JPS5894367A - ステビア甘味料の呈味質改善法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本＠門は、甘味料の製造に際し、ステビオシトとβ−１
、４ガラクトシル糖化合物とを含有する水溶液κ、β一
１、４ガラクトシル転移活性を有する微生物又はβ−１
．４ガラクトシル転移酵素を反応させてβ−１．４ガラ
クトシルステビオシドを生成含有せしめることを特徴と
するステビア甘味料の呈味質改善方法に関するものであ
る。

近年、人工甘味料であるサッカリン酸ナトリウム、サッ
カリン酸ナトリウム、ズルチン等が安全性の見地から一
般食品への使用県止、あるいは便用ｉＩＩＩ限されるよ
５になり、一方では砂糖の摂９すぎκよる健康上への悪
影響が問題とされるようκなっていることなどから、こ
れに代わる天然甘味料の開発が熱望されている。このよ
うな状況下に．オいて、ステビオシトは砂糖と違い低カ
ロリー甘味料であり、しかも甘味倍率が砂ｍＫ比べ約３
００倍と為いことから、その裔兼は急速に尚まってきて
いる。ステビオ７ドはキク科に属するステビア　レパウ
ディアナ　ベルト二一（Ｓｔｅｖｉｉ　ｒ＠ｂａｕｄｉ
ａｎａ　ＢＥＲＴＯＮＩ）から抽出される甘味成分であ
り、ステビオールをアグリコンとするβ−グルコシル配
楯体である。ステビオシトは現在、飲食品のせ味付に使
用されているが、ステビオシトの甘味＆ム砂１１Ｉに比
べると遅く塊われ、しかもそれが残昧として長く残ると
いう欠点以外Ｋｆ昧、嫌味が伴うなどの欠点も持ってお
り、そのままでは便用電、用途に限界があり、側らかの
甘味質の改良が必要であると■われている。ステビオサ
イドの甘味質の数置方法については、砂糖、ふとう紘又
は来場等の天然糖類甘味料の１種又は２ａＩ以上を添加
配合する方法、あるいはアミノ酸及びその塩酸塩を添加
配合する方法がとられている。しかしながらこれらの方
法では、ステビア抽出物の有する苦＊、ｍ味を減じるた
めｋ、前記添加物の配合を惚端に多くしなければならず
、結局ステビオシトのもつ低カロリー甘味料としての特
徴は失なわれてしまうとい５欠点を有している。

そこで本発明者らはステビオシトの持つこれらの欠点を
生化学的手段により解決することを目的として睨ｔ＠究
し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明はステビオシトとβ−１，４ガラクトシ
ル糖化合物例えば乳糖などとを含有する水醪液に、Ｉ−
１，４ガラクトシル糖化合物からガラクトースをステビ
オシトに転移しうる活性を有する微生物、例えばロドト
ルラ属に栖する酵母、ロドトルラ　きヌタ（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａｍｉｍａｔａ）　ＩＦＯ−１５４０、ロド
トルラ　マリナ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍａｒｉｎ
ａ　）　ＩＦＯ−１４２１、及びロドトルラ　ラクトサ
（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　１ａｃｔｏｓａ　）　Ｉ　
ＦＯ−１４２４、またはそれらより得られる＃素（β−
１，４ガラクトシルトランスフエラーゼ）を反応させて
β−１，４ガラクトクルステピオシドを生成含有せしめ
ることを％黴としたステ４ピア甘味料の呈味質改善法を
提供するものである。

この発明により得られたβ−１，４ガラクトシルステビ
オシド＋４倉規な甘味物質であり従来のステビオシト製
品、又はステビオシトと他の甘味料との混合物とは全く
異り、苦味や嫌味がなく、まろやかな甘味を呈する。ま
た残味が′が長ひくことがなく、醪解度が増大する等、
他めて優れた性質ケ何している。

本発明に用いるステビオシトは、高度にｎＩ製されたス
テビオシト製品に限ることなく、ステビオシトとレバク
デイオシドの混合物であっても良く、さらに他の夾雑暢
を含有している！製品であっても、本発明の甘味料を製
造することかできる。

本発明に用いるβ−１，４ガラクトシル糖化合物とは、
例えばラクトース等があげられるが同時に用いるβ−ガ
ラクトシル転移活性１に：有する微生物、あるいはそれ
から得られる酵素によって、ステビオシトからβ−１，
４ガラクトシルステビオシドを生成するものであればい
ずれでもよい。

従ってβ−１，４ガラクトシルステビオシドの生成ｔＰ
谷易にするためには、β−ガラクトシル転１り１＃素に
好適な基質、天然化合物としてのラクトースが最も好ま
しい。

本発明でＭ５β−１，４ガラクトシル転移活性を有する
微生物としては、ロドトルラＩＩ４′に属する微生物が
好ましく、とくにロドトルラ　ミヌタＩＦＯ−１５４０
及びロドトルラマリナＩＦＯ−１４２１、及びロドトル
ラ　ラクトサＩＦＯ−１４２４が好ましい。これらを通
常の酵母に遍した培地、例えば炭素源としてはグルコー
ス、砂糖、ラクトース、グリセリン等、輩嵩源としては
、硫酸アンモニウム、＠酸アンモニウム、尿累、酢酸ア
ンモニウム等、含輩素天然物としては、酵母エキス、コ
ーンステイープリカー等、無機物質としてはリン酸カリ
ウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等、他にビタミン類、微意金属塩等を含有した培
地に植菌して菌体な生育させることＫより得られる。又
反応の方法としては一体の増殖終了と同時にステビオシ
トとβ−１，４ガラクトシル糖化合資を添加することに
より、目的９！Ｊを得ることもでき、培養後、集めた一
体１￥：緩衝准にて洗紗し、同緩衝液にて懸濁した菌体
懸濁ｆｆＬをβ−ガラクトシルトランスフェラーゼ＃嵩
源として用いても良い。

また、この函体１に固定化し、固定化一体を用いてバッ
チ式で反応に（り返し用いること、及び連続式で反応を
行うこともできる。さらに１これらの微生物よりβ−ガ
ラクトシルトランスフェラーゼを＆１４ｇし、その＃本
を用いて反応を行っても全（同様の目的を達成すること
ができる。

β−ガラクトシルトランスフェラーゼの調製方法として
は、咳倣生物の固体培養物及び液体培養物のどちらを使
用してもかまわないが、この場合、液体培養物を利用し
た方が有利である。液体培養物よりのβ−ガラクトシル
トランスフェラーゼを利用するには、培養物をそのまま
使用してもよいが、通常は不溶物を除去した上清液を用
いるか場合によっては菌体より抽出して利用すれば良い
。また必要に応じて硫安塩析により得られる粗酵素を用
いてもよい。まイ（。

た菌体の固定化と同様に本酵素を同Ｘバッチ式あるいは
連続式に反応を行なわせることもできる。

本発明の転移反応条件＆気ステビオシトとβ−１，４ガ
ラクトシル軸化合物とを含有する水＃液に、β−ガラク
トシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物及びそれ
より得られる＃累を反応させればよい。反応に用いるス
テビオシトは、精製ステビオシトの場合、反応液中の１
ｌｌｔを約ａ１〜約１０１量涜とし、β−１，４ガラク
トシル軸化合物は約ｃＬ１〜約５ｏｗｎチとすれば良い
。反応液のｐＨと温度はβ−ガラクトシルトランスフェ
ラーゼが反応して、／−１，４ガラクトシルステビオシ
ドを生成させうる条件であれば良く、通常ｐＨ３〜１０
、温度２０〜７０℃が適当である。このように゛してβ
−１，４ガラクトシルステビオシドを生成せしめた反応
溶液は、そのままでも甘味料として使用できる。また必
要に応じて、微生物菌体を加熱失活させた後、スチレン
とジビニルベンゼンの１合成着樹脂例えばダイヤイオン
ＨＰ−２０、←商品名、三菱化成社製）アンバーライ）
ＸＡＤ−２（商品名、オルガノ社製品）等、又はイオン
父洪樹脂（例えばＨａｔ強酸性イオン交換樹脂および０
Ｈｆｆｉ弱塩基性イオン交換情＆）を用いて脱塩し、こ
れ１に一疎してシラツブ状の甘味料とするか、又は乾燥
、粉末化して粉末状の甘味料とすることもできる。

支に脱塩した反応溶液を精製してβ−１，４ガラクトシ
ルステビオシドを分離採取して甘味料とすることもでき
る。

この際、＃縮、乾燥、粉末化は公知の方法、例えば減圧
濃縮、膜濃縮、真空乾燥、噴霧乾燥等の各徳の方法が自
由に用いられる。このようにして得られたβ−１，４ガ
ラクトシルステビオシドの甘味度は、甘味度の一定条件
によっても異なるが一般には、反応に用いたステビオ７
ドの固型１１蓋に見合う甘味度よりわずかに弱い極板で
ある。またその甘味の質は、苦味−？′渋味等のｍ赫φ
・なくまろり・な甘味であって砂糖に似ており、残味の
切れもよい。

このβ−１，４ガラクトシルステビオシドを工、−Ｉ！
ｒ鉢、趣味、アク味等が全くない無臭、白色の粉末で水
に’ｏｌ嬉であるためステビオシト及びグ、リチルリチ
ンの共存比率、又液体、粉末状の条件下で任慧に共存さ
せることかできる。また、β−１，４ガラクトシルステ
ビオシドを工、サッカリン及びその垣類、サイクラミン
酸ナトリクム、ジヒドロカルコンＪ′スパラテーム等の
周知の合成甘味物質と共用してその呈味籍性′ｔＩ！：
有効利用することが可能であり、これらの合成甘味物質
の１種又は２％１以上に本化合物を添加使用すれば、合
成甘味物質特有の苦味、嫌味等の不快味を改良すること
が可能となる。

またβ−１，４ガラクトシルステピオシドを賦形剤、稀
釈剤、奴着剤的に使用されている砂糖、果楯、ブドウ糖
、乳糖、水飴、デキストリン、デンプン等の周知のＩＩ
ｋ類甘味に添〃口使用することにより、甘味が増強さ汰
従来の蓼用量よりも、大−にその使用音ｔＲＪｊ滅する
ことが可能となる。

更に本化合物をソルビット、マルチトール、マンニトー
ル、キシリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリ
ー甘味ｖＪ負に添）Ｊｕ使用すれば甘味１實の長所を損
うことな（甘味を増強することが出来、良質の低カロリ
ー甘味料が得られる０ ／ｊ−１，４ガラクトシルステビオシドはこの株に一般
食品及びダイエツト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼
料等の甘味源として使用できることはいうまでもない。

例えば、しよう油、粉末しよう油、みそ、粉末みそ、も
ろみ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末
すし酢、中華の素、天つゆ、めんつゆ、ソース、ケチャ
ツプ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の木、ダシの木、複合ｖ４味料、みりん、新みりん、テ
ーブルシラツブ等の各種のｐ４味科。せんべい、あられ
、おこし、絣調、まんじゅう１、ういろプ、あん類、羊
かん、水手かん、ゼリー、カステラ、飴等の各種和菓子
、パン、ビスケット、クラッカー、クツキー、パイ、プ
リン、バタークリーム、カスタードクリーム、シューク
リーム、ワツフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコ
レート、チューイングガム、キャラメル、キャンデー等
の各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベット、アイス
キャンデー等の氷菓、釆爽の７０ツブ漬、水蜜等のシロ
ップ類、フラワーペースト、ビーナツツペースト、フラ
ーペースト等のペースト類、ジャム、マーマレード、シ
ロップ漬、巻巣などの果実、野菜の加工食品類、福神漬
、千枚漬、らつきよ’５ｍ等の漬物類、ハム、ソーセー
ジ等の畜肉製品類、食肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボ
コ、テクワ、天ぷら等の魚肉製品、クニ、イカの塩辛、
さきするめ、ふぐのみりん干等の各槓珍味類、のり、山
菜、するめ、小魚、貝等で製造されるつくだ蕉類、煮豆
、ポテトサラダ、コンブ４！ｆ等のそう菜食品、魚肉、
畜肉、果実、！ｅ菜のピン結、缶詰類、合成酒、果実酒
、洋酒→の酒類、：７−ヒ−、ココア、ジュース、炭＃
に鉱科、乳酸飲料、乳酸函飲料等の清涼飲料水、プリン
ミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席
コーヒー、即席しるこ等槻席飲食品等の％徳政食物、嗜
好物のせ味付に使用できる。

その他、因業品及び医薬外品としては線画みかき、口紅
、リップクリーム、内服薬、トローチ、肝油ドロップ、
口中清涼剤、口中香錠、うがい薬等への甘味剤として使
用することも０自に行い５る。

以下に１本発明の方法およびそれによって得らｎる甘味
料について実施例により具体的に説明するが、以下の優
は］ｉ量基準とする。

実施例１ ＋１１　　ｍ体の調製 り／’＊−カリウム　０．４％％硫安　ｌ１５チ、硫酸
マグネシウム　０．０６％、硫酸亜鉛　［ＬＯＬ）１％
、憾曖第−鉄ｎ、ｏｏｌ、＃母エキス　　α１％、グル
：ｆｆ−ス　１％、ラクトース　［１５チ、（ｐＨ５，
２）の培地組成から成る培地６、Ｏｌを１０！容ジヤー
７アメンターに仕込み、ロドトルラ　マリナ（ＩＦＯ−
１４２１）＃を接種して３０℃で２４時間通気攪拌培養
し、一体を生産した。得られた培ＩＩ販ｔ遠心分離し、
００５ＭＩＪン酸緩衝液にて菌体を２回洗浄した後、同
緩衝液６０ＣＤｌ）ＫＳ濁して、休止菌体懸濁液を調製
した。

（２）転移反応 Ｎ製ステビオ７ド（商品名、ステビア−ＤＩＣ１大日本
インキ化学社製品）８０／、ラクトース　１６０ｙをα
０５Ｍリン酸！ＩＩＩ液（ｐＨ＜！ｃＯ）五４ノに浴解
させて１０！容ジヤーフアメンターに仕込み、滅菌冷却
後、休止菌体懸濁液を加えて４１とし、６７℃で９６時
間反応させた。反応後、加熱失活させた溶液を合成吸着
Ｉ！ｆ脂ダイヤイオンＨＰ−２０（部品名、三菱化成社
製）にＳ、Ｖ、＝２で通し、ステビオシト知を吸着させ
た後、９５チエタノールで脱着した。脱着衣のエタノー
ルを減圧貿去した後、強酸性イオン交換樹脂であるアン
バーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈａ！！、Ｆｍａ６名、ロ
ームアンドハース社製品）、弱塩基性イオン交換樹脂で
あるアンバーライ）ＩＲＡ−９３（ＯＲ型、鋤品名、ロ
ームアンドハース社製品）ＫＳ、Ｖ＝２で通して脱塩し
た。ついでこれを７０℃以下で減圧＃縮し、真空すして
粉末の改善甘味料を得た。（試料４２）一方対照品とし
て、あらかじめ加熱失活させた微生物菌体を用いて同様
に反応させ、教着樹脂、イオン交換樹脂で゛柑製したも
の（試料４１）を得た。

（３）数置甘味料の甘味度試験 試料／Ｉ６１、ム２のα０２嗟及びα０５−水溶液を脚
贅し、砂糖の１〜７チの水溶液なａ５嗟績度段階で１３
徳の標準浴液を作製し、これらについて甘味度試験を行
った。試験は試料溶液と確率溶液との２点比較法で、２
０名のパネル員により、屋温２０℃で行い、その結果を
第１表に示す。

（ａ）　　α０２％水溶液の場合 ［ｂ）　　α０５％水溶液の場合 Ｗ、１表の（ａ）及び（ｂ）の結果から、試料／１６１
の甘ｋｋはａ０２チ水溶液で砂糖製置６−（甘味度１５
０倍）に相当し、α０５％水静液で砂Ｓ装置６チ（せ昧
鼓１２ｏ１行）に相当する。同様に試８Ａ６２の甘味度
は砂ｗ１濃度の各々ｚ５チおよび５％に相当するので改
善甘味料の甘味度は、用いたステビオシトに見合う甘Ｍ
Ｋわずかに弱いせ味直であると判断される。

（４）改善甘味料の味質試験 試料／ｉ６１の対照品と試料溝２の改善甘味料とを用い
て甘味の質の違いの比較を行った。前記甘味度試験で求
めた甘味度から算出して、各試料を３％、６％、１０チ
の砂糖水浴液に相当する甘味度の水溶液に調整した。そ
して各甘味度で試料Ａ１、試料溝２の試料静液につきそ
の味質の良否を対比した。

繭２表の結果から、試料４２の改善甘味料の甘味質は、
いずれの甘味度の場合も試料ム１の対照品よりすぐれて
いることが明らかである。

（５）　　β−１，４ガラクトシルステビオサイドの分
離、ｉ１１關前記転移反応生成物（即ち改善甘味料）を
吸着樹脂、イオン交換樹脂で精製し、減圧濃縮、真９！
乾燥後、クロロボルム：　メ／／−Ｊ／：　水＝３０　
：　２５　：　４（Ｄ１１１媒に＃Ｍシ、Ｗａｋｏｇ＠
Ｉ　Ｃ−２００（商品名、和光細条工業製シリカゲル）
を充礪したカラムによりカラムクロマトグラムを行ない
、前記溶媒で溶出させて各７ラクシヨン別に分離した。

その結果、ズルコシドＡ、ステビオシト、レパウディオ
シドー〇、レバウディオシドムの顔に婢出し、最後にβ
−１゜４ガラクトシルステピオシドとそれぞれ目される
フラクションが溶出した。この最後の７ツクシヨンを諷
圧＃ｌＩ縮、真空乾燥して白色の粉末を得た。得られた
粉末のおよそ２１１ｉ水溶液１ｄを試験管にとり、それ
にβ−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社
製品）を６Ｕｎｉｔ／ｄになるように添加後、２５℃で
５０時間反応させた。反応後得られた生成物をシリカゲ
ルプレート６０Ｆ（メルク社製品）Ｋスポットし、対照
としてステビオシト、β−ガラクトシダーゼ処塩前の物
質、即ち本発９１１曹質およびＤ−ガラクトースを併せ
てスポットしクロロホルム：メタノール：水＝３０：２
０：４の展開各課にＭ開した。充分に風乾後、１２％の
アニスアルデヒドを含有させたＩｆｆ酸を噴霧し、１０
０℃で１０分間加熱して発色させた。このクロマトグラ
ムを第１図に示す。第１図より、β−ガラクトシダーゼ
処理して得られた試料はＩＣ）については、Ｒｆ値α６
６のステビオシト（凰ンとＲｆ値α２８のＤ−ガラクト
ース（ｄ）のスポットが出現した。なお対照として用い
た本発明１質（ｂＨ１Ｒｆ値ｕ、６５の位置にのみスポ
ットが認められた。

また高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津表作所
、ＬＣ−５ムＩＩ）Ｋて次の条件で転移、反応処理液を
測定したところ、結果は絽２図のとおりであり、Ｗ、３
図の反応前の原料でみられるピーク以外に、ｒｔ２Ａ４
４ｍｈａのところに新しい生成物β−１，４ガラクトシ
ルステビオシドかＮ紹された。

ＨＰＬＣＫよる分析条件 １）カラム　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　−ＮＨ２４，１６
Ｊ２’×２５Ｌ）２）移動相　ＣＨｓＣＮ：水＝７８：
２２　　ｖｏｌ比３）　ｆｉ　　ｉｉ　　２５１４ン’
ｗｉｎ４）圧力五０Ｗｔｘ冨 ５）波長２００ｍ これらの結果より反応によって新たに生じたこの物質は
、ステビオシトＫＤ−ガラクトースか等モルｌｌ−１，
４ｋＮ合している。物質、すなわち、β−１，４−モノ
ガラクトシルステビオシドであると判断された。

（６）　　β−１，４ガラクトシルステビオシドの甘味
度試験カラムクロマトグラフィーにより分取したβ−１
，４ガラクトシルステビオシドの０．０２％、０．０５
　％、水溶液なＩ＃表し、砂糖の１〜４嗟の水溶液なα
５１１ｆｆ段階で７種の４＃ｉ準溶液を作製し、これら
について甘味度試験を行った。

試験は試料溶液と俸阜痔液との２点比較法で２０名のパ
ネル員により、室温２０℃で行い、その結果を第５表に
不丁。

第６表 （ａ）　　０．０２チ水溶液の場合 （ｂ）　　α０５チ水溶猷の場合 ＃！３表の結果からＳ−１，４ガラクトシルステピオシ
ドリ甘味ｆは、Ｑ、０２嘩水溶液で砂ＪＩ！＋＃度２チ
（１呟１００倍）に相当し、Ｑ、０５チ水溶液で＃穂＃
度五５−←甘味度７０倍）Ｋ相当すると判断される。

（７）　　β−１，４ガラクトシルステビオシドの＃ｊ
ｉｌＫ験ステビオ７ド純品の対照品と、／−１，４ガラ
クトシルステビオシドとを用いて甘味の質の違いの比較
を行つム前記（６）の試験で求めた甘味度から算出して
、各試料を６チ、６チ、１０嗟の砂糖水溶液に相当する
甘味度の＊＃Ｉ液に胸裏した。そして各甘味［において
、ステビオシト純品とβ−１，４ガラクトシルステビオ
シドの試料溶液につぎ味質の良否を対比した。試験は２
０名のパネル員により２０℃の室温で行った。その結果
は第４表に示す通りである。

第４表の結果から、β−１，４ガラクトシルステビオシ
ドの甘味質は、いずれの甘味度の場合も、ステビオシト
より優れていることが判る。そして各パネル員の感覚に
よるとステビオシトの様に苦味、＃を味の如き後味の不
快感が残存する欠点がな（、まろやかな甘味で！！４味
の切れもよ（、比較的砂槽に近い甘味であった。

実施例２ グルコース　１−、ポリペプトン　Ｕｌ、５％、酵母エ
キス［１３％、麦芽エキス　　０３％、ｐＨ６０からな
る培地１００ｍ１５００−容坂ロフラスコに分注し、ｓ
９．１後、ロドトルラ　マリナＩＦＯ−４４２１を植菌
し、５０℃で４８時間振と５培養した。

この培養液を遠心分離して菌体な集め、その彼Ｑ、０５
Ｍリン赦バッフ７−（ｐＨ７，２ンにて１体を少なくと
も２ＦＥｉｌｆｃ＃した俊、同バッファー２０−にて画
体’ｉｔｓ濁して休止画体懸濁液とし、これをβ−ガラ
クトシルトランスフェラーゼ酵素源とし亀別に、反応容
器として５ｏｏＩＩＪ容坂ロフラスコを用い、０．０５
Ｍ酢酸−酢酸ソーダバッファー（ｐＨ５，０）３０８ｇ
を入れ、精製ステビオシト１品名：ステビアーＤＩＣ，
前出）０５ｇとラクトースｔｏＩを加えて溶解した後、
オートクレーブ滅菌した。

この反応溶液中ｋ、先にｖＩ４製した休止一体ａ１１４
献を加え、絨終ｐＨ６０、反応ＩｉＸ度３０℃で１１０
時間振盪しつつ反応した。反応後を遠心分離機にて遠心
分離して厘体１に除くと、上清敵頃ステビオシトの約３
８−がβ−１，４ガラクトシル化されたβ−１，４ガラ
クトシルステビオシドとステビオシト、レバウデイオシ
ドＣ，レパウデイオシドムなどの混合溶液であった。

この混合ｓｇを陽イオン交ＩＭＦ１ｉＩアンバーライ）
ＺＲ−１２０８（Ｈ型）及び陰イオン交換樹脂アンバー
ライトＩＲム−９３（ＯＨ型）を通して精製し、減圧濃
縮後乾燥し、粉末化して得られた改善甘味料は反応前の
ステビオシト甘味料に比べ苦味や嫌味がまったくなく、
非常にまろやかな甘味を呈した。

実施例６ 実施例２と同様の培地組成からなる培地に、実施例２と
Ｘ＊の方法にて、ロドトルラ　ミヌタ　ＩＦＯ−１５４
０を植画し、６０℃で４８時間振と５培養した。

得られた菌体を５ｊｌ施例２と同様の方法で処理し、同
様の方法でβ−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素源
として反応させた。１３５時間反応後、一体と分離して
得られた反応液は、ステビオシトの約６Ｌｓがβ−１，
４ガラクトシル化されたβ−１，４ガラクトシルステビ
誓シトとステビオシト、レバウデイオシドＣルバウデイ
オシドムなどの混合溶液であった。この混合Ｉ＃敵を実
−例１と同様の方法で精製し、Ｓ縮後乾燥して得られた
改善甘味料は実施例１とまったく同様の甘味度及び甘味
質を示した。

実施例４ 実施例２と同様の培地組成からなる培地に、実施例１と
同様の方法にて、ロドトルラ　ラクトサ画（ＩＦＯ−１
４２４）を植菌し、３０℃で４８時閲振と５培養し１も
得られた一体を実施例２とまったく同様の方法で処理し
、同様の条件で反応させた。１２０時間反応反応後体と
分離して得られた反応液は、ステビオシトの約３０−が
β−１，４−ガラクトシル化されたβ−１，４−ガラク
トシルステビオシドとステビオシト、レバウデイオシド
Ａ、レバクデイオシドＣなどの混合拵液であった。この
混合＃猷を実施例２と同様の方法で精製し、濃縮転向し
て得られたβ−１，４−ガラクトシルステビオシド甘味
料は実施例２で得られたものとまったく同様の甘味度及
び甘味質を示した。

実施例５ リン酸−カリウム　α４−１硫安　ａＳＳ、硫酸マグネ
シウム　［１０６チ、硫酸亜鉛　α００１−１硫酸第一
鉄α００５嗟、酵母エキス　α１％、ラクトース　１Ｌ
ｓ（ｐｉ（５，２）の培地組成からなる培地（培地Ａと
称す）五〇ノを１０！容ジヤーフアメンターに仕込み、
それに別にポリペプトン０．５チ、酵母エキス　ａ、Ｓ
＠、麦芽エキスα５−、グルコース　１１ｓ、ラクトー
ス　１チからなる培地組マ゛′ ）′ 成４８時間、６０℃で種培養したロドトルラ　マリナＩ
ＦＯ−１４２１を樵繭として４００−植菌した。

培誉ｆｆｌ＆３０℃、ｐＨ５，０、通気量１４７７ｚａ
ｉｎ、攪拌速Ｎｔ５　Ｌｌ　Ｏｒｐｍで２４時間培養後
、ステビア−ＤＩＣ４０１、ラクトース８０ｇを培地ム
ロ００−に溶解し、殺−したものを加え、総量４ノとし
た。四時に反応温度を４２℃に、ｐＨ４’＆０にそれぞ
れシフトし、通気量４０１／ｍｉｎでβ−ガラクトシル
転移反応を行わせら　７２時間後、ステビオシトのおよ
そ４５−がβ−１，４ガラクトシルステピオシドに転換
していた。培地成分をイオン交換樹脂ＩＲ−１２０Ｂ及
びＩＲム−９３等を通して除去後、得られたステビオシ
ト、β−１，４ガラクトシルステピオシド、レバクデイ
オシドムおよびＣなどの混合溶液は、稽製ステビオシト
に比べ、＊ｉや苦味がなく、非常Ｋまろやかな甘味を呈
していた。

実施例６ 実施例５のロドトルラ　ｉリナＩＦＯ−１４２１の代わ
りに、ロドトルラ　ミヌタＩＦＯ−１５４０を使用した
以外は実施例５と同様に行ない、反応条件としては、１
１８５７℃、ｐＨ＆０、通気ｔ４．Ｏｊ／ｍ１ｎでガラ
クトシル転移反応を行った。反応７２時間後ステビオシ
トのおよそ１２−がβ−１，４−ガラクトシルステビオ
シドに転移していた。

実施？Ｉ１５と同様のｆＩ！ｌ襄法により、まったく同
じ甘味物質が得られた。

実施例７ 実施例５のロドトルラ　マリナＩＦＯ−１４２１の代わ
りに、ロドトルラ　ラクトサＩＦＯ−１４２４を使用し
た以外は実施例５と同様に行ない、反応条件としては、
温！３７℃、ｐＨ＆Ｌｌ、通気Ｊ１４．ＯＡ／ｗｉｎで
ガラクトシル転移反応を行った。反応７２時間後、ステ
ビオシトのおよそ６８チがβ−１，４−ガラクトシルス
テビオシドに転換していた。実施例５とｌ！ｉＪ様に摺
装することにより、まったく同様の甘味ｒＪｍ質が得ら
れた。

実施例８ 夾り例５と同じ培地組成からなる培地５１ノを１０！容
ジヤーフアメンターに仕込べそれに実施例５と同培地組
成、四培養条件で種培養したロドトルラ　マリナＩＰＯ
−１４２１を１１１ｉｄＩとして４００−接種した。培
養温度３０℃、ｐＨ５，０、通気ｉｔ＆５７／ｗｉｎ、
攪拌速ｊｆ５００　ｒｐｍで２４時間培養後、ステビア
集の水抽出液（ステビオシトが約Ｚ４−含有したもの）
５Ｑ［ｌａｊ中にラクトース８０．９を溶解させ、殺菌
したものを加え、線番ｉｔを４．Ｏｌになるようにした
。反応温度４２℃、ｐ　Ｈ６，Ｏｊｌｌｊ２Ｌｔ４．Ｏ
ｊ／ｍ　ｉ　ｍにセット後、７２時間、５００　ｒｐｍ
で攪拌しつつ反応を行った。反応終了後、一体Ｙ：除い
た上ｆｌＩ液中に（眠ステビオシトのおよそ６５チがβ
−１，４ガラクトシルステピオシドに転換されているも
のを含有していた。この上清液をイオン交換樹脂アンバ
ーフイ）ＩＲ−１２０Ｂ及びＩＲムー９６を通して培地
成分及び、ステビア葉抽出物中の夾細物を除いて得られ
たβ−１，４ガラクトシルステビオ７ド、ステビオシト
、レバウデイオシドＡおよ、びレバウデイオシドＡなど
の混合溶液は反応前のステビア葉璃出愉に比べると、味
覚の点で歴然と差があるのはいうまでもなく、精製ステ
ビオシト甘味料の水溶液と比較しても、苦味や嫌味の大
きな改良が認められた。

次に本発明品の２〜５の応用例について述べる。

応用例１ 次の配合により粉末ジュースを試作した。

グラニユー糖　　　　　　　９６９Ｉ クエン＆　　　　　　　　２ｉ クエン酸ナトリウム　　　　　２１．９リンゴ酸　　　
　　　　１４１１ 香　　　料　　　　　　　　　　ｉｉｙβ−カロチン（
１５％）　　　　　Ｈ１本発明改善甘味料　　　　　　
　３９ また比較例として、上記配合中の改善甘味料の代りに、
ステビオシト粉末（９０１品）を２．５ｙ添加したもの
な試作した。２０名のパネル員による呈味テストの結果
、本発明品名用品は苦味、嫌味等が全くなく、比較品は
、後味に苦味が感じられた。

応用例２ 次の配合により果汁２０チオレンジジユ一スヲ区作した
。

オレンジ１００チ天然果汁　　　４４０Ｊ！上白糖　　
　　　２０９ 高来楯異性化砧　　　　　　　　２１６ｇクエン酸　　
　　　　　　　４ｙ クエン酸ナトリウム　　　　　　　　ＣＬ４ｇリンゴ酸
　　　　　　　　　　２！ 香　　　料　　　　　　　　　　　　　２ｙβ−カロチ
ン（ｔ５ｑｋ）　　　　　［Ｌ６ｇ改善甘味料　　　　
　　　　　　　［１４１１全体ｔを水で２！にする また比較例として、上記配合中の改善甘味料の代わりに
ステビオシト粉末（９０％）をα５１１添加したものを
試作した。２０名のパネル員による呈味テストの結果、
本発明品名用品はマイルドな甘味で風味があり、比較品
は後味に不快味が残存した。

応用例３ 次の配合によりサイダーを試作しｆ二。

グラニユー糖　　　　　　　３４．Ｐ 異性化ａ　　　　　　　　　　１８０．＠クエンｒＲ４
１Ｉ クエン酸ナトリウム　　　　０．２ｐ サイダーエツセンス　　　　Ｑ、２．ｐ改善甘味料　　
　　　　　　α６ｙ 全体量を炭酸水で２ｊＫする また比較例として、上記配合中の改善甘味料の代わりに
ステビオシト粉末（９０１Ｇ）を１２１添加したものな
試作した。２０名のパネル員による呈味テストの結果、
本発明品名用品はあっさりした甘味で残味の切れが良く
、比較品は苦味、渋味が感じられた。

４、図面の簡単な′＃ｉ、明 第１図は、薄層クロマトグラムを示し、（ａ）、　（ｂ
）、　（ｃｌ　（ｄｌは、ステビオシト、β−１，４ガ
ラクトシルステビオシド、ステビオシトのβ−ガラクト
シダーゼ処理物質、ガラクトースを各々示す。第２図は
、ステビオシトのＩ−ガラクトシル転移酵素処理物の高
速液体クロマトグラフィーのチャートを示し、第３図１
′！、ステビオ、シトの＾速液体クロマトグラフィーチ
ャートを示す。

特許出願人二　大日本インキ化学工業株式会社ディック
ファインケミカル味式会社 第　１　図 ○　ス゛う”じオシ）二： Ｏオフ１ＰハＪ１町］り （１）　　ｎ’クタトー人 ％　２区 ろ 乙・ （分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ステビオシトとβ−１，４ガラクトシル糖化合物と
   を含＋Ｔる水浴腋学Ｋ、β−１，４ガラクトクル転移活
   性を有する微生物又はｐ−１，４ガラクトシル転移酵素
   を反応させて、β−１，４ガラクトシルステビオシドを
   生成含有せしめることＹ特許としたステビア甘味料の呈
   味質改善法。 ２、　β−１，４ガラクトシル転移活性を有する微生物
   がロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｍ　）　１４に属
   する微生物であることをｔｐ！ｆ値とする特許請求の範
   囲第１項記載のステビア甘味料の呈味）Ｘ改書法。