖基糖化合物的乳糖，然后冷却至室温，利用浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液调PH到6.0。然后在上述溶液中加入在参考例1中得到的具有β-1，4-半乳糖转移酶活性的菌体悬浮液100ml，50℃下反应24小时。反应结束后将反应液在95℃下保持30分钟，使酶被加热失去活性。
将上述溶液过滤，除去游离的固形物之后，使过滤液流入填充500ml苯乙烯二乙烯基苯系合成吸附树脂(酚醛型离子交换树脂HP-21)的柱，吸附甜味组分。充分水洗固定相，除去本发明中使用的乳糖后，通入1000ml浓度为80％的含水甲醇，洗脱含有β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的甜味组分，然后减压浓缩洗脱液，干燥，得到11.2g淡黄色粉末状的甜味料(下面称为甜味料1)。
接着，根据日本食品添加剂协会的不包括化学合成品的食品添加剂独立规格(第二版，平成5年10月1日发行)第122～123页【斯特维亚菊萃取物〕，测定甜味料1中的新甜菊苷A的重量比例(RA)、β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的重量比例(GRA)、甜菊苷的重量比例(ST)以及β-1，4-半乳糖甜菊苷的重量比例(GST)。具体方法如下。
在105℃下干燥2小时甜味料1，然后称取1.52205g，溶解于纯水中，精确定容为100ml，制备了检测液。将和光纯药工业株式会社制的纯度为99.4％的甜菊苷作为甜菊苷标准品，将其在105℃下干燥2小时，并取52.26mg干燥后的样品，溶解于移动相中，准确定容至100ml，制备了甜菊苷标准液。
同样，将和光纯药工业株式会社制的纯度为99.6％的新甜菊苷A作为新甜菊苷A的标准品，将其在105℃下干燥2小时，并取50.78mg干燥后的样品，溶解于移动相中，准确定容至100ml，制备了新甜菊苷A标准液。
然后，在下述操作条件下，通过液相色谱法进行分析检测液和标准液。
检测器：紫外吸收检测器(测定波长210nm)
柱：粒径为5μm的NH2基结合二氧化硅(Unisil Q NH2 jielusaienshi
株式会社制造)
柱管：内径4.6mm，长度150mm
柱槽温度：40℃
流动相：乙腈和水的混合溶液(78∶22)
流速：2.0ml/分
注射量：5μl
图1表示通过液相色谱法分析得到的检测液的高效液相色谱图，表4中表示上述液相色谱中，各峰对应的保留时间和组分名之间的关系。并且在表5中表示检测液中每个组分的峰面积和标准液甜菊苷、标准品新甜菊苷A峰面积的测定结果。
                    表4
峰的保留时间(分) 组分名
4.662 甜菊苷
8.070 新甜菊苷A
8.722 β-1，4-单半乳糖甜菊苷
9.138 β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A
13.093 β-1，4-单半乳糖甜菊苷
14.412 β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A
15.517 β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A
23.298 β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A
25.428 β-1，4-二半乳糖甜菊苷
29.568 β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A
31.582 β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A
44.917 β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A
                                 表5
标准液  检测液
   甜菊苷(纯度99.4％)  新甜菊苷A(纯度99.6％)  酶处理斯特维亚菊A1
浓度(g/100ml) 0.05226 0.05078 1.52205
面积 甜菊苷 361605 - 1429012
新甜菊苷A - 324814 1923081
β-1，4-单半乳糖甜菊苷 - - 670704
β-1，4-二半乳糖甜菊苷 - - 76874
β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A - - 1346498
β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A - - 802268
β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A - - 162466
然后，利用表5中的各组分面积和下式，算出甜味料1中各组分的重量比例(ST、ST-G1、ST-G2、RA、RA-G1、RA-G2、RA-G3)，具体的计算例如下。另外，ST-G1表示β-1，4-单半乳糖甜菊苷的重量比例，ST-G2表示β-1，4-二半乳糖甜菊苷的重量比例，RA-G1表示β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A的重量比例，RA-G2表示β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A的重量比例，RA-G3表示β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A的重量比例。
ST＝(甜菊苷标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中甜菊苷的峰面积×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中的甜菊苷的峰面积)＝(0.05226×0.994×1429012×100)÷(1.52205×361605)＝13.5％
ST-G1＝(甜菊苷标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中β-1，4-单半乳糖甜菊苷的峰面积×分子量换算系数×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中的甜菊苷的峰面积)＝(0.05226×0.994×670704××1.20×100)÷(1.52205×361605)＝7.6％
ST-G2＝(甜菊苷标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中β-1，4-二半乳糖甜菊苷的峰面积×分子量换算系数×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中的甜菊苷的峰面积)＝(0.05226×0.994×76874×1.4×100)÷(1.52205×361605)＝1.0％
RA＝(新甜菊苷A标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中新甜菊苷A的峰面积×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中的新甜菊苷A的峰面积)＝(0.05078×0.996×1923081×100)÷(1.52205×324814)＝19.7％
RA-G1＝(新甜菊苷A标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中β-1，4-单半乳糖新甜菊苷A的峰面积×分子量换算系数×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中的新甜菊苷A的峰面积)＝(0.05078×0.996×1346498×1.17×100)÷(1.52205×324814)＝16.1％
RA-G2＝(新甜菊苷A标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中β-1，4-二半乳糖新甜菊苷A的峰面积×分子量换算系数×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中的新甜菊苷A的峰面积)＝(0.05078×0.996×802268×1.34×100)÷(1.52205×324814)＝11.0％
RA-G3＝(新甜菊苷A标准品的用量(g)×标准品纯度×检测液中β-1，4-三半乳糖新甜菊苷A的峰面积×分子量换算系数×100)÷(样品的取样量(g)×标准液中新甜菊苷A的峰面积)＝(0.05078×0.996×162466×1.50×100)÷(1.52205×324814)＝2.5％
然后，如上所述，根据日本食品添加剂协会的不包括化学合成品的食品添加剂独立规格(第二版，1993年10月1日发行)第119～121页(酶处理斯特维亚菊〕，测定甜味料1中的甜菊醇糖苷的重量比例X。(1)甜味料1中的甜菊醇重量比例的定量
将甜味料1在105℃下干燥2小时，称取110.1mg放入到烧瓶，加入10ml的20v/v％硫酸(硫酸和水的混合溶液100ml中的硫酸含量为20g的混合溶液)，安装回流冷凝器在水浴加热2小时，将冷却后的馏出物转移到分液漏斗中，用10ml水洗涤烧瓶，加入到分液漏斗中。每次用30ml醚共洗3次烧瓶，将洗涤液加入到分液漏斗中，上下摇匀混合均匀后静置。将与水层分离后的醚层，每次用20ml水洗涤2次后除掉水层。接着，将醚层转移到另一烧瓶内，分液漏斗每次用10ml醚洗涤2次，洗涤液加入到烧瓶内，并加入15g硫酸钠(无水)，摇均匀后倾斜将醚层转移到另一烧瓶内。残留的硫酸钠每次用10ml醚洗涤2次，将洗涤液合并到烧瓶内。馏出醚之后，在残留物中加入乙酸乙酯10ml溶解，加入3ml，2w/v％的重氮甲烷醚溶液(在重氮甲烷和醚的混合溶液100ml中含2g重氮甲烷的混合溶液)，然后密封，时常摇匀放置20分钟。
在上述溶液中加入0.5ml醋酸，摇匀后，精确加入2ml三十碳六烯正丁醇试液(将2.5g三十碳六烯溶解于正丁醇中，最后用正丁醇定容至200ml的溶液)，作为检测液。
另外，在105℃下干燥2小时和光纯药工业株式会社制的纯度为99.4％的甜菊苷，并取42.1mg加入到烧瓶内，进行与甜味料1相同的操作，配制了标准溶液。
在下述操作条件下，用气相色谱法分析检测液和标准溶液。
检测器：氢火焰离子化鉴定器
柱填充剂：液相是相对于载体2％的50％的苯基甲基硅酮树脂，载体
为177～250μm的气相色谱用硅藻土【Silicone OV-17
2％Chromosorb WAW-DMCS 60/80(Jielsaieins株式会社制)】
柱管：3.2mmΦ×2.1m的玻璃管
柱槽温度：245℃
注入口温度：260℃
载气：氮气
流速：50ml/分
注射量：2μl
表6中表示检测液中三十碳烷、异甜菊醇甲酯的峰面积以及标准液中三十碳烷、异甜菊醇甲酯的峰面积的测定结果。
                             表6
标准液(纯度99.4％)  检测液
样品 42.10mg  110.1mg
三十碳烷的峰面积 3926785  3887140
异甜菊醇甲酯的峰面积 3082803  5168502
通过得到的峰面积和下式求出甜味料1中的甜菊醇的重量比例
A＝(As×S×标准品甜菊苷的纯度×100×K)/(Ast×X)    式(8)
其中，
A：样品中甜菊醇的重量比例(％)
As：检测液中异甜菊醇甲酯与三十碳六烯的峰面积之比
Ast：标准液中异甜菊醇甲酯与三十碳六烯的峰面积之比
S：甜菊苷的取样量(mg)
X：样品取样量(mg)
K：与甜菊醇的换算系数318.46/804.88＝0.3957
在本实施例中As＝5168502/3887140＝1.330、Ast＝3082803/3926785＝0.785。因此，甜菊醇的重量比例为(1.330×42.1×0.994×100×0.3957)/(0.785×110.1)＝25.5％。
(1)甜菊醇糖苷中的糖重量比例的定量
在105℃下干燥2小时甜味料1，然后称取1.0074g，溶解于500ml纯水中制备了样品液。
称取200mg蒽酮，溶解于100ml硫酸中，然后边冰冷上述溶液边缓慢加入到20ml水中进行混合，制备了蒽酮试液。用水稀释50倍上述试液，作为检测液。精确取2ml检测液加入到带玻璃塞磨口的试验管中，并将其边在冰水中冷却，边精确加入6ml蒽酮试液，反复摇匀使两种液体均匀混合。然后在沸腾水浴中精确加热16分钟。冰冷后用水作对比，测定在620nm下的吸光度，结果为0.313。
然后从预先做好的葡萄糖标准曲线求出检测液中葡萄糖浓度(μg/ml)。葡萄糖标准曲线是通过分别对葡萄糖浓度为10.96μg/ml、32.88μg/ml、54.80μg/ml的溶液，在与检测液相同的条件下操作，得到各自的吸光度和浓度关系而做成的。在表7中表示了本实施例中使用的葡萄糖标准曲线中葡萄糖浓度和吸光度。
           表7
葡萄糖浓度(μg/ml) 吸光度
10.96  0.137
32.88  0.362
54.80  0.593
标准曲线用下式表示即糖浓度(μg/ml)＝96.31×吸光度-2.15。通过检测液在620nm波长下的吸光度值(0.313)和标准曲线求出检测液中的糖浓度。
检测液中糖浓度(μg/ml)＝96.31×0.313-2.15＝28.0。
另外，用下式求出甜菊醇糖苷中的糖的重量比例。
苷中的糖的重量比例(％)＝〔通过标准曲线求得的糖浓度(μg/ml)×0.9×50×500×100〕÷〔样品取样量(g)×1000×1000〕＝(28.0×0.9×50×500×100)÷(1.0074×1000×10000)＝62.5％。
(2)甜菊醇糖苷重量比例的计算
将甜菊醇的重量比例和苷中的糖的重量比例之和作为甜菊醇糖苷重量比例。甜味料1中的甜菊醇糖苷的重量比例为25.5+62.5＝88.0(％)。
在表8中表示了甜味料1中各组分的重量比例(ST、RA、ST-G1、ST-G2、RA-G1、RA-G2、RA-G3以及X)、〔(GRA+RA)/(X)〕的值以及〔(GRA)/(RA)〕值。
实施例2
用500ml纯水加温溶解10.0g的斯特维亚菊萃取物A1(甜菊苷的重量比例为26.8％，新甜菊苷A的重量比例为58.5％)和100g作为半乳糖基糖化合物的乳糖，然后冷却至室温，利用浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液调PH到6.0。然后在上述溶液中加入全部的在参考例2中制备的具有β-1，4-半乳糖转移酶活性的粗酶液，50℃下反应24小时。反应结束后将反应液在95℃下保持30分钟，使酶被加热失去活性。
将上述溶液过滤，除去游离的固形物之后，使过滤液流入填充500ml苯乙烯二乙烯基苯系合成吸附树脂(酚醛型离子交换树脂HP-21)的柱，吸附甜味组分。充分水洗固定相，除去本发明中使用的乳糖后，通入1000ml浓度为80％的含水甲醇，洗脱含有β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的甜味组分，然后减压浓缩洗脱液，干燥，得到11.1g淡黄色粉末状的甜味料(下面称为甜味料2)。
与实施例1相同，定量甜味料2中的各个成分。在表8中表示出其结果。
实施例3
用500ml纯水加温溶解10.0g高度精制且含90重量％以上新甜菊苷A的斯特维亚菊萃取物A2(甜菊苷的重量比例为1.1％，新甜菊苷A的重量比例为91.3％)和100g作为半乳糖基糖化合物的乳糖，然后冷却至室温，利用浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液调PH到6.0。然后在上述溶液中加入1.0g(2477U)的具有β-1，4-半乳糖转移酶活性的酶制剂【半乳糖N5，大和化成株式会社制】50℃下反应24小时。反应结束后将反应液在95℃下保持30分钟，使酶被加热失去活性。
将上述溶液过滤，除去游离的固形物之后，使过滤液流入填充500ml苯乙烯二乙烯基苯系合成吸附树脂(酚醛型离子交换树脂HP-21)的柱，吸附甜味组分。充分水洗固定相，除去本发明中使用的乳糖后，通入1000ml浓度为80％的含水甲醇，洗脱含有β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的甜味组分，然后减压浓缩洗脱液，干燥，得到10.4g淡黄色粉末状的甜味料(下面称为甜味料3)。
与实施例1相同，定量甜味料3中的各个成分。在表8中表示出其结果。
比较例1
用500ml纯水加温溶解10.0斯特维亚菊萃取物B(甜菊苷的重量比例为79.7％，新甜菊苷A的重量比例为11.1％)和100g作为半乳糖基糖化合物的乳糖，然后冷却至室温，利用浓度为1mol/l的氢氧化钠水溶液调PH到6.0。然后在上述溶液中加入100ml在参考例1中得到的具有β-1，4-半乳糖转移酶活性的菌体悬浮液，50℃下反应24小时。反应结束后将反应液在95℃下保持30分钟，使酶被加热失去活性。
将上述溶液过滤，除去游离的固形物之后，使过滤液流入填充500ml苯乙烯二乙烯基苯系合成吸附树脂(酚醛型离子交换树脂HP-21)的柱，吸附甜味组分。充分水洗固定相，除去本发明中使用的乳糖后，通入1000ml浓度为80％的含水甲醇，洗脱含有β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的甜味组分，然后减压浓缩洗脱液，干燥，得到11.0g淡黄色粉末状的甜味料(下面称为甜味料1’)。
与实施例1相同，定量甜味料1’中的各个成分。在表8中表示出其结果。
                             表8
实施例1 实施例2 实施例3 比较例1
 甜味料  1  2  3  1’
重量比例(％)  ST  13.5  14.1  0.8  42.6
 RA  19.7  23.6  32.4  4.2
 ST-G1  7.6  9.0  0.2  23.2
 ST-G2  1.0  1.1  0.0  3.4
 GST  8.6  10.1  0.2  26.6
 RA-G1  16.1  18.0  27.4  6.4
 RA-G2  11.0  12.8  17.0  2.8
 RA-G3  2.5  3.6  3.3  0.5
 GRA  29.6  34.4  47.7  9.7
 X  88.0  87.8  86.5  89.9
(GRA+RA)/(X)  0.56  0.66  0.92  0.15
GRA/RA  1.50  1.46  1.47  2.31
实施例1至3以及比较实验例1至4(甜度的评价)
评价甜味料1、甜味料2、甜味料3、甜味料1’、作为原料的斯特维亚萃取物A1、斯特维亚萃取物A2以及斯特维亚萃取物B的甜度。
甜度的评价
制备8％浓度的砂糖水溶液，并把它作为砂糖标准溶液。以0.005％浓度梯度制备8种0.025～0.080％浓度的甜味料1、甜味料2、甜味料3、甜味料1’、作为原料的斯特维亚萃取物A1、斯特维亚萃取物A2以及斯特维亚萃取物B样品水溶液，分别将其水溶液与砂糖标准水溶液作比较测定甜度。用样品水溶液和砂糖标准水溶液的2点比较法，由20人的参加者在室温25℃下进行实验。其结果表示于表9及表10。
                            表9
实验例 比较实验例
1  2 3 1
样品浓度 甜味料1 甜味料2 甜味料3 甜味料1’
浓 同  稀  浓  同  稀  浓  同  稀  浓  同  稀
0.040％ 0  0  20  0  0  20  0  0  20  0  0  20
0.045％ 0  0  20  0  0  20  0  2  18  0  0  20
0.050％ 0  2  18  0  2  18  4  12  4  0  0  20
0.055％ 0  8  12  2  13  5  9  11  0  0  2  18
0.060％ 5  12  3  2  15  3  19  1  0  2  9  9
0.065％ 9  8  3  10  9  1  20  0  0  2  15  3
0.070％ 14  6  0  17  3  0  20  0  0  10  9  1
0.075％ 17  3  0  19  1  0  20  0  0  17  3  0
0.080％ 20  0  0  20  0  0  20  0  0  20  0  0
                           表10
从表9和表10中的结果可以看出，8％的砂糖浓度相当于0.060％的甜味料1(甜度133倍)，0.0575％的甜味料2(甜度139倍)，0.0525％的甜味料3(甜度152倍)，0.0650％的甜味料1’(甜度123倍)。并且相当于0.0425％(甜度188倍)的斯特维亚萃取物A1，0.0350％的斯特维亚萃取物A2(甜度229倍)，0.0475倍的斯特维亚萃取物B(甜度168倍)。
从上述结果中明确了，以β-1，4键结合半乳糖基的甜味料的甜度分别保持了作为原料的斯特维亚萃取物A1、斯特维亚萃取物A2、斯特维亚萃取物B甜度的70％左右，具有高甜度。
实验例4至6以及比较实验例5(甜味质量的评价)
用甜味料1、甜味料2、甜味料3以及甜味料1’进行甜味质量的评价。
制备上述的相当于8％砂糖水溶液浓度的各甜味料水溶液，与具有同等甜味的砂糖比较甜味质量，即主要是对作为前味感觉到的圆润性以及作为后味感觉到的苦味或涩味等不好的味道，并且甜味的开始时间以及甜味余感及灵敏度进行评价。在表11中表示出其结果。
                                 表11
实验例 实验例1  实验例2  实验例3 比较实验例5
甜味料1  甜味料2  甜味料3 甜味料1’
良 同 差  良  同  差  良  同  差  良  同  差
甜味质量 圆润感 2  17  1  0  19  1  3  17  0  0  9  11
苦味 1  16  3  0  16  4  0  18  2  0  2  18
甜味开始时间 1  15  4  3  15  2  1  19  0  0  6  14
甜味余感 2  16  2  2  16  2  3  16  1  0  6  14
甜味灵敏度 2  15  3  3  15  2  3  16  1  1  14  5
与砂糖的综合比较 2  17  1  1  18  1  2  17  1  1  8  11
如表11中所示的结果，甜味料1’的甜味敏感度几乎相同于砂糖，而苦味、甜味余感、甜味开始时间等项均低于砂糖，从而甜味质量的改善效果很小。而甜味料1、甜味料2以及甜味料3与甜味料1’相比，主要是前味的圆润感得到改善，并能够抑制后味的苦味或涩味等不好的味道，总体上改善成类似于砂糖的优质甜味。
应用例
混合细粒糖30g，异构化糖170g，柠檬酸3.0g，柠檬酸钠0.20g，汽水香精0.2g，0.22g甜味料1以及碳酸水制备了2升汽水。由20名组织者进行呈味实验的结果，使用甜味料1的汽水具有清爽的甜味，是没有残味的优质汽水。
比较应用例1
除了代替应用例1中的0.22g甜味料，使用0.30g的甜味料1’以外，与应用例1相同地制备汽水。进行应用例1的呈味实验的结果，是甜味来得慢或甜味余感差的汽水。
应用例2
混合细粒糖11g，异构化糖141g，粉末咖啡20g，脱脂奶粉76g，0.22g甜味料1以及温水制备了2升咖啡。由20名组织者进行呈味实验的结果，是具有与咖啡的苦味相称甜味的咖啡。
比较应用例2
除了代替应用例2中的0.2g甜味料1，使用0.30g的甜味料1’以外，与应用例2相同地制备咖啡。进行应用例2的呈味实验的结果，是苦味和甜味的感知时间不一致，感觉不自然的咖啡。
参考例3(确认β-1，4-半乳糖新甜菊苷A的存在)
在与实施例1的液相色谱分析法相同的条件下，用液相色谱分级甜味料3，分离推测的β-1，4-半乳糖新甜菊苷A峰馏分。然后将其粉末化，并溶解于纯水中制得2％的水溶液。取1ml溶液加入到试管中，在其中加入β-D-半乳糖酶(和光纯药工业株式会社产品)使浓度达到10unit/ml，在30℃下反应24小时。
将得到的β-D-半乳糖酶处理物点到硅胶板60F254TCL板(Meilukoo)，作为对照物点甜菊苷、新甜菊苷A、分离得到的β-1，4-半乳糖新甜菊苷A以及D-半乳糖的混合物。用氯仿∶甲醇∶水＝30∶20∶4(体积比)做展开溶剂展开上述板。充分风干后，喷雾含有0.2％对甲氧基苯甲醛的浓硫酸，在100℃下加热10分钟显色。在图2中表示了上述薄层层析图。
图2中的(a)为点甜菊苷后得到的展开，(b)是点新甜菊苷A后的得到的展开，(c)为点分离得到的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A预测组分后得到的展开，(d)为点分离得到的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的β-D-半乳糖酶处理物后得到的展开，(e)为点D-半乳糖后得到的展开。
如图2所示，点用HPLC分离得到的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A推定峰馏分(c)后得到的展开中，可观察到Rf值从0.35左右至0.53左右为止连续的显色点，而点用β-D-半乳糖酶处理得到的样品后得到的展开(d)中，几乎没有Rf值从0.35左右至0.53左右为止连续的显色点，仅出现Rf值为0.48的残留点和新出现的与新甜菊苷A的显色点(b)一致的Rf值为0.55的点和与D-半乳糖的显色点(e)一致的Rf值为0.25的点。
从上述结果能够确认Rf值从0.35左右至0.53左右为止连续的显色点为新甜菊苷A和D-半乳糖结合的物质即β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的衍生物。

Claims (9)

1、一种甜味料，其特征在于，含有甜菊醇糖苷且满足下式(1)和式(2)，
〔(GRA+RA)/(X)〕≥0.4          (1)
〔(GRA)/(RA)〕≥1.0            (2)
〔式中GST表示甜味料中的在每个分子中含有1至3个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基新甜菊苷A的重量比，RA表示甜味料中含有的新甜菊苷A的重量比，X表示甜味料中含有的甜菊醇糖苷的重量比例〕。
2、根据权利要求1所述的甜味料，其特征在于满足下式(3)及(4)，
0.95≥〔(GRA+RA)/(X)〕≥0.5    (3)
10.0≥〔(GRA)/(RA)〕≥1.1      (4)。
3、根据权利要求1或2所述的甜味料，其特征在于满足下式(5)，
〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≥1.0     (5)〔式中GST表示甜味料中的在每个分子中含有1至2个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基甜菊苷的重量比，ST表示甜味料中的甜菊苷的重量比例〕
4、根据权利要求1所述的甜味料，其特征在于满足下式(3)、(6)及(7)，
0.95≥〔(GRA+RA)/(X)〕≥0.5    (3)
5.0≥〔(GRA)/(RA)〕≥1.1       (6)〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≥1.5       (7)〔式中GST表示甜味料中的在每个分子中含有1至2个β-1，4-键半乳糖基的β-1，4-半乳糖基甜菊苷的重量比，ST表示甜味料中的甜菊苷的重量比例〕。
5、一种甜味料的制备方法，其特征在于，在含有新甜菊苷A组分占40重量％以上的斯特维亚菊的萃取物和该斯特维亚菊的萃取物固形物重量的5至20倍量的β-1，4-半乳糖基糖化合物的水溶液中作用β-1，4-半乳糖转移酶。
6、根据权利要求5所述的甜味料的制备方法，其特征在于，所述水溶液中的含有40重量％以上所述新甜菊苷A的斯特维亚菊的萃取物固形物浓度为1至5重量％且对应每克上述斯特维亚菊萃取物固形物，使用1至1000单位的β-1，4-半乳糖转移酶。
7、根据权利要求5或6所述的甜味料的制备方法，其特征在于，含有40重量％以上所述新甜菊苷A的斯特维亚菊萃取物为相对于甜菊苷含有1.5倍重量以上新甜菊苷A的斯特维亚菊萃取物。
8、根据权利要求7所述的甜味料的制备方法，其特征在于，所述β-1，4-半乳糖基糖化合物为乳糖。
9、根据权利要求7所述的甜味料的制备方法，其特征在于，所述β-1，4-半乳糖转移酶为由芽孢杆菌属微生物产生的酶。
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