CN1030766A - 恩卡斯丁：一类具有抑制脑啡肽酶作用的新的糖肽它们的制备方法以及作为药物的应用 - Google Patents

恩卡斯丁：一类具有抑制脑啡肽酶作用的新的糖肽它们的制备方法以及作为药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的具有生物活性的糖肽或其它酸 性衍生物，其通式为：Sacch-A-B-R，其中Sacch， A，B，R的定义如说明书所述。这些化合物具有抑制 脑啡肽酶的特征，因此可以作为镇痛剂应用于人体和 畜牧医学。本发明也叙述了从白色链霉菌 ATCC21838中分离本发明化合物的方法，此外还叙 述了制备它们的其他方法。

Description

本发明所涉及的是一类新的、具有生物活性的糖肽。它们具有抑制脑啡肽酶的特性，例如，可作为镇痛剂应用于人体和畜牧医学。本发明还叙述了它们的制备方法。
恩卡斯丁（Enkastin）是指其中单糖通过氨基氮与氨基酸或二肽相连的一类化合物。带有该类型L-氨基酸的化合物已由K·Heyns和H·Paulsen在（Liebigs    Ann.Chem.622（1959）160-174），H.Roeper，S·Roeper和K·Heyns在（Carbohydrate    Research    116（1983）183-195）中做了描述。化合物，例如N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-甘氨酸和N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-丝氨酸已由B·N·Stepanenko和N.N.Borodina在Prikl，Biokhim、Mikrobio，12（1）（1976）5-13〔C.A.85：143425h〕中揭示。
人们已叙述了多种具有镇痛作用的活性的脑啡肽酶抑制剂，它们一般都带有与亲脂性氨基酸相连的官能团，该官能团能与Z2+ n缔结为金属酶的配位络合物，此络合物实质上与催化作用有关。这些官能团的实例有-SH，HO-NH-CO-，-P（＝O）OH-R和-COOH（R.E.Chipkin，Drugs of the future 11（7）（1986），593-606）。众所周知，这类从细菌中分离出来的化合物，不仅可以抑制脑啡肽酶，而且还能抑制酶热解作用（M.Pozsgay，C.Michaud，M.Liebmann和M.Orlowski，Biochemistry25（1986）1292-1299）。因而，本发明的目的是要找到能特异地抑制脑啡肽酶的化合物。
根据本发明提供的通式Ⅰ化合物或其他的羧酸衍生物或者它们生理上适合的盐，可以实现上述目的，
其中，Sacch代表单糖残基，如果合适，其所携带的羟基可部分或完全地被取代，A代表中性L或D-氨基酸残基，或者，B不存在，A代表中性D-氨基酸残基，B不存在或代表中性L或D-氨基酸残基，或者是ω一位有选择取代的并具有双官能的（酸性或碱性）L或D-氨基酸残基，R代表羟基、（C1-C8）-烷氧基、和由一个或二个相同或不同的基团有选择取代的氨基，一个或二个相同或不同的基团系选自（C1-C8）-烷基，（C5-C8）-环烷基，（C5-C8）-杂烷基或（C5-C8）杂芳基，条件是化合物N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-甘氨酸和N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-丝氨酸除外。
特别适宜作为盐的是碱金属和碱土金属盐，与生理上适合的胺形成的盐，和与无机酸（如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸）、有机酸（如顺丁烯二酸、延胡索酸、柠檬酸和酒石酸）形成的盐。
如果单糖基上的羟基被取代，它们最好被醚化或醋化，尤其是用（C1-C4）-烷氧基或（C1-C4）-烷基羰基醚化或酯化。此外，羟基还可由氢（脱氧糖）、（C1-C4）-烷基和杂原子如氧、氮、硫及它们的衍生物置换。
除非在特殊情况下另有说明，否则烷基或烷氧基可以为直链或带支链的。
作为杂烷基特别适合的是环状化合物，同样还有杂芳基，尤其被认为是含氮化合物，如吡咯烷、哌啶和吡啶。
优选的残基A和B是从天然形成的α-氨基酸衍生而来的物质（参见Schroeder，Lübke，“The    Peptides”，Volume    l，New    York    1965，P137-270或Houben-Weyl，“Methoden    der    Organischen    Chemie”（Methods    of    Organic    Chemistry）Volume    15/l    and    2，Supplement），它们的对映体或它们简单的代谢物。肽的各个手性中心有R或S或R、S构型。
以下所述的氨基酸以L.Styrer在“Biochemistry”（W.H.Freeman & Company，San Francisco，1972，Pages14et se .）所采用的符号表示。加在这些符号前的D，是指D-氨基酸残基，没有构型符号的残基则为L型。
例如，Sacch可以是丙糖、丁糖或由戊醛糖、己醛糖、戊酮糖、己酮糖、脱氧醛糖和氨基醛糖以及它们的立体异构体得到的吡喃糖基或呋喃糖基，特别是D-或L-单糖类物质如核糖（Rib），阿拉伯糖（Ara），木糖（XyL），来苏糖（Lyx），阿洛糖（ALL），阿卓糖（ALt），葡萄糖（Glc），甘露糖（Man），古洛糖（GuL），艾杜糖（Ido），半乳糖（GaL），塔罗糖（Tal），赤藓糖（Ery），苏阿糖（Thr），阿洛酮糖（Psi），果糖（Fru），山梨糖（Sor），塔洛糖（Tag），木酮糖（Xyu），岩藻糖（Fuc），鼠李糖（Rha），橄榄糖〔Olivose，（OLi）〕，低聚糖〔OLigose（OLo）〕，脱氧链丝菌糖（
Figure 881024570_IMG3
yc），玫红菌胺（RN），N-乙酰氨基葡萄糖（GLCNAC）、N-乙酰半乳糖胺（G
Figure 881024570_IMG4
lNAC）、N-乙酰甘露糖胺（ManNAC）和它们人工合成衍生物，如脱氧氨基，乙酰氨基、卤代（首选溴代和碘代）糖或肌醇。Sacch可以是α或β两种形式，但首先β-型，且也可以选用单糖衍生物。
较好的通式Ⅰ的糖肽及其生理上适合的盐，其中，
Sacch表示己醛糖残基或己酮糖残基，或它们衍生物的残基，
A表示Ite，Phe，Leu，Val，Thr，Ser，Gly，Cys，Ala或六氢苯基甘氨酸（Hhp），在每种情况下，上述各个残基都为L或D-型，或者如果B不存在，上述各个残基都为D-型。
B是不存在的或表示Asp，Asx，Glu，Glx，Ser，Thr或Gly，在每种情况下它们都为L或D-型，
R表示羟基或 ，化合物N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-丝氨酸和N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-甘氨酸除外。
更好的通式Ⅰ的糖肽及其生理上适合的盐，其中
Sacch表示果糖残基或其衍生物，
A表示Ile，Phe，Leu，Val，Cys，Ala或Hhp，在每种情况下都为L或D型，或者如果B是不存在的，上述各个残基都为D-型，
B是不存在的或表示Asp，Asx，Glu或Ser，在每种情况下，它们均为L或D-型，
R表示羟基。
最好的通式Ⅰ的糖肽及其生理上适合的盐，其中，
Sacch表示果糖残基或其衍生物，
A表示Ile，Leu，Val，Cys或Hhp，在每种情况下，都为D型，
B表示Asp，Asx，Glu或Ser，每种情况下，它们都为L或D-型，
R表示羟基。
尤其要提到的是下述糖肽：
Enkastin    ID，Enkastin（D）ID
Figure 881024570_IMG6
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-天冬氨酸
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-异亮氨酰-天冬氨酸
Enkastin    VD，Enkastin（D）    VD
Figure 881024570_IMG7
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-缬氨酰-天冬氨酸
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酰-天冬氨酸
Enkastin    AD
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-丙氨酰-天冬氨酸
Enkastin    IE
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-谷氨酸
Enkastin    VE
Figure 881024570_IMG10
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-缬氨酰-谷氨酸
Enkastin    AE
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-丙氨酰-谷氨酸
Enkastin（D）    V
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酸
本发明也涉及通式Ⅰ化合物的制备方法，该方法包括
（a）将白色链霉菌（ATCC21838）及它的变异体和突变体在营养培养基上培养，直至其中Sacch代表N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）残基，A代表Ala，Leu，Val或Ile，B代表Asp或Glu，R代表羟基的通式Ⅰ化合物并且如果合适积聚在培养物中，
（b）将其分离、纯化和衍化。
在含有碳源和氮源及常用无机盐的营养液中，白色链霉菌ATCC21838可特定地生产出enkastin    ID，enkastin    VD，enkastin    AD，enkastin    IE，enkastin    VE和enkastin    AE。
当然，只要能合成出一种上述化合物，就可以用来代替菌株ATcc    21838、它的变异体和突变体。这种类型的突变体也可用本身已知的方法，例如通过物理作用（如辐照，紫外线或X-射线）及化学诱变剂〔如，甲磺酸乙酸乙酯（EMS）或2-羟基-4-甲氧基二苯酮（MOB）〕来产生。
有氧发酵的合适和优选的碳源是可同化的糖类和糖醇，如葡萄糖，乳糖或D-甘露糖醇以及含糖的天然产物如麦精、油类和脂肪。较好的含氮营养素是：氨基酸、肽和蛋白质、以及它们的降解产物，如蛋白胨、胰蛋白胨，还有肉羹，磨碎的种子如玉米、小麦、豆类、黄豆和棉籽，酒糟、肉渣或酵母提取物，还有铵盐和硝酸盐。
营养液中可以含有的其它无机盐是碱金属或碱土金属的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐，或微量元素铁、锌、钴和锰。
Enkastins产物可以满意地生长在含有占营养液总重量0.1-15%，最好为0.1-3%营养成分如黄豆粉、豆油和甘露糖醇的营养液中。发酵是在有氧条件下进行的，就是说，在振荡瓶或发酵桶中进行振荡或搅拌，如果合适，可以通入空气或氧气。发酵是在18-35℃下进行的，25-30℃较好，28-30℃最好。PH值范围为6-8，6.5-7.5较有利。在这些条件下，一般来说经6-15天后肉汤培养基抑制脑啡肽酶的活性是相当大的。
在几个阶段有助于培养的进行，例如，最初阶段，在液体培养基上制备一种或多种预培养物，然后将培养物转移到实际生产培养基（主要培养基）中进行培养，其容量比为1∶10。例如将孢子菌丝体转移到营养液中，并且允许其生长80-400小时，可以得到预培养物。使菌株在固体或液体培养基（如酵母/麦芽琼脂）上生长12天，就可获得到这种孢子菌丝体。
可以根据培养基的PH值或菌丝体的体积或者通过检验生物活性来监测发酵的进程。enkastins可存在于菌丝体和培养滤液中。然而，大部分enkastins存在于培养滤液中。
根据产物的化学，物理和生物学特性，利用已知的方法，如离子交换剂层析、分子筛、吸附树脂和反相载体、溶剂沉淀、逆流渗透及其它方法，可以从培养基中分离出所述化合物。
例如，利用过滤或离心可以方便地使菌丝体与水相分离，也可以方便地从有关相中分离和纯化enkastins。
较好的方法是，用于醇萃取，除去培养滤液中的脂肪，并在真空中浓缩水相。用2-5倍量的甲醇稀释水溶性浓缩物，离心除去大分子量沉淀物。然后用强酸性阳离子交换剂如
Figure 881024570_IMG13
Dowex50WX2处理含水甲醇的上清液，先分离出碱性物质，然后用阴离子交换剂如
Figure 881024570_IMG14
Amberlite IRA-68，从中分离出两性物质。后者的成分中含有enkastins。利用分子筛，如
Figure 881024570_IMG15
Sephadex G-15脱盐后，在反相RP-18上进行制备高效液相色谱，得到各种enkastin。
然而，用其它方法（合成法）来制备enkastins也是可以的。因此，本发明涉及制备通式Ⅰ化合物的另一种方法，该方法包括：
（a）将带有游离的N-末端氨基的氨基酸与带有游离的C-末端羧基的氨基酸缩合，如果合适，脱去为了保护官能团而暂时引入的一个或多个保护基，
（b）将二肽缩合或将带有游离的N-末端氨基的氨基酸与在异头中心带有游离羟基的单糖缩合，如果合适，脱去为了保护官能团而暂时引入的一个或多个保护基，
（c）将生成的N-糖苷转变为N-取代的异糖胺，如果合适，可以用Amadori重排法，并且如果合适，将生成的enkastin转变成它的生理上合适的盐或其衍生物，也可以互变这些反应的顺序-其中在b）中应用氨基酸，一在a）中省去氨基酸。
当然，实质上已知的其它反应也适于形成糖-NH-肽健。
保护基的选择和合成的计划可以根据氨基酸的性质和构型以及偶合条件的性质决定。
根据本发明方法，氨基酸缩合成二肽是利用肽化学的常规方法来完成的，首选通过活性酯，叠氮化合物的混合酸酐法，或用碳化二亚胺法，特别是首选加入能增加反应速率和防止外消旋作用的物质，如1-羟基-苯并三唑，N-羟基琥珀酰胺，3-羟基-4-氧代-3，4-二氢-1，2，3-苯并三嗪或N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二碳亚胺，同样也可以应用1-羟基苯并三唑衍生物或磷酸酐，膦酸及次磷酸的活性衍生物。反应温度为-10℃-反应混合物的沸点之间，最好为-5-40℃。
适用于上述反应的溶剂是二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，六甲基磷三酰胺，N-甲基吡咯烷酮或二甲基亚砜，在各成分的溶解度许可的情况下，也可应用溶剂例如二氯甲烷或氯仿。上面提到的方法见Meinhofer-Gross：“The    Peptides”，Academic    Press    Vol，I，（1979）。
为了使糖基与氨基酸或二肽缩合，预先给予适当的保护可以使羧基和其它官能团不参与反应。已经证明特别适宜该目的的保护基是例如苄酯（OB2l）或对-硝基苄酯（ONb2l），它们通过催化氢化可以脱去。其它合适的保护基，已由Hubbuch在Kontakte Merck 3（1979）P.14-23和Büllesbach，在Kontakte Merck 1（1980）P.23-35中做了描述。
在糖化学方面，人们所知的常用保护基是（C1-C10）-酰基保护基，如（C1-C6）-烷酰基（例，乙酰基，三氯乙酰基和三氟乙酰基），苯甲酰基或对-硝基苯甲酰基，同样还有选择性改变的甲基，甲基氧甲基，苄基、四氢吡喃基，苯亚甲基，异亚丙基或三苯甲基，制备本发明化合物时优选的是酰基保护基，尤其是乙酰（Ac）基。
Enkastins的合成需要连接两种多官能团反应物（糖和氨基酸或二肽）。两者必须能够有选择地被保护和脱去保护。还必须能够释放和功能化糖基组分上的异头中心，并且在氨基酸的组分中允许连接所需的唯一氨基脱去保护。根据配糖健的类型（1，2-顺式或1，2-反式-糖苷引入合适的保护基保护糖基组分上的羟基或氨基，如果需要，找出连接步骤的反应条件，该条件可以有选择地形成两种可能的正位差向异构体中的一种。
N-（1-脱氧果糖-1-基）-L-氨基酸的合成已有多次报导（参见H.Roeper等，CarbohydrateResearch，116（1983）183-195），此合成方法要求未被取代的反应物在水或水/甲醇中溶解，并与各种缓冲剂或添加剂如焦亚硫酸盐一起加热。产量随起如物的性质改变，平均为20%。
目前惊奇地发现，糖与氨基酸或带有游离氨基的二肽的反应能以很高的产率得到所期望的Amadori产物，如在二级和三级脂肪族或芳香族含氮化合物（如吡啶，二甲基氨基吡啶，二-（C1-C8）-烷基和三-（C1-C8）-烷基胺，（C6-C12）-芳基-（C1-C8）-烷基胺，三羟甲氨基甲烷缓冲剂，二甲基甲酰胺或咪唑）存在下进行催化反应，在某些情况下，产率可超过90%，所应用的溶剂是吡啶、水、含水甲醇、甲醇、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）或其它物质，也可用它们的混合物，但应首选无水吡啶或吡啶与无水甲醇、二甲基亚砜和其它溶剂的混合物。反应温度变化范围较大，可行的温度范围为0℃-250℃，然而，优选的温度范围为室温-120℃之间。反应时间取决于反应温度，范围可以从几秒到几天。典型的反应在65℃需要2小时。许多反应是根据最初无色反应物变为金黄色来判断的。继续反应，反应混合物呈现出深褐色，并伴有收率减少（美拉德反应）。
可以应用带有未被取代的醛基或酮基的未被保护的或部分衍化了的糖作为反应物，同样，也可以应用带有游离氨基的未被保护的或被衍化的氨基酸和二肽作为反应物。众所周知，较适宜的糖是丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖和脱氧糖等。
将N-糖苷置于0-200℃，特别是40-70℃，10分钟-10天（最好0.5-3天）则有利于Amadori重排（参见Weygand/Hilgetag，“Organisch-Chemische    Experimentation）J.A.Barth-Verlag    Leipzig（1964）980），如果合适，利用共沸蒸馏除去水，再放置，然后干燥N-取代的异糖胺。
本发明的脑啡肽酶抑制剂十分重要，尤其是用于治疗疼痛，如牙痛、与结肠有关的疼痛，烫伤和酸烧伤引起的疼痛，挤压痛及癌症晚期的疼痛是十分有用的。此外通式Ⅰ的脑啡肽酶抑制剂也适用于治疗精神紧张。
人们知道，疼痛和焦虑可引起内源性脑啡肽的快速释放。内源性脑啡肽通过与鸦片受体相互反应抑制这些刺激作用。然而，就象神经介质的功能一样，脑啡肽特异的肽酶，特别是脑啡肽酶〔EC3，4，24，11〕将脑啡肽迅速地降解成无活性的肽类。应用通式Ⅰ的脑啡肽抑制剂来抑制这种降解作用的结果表明，内源性释放的脑啡肽能够在鸦片受体上在较长时间内显示出它们的作用，因此对于疼痛和焦虑具有抑制作用。
根据本发明化合物的特定性质，其特征还在于它们不仅可以抑制脑啡肽酶对脑啡肽的降解，而且还具有固有的止痛作用。因此式Ⅰ脑啡肽酶抑制剂对鸦片受体还具有直接的作用。
利用文献上已知方法测定enkastins抑制脑啡肽酶的作用，该方法已由Ro ues，B.P.等在〔Life Sciences（1982），1749-1752〕中进行了叙述。所应用的酶是利用本身已知的方法〔Mumford，R.A.等1982，Biochem，Biophys，Res，Comm，109，1303-1309〕从大白鼠肾得到的溶液化的脑啡肽酶制剂。本发明化合物对脑啡肽酶的50%抑制作用，即IC50，是按已知的方法，用本发明抑制剂的一系列浓度进行测定，此抑制剂应在添加底物开始酶促反应之前与酶一起于室温预先孵化60分钟。用相当的非抑制性反应进行对照，非抑制性反应是在无抑制剂的条件下进行的。
对脑啡肽酶的抑制作用 IC50〔moL/L〕
1.N-（1-脱氧果糖-1-基）-D-缬氨酰 1.3×10-9
-丙氨酸
2.N-（1-脱氧果糖-1-基）-D-异亮氨 1.8×10-9
酰-丙氨酸
3.N-（1-脱氧果糖-1-基）-异亮氨酰- 1.8×10-9
丙氨酸
4.N-（1-脱氧果糖-1-基）-缬氨酰-丙 6.3×10-9
氨酸
5.N-（1-脱氧果糖-1-基）-苯丙氨酰- 5.6×10-8
谷氨酸
6.N-（1-脱氧果糖-1-基）-缬氨酰- 3.4×10-8
谷氨酸
7.N-（1-脱氧果糖-1-基）-异亮氨酰 3.4×10-8
-丙氨酸
8.N-（1-脱氧果糖-1-基）-异亮氨酰 5.6×10-8
-谷氨酸
9.N-（1-脱氧果糖-1-基）-异亮氨酰 7.0×10-8
-丙氨酸（OtBu）
10.N-（1-脱氧果糖-1-基）-六氢苯基甘 7.5×10-8
氨酰-丙氨酸
11.N-（1-脱氧果糖-1-基）-异亮氨酰- 2.1×10-7
丝氨酸
12.N-（1-脱氧果糖-1-基）-D-缬氨酸 2.3×10-7
13.N-（1-脱氧果糖-1-基）-缬氨酰-丙 3.2×10-7
氨酸
14.N-（1-脱氧果糖-1-基）-D-异亮氨 3.4×10-7
酸
enkastins能单独服用，或者配方后服用，用生理上适合的介质将enkastins制成非肠道（静脉注射，皮下注射，肌肉注射）给药制剂或制成口服制剂。服用的制量通常为0.1～10mg/Kg。
实施例1
利用发酵液（2，000L）得到enkastins。
为了利用发酵来制得本发明的脑啡肽酶抑制剂，可按微生物学的常规方法，将从冷冻干燥的菌株孢子上得到的白色链霉菌ATCC    21838培养。培养最初是在无菌的Petri皿中于固体营养基上进行的。随后将单菌落在倾斜管中进一步培养，从中得到的菌株在Roux瓶中继续培养直至产生大量发酵所需的孢子。
在固体营养基上传代的琼脂培养基：
糊精    15.0g/L
蔗糖    2.0g/L
肉羹    1.0g/L
酵母膏    2.0g/L
氯化钠    0.5g/L
K2HPO40.5g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
琼脂    2.0g/L
PH值    7.3
120℃灭菌20分钟
30℃温育9天
用100mL无菌水溶解从Roux瓶洗脱下来的孢子，并作为制备第一代接种体，为浸于水中生长的初级增殖体阶段（工作液体积为1.2升）。
初期阶段培养基：
可溶性淀粉    4.0g/L
葡萄糖    1.0g/L
酪蛋白-胨    1.0g/L
玉米浆    0.4g/L
黄豆粉    0.4g/L
（NH4）2SO40.8g/L
PH值    8.3
12℃灭菌20分钟
18℃温育2天
以每分钟150转的速度振摇，振幅为5cm，48小时后，将Fernbach瓶中含有的、用上述方法（见上）得到的第一代初级培养物的内容物作为第二代初级培养的接种物（其数量为200升），并再次在初级培养基（见上）上培养。灭菌时间为30分钟。28℃持续温育48小时，以5米/秒园周速度搅拌并以0.1vvm的速度充气。
第二代初级培养的培养物作为接种物，接种到200升主要的发酵培养基。
主要的发酵培养基：
花生粉    30.0g/L
玉米浆，固体成份    10.0g/L
玉米淀粉    20.0g/L
糊精    40.0g/L
（NH4）2SO45.0g/L
MgSO4·7H2O 5.0g/L
CaCO38.0g/L
PH值    6.8
120℃灭菌50分钟
主发酵是在28℃条件下进行的，并以4米/秒的园周速度搅拌，同时以0.6vvm的速度充气。在4天后开始得到本发明的抑制剂，并在10～12天后达到最大值。在达到发酵最大量后，收集发酵物。含通式Ienkastin的混合物的量为5～10微克/每升培养液。
实施例2
从培养液中分离enkastin。
利用压滤器来除掉实施例1所得到的2000升发酵液中的大量细胞，并用正丁醇萃取清晰液两次，每次用600升。利用降膜式蒸馏器将脱脂水相真空浓缩到约150升，然后再用600升甲醇稀释浓缩物。通过离心收集产生的白色絮状物沉淀，并弃之。再次真空浓缩含水甲醇上清液，干燥，得18公斤褐色粘稠状物，随后，在水介质中，用70升
Figure 881024570_IMG17
Dowex50WX2（酸式）阳离子交换剂吸附，用纯水洗涤负载后的交换剂，并且用0.5M氢氧化铵溶液使抑制剂解吸附。收集能抑制脑啡肽酶的洗脱液并冷冻干燥（3.5公斤）。在70升 Amberlite IRA-68阴离子交换剂上，用类似的方法分离出两性化合物。在这种情况下，用0.5M乙酸洗提enkastins。具有抑制作用的洗提液经冷冻干燥，得320g干燥产物。在
Figure 881024570_IMG19
Sephadex G-15上进行凝胶色谱分离并冷冻干燥有效物质，得30克粗制的enkastin混合物。
实施例3
enkastin成分的分离
用1mL水溶解实施例2得到的150mg物质，并将溶液注入到填有RP-18反相硅胶的钢柱（内部容积为3.2×25cm2）中。开始用0.05%的三氟醋酸（TFA）洗脱，洗脱40分钟后，用乙腈在0.05%TFA中的溶液进行线性梯度洗脱。在200nm处测定紫外吸收量监测柱的洗脱液。在洗脱过程中，大量的容易分离的物质可从柱中洗脱下来，并分别收集，冷冻干燥并检验。峰为2，3，4，5，7，8，11，13，16，18和21的洗脱液，证明具有抑制脑啡肽酶作用。
峰3（保留时间为5分8秒）含有enkastinAD，氨基酸分析证明，克分子量与丙氨酸和天冬氨酸相同，FAB质谱测定其分子量为366，与分子式C13H22N2O10相符，用2D核磁共振试验，确定具有上述结构。
峰4（保留时间5分21秒）产生少量的enkastinVD，分子量为394，与分子式C15H26N2O10相符，图1表示在270MHZ条件下enkastin的1H核磁共振谱。
峰7（保留时间7分20秒）含有enkastin AE，分子量为380，分子式为C14H24N2O10。
峰11（保留时间8分10秒）含有enkastin VE，分子量为408，分子式为C16H28N2O10，带有缬氨酸和谷氨酸;峰13（保留时间18分40秒）含有enkastin ID，分子量408，分子式为C15H28N2O10，带有异亮氨酸和天冬氨酸;峰16（保留时间22分）含有enkastin IE，分子量为422，分子式为C17H30N2O10。
实施例4
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-天冬氨酸的合成
用1.2升甲醇溶解30克无水D-葡萄糖和3克异亮氨酰-天冬氨酸，并加入200毫克NaHCO3。混合物连续加热回流2小时。用丁醇蒸馏除去生成的水，用甲醇稀释反应混合物，然后再加热2小时。待反应完成后，真空除去溶液中的溶剂，用300毫升水稀释剩余物，并将其注入到装有QAE-
Figure 881024570_IMG20
Sephadex A-25的600毫升-容量色谱柱（直径为5厘米）中。过剩的葡萄糖则位于色谱柱的前部，用乙酸梯度（0-0.5摩尔）洗脱，可以选选性地得到N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰天冬氨酸。收集从柱中流出的洗脱液并冷冻干燥。
产量：720毫克，为白色非结晶形粉状物质
1H核磁共振光谱〔ppm〕：4.43;2.69;2.48;3.84;1.93;1.50;1.26;0.93和0.89，为分子的肽部分的氢;3.93;3.91;3.79;3.66;3.65;3.17和3.14，为抑制剂烯糖部分的氢;与天然enkastin 1D化合物的信号相符。
13C核磁共振光谱〔ppm〕：54.63;40.49;66.79;37.13;26.12;14.61和11.75（肽部分）及96.55;70.91;70.40;69.96;64.87和53.43（烯糖部分）。
红外吸收光谱表明，谱带位于3400，2920，2860，1595，1400和1080Cm-1处。
实施例5
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-苯丙氨酰天冬氨酸的合成
将200毫克苯丙氨酰-天冬氨酸和1.5克D-葡萄糖混悬在100毫升甲醇中，加入20毫克NaHCO3。混合物加热煮沸2小时，然后将反应混合物按实施例4所述方法经QAE
Figure 881024570_IMG21
Sephadex A-25色谱柱（1.8Cm×23Cm，60mL）进一步处理和纯化，然后脱盐。得到26毫克N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-苯丙氨酰-天冬氨酸。
enkastin FD的1H核磁共振谱（270MHZ，D2O）为：3.03;2.96;3.65;3.81;3.94;3.99;3.67;3.84;3.17;3.08;7.36;4.43;2.71;2.51ppm。
实施例6
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-丝氨酸的合成
200毫克异亮氨酰-丝氨酸与1.5克D-葡萄糖反应，并用实施例5所述的方法纯化反应产物，得到12毫克N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰丝氨酸。经化学和光谱研究确定结构。
1H核磁共振谱（270MHZ，D2O）：3.38;3.34;3.85;3.98;4.15;4.09;3.82;4.45;4.00;3.97;2.15;1.08;1.79;1.43;1.06ppm。
实施例7
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-天冬酰胺的合成
300毫克异亮氨酰-天冬酰胺与1.5克D-葡萄糖反应，用实施例5所述的方法纯化反应产物，得到90毫克N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-天冬酰胺
enkastin IN的1H核磁共振谱（270MHZ，D2O）表明特征信号为：3.05;4.07;3.95;3.79;4.08和3.78ppm，还有3.60;1.89;1.53;1.28;0.97和0.93ppm，此外还有4.54;2.84和2.69ppm。
实施例8
N-（1-脱氧吡喃塔格糖-1-基）-缬氨酰-天冬氨酸的合成
150毫克缬氨酰天冬氨酸和1克半乳糖反应，按实施例5所述的方法纯化，得到22毫克N-（1-脱氧吡喃塔格糖-1-基）-缬氨酰-天冬氨酸。
1H核磁共振谱（270MHZ，D2O）：3.16;3.17;4.02;3.91;2.68;3.66和3.86及2.63;2.22;1.09和1.05ppm，此外还有4.56;2.81和2.60ppm。
实施例9
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酸的合成
用500毫升无水甲醇，100毫升二甲基亚砜和150毫升吡啶组成的混合液溶解10克无水D-缬氨酸和75克无水D-葡萄糖，溶液加热回流2.5小时。为了除去甲醇和反应过程中形成的水，用旋转蒸发器减压浓缩象蜜一样颜色的反应溶液。将仍然含有吡啶的浓缩物放置室温过夜，除去水分，以便使反应完成。
产品纯化：用水溶解反应混合物，用氢氧化钠溶液调节PH值到9，将此溶液注入处理好的 QAE-Sepharose FF柱内（5Cm×50Cm），并使此柱PH值为9。先用0.1%的乙酸铵溶液（PH为9）冲洗离子交换剂，然后用0.2M的乙酸进行梯度洗脱，收集各部分的洗脱液，并逐一地检验。在PH值为5.3-5.5的洗脱液中含有纯的新合成的抑制剂。合并、干燥，并且用 Sephadex G-15分子筛脱盐，得到无盐产物。从水-甲醇中结晶，得到7克N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酸，沸点为125-126℃。
实施例10
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-异亮氨酸的合成
40毫升无水甲醇和10毫升无水吡啶的混合液加到100毫克无水D-异亮氨酸和300毫克无水葡萄糖中，按实施例9所述的方法进行反应和纯化，但使用小容量的层析柱。将最终产物结晶，得到110毫克N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-异亮氨酸。熔点为142-144℃。
实施例11
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酰-天冬氨酸的合成
将300毫升吡啶和3升甲醇加到10克D-缬氨酰天冬氨酸和50克无水D-葡萄糖中，搅拌混合物，加然煮沸2.5小时。在加热过程中，反应物逐渐溶解，为金黄色。反应完成之后，减压浓缩混合物，并用实施例9所述的方法进一步处理。冷冻干燥得到13.5克非结晶状的N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酰-天冬氨酸。图2表示enkastin D（VD）的1H核磁共振谱270MHZ，D2O）。
实施例12
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-异亮氨酰-天冬氨酸的合成
1克D一异亮氨酰-天冬氨酸与5克D-葡萄糖在100毫升甲醇和10毫升吡啶中反应，按实施例10所述方法纯化，冷冻干燥，得到790毫克纯的非结晶状物质。
enkastin（D）ID的1H核磁共振谱（270MHz，D2O）见图3。
实施例13
单一特丁基N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-天冬氨酸酯的合成
用实施例11所述方法将7克单一特丁基异亮氨酰-天冬氨酸酯与无水D-葡萄糖反应，并纯化。冷冻干燥，得到5.8克非结晶状单一特丁基N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-异亮氨酰-天冬氨酸酯。
enkastin    ID-OtBu的红外光谱见图4。
实施例14
N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-六氢苯基甘氨酰-天冬氨酸的合成
按实施例10所述的方法，将300毫克D-六氢苯基甘氨酰-天冬氨酸（D-Hhp-ASP）与1.5克葡萄糖反应，得到260毫克非结晶状的N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-六氢苯基甘氨酸-天冬氨酸。
红外光谱见图5。
图录：
图1：实例3enkastin VD（果糖-缬氨酰-天冬酰胺）的1H核磁共振谱;
图2：实例11enkastin D（VD）（果糖-D-缬氨酰-天冬酰胺）的1H核磁共振谱;
图3：实例12enkastin（D）ID（果糖-D-丙氨酰-天冬酰胺）的1H核磁共振谱;
图4：实例13enkastin    ID-OtBu（果糖-丙氨酰-天冬酰胺-OtBu）的红外光谱;
图5：实例14果糖-D-六氢苯基甘氨酰-天冬氨酸的红外光谱。
1H核磁共振谱是在以氘代水为溶剂，在270MHZ条件下记录得到的光谱图。
红外光谱是在KBr片中，利用FTIR（Fourier    Transform    lnfrared）记录得到的吸收光谱图。

Claims (7)

1、通式I化合物或其他酸性衍生物或它的生理上合适的盐的制备方法。
其中，Sacch代表单糖残基，如果合适，羟基可部分或完全地被取代，
A代表中性L或D-氨基酸残基，或者如果B不存在，A代表中性D-氨基酸残基，
B不存在或代表中性L或D-氨基酸残基，或者代表ω-位有选择取代的具有双官能性质的(酸性或碱性)L-或D-氨基酸，
R代表羟基，(C1-C8)-烷氧基，及由一个或二个相同或不同的基团有选择取代的氨基，一个或二个相同或不同的基团系选自(C1-C8)-烷基，(C5-C8)-环烷基，(C5-C8)-杂烷基或(C5-C8)-杂芳基，条件是化合物N-(1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基)-谷氨酰-谷氨酸和N-(1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基)-谷氨酰-丝氨酸除外，该方法包括：
(A)  a)白色链霉菌(ATCC  21838)及其变异体和突变体在营养培养基上的培养，使通式I化合物(其中Sacch代表N-(1-脱氧吡喃果糖-1-基)残基，A代表Ala，Leu，Val或Ile，B代表ASP或Glu，R代表羟基)聚集在培养基中，如果合适，
b)对培养物分离，纯化和衍生，或者，包括
(B)  a)使N末端带有游离氨基的氨基酸与C末端带有游离羧基的氨基酸缩合，如果合适，脱去暂时引入保护官能团的一个或多个保护基，如果合适
b)二肽缩合或使N末端带有游离氨基的氨基酸与在异头中心带有游离羟基的单糖缩合，如果合适，脱去暂时引入保护官能团的一个或多个保护基，如果合适
c)用Amadori重排，将所产生的N-糖苷转化为N-取代的异糖胺，并且如果合适，将生成的enkastin转变成它的生理上合适的盐或衍生物，也可互换反应顺序，其中在b)中应用氨基酸，在a)中省略。
2、权利要求1所述制备通式Ⅰ化合物或其生理上合适的盐的方法，其中，Sacch表示己醛糖或己酮糖或它们的衍生物的残基，
A  表示Ile，Phe，Leu，Val，Thr，Ser，Gly，Cys，Ala，在每种情况下，都为L或D型，如果B不存在，上述残基前为D-型，
B  不存在或表示Asp，Asx，Glu，Glx，Ser，Thr或Gly，在每种情况下，都为L或D型，
R 表示羟基或 ，但N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-甘氨酸和N-（1-脱氧-β-D-吡喃果糖-1-基）-甘氨酰-丝氨酸除外。
3、权利要求1和2中一项或一项以上所述的通式Ⅰ化合物或其生理上合适的盐的制备方法，其中
Sacch表示果糖基或它的衍生物，
A  表示Ile，Phe，Leu，Val，Cys，Ala或Hhp，在每种情况下，都为L或D-型，或如果B不存在，上述每个残基前都应为D型，
B不存在或代表Asp，Asx，Glu或Ser，在每种情况下，都为L或D-型，
R代表羟基。
4、权利要求1-3中一项或一项以上所述的通式Ⅰ化合物或其生理上合适的盐的制备方法，其中，
Sacch代表果糖基或其衍生物，
A代表Ile，Leu，Val，Cys或Hhp，在每种情况下，都为D-型，
B代表Asp，Asx，Glu或Ser，在每种情况下，都为L或D-型，
R代表羟基。
5、权利要求1所述的N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-缬氨酰-天冬氨酸和它的生理上合适的盐的制备方法。
6、权利要求1所述的N-（1-脱氧吡喃果糖-1-基）-D-异亮氨酰-天冬氨酸和它的生理上合适的盐的制备方法。
7、制备含有权利要求1-6中一项或一项以上所述通式Ⅰ化合物的组合物的方法，该方法包括将通式Ⅰ化合物或它的生理上合适的盐，与生理上可以接受的赋形剂（如果合适，还可以用添加剂，辅助剂和/或防腐剂）一起制成合适的剂型。
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