DE3739376A1 - Enkastine: neue glycopeptide mit enkephalinase-hemmender wirkung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als pharmazeutische praeparate - Google Patents
Enkastine: neue glycopeptide mit enkephalinase-hemmender wirkung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als pharmazeutische praeparateInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue, biologisch aktive Glycopeptide.
Sie besitzen Enkephalinase-hemmende Eigenschaften und
können daher z. B. als Analgetika in der Human- und
Tiermedizin verwendet werden. Es werden Verfahren zu
ihrer Herstellung beschrieben.
Enkastine sind Verbindungen, in denen ein Monosaccharid
über einen Aminstickstoff mit einer Aminosäure oder einem
Dipeptid verknüpft ist. Derartige Verbindungen mit einer
L-Aminosäure sind von K. Heyns und H. Paulsen (Liebigs Ann.
Chem. 622 (1959) 160-174) und H. Röper, S. Röper und
K. Heyns (Carbohydrate Research 116 (1983) 183-195)
beschrieben worden. Verbindungen wie N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH
und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH
sind bereits aus B. N.
Stepanenko und N. N. Borodina, Prikl. Biokhim. Mikrobio. 12
(1) (1976) 5-13 [C. A. 85: 143425 h] bekannt.
Als analgetisch wirksame Enkephalinase-Inhibitoren sind
verschiedene Verbindungsklassen beschrieben worden.
Gemeinsam ist ihnen eine funktionelle Gruppe in
Nachbarstellung zu einer lipophilen Aminosäure, die mit
dem an der Katalyse essentiell beteiligten Zn2+ dieses
Metallo-Enzyms eine Koordinations-Verbindung eingehen
können. Zu diesen funktionellen Gruppen zählen z. B. -SH,
HO-NH-CO-, -P(=O)OH-R und -COOH (R. E. Chipkin, Drugs of the
Future 11 (7) (1986), 593-606). Es ist ferner bekannt, daß
solche Verbindungen nicht nur Enkephalinase hemmen, sondern
auch das aus Bakterien isolierbare Enzym Thermolysin (M.
Pozsgay, C. Michaud, M. Liebmann und M. Orlowski,
Biochemistry 25 (1986) 1292-1299).
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde,
Verbindungen zu finden, die spezifisch Enkephalinase hemmen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die
Verbindungen der allgemeinen Formel I,
Sacch-A-B-R (I)
in welcher
Sacch für einen Monosaccharid-Rest, wobei gegebenenfalls die OH-Gruppen teilweise oder vollständig substituiert sind,
A für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder - falls B fehlt - für den Rest einer neutralen D-Aminosäure,
B fehlt oder für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder einer gegebenenfalls ω-substituierten bifunktionellen sauren oder basischen L- oder D-Aminosäure und
R für Hydroxy, (C₁-C₈)-Alkoxy, einen Amin-Rest, der gegebenenfalls durch ein oder zwei gleiche oder verschiedene Reste aus der Reihe (C₁-C₈)-Alkyl, (C₅-C₈)-Cycloalkyl, (C₅-C₈)-Heteroalkyl oder (C₅-C₈)-Heteroaryl substituiert ist, oder ein anderes Säurederivat stehen,
oder deren physiologisch verträgliche Salze, mit der Maßgabe, das die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
Sacch für einen Monosaccharid-Rest, wobei gegebenenfalls die OH-Gruppen teilweise oder vollständig substituiert sind,
A für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder - falls B fehlt - für den Rest einer neutralen D-Aminosäure,
B fehlt oder für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder einer gegebenenfalls ω-substituierten bifunktionellen sauren oder basischen L- oder D-Aminosäure und
R für Hydroxy, (C₁-C₈)-Alkoxy, einen Amin-Rest, der gegebenenfalls durch ein oder zwei gleiche oder verschiedene Reste aus der Reihe (C₁-C₈)-Alkyl, (C₅-C₈)-Cycloalkyl, (C₅-C₈)-Heteroalkyl oder (C₅-C₈)-Heteroaryl substituiert ist, oder ein anderes Säurederivat stehen,
oder deren physiologisch verträgliche Salze, mit der Maßgabe, das die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
Als Salze kommen insbesondere Alkali- und Erdalkalisalze,
Salze mit physiologisch verträglichen Aminen und Salzen mit
anorganischen und organischen Säuren wie z. B. HCl, HBr,
H₂SO₄, H₃PO₄, Maleinsäure, Fumarsäure, Citronensäure,
Weinsäure, Essigsäure in Frage.
Die OH-Gruppen des Monosaccharid-Restes sind - falls
substituiert - vorzugsweise verethert oder verestert,
insbesondere durch (C₁-C₄)-Alkoxy oder (C₁-C₄)-Alkylcarbonyl.
Darüber hinaus können auch die OH-Gruppen durch Wasserstoff
(Desoxyzucker), (C₁-C₄)-Alkyl, Heteroatome wie O, N, S und
ihre Abkömmlinge ersetzt sein.
Falls im Einzelfall nicht anders angegeben, können Alkyl
und Alkoxy geradkettig oder verzweigt sein.
Als Heteroalkyl kommen besonders cyclische Verbindungen in
Frage. Ebenso wie unter Heteroaryl werden darunter
insbesondere N-haltige Verbindungen verstanden, wie z. B.
Pyrrolidin, Piperidin, Pyridin.
Bevorzugt sind solche Reste A und B, die sich von natürlich
vorkommenden α-Aminosäuren (s. z. B. Schröder, Lübke, "The
Peptides", Volume I, New York 1965, Seiten 137-270 oder
Houben-Weyl, "Methoden der organischen Chemie", Band 15/1
und 2, Beilage), deren Antipoden oder deren einfachen
Metaboliten ableiten. Die Chiralitätszentren in den
Peptiden können jeweils die R-, S- oder R,S-Konfiguration
besitzen.
Im folgenden werden die Aminosäuren durch Symbole
beschrieben, wie sie in L. Styrer, "Biochemistry" (W. H.
Freeman & Company, San Franzisco, 1972, Seite 14 ff.)
verwendet werden. Diesen Symbolen wird das Symbol "D"
vorangestellt, wenn es sich um den Rest einer D-Aminosäure
handelt; Reste ohne Konfigurationssymbol sind L-konfiguriert.
Sacch kann beispielsweise eine Triose, Tetrose oder ein
Furanosyl- oder Pyranosyl-Rest sein, der sich von
Aldopentosen, Aldohexosen, Ketopentosen, Ketohexosen,
Desoxyaldosen und Aminoaldosen sowie den Stereoisomeren
ableitet, insbesondere von D- oder L-Monosacchariden wie
Ribose (Rib), Arabinose (Ara), Xylose (Xyl), Lyxose (Lyx),
Allose (All), Altrose (Alt), Glucose (Glc), Mannose (Man),
Gulose (Gul), Idose (Ido), Galactose (Gal), Talose (Tal),
Erythrose (Ery), Threose (Thr), Psicose (Psi), Fructose
(Fru), Sorbose (Sor), Tagatose (Tag), Xylulose (Xyu),
Fucose (Fuc), Rhamnose (Rha), Olivose (Oli), Oliose (Olo),
Mycarose (Myc), Rhodosamin (RN), N-Acethylglucosamin
(GlcNAc), N-Acetyl-Galactosamin (GalNAc), N-Acetylmannosamin
(ManNAc) sowie deren synthetischen Derivaten
wie Desoxy-, Amino-, Acetamido-, Halogeno-, bevorzugt
Bromo- oder Jodo-Zucker oder Inosit. Sacch kann in der α-
oder β-Form, bevorzugt jedoch in der β-Form, und auch als
Monosaccharid-Derivat vorliegen.
Bevorzugt sind Glycopeptide der Formel I in welcher
Sacch den Rest einer Aldohexose oder Ketohexose oder deren Derivate,
A Ile, Phe, Leu, Val, Thr, Ser, Gly, Cys, Ala oder Hexahydrophenylglycin (Hhp) jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr oder Gly jeweils in der L- oder D-Form und
R Hydroxy oder
Sacch den Rest einer Aldohexose oder Ketohexose oder deren Derivate,
A Ile, Phe, Leu, Val, Thr, Ser, Gly, Cys, Ala oder Hexahydrophenylglycin (Hhp) jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr oder Gly jeweils in der L- oder D-Form und
R Hydroxy oder
bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze,
wobei die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
sowie deren physiologisch verträgliche Salze,
wobei die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
Glycopeptide der Formel I in welcher
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Phe, Leu, Val, Cys, Ala oder Hhp jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu oder Ser, jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze sind besonders bevorzugt.
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Phe, Leu, Val, Cys, Ala oder Hhp jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu oder Ser, jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze sind besonders bevorzugt.
Ferner sind solche Glycopeptide der Formel I insbesondere
bevorzugt, in welcher
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Leu, Val, Cys oder Hhp, jeweils in der D-Form,
B Asp, Asx, Glu oder Ser jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Folgende Glycopeptide seien insbesondere genannt:
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Leu, Val, Cys oder Hhp, jeweils in der D-Form,
B Asp, Asx, Glu oder Ser jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Folgende Glycopeptide seien insbesondere genannt:
Enkastin ID, Enkastin (D)ID
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Ile-Asp-OH
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Ile-Asp-OH
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Ile-Asp-OH
Enkastin VD, Enkastin (D)VD
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Val-Asp-OH
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Val-Asp-OH
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Val-Asp-OH
Enkastin AD
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Ala-Asp-OH
Enkastin IE
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Ile-Glu-OH
Enkastin VE
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Val-Glu-OH
Enkastin AE
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Ala-Glu-OH
Enkastin (D)V
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Val-OH
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
der Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß
- a) Streptomyces albus (ATCC 21 838), sowie seine Varianten und Mutanten in einem Nährmedium kultiviert werden bis sich Verbindungen der Formel I, in der Sacch für einen N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Rest, A für Ala, Leu, Val oder Ile, B für Asp oder Glu und R für Hydroxy stehen, in der Kultur anhäuft, und diese gegebenenfalls
- b) isoliert, gereinigt und derivatisiert wird.
In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine
Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze
enthält, produziert Streptomyces albus, ATCC 21 838, unter
anderem Enkastin ID, Enkastin VD, Enkastin AD, Enkastin IE,
Enkastin VE sowie Enkastin AE.
Anstelle des Stammes ATCC 21 838 können natürlich auch
seine Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit
sie mindestens eine dieser Verbindungen synthetisieren.
Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch
physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit
Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische
Mutagene, wie beispielsweise Ethansulfonsäuremethylester
(Ethylmethylsulfonat, EMS) oder 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon
(MOB), erzeugt werden.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe
Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und
Zuckeralkohole, wie Glucose, Lactose oder D-Mannit sowie
kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt sowie
Öle und Fette. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in
Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren
Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner
Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais,
Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze,
Destillationsrückstände der Alkoholherstellung,
Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und
Nitrate. An anderen anorganischen Salzen kann die
Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder
Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle oder
Spurenelemente wie z. B. Eisen, Zink, Kobalt und Mangan
enthalten.
Die Bildung der Enkastine verläuft besonders gut in einer
Nährlösung, die 0,1 bis 15% Nährstoffbestandteile, wie
Sojamehl, Sojaöl und Mannit, insbesondere jeweils 0,1 bis
3%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung
enthält. Die Fermentation erfolgt aerob, also
beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in
Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter
Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann
in einem Temperaturbereich von etwa 18 bis 35°C,
vorzugsweise bei etwa 25 bis 30°C, insbesondere bei 28 bis
30°C erfolgen. Der pH-Bereich sollte zwischen 6 und 8
liegen, vorteilhaft zwischen 6,5 und 7,5. Unter diesen
Bedingungen zeigt die Kulturbrühe im allgemeinen nach 6 bis
15 Tagen eine nennenswerte enkephalinasehemmende Wirkung.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man
stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem
flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche
Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im
Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur
erhält man z. B., indem man ein versportes Mycel in eine
Nährlösung überimpft und etwa 80 bis 400 Stunden wachsen
läßt. Das versporte Mycel kann erhalten werden, indem man
den Stamm etwa 12 Tage auf einem festen oder flüssigen
Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar, wachsen läßt.
Der Fermentationsverlauf kann anhand des pH-Wertes der
Kultur oder dem Mycelvolumen, durch Ausprüfen der
biologischen Aktivität überwacht werden. Die Enkastine
sind sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat enthalten.
Die Hauptmenge der Enkastine ist jedoch im allgemeinen im
Kulturfiltrat zu finden.
Die Isolierung der genannten Verbindungen aus dem
Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter
Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und
biologischen Eigenschaften der Produkte, wie beispielsweise
Chromatographie an Ionenaustauschern, Molekularsieben,
Adsorptionsharzen und Reversed-Phase-Trägern, durch
Lösungsmittelfällungen, Reversosmose und andere.
Vorteilhaft ist es auch, die wäßrige Phase vom Mycel,
beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation zu
trennen, und die Enkastine aus den jeweiligen Phasen zu
isolieren und zu reinigen.
Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß das
Kulturfiltrat zur Entfettung mit Butanol extrahiert und die
wäßrige Phase im Vakuum eingeengt wird. Das mit der 2- bis
5fachen Menge Methanol verdünnte wäßrige Konzentrat wird
durch Zentrifugation von den ausgefallenen hochmolekularen
Stoffen befreit. Aus dem wäßrig-methanolischen Überstand
werden dann mit stark sauren Ionenaustauschern wie z. B.
®Dowex 50 WX 2 zunächst die basischen, und daraus
anschließend mit einem Anionenaustauscher wie z. B.
®Amberlite IRA-68 die amphoteren Substanzen isoliert. Diese
Fraktion enthält die Enkastine. Nach Entsalzung mit Hilfe
eines Molekularsiebes wie z. B. ®Sephadex G-15 werden durch
präparative HPLC z. B. an Reversed-Phase RP-18 die einzelnen
Enkastin-Komponenten gewonnen.
Es ist jedoch auch möglich, die Enkastine auf anderem Wege
(synthetisch) herzustellen. Die Erfindung betrifft daher
ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der
Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) eine Aminosäure mit N-terminaler freier Aminogruppe mit einer Aminogruppe mit C-terminaler freier Carboxylgruppe kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
- b) das Dipeptid oder eine Aminosäure mit N-terminaler freier Aminogruppe mit einem Monosaccharid mit freier Hydroxygruppe des anomeren Zentrums kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
- c) das so erhaltene N-Glycosid gegebenenfalls mittels Amadori-Umlagerung in die N-substituierten Iso-Zuckeramine überführt.
und das so erhaltene Enkastin gegebenenfalls in sein
physiologisch verträgliches Salz oder sein Derivat
überführt, wobei es auch möglich ist, die Reihenfolge
dieser Reaktion zu vertauschen und - falls man in b) eine
Aminosäure einsetzt - a) ausgelassen wird.
Geeignet sind aber auch andere, an sich bekannte Reaktionen
zur Bildung der Zucker-NH-Peptidbindung.
Die Auswahl der Schutzgruppen und die Synthesestrategie
wird von der Art und Konfiguration der Aminosäuren sowie
der Art der Kupplungsbedingungen bestimmt.
Die Kondensation der Aminosäuren zu den Dipeptiden nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt nach den allgemeinen
Methoden der Peptidchemie, bevorzugt nach der Methode der
gemischten Anhydride, über Aktivester, Azide oder nach der
Carbodiimid-Methode, insbesondere unter Zusatz
reaktionsbeschleunigender und racemisierungsverhindernder
Substanzen wie z. B. 1-Hydroxy-benzotriazol,
N-Hydroxysuccinimid, 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin,
N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid,
ferner unter Verwendung aktivierter Derivate des
1-Hydroxybenzotriazols oder Anhydriden von Phosphor-,
Phosphon- und Phosphinsäuren bei einer Reaktionstemperatur
zwischen -10°C und dem Siedepunkt des Reaktionsgemisches,
vorzugsweise zwischen -5°C und 40°C.
Geeignete Lösungsmittel dafür sind Dimethylformamid,
Dimethylacetamid, Hexamethylphosphorsäuretriamid,
N-Methylpyrrolidon oder Dimethylsulfoxid. Sofern die
Löslichkeit der Komponenten es erlaubt, können auch
Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Chloroform
eingesetzt werden. Die genannten Methoden sind z. B. in
Meienhofer-Gross: "The Peptides", Academic Press, Vol. I,
(1979) beschrieben.
Um den Glycosylrest an die Aminosäure bzw. das Dipeptid zu
kondensieren, kann vorher die Carboxylgruppe bzw. weitere an
der Reaktion nicht beteiligte funktionelle Gruppen geeignet
geschützt sein. Als besonders günstig erwiesen sich hierbei
Schutzgruppen, die durch katalytische Hydrierung,
abspaltbar sind, wie z. B. der Benzyl-(-OBzl) oder
p-Nitrobenzylester (-ONbzl). Weitere geeignete
Schutzgruppen sind z. B. von Hubbuch, Kontakte Merck 3 (1979)
Seite 14 bis 23 und Büllesbach, Kontakte Merck 1 (1980)
Seite 23 bis 35 beschrieben.
Unter den in der Kohlenhydratchemie üblichen Schutzgruppen
versteht man z. B. die (C₁-C₁₀)-Acylschutzgruppen wie
(C₁-C₆)-Alkanoyl (z. B. Acetyl-, Trichloracetyl-,
Trifluoracetyl-), Benzoyl- oder p-Nitrobenzoyl-, sowie
gegebenenfalls modifizierte Methyl-, Methyloxymethyl-,
Benzyl-, Tetrahydropyranyl-, Benzyliden-, Isopropyliden-
oder Trityl-Gruppe, wobei hier die Acylschutzgruppen,
insbesondere die Acetyl-(Ac-)Gruppe, bevorzugt sind.
Bei der Synthese der Enkastine sind zwei polyfunktionelle
Reaktionspartner (Kohlenhydrat und Aminosäure bzw. Dipeptid)
zu verknüpfen. Beide müssen sich selektiv blockieren und
deblockieren lassen. In der Glycosylkomponente muß das
anomere Zentrum freisetzbar und funktionalisierbar sein
und in der Aminosäurekomponente darf nur die für die
Verknüpfung notwendige Aminogruppe deblockiert sein. Je
nach dem Typ der angestrebten glycosidischen Bindung
(1,2-cis- oder 1,2-trans-Glycoside) ist es notwendig,
geeignete Schutzgruppen für die Blockierung der Hydroxy-
oder Aminogruppen in der Glycosylkomponente einzuführen
und gegebenenfalls Reaktionsbedingungen für den
Verknüpfungsschritt auszuarbeiten, der stereoselektiv zu
nur einem der beiden möglichen Anomeren führt.
Die Synthese von N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-L-Aminosäuren
ist bereits mehrfach beschrieben worden (s. z. B. H. Röper
et al. Carbohydrate Research, 116 (1983) 183-195). Hierbei
werden die unsubstituierten Reaktanten in Wasser oder
Wasser-Methanol gelöst und mit verschiedenen Puffern oder
Zutaten wie z. B. Natriumpyrosulfit erhitzt. Die Ausbeuten
betragen je nach Art des Ausgangsmaterials im Durchschnitt
20%.
Es ist nun überraschenderweise gefunden worden, daß die
Umsetzung von Zuckern mit Aminosäuren oder Peptiden mit
freien Aminogruppen zu den gewünschten Amadoriprodukten in
Gegenwart, d. h. unter Katalyse sekundärer oder tertiärer,
aliphatischer oder aromatischer, stickstoffhaltiger
Verbindungen wie z. B. Pyridin, Dimethylaminopyridin,
Di-(C₁-C₈)-alkyl- und Tri-(C₁-C₈)-alkylaminen, (C₆-C₁₂)-Aryl-(C₁-C₈)-alkylaminen,
Tris-puffer, Dimethylformamid,
Imidazol mit sehr guten Ausbeuten, d. h. zum Teil über
90% durchgeführt werden kann. Als Lösungsmittel dienen
Pyridin, Wasser, wäßriges Methanol, Methanol, Ethanol,
Dimethylsulfoxid (DMSO) oder andere sowie Mischungen davon,
vorzugsweise jedoch wasserfreies Pyridin oder solches in
Mischungen mit wasserfreiem Methanol, DMSO und anderen
Lösungsmitteln. Die Reaktionstemperatur kann in einem
weiten Bereich variiert werden. Möglich sind Temperaturen
zwischen 0°C und 250°C. Vorzugsweise arbeitet man jedoch
zwischen Raumtemperatur und 120°C. Die Reaktionsdauer
beträgt in Abhängigkeit von der Temperatur wenige Sekunden
bis einige Tage. Ein typischer Reaktionsansatz verläuft bei
65°C und dauert 2 Stunden. Die weitgehende Umsetzung
erkennt man an der goldgelben Verfärbung der ursprünglich
farblosen Reaktanten. Bei einer Weiterführung der Reaktion
nimmt die Reaktionsmischung eine tiefer werdende braune
Farbe an, die auf Kosten der Ausbeute geht
(Maillandreaktion).
Als Reaktanten können ungeschützte oder teilderivatisierte
Zucker mit unsubstituierten Aldehyd- oder Ketogruppen sowie
ungeschützte oder derivatisierte Aminosäuren und Peptide
mit freien Aminogruppen eingesetzt werden. Als Zucker
kommen alle bekannten Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen,
Heptosen, Desoxyzucker usw. in Frage.
Die Amadori-Umlagerung (vgl. Weygand/Hilgetag, "Organisch-chemische
Experimentierkunst", J. A. Barth-Verlag Leipzig
(1964) 980) erfolgt durch 10minütiges bis 10tägiges
Stehenlassen des N-Glycosids - bevorzugt 0,5 bis 3 Tage -
bei einer Temperatur von 0° bis 200°C - insbesondere bei
40 bis 70°C -, anschließende Wasserentfernung -
gegebenenfalls durch azeotrope Destillation - erneutes
Stehenlassen und anschließende Trocknung des N-substituierten
Iso-Zuckeramins.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Enkephalinase sind
von großem Interesse, insbesondere für die Behandlung von
schmerzhaften Zuständen wie z. B. Zahnschmerzen, Schmerzen
im Zusammenhang mit Koliken, durch Hitze oder Säuren
induzierte Schmerzen, durch Streß erzeugte Schmerzen sowie
Schmerzen im finalen Krebsstadium. Darüber hinaus kommen
Enkephalinase-Inhibitoren der Formel I auch für die
Behandlung von seelischen Spannungszuständen in Frage.
Es ist bekannt, daß z. B. Schmerzempfindungen und
Angstzustände zu einer schnellen Ausschüttung endogener
Enkephaline führen, die durch Wechselwirkung mit
sogenannten Opiat-Rezeptoren die Wirkung dieser Reize
unterdrücken. Allerdings werden Enkephaline, entsprechend
ihrer Rolle als Neurotransmitter, durch Enkephalinspezifische
Peptidasen, insbesondere aber durch das Enzym
Enkephalinase [EC 3.4.24.11], rasch zu inaktiven Peptiden
abgebaut. Eine Hemmung dieses Abbaus durch Enkephalinase-Inhibitoren
der Formel I hat daher zur Folge, daß endogen
ausgeschüttete Enkephaline ihre Wirkung auf Opiat-Rezeptoren
und damit ihre Schmerz- bzw. Angst-supprimierende Wirkung
über eine längere Zeit entfalten können.
Die speziellen Eigenschaften der dieser Erfindung zugrunde
liegenden Verbindungen können ferner dadurch charakterisiert
werden, daß sie nicht nur den Abbau von Enkephalinen durch
Enkephalinase hemmen, sondern auch eigen-analgetische
Wirkung besitzen. Es erscheint daher möglich, daß die
durch Formel I charakterisierten Enkephalinase-Inhibitoren
auch eine direkte Wirkung auf Opiat-Rezeptoren ausüben.
Die Enkephalinase-inhibierenden Eigenschaften der Enkastine
wurden nach Literatur-bekannten Methoden ermittelt, wie sie
z. B. von Roques, B. P. et al. beschrieben wurden [Life
Sciences (1982), 1749-1752]. Als Enzym wurde eine
nach an sich bekannten Methoden [Mumford, R. A. et al. 1982,
Biochem. Biophzs. Res. Commun. 109, 1303-1309]
aus Ratten-Nieren solubilisierte Enkephalinase-Präparation
verwendet. Die 50%ige Hemmung der Enkephalinase durch die
erfindungsgemäßen Verbindungen, d. h. der IC₅₀-Wert, wurde
in bekannter Weise mit Hilfe einer Konzentration-Reihe
ermittelt, wobei die Inhibitoren, die Gegenstand der
Erfindung sind, 60 Minuten lang mit dem Enzym bei
Raumtemperatur vorinkubiert wurden, bevor die enzymatische
Reaktion durch Zugabe des Substrats gestartet wurde.
Geeignete Kontrollen für die ungehemmte Reaktion wurden in
Abwesenheit eines Inhibitors durchgeführt.
IC₅₀ [mol/l] | |
1. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-D-Val-Asp|1,3 · 10-9 | |
2. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-D-Ile-Asp | 1,8 · 10-9 |
3. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Ile-Asp | 1,8 · 10-9 |
4. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Val-Asp | 6,3 · 10-9 |
5. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Phe-Glu | 5,6 · 10-8 |
6. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Val-Glu | 3,4 · 10-8 |
7. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Ile-Asp | 3,4 · 10-8 |
8. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Ile-Glu | 5,6 · 10-8 |
9. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Ile-Asp(OtBu) | 7,0 · 10-8 |
10. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Hhp-Asp | 7,5 · 10-8 |
11. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Ile-Ser | 2,1 · 10-7 |
12. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-D-Val | 2,3 · 10-7 |
13. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-Val-Asp | 3,2 · 10-7 |
14. N-(1-Desoxyfructos-1-yl)-D-Ile | 3,4 · 10-7 |
Die Enkastine können einzeln oder in Kombination parenteral
(i. v., s. c., i. m.) oder oral in einem physiologisch
verträglichen Medium verabreicht werden. Die zu
verabreichende Dosis liegt in der Regel bei 0,1 bis 10 mg/kg.
Zur fermentativen Gewinnung der erfindungsgemäßen
Enkephalinase-Inhibitoren erfolgte die Anzucht des
produzierenden Mikroorganismus Streptomyces albus
ATCC 21 838 - wie in der Mikrobiologie üblich - aus einer
gefriergetrockneten Dauerform dieses Stammes. Die Anzucht
erfolgte zunächst auf einem festen Nährboden in sterilen
Petri-Schalen. Vereinzelte Kolonien wurden anschließend in
Schrägröhrchen weiter kultiviert und von diesen Kulturen
die für die Fermentation notwendige Massenproduktion von
Sporen in Roux-Flaschen durchgeführt.
Agarmedium für Passagen auf festen Nährböden | |
Dextrin|15,0 g/l | |
Rohrzucker | 2,0 g/l |
Fleischextrakt | 1,0 g/l |
Hefeextrakt | 2,0 g/l |
Kochsalz | 0,5 g/l |
K₂HPO₄ | 0,5 g/l |
FeSO₄ · 7 H₂O | 0,01 g/l |
Agar-Agar | 2,0 g/l |
pH-Wert 7,3
Sterilisation bei 120°C, 20 Minuten
Inkubation bei 30°C, 9 Tage
Sterilisation bei 120°C, 20 Minuten
Inkubation bei 30°C, 9 Tage
Die Sporenabschwemmung einer Rouxflasche wurde in 100 ml
sterilem Wasser aufgenommen und diente als Inokulum für die
Herstellung der ersten submersen vegetativen Fermentations-Vorstufe
(Arbeitsvolumen 1,2 l).
Vorstufen-Medium | |
lösliche Stärke|4,0 g/l | |
Glucose | 1,0 g/l |
Casein-Pepton | 1,0 g/l |
Cornsteep flüssig | 0,4 g/l |
Sojamehl | 0,4 g/l |
(NH₄)₂SO₄ | 0,8 g/l |
pH-Wert 8,3
Sterilisation bei 120°C, 20 Minuten
Inkubation bei 18°C, 2 Tage
Schüttelmaschine mit 150 UpM und 5 cm Amplitude
Sterilisation bei 120°C, 20 Minuten
Inkubation bei 18°C, 2 Tage
Schüttelmaschine mit 150 UpM und 5 cm Amplitude
Nach 48 Stunden wurde der Inhalt einer Fernbachflasche mit
der so erhaltenen ersten Vorkultur (s. o.) als Inokulum für
die 200 l betragende zweite Vorkultur eingesetzt, wobei
auch hier das Vorstufen-Medium (s. o.) verwendet wurde. Die
Sterilisationszeit betrug 30 Minuten. Die Inkubation
erfolgte 48 Stunden lang bei 28°C unter Rühren mit einer
Umfangsgeschwindigkeit von 5 m/sec und einer Belüftungsrate
von 0,1 vvm.
Der Inhalt der zweiten Vorkultur diente als Inokulum für
2000 l Haupt-Fermentationsmedium.
Hauptfermentationsmedium | |
Erdnußmehl|30,0 g/l | |
Cornsteep, fest | 10,0 g/l |
Maisstärke | 20,0 g/l |
Dextrin | 40,0 g/l |
(NH₄)₂SO₄ | 5,0 g/l |
MgSO₄ · 7 H₂O | 5,0 g/l |
CaCO₃ | 8,0 g/l |
pH-Wert 6,8
Sterilisation bei 120°C, 50 Minuten
Sterilisation bei 120°C, 50 Minuten
Die Hauptfermentation wurde bei 28°C unter Rühren mit
einer Umfangsgeschwindigkeit von 4 m/sec und einer
Belüftungsrate von 0,6 vvm durchgeführt. Die Bildung der
erfindungsgemäßen Inhibitoren begann nach 4 Tagen und
erreichte ihr Maximum nach 10 bis 12 Tagen. Nach Erreichen
des Fermentations-Maximums wurde der Fermenter abgeerntet.
Die Ausbeute an Enkastin-Komplex der Formel I betrug
zwischen 5 und 10 µg/l Kulturlösung.
2000 l Fermentationslösung gemäß Beispiel 1 wurden mit
Hilfe einer Filterpresse von der Zellmasse befreit und die
klare Flüssigkeit zweimal mit je 600 l n-Butanol extrahiert.
Anschließend konzentrierte man die entfettete wäßrige Phase
im Vakuum in einen Fallstromverdampfer auf 150 l und
verdünnte dann dieses Konzentrat mit 600 l Methanol.
Hierbei entstand ein heller, flockiger Niederschlag, der
durch Zentrifugieren abgeschieden und verworfen wurde. Der
wäßrig-methanolische Überstand wurde erneut im Vakuum
eingeengt und zu 18 kg einer braunen klebrigen Masse
getrocknet. Anschließend adsorbierte man im wäßrigen Medium
auf 70 l Kationenaustauscher ®Dowex 50 WX 2 (Säureform),
wusch den beladenen Austauscher mit reinem Wasser und
desorbierte die Inhibitoren mit 0,5 M
Ammoniumhydroxidlösung. Die Enkephalinase-hemmenden Eluate
wurden gesammelt und gefriergetrocknet (3,5 kg). Hieraus
wurden durch analoge Arbeitsweise an 70 l Anionenaustauscher
®Amberlite IRA-68 die amphoteren Verbindungen abgetrennt.
Die Elution der Enkastine erfolgte in diesem Fall mit 0,5 M
Essigsäure. Die Gefriertrocknung der inhibitorisch hemmaktiven
Eluate erbrachte 320 g Trockenprodukt. Die
Gelchromatographie an ®Sephadex G-15 sowie die
Gefriertrocknung des aktiven Materials ergab 30 g
Enkastin-Rohkomplex.
150 mg des nach Beispiel 2 gewonnenen Materials wurden in
1 ml Wasser gelöst und auf eine Stahlsäule (mit den
Innenmaßen 3,2 × 25 cm²) aufgetragen, die mit Reversed-Phase-Kieselgel
RP-18 gefüllt war. Die Elution wurde
zunächst mit 0,05%iger Trifluoressigsäure (TFA)
durchgeführt, der nach 40 Minuten Laufzeit ein linearer
Acetonitrilgradient in 0,05%iger TFA folgte. Den
Säulenausfluß kontrollierte man durch Bestimmen der
Ultraviolettabsorption bei 200 nm. Im Verlauf der Elution
wurden zahlreiche scharfgetrennte Substanzen von der Säule
eluiert, die jeweils separat gesammelt wurden. Sie wurden
gefriergetrocknet und untersucht. Die Peaks 2, 3, 4, 5, 7,
8, 11, 13, 16, 18 und 21 erwiesen sich hemmaktiv gegen die
Enkephalinase.
Peak 3 (Retentionszeit 5 Minuten 8 Sekunden) enthielt das
Enkastin AD. Die Aminosäureanalyse ergab äquimolare Mengen
Alanin und Asparaginsäure. Das durch FAB-Massenspektrum
bestimmte Molekulargewicht betrug 366, entsprechend der
Summenformel C₁₃H₂₂N₂O₁₀. Durch ²D-NMR Experimente wurde
die o. a. Struktur ermittelt.
Peak 4 (Retentionszeit 5 Minuten 21 Sekunden) ergab geringe
Mengen des Enkastin VD mit dem Molekulargewicht 394
entsprechend der Summenformel C₁₅H₂₆N₂O₁₀. Die Fig. 1
zeigt das 270 MH-¹H-NMR-Spektrum des Enkastin VD.
Peak 7 (Retentionszeit 7 Minuten 20 Sekunden) enthielt das
Enkastin AE, Molekulargewicht 380, Summenformel C₁₄H₂₄N₂O₁₀.
Peak 11 (Retentionszeit 8 Minuten 10 Sekunden) ergab das
Enkastin VE, Molekulargewicht 408, C₁₆H₂₈N₂O₁₀, mit den
Aminosäuren Val und Glu sowie Peak 13 (Retentionszeit
18 Minuten 40 Sekunden) das Enkastin ID, Molekulargewicht
408, C₁₅H₂₈N₂O₁₀, mit Ile und Asp als Aminosäuren.
Peak 16 (Retentionszeit 22 Minuten) beinhaltete das
Enkastin IE, Molekulargewicht 422, C₁₇H₃₀N₂O₁₀.
30 g D-Glucose, wasserfrei, wurden zusammen mit 3 g
Isoleucyl-Asparaginsäure in 1,2 l Methanol gelöst und mit
200 mg NaHCO₃ versetzt. Anschließend erhitzte man 2 Stunden
unter Rückfluß. Danach wurde das gebildete Wasser mit
Butanol abdestilliert und die mit Methanol verdünnte
Reaktionsmischung nochmals 2 Stunden erwärmt. Die fertige
Reaktionslösung wurde im Vakuum vom Lösungsmittel befreit
und in 300 ml Wasser auf eine, mit QAE-®Sephadex A-25
gefüllte Trennsäule von 600 ml Inhalt (Durchmesser 5 cm)
gegeben. Während sich im Durchlauf die überschüssige
Glucose befand, konnte mit einem Essigsäuregradienten (0 bis
0,5 Molar) selektiv die N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-isoleucyl-asparaginsäure,
gewonnen werden. Diese
Säuleneluate wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 720 mg eines weißen, amorphen Pulvers.
¹H-NMR-Spektrum [ppm]: 4,43; 2,69; 2,48; 3,84; 1,93; 1,50;
1,26; 0,93 und 0,89, verursacht vom Peptidteil des Moleküls;
3,93; 3,91; 3,79; 3,66; 3,65; 3,17; sowie 3,14 vom
Glycanteil des Inhibitors entsprechend den Signalen
der natürlichen Verbindung des Enkastin ID.
¹³C-NMR-Spektrum [ppm]: 54,63; 40,49; 66,79; 37,13; 26,12;
14,61 und 11,75 (Peptidteil) sowie bei 96,55; 70,91; 70,40;
69,96; 64,87 und 53,43 (Glycanteil).
Das Infra-Rot-Absorptionsspektrum zeigt Banden bei 3400,
2920, 2960, 1595, 1400 und 1080 cm-1.
200 mg Phenylalanyl-asparaginsäure wurden mit 1,5 g
D-Glucose in 100 ml Methanol aufgeschlämmt, 20 mg NaHCO₃
hinzugesetzt und 2 Stunden zum Sieden erhitzt. Danach wurde
die Reaktionsmischung, wie in Beispiel 4 beschrieben,
weiter bearbeitet und auf einer QAE ®Sephadexsäule A 25
(1,8 cm × 23 cm, 60 ml) gereinigt, anschließend entsalzt.
Man erhielt 26 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-phenylalanyl-asparaginsäure.
270 MHz-¹H-NMR-Spektrum (D₂O) des Enkastin FD: 3,03; 2,96;
3,65; 3,81; 3,94; 3,99; 3,67; 3,84; 3,17; 3,08; 7,36; 4,43;
2,71; 2,51 ppm.
200 ml Isoleucyl-serin wurden mit 1,5 g D-Glucose wie im
Beispiel 5 beschrieben umgesetzt und das Reaktionsprodukt
gereinigt. Es entstanden 12 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Ile-Ser-OH.
Die Struktur wurde durch chemische und
spektroskopische Untersuchungen bestätigt.
270 MHz-¹H-NMR-Spektrum (D₂O) des Enkastin IS:
3,38; 3,34; 3,85; 3,98; 4,15; 4,09; 3,82; 4,45; 4,00;
3,95; 3,97; 2,15; 1,08; 1,79; 1,43; 1,06 ppm.
300 mg Isoleucyl-asparagin wurden mit 1,5 g D-Glucose wie
im Beispiel 5 beschrieben umgesetzt und das Reaktionsprodukt
gereinigt. Es entstanden 90 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Ile-Asn.
Das 270-MHz-¹H-NMR-Spektrum (D₂O) zeigt folgende
charakteristische Signale des Enkastin IN:
3,05; 4,07; 3,95; 3,79; 4,08 und 3,78 ppm sowie 3,60; 1,89;
1,53; 1,28; 0,97 und 0,93 ppm darüber hinaus 4,54; 2,84 und
2,69 ppm.
150 mg Valyl-asparaginsäure wurden mit 1 g Galactose wie im
Beispiel 5 beschrieben umgesetzt und gereinigt. Es
resultierten 22 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-valyl-asparaginsäure.
Das in D₂O gemessene 270 MHZ-¹H-NMR-Spektrum weist folgende
Signale auf:
3,16; 3,17; 4,02; 3,91; 2,68; 3,66 und 3,86 ppm sowie 2,63;
2,22; 1,09 und 1,05 ppm, darüber hinaus 4,56; 2,81 und 2,60 ppm.
Es wurden 10 g wasserfreies D-Valin mit 75 g wasserfreier
D-Glucose in einer Mischung von 500 ml trockenem Methanol,
100 ml Dimethylsulfoxid sowie 150 ml Pyridin gelöst und
2,5 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach dieser Zeit wurde
die honigfarbene Reaktionslösung im Rotationsverdampfer
im Vakuum konzentriert, um das Methanol und das während
der Reaktion gebildete Wasser zu entfernen. Das noch
pyridinhaltige Konzentrat wurde unter Feuchtigkeitsausschluß
bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen, um die
Reaktion zu vervollständigen.
Zur Reinigung des Produktes löste man die Reaktionsmischung
in Wasser, stellte den pH-Wert mit Natronlauge auf pH 9 und
trug die Lösung auf eine vorbereitete, bei pH 9 äquilibrierte
®QAE-Sepharose FF-Säule (5 cm × 50 cm) auf. Man wusch dann
den Ionenaustauscher zunächst mit 0,1% Ammoniumacetat-Lösung,
pH 9,0 und legte anschließend einen 0,2 molaren
Essigsäuregradienten an. Der Säulenauslauf, das sogenannte
Eluat, wurde fraktioniert gesammelt und die Fraktionen
einzeln untersucht. Die Fraktionen mit einem pH von 5,3 bis
5,5 enthielten den reinen, neu synthetisierten Inhibitor.
Sie wurden zusammengefaßt und getrocknet. Ihre Entsalzung
mit Hilfe des Molekularsiebes ®Sephadex G-15 führte zum
salzfreien Produkt. Die Kristallisation aus Wasser-Methanol
ergab 7 g N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Valin.
Fp.: 125-126°C.
Es wurden 100 mg trockenes D-Isoleucin zusammen mit 300 mg
wasserfreier Glucose mit einer trockenen Mischung von 40 ml
Methanol und 10 ml Pyridin versetzt, wie im Beispiel 9
beschrieben umgesetzt und gereinigt, wobei aber
Trennsäulen mit kleineren Volumina verwendet wurden.
Die Kristallisation des Endproduktes ergab 110 mg
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Isoleucin.
Fp.: 142-144°C.
10 g D-Valyl-asparaginsäure und 50 g wasserfreie D-Glucose
wurden mit 300 ml Pyridin sowie 3 l Methanol versetzt und
unter Rühren 2,5 Stunden zum Sieden erhitzt. Während dieser
Zeit lösten sich die Reaktanten allmählich und die
Reaktionsmischung nahm eine goldgelbe Farbe an. Nach
Beendigung der Reaktion wurde im Vakuum konzentriert und
wie im Beispiel 9 beschrieben weiter gearbeitet. Nach
der Gefriertrocknung enthielt man 13,5 g amorphe
N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-valyl-asparaginsäure.
Die Fig. 2 zeigt das 270 MHz-¹H-NMR-Spektrum (D₂O) des
Enkastin (D)VD.
1 g D-Isoleucyl-asparaginsäure wurden mit 5 g D-Glucose in
100 ml Methanol und 10 ml Pyridin wie im Beispiel 10
beschrieben umgesetzt und gereinigt. Es resultierten nach
der Gefriertrocknung 790 mg eines reinen amorphen Materials.
Das 270 MHz-¹H-NMR-Spektrum (D₂O) des Enkastin (D)ID ist in
Fig. 3 wiedergegeben.
7 g Isoleucyl-asparaginsäure-mono-tert.-butylester wurden,
wie im Beispiel 11 beschrieben, der Reaktion unterworfen
und gereinigt. Es resultierten 5,8 g eines amorphen
Gefriertrocknungsproduktes des N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-isoleucyl-asparaginsäure-mono-tert.-b-utylesters.
Das IR-Spektrum des Enkastin ID-OtBu gibt Fig. 4 wieder.
300 mg D-Hexahydrophenylglycyl-asparaginsäure (D-Hhp-Asp)
setzte man mit 1,5 g Glucose wie im Beispiel 10 beschrieben
um. Man erhielt 260 mg amorphes N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Hhp-Asp.
Das IR-Spektrum zeigt Fig. 5.
Verzeichnis der Abbildungen:
Fig. 1: ¹H-NMR-Spektrum des Enkastin VD (Fru-Val-Asp) aus
Beispiel 3;
Fig. 2: ¹H-NMR-Spektrum des Enkastin (D) VD (Fru-D-Val-Asp)
aus Beispiel 11;
Fig. 3: ¹H-NMR-Spektrum des Enkastin (D) ID (Fru-D-Ile-Asp)
aus Beispiel 12;
Fig. 4: IR-Spektrum des Enkastin ID-OtBu (Fru-Ile-AspOtBu)
aus Beispiel 13;
Fig. 5: IR-Spektrum des (Fru-D-Hhp-Asp) aus Beispiel 14.
Die ¹H-NHR-Spektren wurden in D₂O bei 270 MHz aufgenommen.
Die IR-Spektren sind FTIR (F urier-Transfer-Infrarot)-Absorptionsspektren,
in KBr-Preßlingen gemessen.
Claims (13)
1. Verbindung der Formel I,
Sacch-A-B-R (I)in welcher
Sacch für einen Monosaccharid-Rest, wobei gegebenenfalls die OH-Gruppen teilweise oder vollständig substituiert sind,
A für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder - falls B fehlt - für den Rest einer neutralen D-Aminosäure,
B fehlt oder für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder einer gegebenenfalls ω-substituierten bifunktionellen sauren oder basischen L- oder D-Aminosäure und
R für Hydroxy, (C₁-C₈)-Alkoxy, einen Amin-Rest, der gegebenenfalls durch ein oder zwei gleiche oder verschiedene Reste aus der Reihe (C₁-C₈)-Alkyl, (C₅-C₈)-Cycloalkyl, (C₅-C₈)-Heteroalkyl oder (C₅-C₈)-Heteroaryl substituiert ist, oder ein anderes Säurederivat stehen,
oder dessen physiologisch verträgliche Salze, mit der Maßgabe, daß die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
Sacch für einen Monosaccharid-Rest, wobei gegebenenfalls die OH-Gruppen teilweise oder vollständig substituiert sind,
A für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder - falls B fehlt - für den Rest einer neutralen D-Aminosäure,
B fehlt oder für den Rest einer neutralen L- oder D-Aminosäure oder einer gegebenenfalls ω-substituierten bifunktionellen sauren oder basischen L- oder D-Aminosäure und
R für Hydroxy, (C₁-C₈)-Alkoxy, einen Amin-Rest, der gegebenenfalls durch ein oder zwei gleiche oder verschiedene Reste aus der Reihe (C₁-C₈)-Alkyl, (C₅-C₈)-Cycloalkyl, (C₅-C₈)-Heteroalkyl oder (C₅-C₈)-Heteroaryl substituiert ist, oder ein anderes Säurederivat stehen,
oder dessen physiologisch verträgliche Salze, mit der Maßgabe, daß die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
2. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1, in welcher
Sacch den Rest einer Aldohexose oder Ketohexose oder deren Derivate
A Ile, Phe, Leu, Val, Thr, Ser, Gly, Cys, Ala oder Hexahydrophenylglycin (Hhp) jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr oder Gly jeweils in der L- oder D-Form und
R Hydroxy oder bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze,
wobei die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
Sacch den Rest einer Aldohexose oder Ketohexose oder deren Derivate
A Ile, Phe, Leu, Val, Thr, Ser, Gly, Cys, Ala oder Hexahydrophenylglycin (Hhp) jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr oder Gly jeweils in der L- oder D-Form und
R Hydroxy oder bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze,
wobei die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.
3. Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren
der Ansprüche 1 und 2, in welcher
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Phe, Leu, Val, Cys, Ala oder Hhp jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu oder Ser, jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Phe, Leu, Val, Cys, Ala oder Hhp jeweils in der L- oder D-Form, oder - falls B fehlt - vorstehende Reste jeweils in der D-Form,
B fehlt oder Asp, Asx, Glu oder Ser, jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
4. Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 3, in welcher
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Leu, Val, Cys oder Hhp, jeweils in der D-Form,
B Asp, Asx, Glu oder Ser jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Sacch Fructosyl oder dessen Derivate,
A Ile, Leu, Val, Cys oder Hhp, jeweils in der D-Form,
B Asp, Asx, Glu oder Ser jeweils in der L- oder D-Form, und
R Hydroxy bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
5. N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Val-Asp sowie dessen
physiologisch verträgliche Salze.
6. N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-D-Ile-Asp sowie dessen
physiologisch verträgliche Salze.
7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der
Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) Streptomyces albus (ATCC 21 838), sowie seine Varianten und Mutanten in einem Nährmedium kultiviert werden bis sich Verbindungen der Formel I, in der Sacch für einen N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Rest, A für Ala, Leu, Val oder Ile, B für Asp oder Glu und R für Hydroxy stehen, in der Kultur anhäuft, und diese gegebenenfalls
- b) isoliert, gereinigt und derivatisiert wird.
8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I
gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- a) eine Aminosäure mit N-terminaler freier Aminogruppe mit einer Aminogruppe mit C-terminaler freier Carboxylgruppe kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
- b) das Dipeptid oder eine Aminosäure mit N-terminaler freier Aminogruppe mit einem Monosaccharid mit freier Hydroxygruppe des anomeren Zentrums kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
- c) das so erhaltene N-Glycosid gegebenenfalls mittels Amadori-Umlagerung in die N-substituierten Iso-Zuckeramine überführt
und das so erhaltene Enkastin gegebenenfalls in sein
physiologisch verträgliches Salz oder sein Derivat
überführt, wobei es auch möglich ist, die Reihenfolge
dieser Reaktion zu vertauschen und - falls man in b) eine
Aminosäure einsetzt - a) ausgelassen wird.
9. Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 6 zur Anwendung als Heilmittel.
10. Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 6 zur Anwendung als Heilmittel bei der
Behandlung von schmerzhaften Zuständen.
11. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine
Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 6 oder deren physiologisch verträgliches
Salz.
12. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung gemäß
Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung
der allgemeinen Formel I oder dessen physiologisch
verträgliches Salz zusammen mit einem physiologisch
annehmbaren Träger und gegebenenfalls weiteren Zusatz-,
Hilfs- und/oder Konservierungsstoffen in eine geeignete
Darreichungsform bringt.
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