DE60200749T2

DE60200749T2 - Süssungsmittel und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE60200749T2
Application number: DE60200749T
Authority: DE
Inventors: Masato Chiba-shi Kitazume; Tadashi Hunabashi-shi Katabami
Original assignee: Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: DIC Lifetec Co Ltd
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: CN1408262A; EP1295533A1; DE60200749D1; CN100455209C; US7267835B2; EP1295533B1; KR100851610B1; KR20030025822A; US20030138538A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Süßstoff, der eine hohe Süßkraft und eine hervorragende Qualität der Süße aufweist und zusätzlich als Hauptbestandteil Rebaudiosid A und β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A enthält, die als Süßstoffe für verschiedene Nahrungsmittel und Getränke verwendet werden können, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.
2. BESCHREIBUNG DES EINSCHLÄGIGEN STANDS DER TECHNIK
Bisher wurde Zucker (Saccharose) verbreitet als Süßstoff für Nahrungsmittel und Getränke verwendet. Insbesondere enthalten Kaffeegetränke, einschließlich Kaffee in Dosen, und kohlensäurehaltige Getränke große Mengen an Zucker. In der letzten Zeit besteht die Tendenz, aufgrund eines gesteigerten Gesundheitsinteresses bzw. Interesses an Nahrungsmitteln und Getränken mit niedriger Kalorienzahl, die Ein- bzw. Aufnahme von Zucker zu verringern, der zu Fettleibigkeit, Diabetes und Zahnkaries führen kann, und nach einem Süßstoff von hoher Süßkraft, welcher Zucker ersetzen kann.
Ein solcher Süßstoff mit hoher Süßkraft ist ein Stevia-Süßstoff, der von einem Extrakt einer perennierenden Pflanze, der Aster-Familie, abgeleitet ist, welche aus Paraguay, Südamerika stammt, z. B. Stevia rebaudiana BERTONI.
Ein aus dem Extrakt von Stevia-Pflanzen erhaltener Stevia-Süßstoff (im Weiteren als Stevia-Extrakt bezeichnet) weist eine Süßkraft auf, die einhundert Mal stärker als die von Zucker ist, besitzt aber die Eigenschaft, dass Süßeempfinden langsamer entsteht als bei Zucker, d. h. der sogenannte "Kopfgeschmack der Süße" wird verzögert, überdies hält die Süße vergleichsweise länger an, d. h. der sogenannte "Nachgeschmack der Süße" wird verlängert. Bei der Verwendung einer großen Menge an Steviosid in dem Stevia-Süßstoff in Kaffeegetränken und kohlensäurehaltigen Getränken empfindet der Verbraucher in unangenehmer Weise eine besondere Adstringenz und einen bitteren Nachgeschmack zusätzlich zu der Süße.
Es wurde daher umfangreich geforscht um die Süßequalität des Stevia-Süßstoffs zu verbessern. So offenbart z. B. die japanische ungeprüfte Patentanmeldung mit der Ersten Veröffentlichungsnr. Sho 58-094367 ein Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs, der als Hauptbestandteil β-1,4-Galactosyl-steviosid enthält, das aus der β-1,4-Bindung einer Galactosylgruppe an Steviosid resultiert, das die Einwirkung einer β-1,4-Galactosyl-Transferase auf eine wässrige Lösung umfasst, die einen Stevia-Extrakt enthält, welcher Steviosid als Hauptkomponente und eine β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung enthält.
Durch dieses Verfahren wird die Süße zu einer milden Süße verbessert und der verlängerte Nachgeschmack der Süße wird auch relativ gesehen verbessert, des Weiteren werden die Bitterkeit und die Adstringenz verringert, hingegen ist die Verbesserung der Qualität der Süße ungenügend und der resultierende Süßstoff zur Verwendung in Kaffeegetränken und kohlensäurehaltigen Getränken immer noch ungenügend.
Des Weiteren offenbart die japanische ungeprüfte Patentanmeldung mit der Ersten Veröffentlichungsnr. Hei 9-107913 ein Verfahren für die α-Additionsreaktion von Glucose an einen Stevia-Extrakt, der Rebaudiosid A als Hauptkomponente enthält. Dabei ist jedoch das Problem aufgetreten, dass die Enzymreaktion unter Bildung einer langen Glucosekette aus an Rebaudiosid A angekoppelter Glucose fortschreitet, so dass die Intensität der Süße des resultierenden α-Glucosyl-rebaudiosid A um etwa 45% im Vergleich zu Rebaudiosid A verringert wird. weiterhin offenbart die japanische ungeprüfte Patentanmeldung mit der Ersten Veröffentlichungsnr. Hei 2-131592 ein Herstellungsverfahren für einen Süßstoff, das das Einwirken von β-Galactosyl-Transferase auf eine wässrige Lösung oder Suspension von Steviosid oder Rubusosid, das die Steviol-Glycoside sind, und β-Galactosylglycosid umfasst um Galactose vorzugsweise zu einer β-Galactosylgruppe, die durch eine Esterbindung an eine COOH-Gruppe in Position 19 des Steviolglycosids gebunden ist, zu transferieren bzw. umzuwandeln, gefolgt von thermischer Inaktivierung der β-Galactosyl-Transferase und anschließender Einwirkung von α-Glycosyl-Transferase auf eine wässrige Lösung oder eine Suspension, die durch Zugabe einer α-Glycosyl-Zuckerverbindung zu der umgesetzten Flüssigkeit hergestellt worden ist um selektiv Glucose zu einer β-Glucosylgruppe zu transferieren bzw. umzuwandeln, die über eine Etherbindung an eine OH-Gruppe in Position 13 gebunden ist.
Wie oben beschrieben, wird die Qualität der Süße eines konventionellen, mit Zucker versetzten Stevia-Süßstoffs in gewissem Umfang durch die Zugabe von Zucker verbessert, während die Intensität der Süße reduziert wird um Mängel, die dem Stevia-Süßstoff innewohnen, z. B. der verzögerte Kopfgeschmack der Süße sowie der mit Bitterkeit und Adstringenz verbundene Nachgeschmack nicht vollständig abgestellt werden, so dass die Verbraucher bei der Verwendung von Stevia-Süßstoffen in Kaffee und kohlensäurehaltigen Getränken mit dem Geschmack nicht zufrieden sind.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Süßstoff bereitzustellen, der eine milde Süße, wie Zucker, aufweist, während die hohe Süßeintensität eines Stevia-Süßstoffs beibehalten wird, und der auch einen scharfen Kopfgeschmack der Süße, einen scharfen Nachgeschmack der Süße sowie eine Verringerung der Bitterkeit und Adstringenz des Nachgeschmacks, der dem Stevia-Süßstoff innewohnt, aufweist, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Die benannten Erfinder haben intensiv geforscht und das Folgende gefunden.

(A) Ein Süßstoff, in dem der Gewichtsprozentsatz an β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül (GRA), der Gewichtsprozentsatz von Rebaudiosid A (RA) und der Gewichtsprozentsatz von Steviolglucosiden (X) einer speziellen Beziehung genügen, ein Süßstoff ist der eine milde Süße, wie Zucker, aufweist und auch einen scharfen Kopfgeschmack der Süße, einen scharfen Nachgeschmack der Süße sowie eine verringerte Bitterkeit und Adstringenz des dem Stevia-Süßstoff innewohnenden Nachgeschmacks.
(B) β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül kann eine Verringerung der Süße um 30% im Vergleich mit Rebaudiosid A inhibieren, da die Additionspolymerisation der Galactosylgruppen an die die dem Rebaudiosid A zugesetzten Galactosylgruppen nicht auftritt.
(C) Der oben genannte Süßstoff kann in einfacher Weise hergestellt werden, indem eine β-1,4-Galactosyl-Transferase auf eine wässrige Lösung einwirkt, die einen Stevia-Extrakt enthält, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung in einer 5- bis 20fachen Menge, bezogen auf den Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts, enthält.

Die vorliegende Erfindung ist aufgrund dieser Erkenntnis gemacht worden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Süßstoff bereit, welcher Steviolglucoside enthält, umfassend
β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül und
Rebaudiosid A,
worin die folgenden Beziehungen (1) und (2) erfüllt werden: [(GRA + RA)/(X)] ≥ 0,4 (1) [(GRA)/(RA)] ≥ 1,0 (2)worin GRA die Gewichtsprozente des β-1,4-Galactosylrebaudiosids A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül angibt, RA für die Gewichtsprozente an Rebaudiosid A steht und X die Gewichtsprozente der Steviolglucoside darstellt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs bereit, wobei das Verfahren das Einwirkenlassen einer β-1,4-Galactosyltransferase auf eine wässrige Lösung umfasst, die einen Stevia-Extrakt enthält, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosylzuckerverbindung in einer 5- bis 20fachen Menge, bezogen auf den Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts, enthält.
Die vorliegende Erfindung zeigt die unten beschriebenen Effekte.
Da der erfindungsgemäße Süßstoff eine Beziehung dergestalt aufweist, dass das Verhältnis der Gesamtmenge des Ge wichtsprozentsatzes des in dem Süßstoff enthaltenen β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A (GRA) und des Gewichtsprozentsatzes des in dem Süßstoff enthaltenden Rebaudiosid A (RA), d. h. (GRA + RA), zu dem Gewichtsprozentsatz der in dem Süßstoff enthaltenen Steviolglucoside (X) 0,4 oder mehr beträgt und das Verhältnis von GRA zu RA 1,0 oder größer ist, weist der Süßstoff eine milde Süße, wie Zucker, auf und besitzt auch einen scharfen Kopfgeschmack der Süße, einen scharfen Nachgeschmack der Süße sowie eine verringerte Bitterkeit und Adstringenz des dem Stevia-Süßstoff innewohnenden Nachgeschmacks.
Das β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A kann eine Verringerung der Süße um etwa 30% im Vergleich zu Rebaudiosid A inhibieren, da die Additionspolymerisation der Galactosylgruppen an die Rebaudiosid A zugesetzten Galactosylgruppen nicht auftritt.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Süßstoffs ist ein einfaches Verfahren, das die Einwirkung einer β-1,4-Galactosyl-Transferase auf eine wässrige Lösung, die einen Stevia-Extrakt enthält, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung in einer 5- bis 20fachen Menge, bezogen auf den Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts, enthält, umfasst, was es auf diese Weise ermöglicht, vorzugsweise einen Süßstoff herzustellen, der eine milde Süße, wie Zucker, besitzt und der auch einen scharfen Kopfgeschmack der Süße, einen scharfen Nachgeschmack der Süße sowie eine verringerte Bitterkeit und Adstringenz des dem Stevia-Süßstoff innewohnenden Nachgeschmacks besitzt.
KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine graphische Darstellung, die ein HPLC-Chromatogramm eines Süßstoffs 1 von Beispiel 1 zeigt.
Die 2 ist eine graphische Darstellung, die ein Dünnschichtchromatogramm von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der erfindungsgemäße Süßstoff ist zufrieden stellend, solange er Steviolglucoside enthält und solange die oben genannten Beziehungen (1) und (2) erfüllt sind. Vorzugsweise sind jedoch die folgenden Beziehungen (3) und (4) erfüllt, weil der resultierende Süßstoff eine milde Süße aufweist: 0,95 ≥ [(GRA + RA)/(X)] ≥ 0,5 (3) 10,0 ≥ [(GRA)/(RA)] ≥ 1,1 (4)
Es ist bevorzugter, dass die Steviolglucoside weiterhin
β-1,4-Galactosyl-steviosid mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül und
Steviosid umfassen
und dass die folgende Beziehung (5) erfüllt ist, weil der resultierende Süßstoff eine noch mildere Süße aufweist: [(GRA + RA)/(GST + ST)] ≥ 1,0 (5),worin GST für die Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosylsteviosid mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül steht und ST die Gewichtsprozente von Steviosid darstellt.
Es ist sogar noch mehr bevorzugt, dass die vorher erwähnte Beziehung (3) und die folgenden Beziehungen (6) und (7) erfüllt sind, da der resultierende Süßstoff eine besonders milde Süße aufweist: 5,0 > [(GRA)/(RA)] ≥ 1,1 (6) [(GRA + RA)/(GST + ST)] ≥ 1,5 (7), worin GRA, RA, GST und ST wie oben definiert sind.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Süßstoffs unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, ist aber vorzugsweise ein Verfahren zur Herstellung des Süßstoffs, das die Einwirkung einer β-1,4-Galactosyl-Transferase auf eine wässrige Lösung, die einen Stevia-Extrakt enthält, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung in einer 5- bis 20fachen Menge, bezogen auf den Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts, enthält, umfasst, da es ermöglicht, einen Süßstoff in einfacher Weise herzustellen, der den Beziehungen (1) und (2) genügt und eine milde Süße, wie Zucker, aufweist und auch einen scharfen Kopfgeschmack der Süße, einen scharfen Nachgeschmack der Süße sowie eine Verringerung der Bitterkeit und Adstringenz des Nachgeschmacks, die dem Stevia-Süßstoff innewohnt, besitzt.
Das Verfahren, das einen Stevia-Extrakt verwendet, der weniger als 40 Gew.-% Rebaudiosid A enthält, ist aus den folgenden Gründen nicht bevorzugt. Da die Summe der Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül (im Weiteren als β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A bezeichnet) und die Gewichtsprozente von Rebaudiosid A (GRA + RA) abnimmt und gleichzeitig die Summe der Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosyl-Steviosid mit einer oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül (im Weiteren als β-1,4-Galactosyl-Steviosid bezeichnet) und die Gewichtsprozente von Steviosid (GST + ST) zunimmt, wird es schwierig, einen Süßstoff herzustellen, der den Beziehungen (1) und (2) genügt, und der resultierende Süßstoff weist eine mangelhafte milde Süße, einen verzögerten Kopfgeschmack der Süße, einen verlängerten Nachgeschmack der Süße sowie Bitterkeit und Adstringenz des Nachgeschmacks auf, der dem Stevia-Süßstoff innewohnt.
Der Stevia-Extrakt enthält üblicherweise eine Süßekomponente, die aus Steviolglucosiden, wie Steviosid, Rebaudiosid A, Rebaudiosid C oder Dulcosid A zusammengesetzt ist, und das Steviosid besitzt die folgende Struktur.
Das Rebaudiosid A weist auch die folgende Struktur auf, in der Glucose weiter an einen Glucoserest, dargestellt durch 13-G1 in der Struktur des Steviosids, gebunden ist.
Typische Beispiele der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung schließen Disaccharide von Galactose und Glucose ein, die aneinander gebunden sind, wie Lactose und α-D-Galactose. Diese Verbindungen besitzen die folgende Struktur.
Beispiele für β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A, das in dem erfindungsgemäßen Süßstoff enthalten ist, schließen solche ein, worin eine Galactosylgruppe an jeden von ein bis drei Glucoseresten unter vier Glucoseresten eines Glucoserests, gebunden in der 13-Stellung eines Steviol-Gerüsts von Rebaudiosid A (im Weiteren als 13-G1 bezeichnet) gebunden ist, zwei Glucosereste in 13-Stellung des Steviol-Gerüst-Glucoserests (als 13-G2 und 13-G3 bezeichnet) gebunden sind und ein Glucoserest in der 19-Stellung eines Steviol-Gerüsts (als 19-G1 bezeichnet) über die β-1,4-Bindung gebunden ist.
Man vermutet, dass die drei Glucosereste 13-G2, 13-G3 und 19-G1 verantwortlich für die β-1,4-Übertragung der Galactosylgruppen durch eine Einwirkung der β-1,4-Galactosyl-Transferase unter den Glucoseresten von Rebaudiosid A sind. In der Tat zeigte, wie in den später beschriebenen Beispielen erläutert, eine HPLC-Chromatographie einen β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A-Peak, worin drei oder weniger Galactosylgruppen an Rebaudiosid A gebunden sind.
Es wird vermutet, dass jede dieser Galactosylgruppen an drei Glucosereste an der β-1,4-Position infolge einer sterischen Hinderung gebunden sind und dass mit dem Fortschreiten der Enzymreaktion Rebaudiosid A mit einer daran gebundenen β-1,4-Galactosylgruppe (β-1,4-Monogalactosyl rebaudiosid A), Rebaudiosid A mit zwei daran gebundenen β-1,4-Galactosylgruppen (β-1,4-Digalactosyl-rebaudiosid A) und Rebaudiosid A mit drei daran gebundenen β-1,4-Galactosylgruppen (β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid A) in dieser Reihenfolge gebildet werden. Das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A in dem Süßstoff ist aus einem Gemisch einer Vielzahl von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A zusammengesetzt.
Der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Süßstoff kann zusätzlich zu dem vorher erwähnten Haupt-β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A, β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A, resultierend aus der β-1,4-Bindung einer Galactosylgruppe an 13-G1 oder eine kleine Menge an Galactosylrebaudiosid A enthalten, solange es ein Galactosylrebaudiosid A ist, das erhalten wurde durch Übertragen einer Galactosylgruppe auf Rebaudiosid A von einer β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung mittels Einwirkung einer β-1,4-Galactosyl-Transferase.
Es ist unerlässlich, dass der in dem Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Süßstoffs verwendete Stevia-Extrakt ein Stevia-Extrakt ist, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A enthält. Der Stevia-Extrakt ist vorzugsweise ein Stevia-Extrakt, der 50 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A enthält, und bevorzugter ein Stevia-Extrakt, der 70 bis 95 Gew.-% Rebaudiosid A enthält, da es leichter ist, einen Süßstoff herzustellen, der eine milde Süße aufweist und der auch einen scharfen Kopfgeschmack der Süße, einen scharfen Nachgeschmack der Süße sowie eine verminderte Bitterkeit und Adstringenz, die dem Stevia-Süßstoff innewohnen, besitzt. Des Weiteren ist der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stevia-Extrakt besonders bevorzugt ein Stevia-Extrakt, der Rebaudiosid A in einer 1,5fachen Menge oder mehr, bezogen auf das Gewicht von Steviosid, enthält, und zwar aus dem folgenden Grund. Die Süßeintensität von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A, die aus der Übertragung einer Galactosylgruppe auf Rebaudiosid A mittels einer β-1,4-Galactosyl-Transferase resultiert, wird im Vergleich zu dem ursprünglichen Rebaudiosid A verringert, während die Verringerung in der Süßeintensität beträchtlich geringer ist als die Süßeintensität von β-1,4-Galactosyl-Steviosid, welches aus der Bindung einer Galactosylgruppe an Steviosid resultiert. Der Gehalt an Rebaudiosid A in dem Stevia-Extrakt von weniger als 40 Gew.-% ist nicht bevorzugt, da die Süßeintensität und die Süße des resultierenden Süßstoffs verringert werden, was zu einer verminderten Süße führt.
Beispiele für das Verfahren zur Herstellung des Stevia-Extrakts, welches den oben genannten Bedingungen genügt, schließen die folgenden zwei Verfahren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein erstes Verfahren ist ein Verfahren der Extraktion von Pflanzen oder getrockneten Blättern von Stevia rebaudiana BERTONI, die 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und Rebaudiosid A in einer 1,5fachen Menge oder mehr enthalten, bezogen auf das Gewicht von Steviosid, mit Wasser oder einem wässrigen organischen Lösungsmittel, wie wässrigem Methanol oder wässrigem Ethanol und des Entfernens einer Nicht-Süßekomponente aus dem resultierenden Extrakt.
Ein zweites Verfahren ist ein Verfahren der Extraktion von Pflanzen oder getrockneten Blättern von Stevia rebaudiana BERTONI, die Rebaudiosid A in einer beliebigen Menge, bezogen auf Steviosid, enthalten, mit Wasser oder einem wässrigen organischen Lösungsmittel, wie wässrigem Methanol oder wässrigem Ethanol, des Entfernens einer Nicht-Süßekomponente aus dem resultierenden Extrakt und der Isolation und Reinigung des Rückstands unter Verwendung eines konventionellen Verfahrens, wie Umkristallisation oder Säulenchromatographie um einen Stevia-Extrakt mit einem Gehalt von 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und Rebaudio sid A in einer 1,5fachen Menge oder mehr, bezogen auf das Gewicht von Steviosid, zu erhalten. Diese ersten und zweiten Verfahren können in Kombination miteinander verwendet werden.
In diesem ersten und zweiten Verfahren schließen Beispiele für das Verfahren zur Entfernung der Nicht-Süßekomponente konventionelle Reinigungsverfahren, wie ein Verfahren zur Entfernung ionischer Verunreinigungen aus dem Stevia-Extrakt, unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes, des Adsorbierens einer süßen Komponente auf einem Adsorberharz, das Eluieren mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, und das Konzentrieren des Eluats unter reduziertem Druck zur Entfernung des organischen Lösungsmittels und ein Verfahren des Adsorbierens einer Süßekomponente auf einem Adsorberharz, des Eluierens mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, des Konzentrierens des Eluats unter reduziertem Druck zur Entfernung des organischen Lösungsmittels und des Entfernens ionischer Verunreinigungen unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, ein.
Beispiele für das Kationenaustauscherharz schließen AMBERLITE IR-120B (ein Produkt von ORGANO CORPORATION) ein und Beispiele für Anionenaustauscherharze schließen AMBERLITE IRA-93, hergestellt von ORGANO CORPORATION, ein. Beispiele für das Adsorptionsmittel schließen AMBERLITE XAD-2, hergestellt von ORGANO CORPORATION, ein.
In dem zweiten Verfahren ist das industrielle Verfahren zur Entfernung der Nicht-Süßekomponente aus dem Extrakt und des Isolierens und Reinigen des Rückstands zum Erhalt eines Stevia-Extrakts, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und Rebaudiosid A in einer 1,5fachen Menge oder mehr, bezogen auf das Gewicht von Steviosid, enthält, beispielsweise ein Umkristallisationsverfahren des Auflösens des Stevia-Extrakts, dessen Nicht-Süßekomponente entfernt worden ist, in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, bis zu einer Sättigungskonzentration, des selektiven Abscheidens von Rebaudiosid A mittels Konzentration oder Abkühlen und Isolieren von Kristallen durch Filtration.
Die β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, solange sie als Substrat des β-1,4-Galactosyls dienen kann und in der Lage ist, eine β-1,4-Galactosylgruppe auf Rebaudiosid A von der β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung zu übertragen, und ist unter dem Gesichtspunkt der Verfügbarkeit am bevorzugtesten Lactose.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete β-1,4-Galactosyl-Transferase kann jedes Enzym sein, das eine β-1,4-Galactosyl-übertragende Aktivität aufweist und Beispiele hierfür schließen Enzyme ein, die von Mikroorganismen abgeleitet sind, die in der Lage sind, ein Enzym mit einer β-1,4-Galactosyl-übertragenden Aktivität zu produzieren. Unter diesen Enzymen ist ein Enzym, das aus kultivierten Zellen, erhalten durch Kultivierung von Mikroorganismen, extrahiert worden ist, bevorzugt unter dem Gesichtspunkt der einfachen Handhabung. Anstelle einer solchen β-1,4-Galactosyl-Transferase kann eine Suspension von Zellen verwendet werden, die durch Kultivierung von Mikroorganismen erhalten worden ist, die ein Enzym mit β-1,4-Galactosyl-übertragender Aktivität produzieren können, und zwar so wie sie sind; alternativ können immobilisierte Zellen, die durch Immobilisierung der Mikroorganismen erhalten worden sind, verwendet werden. Beispiele des aus den kultivierten Zellen extrahierten Enzyms schließen Lactase ein, die Lactose hydrolysieren kann, z. B. BIOLACTA, hergestellt von Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd..
Die Mikroorganismen, die das Enzym mit einer β-1,4-Galactosyl-übertragenden Aktivität produzieren können, sind vorzugsweise Mikroorganismen der Gattung Rhodotorula und besonders bevorzugt Rhodotorula minuta IFO-1540, Rhodotorula marina IFO-1421 und Rhodotorula lactosa IFO-1424.
Es können auch Mikroorganismen der Gattung Bacillus vorzugsweise verwendet werden und Bacillus circulans werden besonders bevorzugt verwendet. Die Mikroorganismen, die in der Lage sind, das Enzym mit einer β-1,4-Galactosylübertragenden Aktivität zu produzieren, können Mikroorganismen sein, die dazu in der Lage sind, das Enzym mit einer β-1,4-Galactosyl-transferierenden Aktivität zu produzieren, und die anderen Gattungen oder Spezies angehören, sofern sie keine Eigenschaften aufweisen, die sie für die Verwendung in Nahrungsmitteln und Getränken ungeeignet machen, z. B. Pathogenität.
Diese Mikroorganismen werden durch Züchtung in einem Kulturmedium erhalten, das für die Zucht konventioneller Mikroorganismen geeignet ist, z. B. ein Kulturmedium, das Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose und Glycerin, Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und Ammoniumacetat, stickstoffhaltige natürliche Produkte, wie Hefeextrakt und Maiskläre, und anorganische Salze, wie Kaliumphosphat, Calciumphosphat, Natriumchlorid und Magnesiumsulfat, sowie Vitamine und Spuren von Metallsalzen enthält.
Die Übertragung der Galactosylgruppe auf Rebaudiosid A von der β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung und die β-1,4-Additionsreaktion schreitet voran durch Zugabe einer β-1,4-Galactosyl-Transferase zu einer wässrigen Lösung, die einen Stevia-Extrakt enthält, der Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung enthält.
Die wässrige Lösung, die den Stevia-Extrakt enthält, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung enthält, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann den Stevia-Extrakt und die β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung einer 5- bis 20fachen Menge und vorzugsweise 6- bis 16fachen Menge, bezogen auf das Gewicht des Feststoffgehalts des Stevia-Extrakts, enthalten.
Der Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts in der vorgenannten wässrigen Lösung reicht üblicherweise von 0,1 bis 15 Gew.-%, beträgt aber vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-% unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten. Die Konzentration der β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung in der wässrigen Lösung beträgt üblicherweise 0,1 bis 30 Gew.-% und vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-% im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit und Produktivität.
Die Menge der β-1,4-Galactosyl-Transferase unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, solange sie in einer Menge vorliegt, die ausreichend ist, β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A durch Einwirkung der β-1,4-Galactosyl-Transferase zu produzieren, sie beträgt aber vorzugsweise 1 bis 1000 Einheiten (U) und mehr bevorzugt 5 bis 500 U pro g des Feststoffgehalts des Stevia-Extrakts, da die Reaktionseffizienz verbessert wird, und unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten. So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff "1 Einheit (U)" auf eine Menge einer β-1,4-Galactosyl-Transferase, die erforderlich ist, 1 μmol o-Nitrophenol in einer Minute durch Hydrolyse einer β-Galactosidbindung in o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (im Weiteren als ONPG bezeichnet) zu bilden, wenn 1 μmol mit der Galactosyl-Transferase reagieren gelassen wird.
Die Einheit der β-1,4-Galactosyl-Transferase wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. 0,1 ml einer Enzymlösung wurde zu einer Lösung gegeben, die durch Vermischen von 2,5 ml einer wässrigen ONPG-Lösung mit einer Konzentration von 5 mmol/l (Liter) mit 4,9 ml eines Kalium-Natriumphosphatpuffers (pH 7,25) mit einer Konzentration von 100 mmol/l hergestellt worden war, anschließend ließ man 10 Minuten lang bei 40°C reagieren und fügte dann 2,5 ml einer wässrigen Natriumcarbonat(Na₂CO₃)-Lösung mit einer Konzentration von 1,0 mol/l zu, wodurch die Reaktion beendet wurde. Sofern erforderlich, wurde die Reaktionslösung mit einer entsprechenden Menge an reinem Wasser verdünnt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 420 nm des resultierenden o-Nitrophenols gemessen und die Menge des Nitrophenols aus der resultierenden Absorption bestimmt und anschließend die Menge durch 10 geteilt um die in einer Minute gebildete Menge an Nitrophenol zu halten.
Der pH des Systems unterliegt, wenn die β-1,4-Galactosyl-Transferase auf die wässrige Lösung einwirkt, keinen besonderen Beschränkungen, solange β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A hergestellt werden kann, indem die β-1,4-Galactosyl-Transferase auf die wässrige Lösung unter den pH-Bedingungen einwirkt, üblicherweise beträgt er jedoch 3 bis 10 und vorzugsweise 4 bis 10, im Hinblick auf die hervorragende Effizienz der Enzymreaktion. Des Weiteren unterliegt die Reaktionstemperatur keinen speziellen Beschränkungen, solange das β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A hergestellt werden kann dadurch, dass die β-1,4-Galactosyl-Transferase auf die wässrige Lösung unter den Bedingungen der Reaktionstemperatur einwirkt, üblicherweise beträgt sie jedoch 20 bis 70°C und vorzugsweise 40 bis 60°C, im Hinblick auf die exzellente Effizienz der Enzymreaktion. Die Zeit, während der die β-1,4-Galactosyl-Transferase auf die wässrige Lösung einwirken soll, beträgt üblicherweise 3 bis 48 Stunden, vorzugsweise jedoch 9 bis 24 Stunden, im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit und die Produktivität.
Die β-1,4-Übertragung der Galactosylgruppe auf Rebaudiosid A von der β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung durch Einwirkung der β-1,4-Galactosyl-Transferase weist den folgenden Vorteil auf: die Spaltung der Galactosylgruppe von der β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung und β-1,4-Übertragung treten gleichzeitig auf und es ist unmöglich, eine zusätzliche β-1,4-Übertragung der Galactosylgruppe auf eine Hydroxylgruppe in 4-Position der Galactosylgruppe durchzuführen, die einmal auf einen Glucoserest von Rebaudiosid A übertragen worden ist. D. h. es wird die Intensität der Süße des resultierenden Süßstoffs, im Gegensatz zu einer α-1,4-Glycosidase oder Glucosyltransferase nicht reduziert, da keine lange Glucosekette durch die kontinuierliche α-1,4-Additionspolymerisation der Glucosylgruppe an die Hydroxylgruppe in der 4-Position des vorher übertragenen Glucoserests gebildet wird.
Die wässrige Lösung kann als Süßstoff so wie sie ist verwendet werden, nachdem die β-1,4-Galactosyl-Transferase auf die wässrige Lösung einwirken konnte, die den Stevia-Extrakt und die β-1,4-Galactosyl-Zuckerverbindung enthält, üblicherweise wird der Süßstoff jedoch in Form eines Sirups oder eines Pulvers verwendet, nachdem die β-1,4-Galactosyl-Transferase inaktiviert wurde (bei der Verwendung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein Enzym mit einer β-1,4-Galactosyl-übertragenden Aktivität anstelle von der β-1,4-Galactosyl-Transferase zu produzieren, wurde eine Hitzesterilisation der Mikroorganismen durchgeführt) und Verunreinigungen wurden entfernt, indem ein synthetisches Adsorberharz auf Styroldivinylbenzol-Basis, wie Diaion HP-21 (ein Produkt, hergestellt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), AMBERLITE XAD-2 (ein Produkt, hergestellt von ORGANO CORPORATION), ein Kationenaustauscherharz oder ein Anionenaustauscherharz verwendet wurden, und anschließend wurde die wässrige Lösung konzentriert oder getrocknet. In diesem Fall können verschiedene konventionelle bekannte Verfahren, wie die Konzentra tion unter reduziertem Druck, die Filmkonzentration, das Gefriertrocknen und das Sprühtrocknen, als Mittel zur Konzentration, Trocknung und Pulverisierung verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Süßstoff oder der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Süßstoff kann einzeln oder in Kombination mit einem Süßstoff von geringem Kaloriengehalt verwendet werden, der eine Süßkraft aufweist, die niedriger als die von Zucker ist, beispielsweise Sorbit, Maltit, reduzierter Stärkesirup, Xylit, Trehalose oder Erythrit, was es ermöglicht, die Süßkraft zu erhöhen, ohne diese Süßstoffe zu beeinträchtigen und eine Süßstoffzubereitung von geringem Kaloriengehalt und guter Qualität herzustellen.
Der erfindungsgemäße Süßstoff oder der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Süßstoff ist in trockener Form ein blassgelbes oder weißes geruchloses Pulver. Daher kann der Süßstoff in trockener Form einzeln oder vorzugsweise in Verbindung mit einem Saccharid-Süßstoff als Verdünnungsmittel, z. B. Zucker, Fructose, Glucose, Lactose, isomerisierter Zucker, Stärkesirup, Dextrin oder Stärke, verwendet werden. Außerdem kann er vorzugsweise in Verbindung mit einem Nicht-Saccharid-Süßstoff von hoher Süßkraft bzw. -intensität, z. B. Lakritzextrakt, Saccharin, Aspartam, Kaliumacesulfam oder Sucralose, verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet X [die Gewichtsprozente der Steviolglucoside, die in dem Süßstoff enthalten sind], wie in den Beziehungen (1) und (3) verwendet, einen Gewichtsprozentsatz (%), der gemäß einem Verfahren bestimmt wird [(1) Verfahren zur Bestimmung von Steviol, (2) Verfahren zur Bestimmung von Zucker in Glucosid und (4) Berechnung des Gehalts], das in "Independent Standard for Food Additives excluding Chemically Synthesized Products", herausgegeben von der Japan Food Additives Association (2. Auflage, herausgegeben am 1. Oktober 1993), S. 119–121 "Enzyme-Treated Stevia", beschrieben ist.
Das in "Enzyme-Treated Stevia" beschriebene Bestimmungsverfahren ist kein Bestimmungsverfahren für ein Galactose-Additionsreaktionsprodukt, wie β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A, sondern ein Bestimmungsverfahren für ein Glucose-Additionsreaktionsprodukt, wie α-Glucosylsteviosid. In der vorliegenden Erfindung wurde X nach diesem Verfahren bestimmt.
Die in den Beziehungen (1) bis (7) verwendeten Platzhalter RA [Gewichtsprozent an Rebaudiosid A in dem Süßstoff] und ST [Gewichtsprozent an Steviosid in dem Süßstoff], der in den Beziehungen (5) und (7) verwendet wird, bezeichnet einen Gewichtsprozentsatz (%), der gemäß dem Bestimmungsverfahren, das in "Independent Standard for Food Additives excluding Chemically Synthesized Products", herausgegeben von der Japan Food Additives Association (2. Auflage, herausgegeben am 1. Oktober 1993), S. 122–123 "Stevia Extract", beschrieben ist und dem Bestimmungsverfahren [(3) Verfahren zur Bestimmung nicht-umgesetzter Steviolglucoside], beschrieben in "Enzyme-Treated Stevia", gemessen wird.
Weiterhin wurden GRA [der Gewichtsprozentsatz an β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A in dem Süßstoff mit ein bis drei β-1,4-Galactosyl-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül] und GST [der Gewichtsprozentsatz des β-1,4-Galactosylsteviosids in dem Süßstoff mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül], die in den Beziehungen (1) bis (7) verwendet werden, simultan mit der Messung von RA und ST bestimmt, obwohl das Bestimmungsverfahren nicht in "Independent Standard for Food Additives excluding Chemically Synthesized Products", herausgegeben von der Japan Food Additives Association, beschrieben ist.
In der vorliegenden Erfindung wurde jeder Gewichtsprozentsatz X, RA, ST, GRA und GST gemäß dem Bestimmungsverfahren, das in "Enzyme-Treated Stevia" und "Stevia Extract" beschrieben ist, mit Ausnahme der folgenden Punkte bestimmt. Der Unterschied und der Grund dafür werden nachstehend erläutert.
Unterschied im "(1) Verfahren zur Bestimmung von Steviol" von "Enzym-Treated Stevia"
(1)-(i): Stufe der Trocknung der Probe
Obwohl es keine Beschreibung in Bezug auf das Trocknen der Probe "(1) Verfahren zur Bestimmung von Steviol" gibt, wurde die Probe 2 Stunden lang bei 105°C in derselben Weise wie in einem Bezugsstandard getrocknet um eine genaue Analyse durchzuführen.
(1)-(ii): Berechnungsgleichung für den Gewichtsprozentsatz von Steviol
Obwohl der Gehalt an Steviol nicht berechnet wird unter Berücksichtigung der Reinheit von Steviosid eines Bezugsstandards in "(1) Process for determination of steviol" um den Steviolgehalt exakt zu berechnen, wurde der Gewichtsprozentsatz von Steviol unter Berücksichtigung der Reinheit von Steviosid des Bezugsstandards unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt:
worin
A den Gewichtsprozentsatz (%) von Steviol als Probe bezeichnet,
As ein Flächenverhältnis eines Isosteviolmethylesters als eine Testlösung zu Squalin bezeichnet,
Ast ein Flächenverhältnis eines Isosteviolmethylesters als Standardlösung zu Squalen bezeichnet,
S eine Probenmenge (mg) Steviosid bezeichnet,
X eine Probenmenge (mg) einer Probe und
K einen Reduktionskoeffizienten zu Steviol, 318,46/804,88 = 0,3957, bezeichnet.
Änderung in "(2) Verfahren zur Behandlung von Zucker in Glucosid" von "Enzyme-Treated Stevia"
(2)-(i): Herstellung der Probenlösung
In "(2) process for determination of sugar in glucoside" ist das Verfahren zur Herstellung einer Probe wie folgt. Nach Aufnahme von etwa 1,0 g einer Probe und genauem Wiegen wurde die Probe in 50 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf eine Harzsäule mit einem Durchmesser von etwa 2,0 cm aus 50 ml eines Adsorberharzes für enzymbehandeltes Stevia gegossen, mit einer Geschwindigkeit von 3 ml oder weniger pro Minute ausfließen gelassen und anschließend mit 250 ml Wasser gewaschen. Danach wird die auf dem Harz adsorbierte Komponente eluiert, indem 250 ml von 50 Vol./Vol.-% Ethanol (als Mischlösung, worin der Ethanolgehalt in 100 ml einer aus Ethanol und Wasser gemischten Lösung 50 ml beträgt) oder 90 Vol./Vol.-% Methanol (als Mischlösung, in der der Methanolgehalt in 100 ml einer aus Methanol und Wasser gemischten Lösung 90 ml beträgt) durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 3 ml oder weniger pro Minute passiert werden. Nach Eindampfen dieser Lösung bis zur Trockene in einem Rotationsverdampfer zum Erhalt eines Rückstands, wurde Wasser bis zu einer Gesamtmenge von genau 500 ml zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde als Probenlösung verwendet.
Das oben genannte Verfahren zur Herstellung der Probe ist jedoch ein Verfahren zur Herstellung einer Probe, die frei von Sacchariden im Hinblick auf das enzymbehandelte Stevia, das zugesetzte Saccharide enthält, ist. In der vorliegenden Erfindung werden keine Saccharide dem enzymbehandelten Stevia zugesetzt. Deshalb wird nach der Aufnahme von etwa 1,0 g einer Probe und ihres genauen Einwiegens ohne die Verfahrensmaßnahme, die in dem Verfahren zur Herstellung der Probe beschrieben ist, Wasser zugesetzt um eine exakte Gesamtmenge von 500 ml zu erhalten. Die resultierende Lösung wird als Probenlösung verwendet. Die Probenlösung wurde 2 Stunden lang bei 105°C getrocknet um eine genaue Messung durchzuführen.
Änderung in "Stevia Extract"
(i) Trocknungsstufe der Probe
Obwohl in dem in "Stevia Extract" beschriebenen Bestimmungsverfahren eine Trocknung der Probe nicht beschrieben wird, wurde die Probe 2 Stunden lang bei 105°C in der gleichen Weise wie bei einem Bezugsstandard getrocknet um eine genaue Analyse durchzuführen.
(ii) Mobile Phase bei der Flüssigkeitschromatographie
Bei dem in "Stevia Extract" beschriebenen Bestimmungsverfahren wurde eine Mischlösung aus Acetonitril und Wasser in einem Volumenverhältnis von 80 : 20 als mobile Phase bei der Flüssigkeitschromatographie verwendet. Diese Lösungsmittelzusammensetzung ist zum Zwecke der Bestimmung von Steviosid und Rebaudiosid A definiert. Die Retentionszeit des Steviosid-Peaks beträgt etwa 120 Minuten, während die Retentionszeit des Rebaudiosid A-Peaks etwa 120 Minuten beträgt, und diese Komponenten werden innerhalb von 30 Minuten eluiert.
Wenn jedoch eine β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A-Zusammensetzung analysiert wird, unter Verwendung dieser Zusammensetzung der mobilen Phase, beträgt die Retentionszeit eines β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid-Peaks A etwa 170 Minuten und die Elution der gesamten, mit Zucker versetzten Komponente erfordert 3 oder mehr Stunden. Daher ist dieses Verfahren als ein tatsächliches Analysenverfahren nicht geeignet.
Deshalb wurde in der vorliegenden Erfindung eine Mischlösung aus Acetonitril und Wasser in einem Volumenverhältnis von 78 : 22 als mobile Phase zur Erhöhung der Effizienz der Flüssigkeitschromatographie verwendet. wenn diese mobile Phase verwendet wurde, betrug die Retentionszeit des Steviosid-Peaks etwa 5 Minuten, während die Retentionszeit des Rebaudiosid A-Peaks etwa 8 Minuten beträgt und die längste Retentionszeit des β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid A-Peaks etwa 45 Minuten ist. Auf diese Weise ist die Elution der gesamten, mit Zucker versetzten Komponente innerhalb einer Stunde abgeschlossen.
(iii) Berechung des Gewichtsprozentsatzes
Obwohl der Gehalt nicht berechnet wird unter Berücksichtigung der Reinheit eines Bezugsstandards (Steviosid, Rebaudiosid), wenn das in "Stevia Extract" beschriebene Bestimmungsverfahren verwendet wird, wurde um eine genaue Bestimmung durchzuführen, die Probenmenge des Bezugsstandards unter Berücksichtigung der Reinheit des Bezugsstandards mit der Reinheit multipliziert. Dies gilt auch, wie nachfolgend beschrieben, für β-1,4-Galactosyl-steviosid und und β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A.
(iv) Berechnung des Gewichtsprozentsatzes von β-1,4-Galactosyl-steviosid und β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A
Die Gewichtsprozentsätze von β-1,4-Galactosyl-steviosid und β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A wurden gemessen, indem das in "Stevia extract" beschriebene Bestimmungsverfahren in Kombination mit einem Molekulargewichts-Reduktionsverfahren verwendet wurde. Die Gewichtsprozentsätze von β-1,4-Galactosyl-steviosid wurden wie folgt berechnet: unter Verwendung von Steviosid als Standardsubstanz wurden die entsprechenden Peakflächen von β-1,4-Monogalactosylsteviosid und β-1,4-Digalactosylsteviosid als β-1,4-Galactosyl-steviosid anstelle der Peakfläche von Steviosid der Testlösung in der Berechnungsgleichung für die Bestimmung des Gewichtsprozentsatzes von Steviosid verwendet und außerdem wurde die Berechnung durchgeführt, indem die Berechnungsgleichung zur Bestimmung des Gewichtsprozentsatzes von Steviosid mit einem Molekulargewichtsverhältnis zwischen den entsprechenden Komponenten, d. h. dem in Tabelle 1 unten beschriebenen Steviosid und β-1,4-Galactosyl-steviosid multipliziert wurde.
Tabelle 1
Die Gewichtsprozentsätze von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A wurden in der folgenden weise berechnet. Unter Verwendung von Rebaudiosid A als Standardsubstanz wurden die entsprechenden Peakflächen von β-1,4-Monogalactosyl-rebaudiosid A, β-1,4-Digalactosyl-rebaudiosid A und β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid A als β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A anstelle der Peakfläche von Rebaudiosid A der Testlösung in der Berechnungsgleichung zur Bestimmung des Gewichtsprozentsatzes von Rebaudiosid A verwendet und außer dem wurde die Berechnung durchgeführt, indem die Berechungsgleichung zur Bestimmung des Gewichtsprozentsatzes von Rebaudiosid A mit einem Molekulargewichtsverhältnis zwischen den entsprechenden Komponenten, d. h. des in Tabelle 2 unten gezeigten Steviosids und β-1,4-Galactosylrebaudiosid A multipliziert wurde.
Tabelle 2
In dem Bestimmungsverfahren, das in "Stevia Extract" beschrieben ist, ist es erforderlich um die Gewichtsprozentsätze von Steviosid, Rebaudiosid A, β-1,4-Monogalactosyl-steviosid, β-1,4-Digalactosyl-steviosid, β-1,4-Monogalactosyl-rebaudiosid A, β-1,4-Digalactosyl-rebaudiosid A und β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid A zu bestimmen, den Peak der entsprechenden Komponenten, wie Steviosid und β-1,4-Monogalactosyl-rebaudiosid, die bei der Flüssigkeitschromatographie erhalten werden, zu spezifizieren. Deshalb wurde in der vorliegenden Erfindung eine Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt um eine Peak-Retentionszeit zu erhalten und anschließend wurde jede Komponente spezifiziert, damit jede Peak-Retentionszeit den Messergebnissen von Beispiel 1 in Tabelle 3 unten ähnlich war.
Messbedingungen

Säule: NH₂-Gruppen-gebundenes Kieselgel mit einem Teilchendurchmesser von 5 μm (Unisil Q NH₂, hergestellt von GL Sciences Inc.)
Säulenrohr: Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 150 mm
Säulenbehältertemperatur: 40°C
Mobile Phase: Mischlösung aus Acetonitril-Wasser in einem Mischverhältnis von 78 : 22
Flussgeschwindigkeit: 2,0 ml/min
Eingespritzte Menge: 5 μl
Messwellenlänge: 210 nm

Tabelle 3
Spezielle Beispiele dieser Messungen sind als Beispiel 1 in der vorliegenden Beschreibung erläutert.
BEISPIELE
Die folgenden Bezugsbeispiele, Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutern die vorliegende Erfindung im Detail. In diesen Beispielen bedeuten, soweit nichts anderes angegeben ist, Prozentangaben Gewichtsprozente. Die Gewichtsprozentsätze von Steviosid und Rebaudiosid A in dem Stevia-Extrakt A1 und dem Stevia-Extrakt B sind Gewichtsprozente (%), die gemäß dem in Independent Standard for Food Additives excluding Chemically Synthesized Products of Japan Food Additives Association (2. Ausgabe, herausgegeben am 1. Oktober 1993), S. 122–123, "Stevia Extract" gemessen worden sind.
Bezugsbeispiel 1 (Herstellung einer Stammsuspension für die Kultivierung von Mikroorganismen, die β-1,4-Galactosyl-Transferase produzieren können)
Ein Kulturmedium (pH 5,2, 3 Liter), das aus 0,4% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,06% Magnesiumsulfat, 0,001% Zinksulfat, 0,005% Eisen(II)sulfat, 0,1% Hefeextrakt, 1,0% Glucose und 0,5% Lactose zusammengesetzt war, wurde in einen Standfermenter mit einem Volumen von 10 Litern eingebracht und anschließend durch Autoklavieren sterilisiert. Nach Luftkühlung wurde das Kulturmedium mit einem Stamm von Rhodotorula minuta beimpft und bei 30°C unter Belüftung und Rühren über 24 Stunden kultiviert um Zellen zu produzieren. Die resultierende Kulturlösung wurde zentrifugiert und die Zellen wurden gesammelt. Die Zellen wurden zweimal mit einem Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 0,05 mol/l gewaschen und anschließend in 600 ml desselben Puffers suspendiert um eine Zellsuspension herzustellen. Die Gesamtaktivität der β-1,4-Galactosyl-Transferase in den ruhenden Zellen betrug 3420 U.
Bezugsbeispiel 2 (Herstellung einer Rohenzymlösung von β-1,4-Galactosyl-Transferase)
Dasselbe Kulturmedium (3 Liter) wie in Bezugsbeispiel 1 wurde in einen Standfermenter mit einem Volumen von 10 Litern eingebracht und anschließend durch Autoklavieren sterilisiert. Nach Luftkühlung wurde das Kulturmedium mit einem Stamm von Bacillus circulans beimpft und unter Belüftung und Rühren 24 Stunden lang bei 30°C kultiviert um Zellen zu produzieren. Die resultierende Kulturlösung wurde zentrifugiert und die Zellen wurden gesammelt. Die Zellen wurden zweimal mit einem 0,05 mol/l Phosphatpuffer gewaschen und anschließend in 100 ml desselben Puffers suspendiert um eine Zellsuspension herzustellen. Nach dem Zerkleinern der Zellen mittels Ultraschall wurde die Suspension zentrifugiert um die zerstörten Zellen zu entfernen und ein Niederschlag wurde aus dem Überstand durch Zugabe von 70% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt. Der gesammelte Niederschlag wurde in 100 ml Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 0,05 mol/l suspendiert um eine Rohenzymlösung herzustellen. Die Gesamtaktivität der β-1,4-Galactosyl-Transferase der Rohenzymlösung betrug 2988 U.
Beispiel 1
10,0 g eines Stevia-Extrakts A1 (Gewichtsprozent Steviosid: 26,8%, Gewichtsprozent Rebaudiosid A: 58,5%) und 100 g Lactose als Galactosyl-Zuckerverbindung wurden in 500 ml Wasser unter Erhitzen aufgelöst und die Lösung wurde mit Luft auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend wurde der pH mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung mit einer Konzentration von 1 mol/l auf 6,0 eingestellt. Zu der Lösung wurden 100 ml einer Zellsuspension mit β-1,4-Galactosyl-Transferaseaktivität, die in Bezugsbeispiel 1 erhalten worden war, zugesetzt, woran sich die Reaktion bei 50°C über 24 Stunden anschloss. Nach Beendigung der Reaktion wurde diese Reaktionslösung bei 95°C 30 Minuten lang gehalten um das Enzym zu inaktivieren.
Nachdem diese Lösung filtriert worden war um einen suspendierten Feststoff zu entfernen, wurde das Filtrat durch eine Säule passiert, die mit 500 ml eines synthetischen Styroldivinylbenzol-Adsorberharzes (Diaion HP-21) gepackt war um eine Süßekomponente zu adsorbieren. Nachdem die stationäre Phase ausreichend mit Wasser gewaschen worden war um die bei dieser Reaktion verwendete Lactose zu entfernen, wurden 1000 ml wässriges Methanol mit einer Konzentration von 80% durch die Säule passiert um die das β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A enthaltende Süßekomponente zu eluieren, und das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und getrocknet, wodurch 11,2 g eines Süßstoffs als blassgelbes Pulver (im Weiteren als Süßstoff 1 bezeichnet) erhalten wurden.
Anschließend wurden die Gewichtsprozente von Rebaudiosid A (RA), die Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosyl-rebauiosid A (GRA), die Gewichtsprozente von Steviosid (ST) und die Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosyl-steviosid (GST) in dem Süßstoff 1 gemäß dem vorher erwähnten Independent Standard for Food Additives excluding Chemically Synthesized Products of Japan Food Additives Association (2. Ausgabe, herausgegeben am 1. Oktober 1993), S. 122–123, "Stevia Extract" gemessen. Ein spezielles Verfahren wird nachstehend erläutert.
Der Süßstoff 1 wurde 2 Stunden lang bei 105°C getrocknet und 1,52205 g des Süßstoffs wurden in reinem Wasser aufgelöst um genau 100 ml einer Testlösung herzustellen. Unter Verwendung von Steviosid mit einer Reinheit von 99,4%, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., als Steviosid-Bezugssstandard, wurde Steviosid bei 105°C 2 Stunden lang getrocknet und 52,26 mg des Steviosids wurden in einer mobilen Phase aufgelöst um genau 100 ml einer Bezugs-Steviosidlösung herzustellen.
In der gleichen Weise wurden unter Verwendung von Rebaudiosid A mit einer Reinheit von 99,6%, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., als Rebaudiosid A-Bezugsstandard, das Rebaudiosid A 2 Stunden lang bei 105°C getrocknet und 50,78 mg des Rebaudiosid A wurden in einer mobilen Phase aufgelöst um genau 100 ml einer Standard-Rebaudiosid A-Lösung herzustellen.
Anschließend wurden die Testlösung und die Standardlösung mittels Flüssigkeitschromatographie unter den folgenden Betriebsbedingungen analysiert.
Detektor: Ultraviolett-Absorptionsdetektor (Messwellenlänge: 210 nm)
Säule: NH₂-Gruppen-gebundenes Kieselgel mit einem Teilchendurchmesser von 5 μm (Unisil Q NH₂, hergestellt von GL Sciences Inc.)
Säulenrohr: Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 150 mm
Säulenbehältertemperatur: 40°C
Mobile Phase: Mischlösung aus Acetonitril-Wasser in einem Mischverhältnis von 78 : 22
Flussgeschwindigkeit: 2,0 ml/min
Eingespritzte Menge: 5 μl
Das HPLC-Chromatogramm der Testlösung, das als Ergebnis der Analyse durch Flüssigkeitschromatographie erhalten wurde, ist in 1 gezeigt, während die Beziehung zwischen der Retentionszeit des Peaks in dem Flüssigkeitschromatogramm und dem Namen der Komponente in Tabelle 4 gezeigt ist. Die Peakfläche jeder Komponente in der Testlösung ebenso wie die Peakfläche von Steviosid in der Standardlösung und die von Rebaudiosid A des Bezugsstandards wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 4
Tabelle 5
Anschließend wurden unter Verwendung der in Tabelle 5 gezeigten Flächen jeder Komponente und der folgenden Gleichung die Gewichtsprozente jeder Komponente (ST, ST-G1, ST-G2, RA, RA-G1, RA-G2, RA-G3) in dem Süßstoff 1 berechnet. Spezielle Berechnungsbeispiele sind unten illust riert. ST-G1 bezeichnet die Gewichtsprozente an β-1,4-Monogalactosyl-steviosid, ST-G2 bezeichnet die Gewichtsprozente an β-1,4-Digalactosyl-steviosid, RA-G1 bezeichnet die Gewichtsprozente an β-1,4-Monogalactosyl-rebaudiosid A, RA-G2 bezeichnet die Gewichtsprozente an β-1,4-Digalactosyl-rebaudiosid A und RA-G3 bezeichnet die Gewichtsprozente an β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid A
ST = (Probenmenge (g) des Steviosid-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des Steviosids der Testlösung × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Steviosids der Standardlösung) = (0,05226 × 0,99 × 1429012 × 100)/(1,52205 × 361605) = 13,5 (%)
ST-G1 = (Probenmenge (g) des Steviosid-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des β-1,4-Monogalactosyl-steviosid der Testlösung × Molekulargewicht-Reduktionskoeffizient × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Steviosids der Standardlösung) = (0,05226 × 0,994 × 670704 × 1,20 × 100)/(1,52205 × 361605) = 7,6 (%)
ST-G2 = (Probenmenge (g) des Steviosid-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des β-1,4-Digalactosyl-steviosids der Testlösung × Molekulargewicht-Reduktionskoeffizient × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Steviosids der Standardlösung) = (0,05226 × 0,994 × 76874 × 1,40 × 100)/(1,52205 × 361605) = 1,0 (%)
RA = (Probenmenge (g) des Rebaudiosid-A-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des Rebaudiosid A der Testlösung × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Rebaudiosid A der Standardlösung) = (0,05078 × 0,996 × 1923081 × 100)/(1,52205 × 324814) = 19,7 (%)
RA-G1 = (Probenmenge (g) des Rebaudiosid A-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des β-1,4-Monogalactosyl-rebaudiosid A der Testlösung × Molekulargewicht-Reduktionskoeffizient × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Rebaudiosid A der Standardlösung) = (0,05078 × 0,996 × 1346498 × 1,17 × 100)/(1,52205 × 324814) = 16,1 (%)
RA-G2 = (Probenmenge (g) des Rebaudiosid A-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des β-1,4-Digalactosyl-rebaudiosid A der Testlösung × Molekulargewicht-Reduktionskoeffizient × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Rebaudiosid A der Standardlösung) = (0,05078 × 0,996 × 802268 × 1,34 × 100)/(1,52205 × 324814) = 11,0 (%)
RA-G3 = (Probenmenge (g) des Rebaudiosid A-Bezugsstandards × Reinheit des Bezugsstandards × Peakfläche des β-1,4-Trigalactosyl-rebaudiosid A der Testlösung × Molekulargewicht-Reduktionskoeffizient × 100)/(Probenmenge (g) der Probe × Peakfläche des Rebaudiosid A der Standardlösung) = (0,05078 × 0,996 × 162466 × 1,50 × 100)/(1,52205 × 324814) = 2,5 (%)
Anschließend wurde der Gewichtsprozentsatz X der Steviosidglucoside in dem Süßstoff 1 gemessen gemäß dem vorher erwähnten Independent Standard for Food Additives excluding Chemically Synthesized Products of Japan Food Additives Association (2. Ausgabe, herausgegeben am 1. Oktober 1993), S. 119–121, "Enzyme-Treated Stevia".
(1) Bestimmung des Gewichtsprozentsatzes an Steviol in dem Süßstoff 1
Der Süßstoff 1 wurde 2 Stunden lang bei 105°C getrocknet und danach wurden 110,1 mg des Süßstoffs in einen Kolben eingewogen und 10 ml 20 Vol./Vol.-% Schwefelsäure (als Mischlösung, in der der Gehalt an Schwefelsäure in 100 ml einer Mischlösung aus Schwefelsäure und Wasser 20 g betrug) wurden zugegeben. Nach Abkühlen in laufendem Wasser, erhitzt über einem Wasserbad, ausgerüstet mit einem Rückflusskühler für 2 Stunden, wurde der Inhalt in einen Scheidetrichter überführt, während der Kolben mit 10 ml Wasser gespült und die Spüllösung in den Scheidetrichter überführt wurde. Nachdem der Kolben noch dreimal mit je 30 ml Ether gewaschen worden war, wurden die Waschlösungen in dem Scheidetrichter vereint, gut geschüttelt und anschließend stehen gelassen. Die wässrige Phase wurde entfernt und die Etherphase zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend wurde die wässrige Schicht entfernt. Die Etherschicht wurde in einen weiteren Kolben überführt und der Scheidetrichter wurde zweimal mit je 10 ml Ether gewaschen, während die Waschlösungen in einem Kolben vereinigt wurden und 15 mg Natriumsulfat (wasserfrei) zugesetzt wurden. Nach gutem Durchschütteln und Neigen wurde die Etherphase in einen weiteren Kolben überführt. Das verbleibende Natriumsulfat wurde zweimal mit je 10 ml gewaschen und die Waschlösungen wurden in einem Kolben vereinigt. Nachdem der Ether abdestilliert worden war, wurde der Rückstand in 10 ml Ethylacetat, das zugegeben wurde, aufgelöst und 3 ml einer 2 Gew./Vol.-% einer Diazomethan-Ether-Lösung (eine Mischlösung, in der der Gehalt an Diazomethan in 100 ml einer Mischlösung aus Diazomethan und Ether 2 g betrug) wurden zugesetzt. Nach dem Verschließen mit einem Stopfen wurde die Mischlösung ab und zu geschüttelt und 20 min lang stehen gelassen.
Eine Testlösung wurde durch Zugabe von 0,5 ml Essigsäure zu dieser Lösung, Schütteln und Zugabe von genau 2 ml einer Squalen-n-butanol-Lösung (hergestellt durch Auflösen von 2,5 g Squalen in n-Butanol und Zugabe von n-Butanol bis zu einer Menge von 200 ml) hergestellt.
Separat wurde Steviosid mit einer Reinheit von 99,4%, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 2 Stunden lang bei 105°C getrocknet und nach Abmessen von 42,1 ml Steviosid in einen Kolben wurde das gleiche Verfahren wie im Fall des Süßstoffs 1 durchgeführt um eine Standardlösung herzustellen.
Die Testlösung und die Standardlösung wurden durch Gaschromatographie unter den folgenden Betriebsbedingungen analysiert.
Detektor: Wasserstoff-Flammenionisations-Detektor
Säulenpackung: Die flüssige Phase ist ein 50% Phenylmethylsiliconpolymer in einem Anteil von 2%, bezogen auf einen Träger, während der Träger Diatomeenerde (Teilchengröße: 177 bis 250 μm) für die Gaschromatographie [Silicone OV-17, 2% Chromosorb WAW-DMCS 60/80, (hergestellt von GL Sciences Inc.)] ist.
Säulenrohr: Glasrohr mit einer Größe von 3,2 mm ∅ × 2,1 m
Säulenbehältertemperatur: 245°C
Injektortemperatur: 260°C
Trägergas: Stickstoffgas
Flussgeschwindigkeit: 50 ml/min
Eingespritze Menge: 2 μl
Die Peakflächen von Squalen und Isosteviolmethylester der Testlösung und die Peakflächen von Squalen und Isosteviolmethylester der Standardlösung wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
Der Gewichtsprozentsatz von Steviol in dem Süßstoff 1 wurde aus der resultierenden Peakfläche unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt:
worin
A die Gewichtsprozente (%) von Steviol als Probe bezeichnet,
As ein Flächenverhältnis eines Isosteviolmethylesters als Testlösung zu Squalen bezeichnet,
Ast ein Flächenverhältnis eines Isosteviolmethylesters als Standardlösung zu Squalen bezeichnet
S eine Probenmenge (mg) Steviosid bezeichnet,
X eine Probenmenge einer Probe bezeichnet und
K einen Reduktionskoeffizienten zu Steviol, 318,46/804,88 = 0,3957 bezeichnet.
In diesem Beispiel ist As = 5168502/3887140 = 1,330 und Ast = 3082803/3926785 = 0,785. Deshalb berechnet sich der Gewichtsprozentsatz von Steviosid wie folgt: (1,330 × 42,1 × 0,994 × 100 × 0,3957)/(0,785 × 110,1) = 25,5%.
(2) Bestimmung des Gewichtsprozentsatzes von Zucker in Steviolglucosiden
Der Süßstoff 1 wurde 2 Stunden lang bei 105°C getrocknet und nach Abmessen von 1,0074 g des Süßstoffs wurde der Süßstoff in 500 ml Wasser aufgelöst um eine Probenlösung herzustellen.
Nach Abmessen bzw. Abwiegen von 200 mg Anthron wurde das Anthron in 100 ml Schwefelsäure aufgelöst und die Lösung wurde allmählich in 20 ml Wasser unter Eiskühlung zugesetzt und anschließend vermischt um ein Anthron-Reagens herzustellen. Die Probenlösung wurde 50-mal mit Wasser verdünnt um eine Testlösung herzustellen. Nach genauem Abmessen von 2 ml der Testlösung in ein Teströhrchen mit Glasstopfen wurden genau 6 ml des Anthron-Reagenses unter Kühlen der Testlösung in Eiswasser zugesetzt und anschließend gut geschüttelt, bis die zwei Lösungen vollständig vermischt waren. Anschließend wurde die Mischlösung in einem kochenden Wasserbad genau 16 Minuten lang erhitzt. Nach Eiskühlung wurde die Absorptin bei einer Wellenlänge von 620 nm unter Verwendung von Wasser als Referenz gemessen. Das Ergebnis war 0,313.
Anschließend wurde die Glucosekonzentration (μg/ml) der Testlösung mittels einer zuvor erstellten Glucose-Kalibrationskurve bestimmt. Die Glucose-Kalibrationskurve wurde aus den Absorptionen und Konzentrationen erstellt, die durch Behandlung von Lösungen mit jeweils einer Glucosekonzentration von 10,96 μg/ml, 32,88 μg/ml und 54,80 μg/ml in der gleichen Weise wie im Fall der Testlösung erhalten worden waren. Die Glucose-Konzentrationen der Glucose-Kalibrationskurven, die in diesem Beispiel verwendet wurden, und die Absorptionen sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Die Kalibrationskurve wurde durch die Gleichung: Zuckerkonzentration (μg/ml) = 96,31 × Absorption – 2,15 dargestellt. Die Zuckerkonzentration in der Testlösung wurde aus der Absorption (0,313) bei einer Wellenlänge von 620 nm der Testlösung und der Kalibrationskurve bestimmt. Die Zuckerkonzentration (μg/ml) der Testlösung = 96,31 × 0,313 – 2,15 = 28,0
Des Weiteren wurde der Gewichtsprozentsatz von Zucker in Steviolglucosiden durch die folgende Gleichung bestimmt: Gewichtsprozent (%) von Zucker im Glucosid = [Zuckerkonzentration (μg/ml), bestimmt aus der Kalibrationskurve × 0,9 × 50 × 500 × 100]/[Probenmenge (g) der Probe × 1000 × 1000] = (28,0 × 0,9 × 50 × 500 × 100)/(1,0074 × 1000 × 1000) = 62,5%
(3) Berechnung des Gewichtsprozentsatzes an Steviolglucosiden
Die Summe der Gewichtsprozente Steviol und die des Zuckers in Glucosid wird als Gewichtsprozent der Steviolglucoside genommen. Der Gewichtsprozentsatz an Steviolglucosiden in dem Süßstoff 1 wird wie folgt berechnet: 25,5 + 62,5 = 88,0(%)
Die Gewichtsprozente (ST, RA, ST-G1, ST-G2, RA-G1, RA-G2, RA-G3 und X) jeder Komponente in dem Süßstoff 1, der Wert [(GRA + RA)/(X)] und der wert [(GRA)/(RA)] sind in der Tabelle 8 gezeigt.
Beispiel 2
10,0 g eines Stevia-Extrakts A1 (Gewichtsprozent Steviosid: 26,8%, Gewichtsprozent Rebaudiosid A: 58,5%) und 100 g Lactose als Galactosyl-Zuckerverbindung wurden in 500 ml reinem Wasser unter Erhitzen aufgelöst und die Lösung wurde mit Luft auf Raumtemperatur abgekühlt und dann wurde der pH auf 6,0 eingestellt, wobei eine wässrige Natriumhydroxidlösung mit einer Konzentration von 1 mol/l verwendet wurde. Zu der Lösung wurde die Gesamtmenge einer Lösung eines Rohenzyms mit β-1,4-Galactosyl-Transferaseaktivität, die in Bezugsbeispiel 2 erhalten worden war, zugegeben, woran sich eine 24-stündige Reaktion bei 50°C anschloss. Nach Beendigung der Reaktion wurde diese Reaktionslösung 30 Minuten lang bei 95°C gehalten um das Enzym zu inaktivieren.
Nachdem die Reaktionslösung filtriert worden war um einen suspendierten Feststoff zu entfernen, wurde das Filtrat durch eine Säule passiert, die mit 500 ml eines synthetischen Styroldivinylbenzol-Adsorberharzes (Diaion HP-21) gepackt war um eine Süßekomponente zu adsorbieren. Nachdem die stationäre Phase ausreichend mit Wasser gewaschen worden war um die in dieser Reaktion verwendete Lactose zu entfernen, wurden 1000 ml wässriges Methanol mit einer Konzentration von 80% durch die Säule passiert um eine Süßekomponente, die β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A enthielt zu eluieren, und das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und getrocknet, wodurch 11,1 g eines Süßstoffs als blassgelbes Pulver (im Weiteren als Süßstoff 2 bezeichnet) erhalten wurden.
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde die Bestimmung jeder Komponente in dem Süßstoff 2 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Beispiel 3
10,0 g eines hoch gereinigten Stevia-Extrakts A2, der 90 Gew.-% Rebaudiosid A (Gewichtsprozent Steviosid: 1,1 Gew.-%, Gewichtsprozent Rebaudiosid A: 91,3 Gew.-%) enthielt, und 100 g Lactose als Galactosyl-Zuckerverbindung wurden in 500 ml reinem Wasser unter Erhitzen aufgelöst und die Lösung wurde mit Luft auf Raumtemperatur abgekühlt, anschließend wurde der pH unter Verwendung einer wässrigen Natriumhydroxidlösung mit einer Konzentration von 1 mol/l auf 6,0 eingestellt. Zu der Lösung wurden 1,0 g (2477 U) einer Enzymzubereitung mit β-1,4-Galactosyl-Transferaseaktivität [Biolacta N5, hergestellt von Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.] zugesetzt, woran sich eine 24-stündige Reaktion bei 50°C anschloss. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung 30 Minuten lang bei 95°C gehalten um das Enzym zu inaktivieren.
Nachdem die Reaktionslösung filtriert worden war um einen suspendierten Feststoff zu entfernen, wurde das Filtrat durch eine Säule passiert, die mit 500 ml eines synthetischen Styroldivinylbenzol-Adsorberharzes (Diaion HP-21) gepackt war um die Süßekomponente zu adsorbieren. Nachdem die stationäre Phase ausreichend mit Wasser gewaschen worden war um die in dieser Reaktion verwendete Lactose zu entfernen, wurden 1000 ml wässriges Methanol mit einer Konzentration von 80% durch die Säule passiert um eine Süßekomponente, die β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A enthielt, zu eluieren, und das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und getrocknet, wodurch 10,4 g eines Süßstoffs als blassgelbes Pulver erhalten wurden (im Weiteren als Süßstoff 3 bezeichnet).
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde jede Komponente in dem Süßstoff 3 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1
10,0 g eines Stevia-Extrakts B (Gewichtsprozent Steviosid: 79,7%, Gewichtsprozent Rebaudiosid A: 11,1%) und 100 g Lactose als Galactosyl-Zuckerverbindung wurden in 500 ml reinem Wasser unter Erhitzen aufgelöst und die Lösung wurde mit Luft auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend der pH unter Verwendung einer wässrigen Natriumhydroxidlösung mit einer Konzentration von 1 mol/l auf 6,0 eingestellt. Zu der Lösung wurden 100 ml einer Zellsuspension mit β-1,4-Galactosyl-Transferaseaktivität, die in Bezugsbeispiel 1 erhalten worden war, gegeben, woran sich eine 24-stündige Reaktion bei 50°C anschloss. Nach Beendigung der Reaktion wurde diese Reaktionslösung 30 Minuten lang bei 95°C gehalten um das Enzym zu inaktivieren.
Nachdem die Reaktionslösung filtriert worden war um einen suspendierten Feststoff zu entfernen, wurde das Filtrat durch eine Säule passiert, die mit 500 ml eines synthetischen Styroldivinylbenzol-Adsorberharzes (Diaion HP-21) gepackt war um die Süßekomponente zu adsorbieren. Nachdem die stationäre Phase ausreichend mit Wasser gewaschen worden war um die in dieser Reaktion verwendete Lactose zu entfernen, wurden 1000 ml wässriges Methanol mit einer Konzentration von 80% durch die Säule passiert um eine Süßekomponente, die β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A enthielt, zu eluieren, und das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und getrocknet, wodurch 11,0 g eines Süßstoffs als blassgelbes Pulver erhalten wurden (im Weiteren als Süßstoff 1' bezeichnet).
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde jede Komponente in dem Süßstoff 1' bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8
Testbeispiele 1 bis 3 und Vergleichs-Testbeispiele 1 bis 4
Bewertung der Süßeintensität
Unter Verwendung des Süßstoffs 1, des Süßstoffs 2, des Süßstoffs 3 und des Süßstoffs 1' sowie des Stevia-Extrakts A1, des Stevia-Extrakts A2 und des Stevia-Extrakts B als Rohmaterial wurde die Süßeintensität bewertet.
Bewertung der Süßeintensität
Eine Zuckerlösung mit einer Konzentration von 8% wurde hergestellt und als wässrige Standard-Zuckerlösung verwendet. Wässrige Probenlösungen des Süßstoffs 1, des Süßstoffs 2, des Süßstoffs 3, des Süßstoffs 1' sowie des Stevia-Extrakts A1, des Stevia-Extrakts A2 und des Stevia- Extrakts B als Rohmaterial in Konzentrationen im Bereich von 0,025% bis 0,080% (8 verschiedene Konzentrationen, die sich um 0,005% unterscheiden) wurden hergestellt. Der Test auf Süße wurde mit diesen Lösungen durchgeführt. Jede der Probenlösungen wurde mit jeder der Standardlösungen bei 25°C unter Verwendung eines Zwei-Punkt-Vergleichsverfahrens von 20 Testern verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 und Tabelle 10 gezeigt.
Aus den in Tabelle 9 und 10 gezeigten Ergebnissen ergibt sich, dass für den Süßstoff 1 die Konzentration, die der Zuckerkonzentration von 8% entspricht, 0,060% (Süßeintensität: 133fach) betrug, für den Süßstoff 2 0,0575% (Süßeintensität: 139fach) betrug, für den Süßstoff 3 0,052% (Süßeintensität: 152fach betrug oder für den Süßstoff 1' 0,0650% (Süßeintensität: 123fach) betrug. Für den Stevia-Extrakt A1 betrug die Konzentration, die der Zuckerkonzentration von 8% entspricht, 0,0425% (Süßeintensität: 188fach), für den Stevia-Extrakt A2 0,0350% (Süßeintensität: 229fach) oder für den Stevia-Extrakt B 0,0475% (Süßeintensität: 168fach).
Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, dass die Süßeintensität für jeden der Süßstoffe, der aus der β-1,4-Bindung einer Galactosylgruppe an Steviosid resultiert, etwa 70% der Süßeintensität von jedem der Stevia-Extrakte A1, A2 und B als Ausgangsmaterial beibehält und somit weisen diese Süßstoffe eine hohe Süßeintensität auf.
Testbeispiele 4 bis 6 und Vergleichs-Testbeispiel 5
Bewertung der Süße
Unter Verwendung der Süßstoffe 1, 2 und 3 und des Süßstoffs 1' wurde die Süße bewertet.
Wässrige Lösungen der Süßstoffe mit einer Konzentration, die der der wässrigen Lösung mit einer Konzentration von 8% entspricht, wurden hergestellt. Die als Vorgeschmack der Süße empfundene Milde, unangenehme Geschmacksempfindungen, wie Bitterkeit oder Adstringenz, die als Nachgeschmack empfunden wurden, der Kopfgeschmack der Süße, Nachgeschmack und die Schärfe wurden bewertet, indem mit Zucker der gleichen Süßeintensität verglichen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
Aus den in Tabelle 11 gezeigten Ergebnissen geht hervor, dass der Süßstoff 1' nahezu die gleiche Schärfe aufweist, aber in Bezug auf die Bitterkeit, den Nachgeschmack der Süße und den Kopfgeschmack der Süße schlechter ist und dass deshalb die geschmacksverbessernde Wirkung gering ist. Im Gegensatz dazu war bei den Süßstoffen 1, 2 und 3 die Milde als Vorgeschmack verbessert und sie wiesen im Vergleich zu dem Süßstoff 1' einen weniger unangenehmen Geschmack, wie Bitterkeit oder Adstringenz, als Nachgeschmack auf; überdies war die Süße bis zu einer Süße mit guter Qualität verbessert, die im Allgemeinen der von Zucker ähnlich ist.
Anwendungsbeispiel 1
30 g granulierter Zucker, 170 g isomerisierter Zucker, 3,0 g Citronensäure, 0,20 g Natriumcitrat, 0,20 g Brauselimonaden-Extrakt, 0,22 g des Süßstoffs 1 und kohlensäurehaltiges Wasser wurden gemischt um 2 Liter Brauselimonade herzustellen. Als Ergebnis eines von 20 Testern vorgenommenden Geschmackstests wurde gefunden, dass die erhaltene Brauslimonade mit dem Süßstoff 1 eine leichte Süße und einen scharfen Nachgeschmack der Süße zeigte.
Vergleichs-Anwendungsbeispiel 1
In der gleichen Weise wie in Anwendungbeispiel 1, mit der Ausnahme, dass 0,30 g des Süßstoffs 1' anstelle von 0,22 g des Süßstoffs 1 verwendet wurden, wurde eine Brauselimonade hergestellt. In der gleichen Weise wie in Anwendungsbeispiel 1 wurde der Geschmackstest durchgeführt. Im Ergebnis zeigte die erhaltene Brauselimonade einen verzögerten Kopfgeschmack der Süße und einen verlängerten Nachgeschmack der Süße.
Anwendungsbeispiel 2
11 g granulierter Zucker, 141 g isomerisierter Zucker, 20 g Pulverkaffee, 76 g Pulver von entrahmter Milch, 0,26 g eines Süßstoffs 1 und warmes Wasser wurden gemischt um 2 Liter eines Kaffeegetränks herzustellen. In einem Geschmackstest durch 20 Tester zeigte das erhaltene Kaffeegetränk im Ergebnis gute Süße im Einklang mit der Bitterkeit des Kaffeegetränks.
Vergleichs-Anwendungsbeispiel 2
In der gleichen Weise wie in Anwendungsbeispiel 2 mit der Ausnahme, dass 0,30 g des Süßstoffs 1' anstelle von 0,26 g des Süßstoffs 1 verwendet wurden, wurde ein Kaffeegetränk hergestellt. In derselben Weise wie in Anwendungsbeispiel 2 wurde der Geschmackstest durchgeführt. Im Ergebnis wies das erhaltene Soda-Kaffeegetränk keinen natürlichen Geschmack auf, da das Einsetzen des Bitterkeitsempfindens nicht mit dem Einsetzen des Süßeempfindens des Kaffeegetränkts korrespondierte.
Bezugsbeispiel 3 (Bestätigen des Vorliegens von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A)
Unter denselben Bedingungen, die in der Analyse durch Flüssigkeitschromatographie von Beispiel 1 verwendet wurden, wurde der Süßstoff 3 durch Flüssigkeitschromatographie fraktioniert und die geschätzten Peakfraktionen von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A isoliert. Diese Fraktionen wurden pulverisiert und in reinem Wasser aufgelöst um eine 2%ige wässrige Lösung herzustellen. Nach Abmessen von 1 ml dieser Lösung in einem Teströhrchen wurde β-D-Glucosidase (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer Konzentration von 10 Einheiten/ml zugegeben. Anschließend wurde die Reaktion 24 Stunden lang bei 30°C durchgeführt.
Das resultierende mit β-D-Glucosidase behandelte Produkt wurde auf eine 60F254-TLC-Kieselgelplatte aufgetüpfelt (ein Produkt von Merck & Co.). Als Vergleich wurden auch Steviosid, Rebaudiosid A, fraktioniertes β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A und D-Galactose aufgetüpfelt. Anschließend wurde die Platte mit einem Mischlösungsmittel aus Chloroform, Methanol und Wasser in einem Volumenverhältnis von 30 : 20 : 4 entwickelt. Nach dem vollständigen Lufttrocknen wurde konzentrierte Schwefelsäure, die 0,2% Anisaldehyd enthielt, auf die Platte aufgesprüht und diese 10 Minuten lang bei 100°C erhitzt um eine Farbentwicklung zu induzieren. Das resultierende Chromatogramm ist in 2 gezeigt.
In 2 bezeichnen die Bezugszeichen (a) eine Probe, die durch Entwicklung eines Punktes erhalten wurde, der Steviosid zugeschrieben wird, (b) ein Chromatogramm, das durch Entwicklung eines Punktes von Rebaudiosid A erhalten wurde, (c) eine Probe, die durch Entwicklung eines Punktes einer vermuteten Komponente von präparativem β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A erhalten wurde, (d) eine Probe, die durch Entwicklung eines Punktes eines Produktes von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A erhalten wurde, das mit präparativer β-D-Glucosidase behandelt worden war, und (e) eine Probe, die durch Entwicklung eines Punktes von D-Galactose erhalten worden war.
Wie in 2 gezeigt, erschien im Fall der Probe (c), die durch Auftüpfeln einer vermuteten Peakfraktion von β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A durch präparative HPLC erhalten worden war, ein kontinuierlicher Punkt bei einem Rf-Wert im Bereich von etwa 0,35 bis etwa 0,53. Im Fall der Probe (d), die durch Auftüpfeln nach Behandlung mit β-D-Glucosidase erhalten worden war, verschwand ein kontinuierlicher Punkt bei einem Rf-Wert im Bereich von etwa 0,35 bis etwa 0,53 nahezu vollständig und ein Punkt bei einem Rf-Wert von 0,48 blieb bestehen und überdies erschien zusätzlich ein Punkt bei einem Rf-Wert von 0,55, der dem Punkt (b) von Rebaudiosid A entspricht, und ein Punkt bei einem Rf-Wert von 0,25, der dem Punkt (e) von D-Galactose entspricht.
Die vorgenannten Ergebnisse bestätigten, dass der kontinuierliche Punkt bei einem Rf-Wert im Bereich von etwa 0,35 bis etwa 0,53 von einem β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A-Derivat herrührt, das eine aus Rebaudiosid A und D-Galactose kombinierte Substanz ist.

Claims

Süßstoff, welcher Steviolglucoside enthält, umfassend β-1,4-Galactosyl-rebaudiosid A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül und Rebaudiosid A, worin die folgenden Beziehungen (1) und (2) erfüllt werden: [(GRA + RA)/(X)] ≥ 0,4 (1) [(GRA)/(RA)] ≥ 1,0 (2)worin GRA die Gewichtsprozente des β-1,4-Galactosyl-rebaudiosids A mit ein bis drei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül angibt, RA für die Gewichtsprozente an Rebaudiosid A steht und X die Gewichtsprozente der Steviolglucoside darstellt.
Süßstoff nach Anspruch 1, worin die folgenden Beziehungen (3) und (4) erfüllt sind: 0,95 ≥ [(GRA + RA)/(X)] ≥ 0,5 (3) 10,0 ≥ (GRA)/(RA)] ≥ 1,1 (4)
Süßstoff nach Anspruch 1 oder 2, worin die Steviolglucoside weiterhin β-1,4-Galactosyl-steviosid mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül und Steviosid umfassen und die folgende Beziehung (5) erfüllt ist: [GRA + RA)/(GST + ST)] ≥ 1,0 (5) worin GST für die Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosylsteviosid mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül steht und ST die Gewichtsprozente von Steviosid darstellt.
Süßstoff nach Anspruch 1, worin die Steviolglucoside weiterhin β-1,4-Galactosylsteviosid mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül und Steviosid umfassen und die folgenden Beziehungen (3), (6) und (7) erfüllt sind: 0,95 ≥ [(GRA + RA)/(X)] ≥ 0,5 (3) 5,0 ≥ [(GRA)/(RA)) ≥ 1,1 (6) [(GRA + RA)/(GST + ST)] ≥ 1,5 (7)worin GST für die Gewichtsprozente von β-1,4-Galactosylsteviosid mit ein oder zwei β-1,4-gebundenen Galactosylgruppen in einem Molekül steht und ST die Gewichtsprozente von Steviosid darstellt.
Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs, wobei das Verfahren das Einwirkenlassen einer β-1,4-Galactosyltransferase auf eine wässrige Lösung umfasst, die einen Stevia-Extrakt enthält, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A und eine β-1,4-Galactosylzuckerverbindung in einer 5- bis 20fachen Menge, bezogen auf den Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts, enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs nach Anspruch 5, wobei der Feststoffgehalt des Stevia-Extrakts, der 40 Gew.-% oder mehr an Rebaudiosid A in der wässrigen Lösung enthält, 1 bis 5 Gew.-% beträgt und die β-1,4-Galactosyltransferase in einer Menge von 1 bis 1000 Einheiten, bezogen auf 1 g des Feststoffgehalts des Stevia-Extrakts, verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Stevia-Extrakt, der 40 Gew.-% oder mehr Rebaudiosid A enthält, ein Stevia-Extrakt ist, der Rebaudiosid A in einer 1,5fachen Menge oder mehr, bezogen auf das Gewicht an Steviosid, enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs nach Anspruch 7, wobei die α-1,4-Galactosylzucukerverbindung Lactose ist.
Verfahren zur Herstellung eines Süßstoffs nach Anspruch 7, wobei die β-1,4-Galactosyltransferase ein Enzym ist, das aus dem Mikroorganismus der Gattung Bacillus stammt.