DE3713873A1

DE3713873A1 - Enkastine: neue glycopeptide mit enkephalinase-hemmender wirkung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als pharmazeutische praeparate

Info

Publication number: DE3713873A1
Application number: DE19873713873
Authority: DE
Inventors: Laslzo Dr Vertesy; Peter Dr Schindler; Herbert Dr Kogler; Hans-Wolfram Dr Fehlhaber; Francoise Delevallee
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1987-04-25
Filing date: 1987-04-25
Publication date: 1988-11-10
Also published as: ZA882855B

Description

Die Erfindung betrifft neue, biologisch aktive Glycopeptide. Sie besitzen Enkephalinase-hemmende Eigenschaften und können daher z. B. als Analgetika in der Human- und Tiermedizin verwendet werden. Es werden Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.

Enkastine sind Verbindungen, in denen ein Monosaccharid über einen Aminstickstoff mit einem Dipeptid verknüpft ist. Verbindungen wie N-(1-Desoxy-b-D-fructopyranos-1-yl)-Gly- Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH sind bereits aus B.N. Stepanenko und N.N. Borodina, Prikl. Biokhim. Mikrobio. 12 (1) (1976) 5-13 [C.A. 85: 143 425 h] bekannt.

Als analgetisch wirksame Enkephalinase-Inhibitoren sind verschiedene Verbindungsklassen beschrieben worden. Gemeinsam ist ihnen eine funktionelle Gruppe in Nachbarstellung zu einer lipophilen Aminosäure, die mit dem an der Katalyse essentiell beteiligten Zn²⁺ dieses Metallo-Enzyms eine Koordinations-Verbindung eingehen können. Zu diesen funktionellen Gruppen zählen z. B. -SH, HO-NH-CO-, -P(=O)OH-R und -COOH (R.E. Chipkin, Drugs of the Future 11 (7) (1986), 593-606). Es ist ferner bekannt, daß solche Verbindungen nicht nur Enkephalinase hemmen, sondern auch das aus Bakterien isolierbare Enzym Thermolysin (M. Pozsgay, C. Michaud, M. Liebmann und M. Orlowski, BIOCHEMISTRY 25 (1986) 1292-1299).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zu finden, die spezifisch Enkephalinase hemmen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verbindungen der allgemeinen Formel I,

Sacch - A - B - R (I)

in welcher

Sacchfür einen Monosaccharid-Rest, Afür den Rest einer neutralen Aminosäure, Bfür den Rest einer neutralen Aminosäure oder einer gegebenenfalls ω-substituierten bifunktionellen sauren oder basischen Aminosäure und Rfür Hydroxyl, (C₁-C₈)-Alkoxy einen Amin-Rest, der gegebenenfalls durch ein oder zwei gleiche oder verschiedene Reste aus der Reihe (C₁-C₈)-Alkyl, (C₅-C₈)-Cycloalkyl, (C₅-C₈)-Heteroalkyl oder (C₅-C₈)-Heteroaryl substituiert ist, oder ein anderes Säurederivat stehen,

oder deren physiologisch verträgliche Salze, mit der Maßgabe, das die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D- fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D- fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.

Als Salze kommen insbesondere Alkali- und Erdalkalisalze, Salze mit physiologisch verträglichen Aminen und Salze mit anorganischen und organischen Säuren wie z. B. HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, Maleinsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Weinsäure, Essigsäure in Frage.

Falls im Einzelfall nicht anders angegeben, können Alkyl und Alkoxy geradkettig oder verzweigt sein.

Bevorzugt sind solche Reste A und B, die sich von natürlich vorkommenden α-Aminosäuren - insbesondere L-Aminosäuren - (s. z. B. Schröder, Lübke, "The Peptides", Volume I, New York 1965, Seiten 137-270), deren Antipoden oder deren einfachen Metaboliten ableiten. Die Chiralitätszentren in den Peptiden können jeweils die R-, S- oder R,S-Konfiguration besitzen.

Im folgenden werden die Aminosäuren durch Symbole beschrieben, wie sie in L. Styrer, "Biochemistry" (W.H. Freeman & Company, San Francisco, 1972, Seite 14ff.) verwendet werden. Diesen Symbolen wird das Symbol "D" vorangestellt, wenn es sich um den Rest einer D-Aminosäure handelt; Reste ohne Konfigurationssymbol sind L-konfiguriert.

Sacch. kann beispielsweise eine Triose, Tetrose oder ein Furanosyl- oder Pyranosyl-Rest sein, der sich von Aldopentosen, Aldohexosen, Ketopentosen, Ketohexosen, Desoxyaldosen und Aminoaldosen sowie den Stereoisomeren ableitet, insbesondere von D- oder L-Monosacchariden wie Ribose (Rib), Arabinose (Ara), Xylose (Xyl), Lyxose (Lyx), Allose (All), Altrose (Alt), Glucose (Glc), Mannose (Man), Gulose (Gul), Idose (Ido), Galactose (Gal), Talose (Tal), Erythrose (Ery), Threose (Thr), Psicose (Psi), Fructose (Fru), Sorbose (Sor), Tagatose (Tag), Xylulose (Xyu), Fucose (Fuc), Rhamnose (Rha), Olivose (Oli), Oliose (Olo), Mycarose (Myc), Rhodosamin (RN), N-Acetylglucosamin (GlcNac), N-Acetyl-Galactosamin (GalNAc), N-Acetyl mannosamin (ManNAc) sowie deren synthetischen Derivate wie 2-Desoxy-, 2-Amino-, 2-Acetamido- oder 2-Halogeno-, bevorzugt Bromo- oder Jodo-Zucker; oder ein Inosit. Sacch. kann in der α- oder β-Form bevorzugt jedoch in der β-Form, und auch als Monosaccharid-Derivat vorliegen.

Bevorzugt sind Glycopeptide der Formel I in welcher

Sacchder Rest einer Aldohexose oder Ketohexose, AIle, Phe, Leu, Val, Thr, Ser, Gly oder Ala, BAsp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr oder Gly und

wobei die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)- Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly- Ser-OH ausgenommen sind.

Glycopeptide der Formel I in welcher

SacchFructosyl, AIle, Phe, Val oder Ala BAsp, Glu oder Ser und RHydroxy bedeuten,

sind besonders bevorzugt.

Folgende Glycopeptide seien insbesondere genannt:
Enkastin ID

N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl) - Ile - Asp - OH
Enkastin VD

N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl) - Val - Asp -OH
Enkastin AD

N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl) - Ala - Asp - OH
Enkastin IE

N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl) - Ile - Glu - OH
Enkastin VE

N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl) - Val - Glu - OH
Enkastin AE

1-Desoxyfructopyranosyl - Ala - Glu - OH

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

a) Streptomyces albus (ATCC 21838), sowie seine Varianten und Mutanten in einem Nährmedium kultiviert werden bis sich die Verbindung der Formel I, in der Sacch. für einen N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-Rest, A für Ala, Val oder Ile, B für Asp oder Glu und R für Hydroxyl stehen, in der Kultur anhäuft, und diese gegebenenfalls
b) isoliert, gereinigt und derivatisiert wird.

In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Streptomyces albus, ATCC 21838, unter anderem Enkastin ID, Enkastin VD, Enkastin AD, Enkastin IE, Enkastin VE sowie Enkastin AE.

Anstelle des Stammes ATCC 21838 können natürlich auch seine Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie mindestens eine dieser Verbindungen synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethansulfonsäuremethylester (Ethylmethylsulfonat, EMS) oder 2-Hydroxy-4- methoxybenzophenon (MOB), erzeugt werden.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt sowie Öle und Fette. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle oder Spurenelemente wie z. B. Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.

Die Bildung der Enkastine verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die 0,1 bis 15% Nährstoffbestandteile, wie Sojamehl, Sojaöl und Mannit, insbesondere jeweils 0,1 bis 3% bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung enthält. Die Fermentation erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann in einem Temperaturbereich von etwa 18 bis 35°C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 30°C, insbesondere bei 28 bis 30°C erfolgen. Der pH-Bereich sollte zwischen 6 und 8 liegen, vorteilhaft zwischen 6,5 und 7,5. Unter diesen Bedingungen zeigt die Kulturbrühe im allgemeinen nach 6 bis 15 Tagen eine nennenswerte enkephalinasehemmende Wirkung.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man ein versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 80 bis 400 Stunden wachsen läßt. Das versporte Mycel kann erhalten werden, indem man den Stamm etwa 12 Tage auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar, wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf kann anhand des pH-Wertes der Kultur oder dem Mycelvolumen, durch Ausprüfen der biologischen Aktivität überwacht werden. Die Enkastine sind sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat enthalten. Die Hauptmenge der Enkastine ist jedoch im allgemeinen im Kulturfiltrat zu finden.

Die Isolierung der genannten Verbindungen aus dem Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte, wie beispielsweise Chromatographie an Ionenaustauschern, Molekularsieben, Adsorptionsharzen und Reversed-Phase-Trägern, durch Lösungsmittelfällungen, Reversosmose und andere.

Vorteilhaft ist es auch, die wäßrige Phase vom Mycel, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation zu trennen, und die Enkastine aus den jeweiligen Phasen zu isolieren und zu reinigen.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß das Kulturfiltrat zur Entfettung mit Butanol extrahiert und die wäßrige Phase im Vakuum eingeengt wird. Das mit der 2- bis 5fachen Menge Methanol verdünnte wäßrige Konzentrat wird durch Zentrifugation von den ausgefallenen hochmolekularen Stoffen befreit. Aus dem wäßrig-methanolischen Überstand werden dann mit stark sauren Ionenaustauschern wie z. B. Dowex® 50 WX 2 zunächst die basischen, und daraus anschließend mit einem Anionenaustauscher wie z. B. Amberlite ® IRA-68 die amphoteren Substanzen isoliert. Diese Fraktion enthält die Enkastine. Nach Entsalzung mit Hilfe eines Molekularsiebes wie z. B. Sephadex® G-15 werden durch präparative HPLC z. B. an Reversed-Phase RP-18 die einzelnen Enkastin-Komponenten gewonnen.

Es ist jedoch auch möglich, die Enkastine auf anderem Wege (synthetisch) herzustellen. Die Erfindung betrifft daher ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine Aminosäure mit N-terminaler freier Aminogruppe mit einer Aminosäure mit C-terminaler freier Carboxylgruppe kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
b) das Dipeptid mit N-terminaler freier Aminosäure mit einem Monosaccharid mit freier Hydroxygruppe des anomeren Zentrums kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
c) das so erhaltene N-Glycosid gegebenenfalls mittels Amadori-Umlagerung in die N-substituierten Iso- Zuckeramine überführt,

und das so erhaltene Enkastin gegebenenfalls in sein physiologisch verträgliches Salz oder sein Derivat überführt, wobei es auch möglich ist, die Reihenfolge dieser Reaktionen zu vertauschen.

Geeignet sind aber auch andere, an sich bekannte Reaktionen zur Bildung der Zucker-NH-Peptidbindung.

Die Amadori-Umlagerung (vgl. Weygand/Hilgetag, "Organisch- chemische Experimentierkunst", J.A. Barth-Verlag Leipzig (1964) 980) erfolgt durch 10minütiges bis 10tägiges Stehenlassen des N-Glycosids - bevorzugt 0,5 bis 3 Tage - bei einer Temperatur von 0 bis 200°C - insbesondere bei 40 bis 70°C -, anschließende Wasserentfernung - gegebenenfalls durch azeotrope Destillation - erneutes Stehenlassen und anschließende Trocknung des N-substituierten Iso-Zuckeramins.

Die Auswahl der Schutzgruppen und die Synthesestrategie wird von der Art und Konfiguration der Aminosäuren sowie die Art der Kupplungsbedingungen bestimmt.

Die Kondensation nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt nach den allgemeinen Methoden der Peptidchemie, bevorzugt nach der Methode der gemischten Anhydride, über Aktivester, Azide oder nach der Carbodiimid-Methode, insbesondere unter Zusatz reaktionsbeschleunigender und racemisierungsverhindernder Substanzen wie z. B. 1-Hydroxy benzotriazol, N-Hydroxysuccinimid, 3-Hydroxy-4-oxo-3.4- dihydro-1.2.3-benzotriazin, N-Hydroxy-5-norbornen-2.3- dicarboximid, ferner unter Verwendung aktivierter Derivate des 1-Hydroxybenzotriazols oder Anhydriden von Phosphor-, Phosphon- und Phosphinsäuren bei einer Reaktionstemperatur zwischen -10°C und dem Siedepunkt des Reaktionsgemisches, vorzugsweise zwischen -5°C und 40°C.

Geeignete Lösungsmittel dafür sind Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Hexamethylphosphorsäuretriamid, N-Methylpyrrolidon oder Dimethylsulfoxid. Sofern die Löslichkeit der Komponenten es erlaubt, können auch Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Chloroform eingesetzt werden.Die genannten Methoden sind z. B. in Meienhofer-Gross: "The Peptides", Academic Press, Vol. I, (1979) beschrieben.

Um den Glycosylrest an die Aminosäure bzw. das Dipeptid zu kondensieren, muß vorher die Carboxylgruppe bzw. weitere an der Reaktion nicht beteiligte funktionelle Gruppen, geeignet geschützt sein. Als besonders günstig erwiesen sich hierbei Schutzgruppen, die durch katalytische Hydrierung, abspaltbar sind, wie z. B. der Benzyl-(-OBzl) oder p-Nitrobenzylester (-ONbzl). Weitere geeignete Schutzgruppen sind z. B. in Hubbuch, Kontakte Merck 3 (1979) Seite 14 bis 23 und Büllesbach, Kontakte Merck 1 (1980) Seite 23 bis 25 beschrieben.

Unter den in der Kohlenhydratchemie üblichen Schutzgruppen versteht man z. B. die (C₁-C₁₀)-Acylschutzgruppen wie (C₁-C₆)-Alkanoyl (z. B. Acetyl-, Trichloracetyl-, Trifluoracetyl-), Benzoyl- oder p-Nitrobenzoyl-, sowie gegebenenfalls modifizierte Methyl-, Methyloxymethyl-, Benzyl-, Tetrahydropyranyl-, Benzyliden-, Isopropyliden- oder Trityl-Gruppe, wobei hier die Acylschutzgruppen, insbesondere die Acetyl-(Ac-)Gruppe, bevorzugt sind.

Bei der Synthese der Enkastine sind zwei polyfunktionelle Reaktionspartner (Kohlenhydrat und Aminosäure bzw. Dipeptid) zu verknüpfen. Beide müssen sich selektiv blockieren und deblockieren lassen. In der Glycosylkomponente muß das anomere Zentrum freisetzbar und funktionalisierbar sein und in der Aminosäurekomponente darf nur die für die Verknüpfung notwendige Aminogruppe deblockiert sein. Je nach dem Typ der angestrebten glycosidischen Bindung (1.2-cis- oder 1.2-trans-Glycoside) ist es notwendig, geeignete Schutzgruppen für die Blockierung der Hydroxy- oder Aminogruppen in der Glycosylkomponente einzuführen und gegebenenfalls Reaktionsbedingungen für den Verknüpfungsschritt auszuarbeiten, der stereoselektiv zu nur einem der beiden möglichen Anomeren führt.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Enkephalinase sind von großem Interesse, insbesondere für die Behandlung von schmerzhaften Zuständen wie z. B. Zahnschmerzen, Schmerzen im Zusammenhang mit Koliken, durch Hitze oder Säuren induzierte Schmerzen, durch Streß erzeugte Schmerzen sowie Schmerzen im finalen Krebsstadium. Darüber hinaus kommen Enkephalinase-Inhibitoren der Formel I auch für die Behandlung von Angstzuständen in Frage.

Es ist bekannt, daß z. B. Schmerzempfindungen und Angstzustände zu einer schnellen Ausschüttung endogener Enkephaline führen, die durch Wechselwirkung mit sogenannten Opiat-Rezeptoren die Wirkung dieser Reize unterdrücken. Allerdings werden Enkephaline, entsprechend ihrer Rolle als Neurotransmitter, durch Enkephalin- spezifische Peptidasen, insbesondere aber durch das Enzym Enkephalinase [EC 3.4.24.11], rasch zu inaktiven Peptiden abgebaut. Eine Hemmung dieses Abbaus durch Enkephalinase- Inhibitoren der Formel I hat daher zur Folge, daß endogen ausgeschüttete Enkephaline ihre Wirkung auf Opiat-Rezeptoren und damit ihre Schmerz- bzw. Angst-supprimierende Wirkung über eine längere Zeit entfalten können.

Die speziellen Eigenschaften der dieser Erfindung zugrunde liegenden Verbindungen können ferner dadurch charakterisiert werden, daß sie nicht nur den Abbau von Enkephalinen durch Enkephalinase hemmen, sondern auch eigen-analgetische Wirkung besitzen. Es erscheint daher auch möglich, daß die durch Formel I charakterisierten Enkephalinase-Inhibitoren auch eine direkte Wirkung auf Opiat-Rezeptoren ausüben.

Enkephalinase-Test

Die Enkephalinase-inhibierenden Eigenschaften der Enkastine wurden nach Literatur-bekannten Methoden ermittelt, wie sie z. B. von Roques, B.P. et al. beschrieben wurden [Life Sciences (1982), Seite 1949 bis 1752]. Als Enzym wurde eine nach an sich bekannten Methoden [Mumford, R.A. et al. 1982, Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, Seite 1303 bis 1309] aus Ratten-Nieren solubilisierte Enkephalinase-Präparation verwendet. Die 50%ige Hemmung der Enkephalinase durch die erfindungsgemäßen Verbindungen, d. h. der IC₅₀-Wert, wurde in bekannter Weise mit Hilfe einer Konzentrations-Reihe ermittelt, wobei die Inhibitoren, die Gegenstand der Erfindung sind, 60 Minuten lang mit dem Enzym bei Raumtemperatur vorinkubiert wurden, bevor die enzymatische Reaktion durch Zugabe des Substrats gestartet wurde. Geeignete Kontrollen für die ungehemmte Reaktion wurden in Abwesenheit eines Inhibitors durchgeführt.

Enkephalinase-Hemmung

IC₅₀ [µg/l]

1. Enkastin ID< 2

2. Enkastin ND∼ 4

3. Enkastin IN∼ 12

4. Enkastin FD∼ 20

Die Enkastine können einzeln oder in Kombination parenteral (i.v., s.c., i.m.) oder oral in einem physiologisch verträglichen Medium verabreicht werden. Die zu verabreichende Dosis liegt in der Regel bei 0,1 bis 10 mg/kg.

Beispiel 1 Fermentative Gewinnung der Enkastine (2000 l)

Zur fermentativen Gewinnung der erfindungsgemäßen Enkephalinase-Inhibitoren erfolgte die Anzucht des produzierenden Mikroorganismus Streptomyces albus ATCC 21838 - wie in der Mikrobiologie üblich - aus einer gefriergetrockneten Dauerform dieses Stammes. Die Anzucht erfolgte zunächst auf einem festen Nährboden in sterilen Petri-Schalen. Vereinzelte Kolonien wurden anschließend in Schrägröhrchen weiter kultiviert und von diesen Kulturen die für die Fermentation notwendige Massenproduktion von Sporen in Roux-Flaschen durchgeführt.

Agarmedium für Passagen auf festen Nährböden

Dextrin15,0 g/l Rohrzucker2,0 g/l Fleischextrakt1,0 g/l Hefeextrakt2,0 g/l Kochsalz0,5 g/l K₂HPO₄0,5 g/l FeSO₄·7H₂O0,01 g/l Agar-Agar2,0 g/l

pH-Wert 7,3
Sterilisation bei 120°C, 20 Minuten
Inkubation bei 30°C, 9 Tage.

Die Sporenabschwemmung einer Rouxflasche wurde in 100 ml sterilem Wasser aufgenommen und diente als Inokulum für die Herstellung der ersten submersen vegetativen Fermentations- Vorstufe (Arbeitsvolumen 1,2 l).

Vorstufen-Medium

lösliche Stärke4,0 g/l Glucose1,0 g/l Casein-Pepton1,0 g/l Cornsteep flüssig0,4 g/l Sojamehl0,4 g/l (NH₄)₂SO₄0,8 g/l

pH-Wert 8,3
Sterilisation bei 120°C, 20 Minuten
Inkubation bei 18°C, 2 Tage, Schüttelmaschine mit 150 UpM und 5 cm Amplitude.

Nach 48 Stunden wurde der Inhalt einer Fernbachflasche mit der so erhaltenen ersten Vorkultur (s. o.) als Inokulum für die 200 l betragende zweite Vorkultur eingesetzt, wobei auch hier das Vorstufen-Medium (s. o.) verwendet wurde. Die Sterilisationszeit betrug 30 Minuten. Die Inkubation erfolgte 48 Stunden lang bei 28°C unter Rühren mit einer Umfangsgeschwindigkeit von 5 m/sec und einer Belüftungsrate von 0,1 vvm.

Der Inhalt der zweiten Vorkultur diente als Inokulum für 2000 l Haupt-Fermentationsmedium.

Hauptfermentationsmedium:

Erdnußmehl30,0 g/l Cornsteep, fest10,0 g/l Maisstärke20,0 g/l Dextrin40,0 g/l (NH₄)₂SO₄5,0 g/l MgSO₄·7H₂O5,0 g/l CaCO₃8,0 g/l

pH-Wert 6,8
Sterilisation bei 120°C, 50 Minuten.

Die Hauptfermentation wurde bei 28°C unter Rühren mit einer Umfangsgeschwindigkeit von 4 m/sec und einer Belüftungsrate von 0,6 vvm durchgeführt. Die Bildung der erfindungsgemäßen Inhibitoren begann nach 4 Tagen und erreichte ihr Maximum nach 10 bis 12 Tagen. Nach Erreichen des Fermentations-Maximums wurde der Fermenter abgeerntet. Die Ausbeute an Enkastin-Komplex der Formel I betrug zwischen 5 und 10 µg/l Kulturlösung.

Beispiel 2 Isolierung der Enkastine aus der Kulturlösung

2000 l Fermentationslösung gemäß Beispiel 1 wurden mit Hilfe einer Filterpresse von der Zellmasse befreit und die klare Flüssigkeit zweimal mit je 600 l n-Butanol extrahiert. Anschließend konzentrierte man die entfettete wäßrige Phase im Vakuum in einen Fallstromverdampfer auf 150 l und verdünnte dann dieses Konzentrat mit 600 l Methanol. Hierbei entstand ein heller, flockiger Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgeschieden und verworfen wurden. Der wäßrig-methanolische Überstand wurde erneut im Vakuum eingeengt und zu 18 kg einer braunen klebrigen Masse getrocknet. Anschließend adsorbierte man im wäßrigen Medium auf 70 l Kationenaustauscher Dowex® 50 WX 2 (Säureform), wusch den beladenen Austauscher mit reinem Wasser und desorbierte die Inhibitoren mit 0,5 M Ammoniumhydroxidlösung. Die Enkephalinase-hemmenden Eluate wurden gesammelt und gefriergetrocknet (3,5 kg). Hieraus wurden durch analoge Arbeitsweise an 70 l Anionenaustauscher Amberlite® IRA-68 die amphoteren Verbindungen abgetrennt. Die Elution der Enkastine geschah in diesem Fall mit 0,5 M Essigsäure. Die Gefriertrocknung der inhibitorisch hemmaktiven Eluate erbrachte 320 g Trockenprodukt. Die Gelchromatographie an Sephadex® G-15 sowie die Gefriertrocknung des aktiven Materials ergab 30 g Enkastin-Rohkomplex.

Beispiel 3 Auftrennung der Enkastinkomponenten

150 mg des nach Beispiel 2 gewonnenen Materials wurden in 1 ml Wasser gelöst und auf eine Stahlsäule (mit den Innenmaßen 3,2 × 25 cm²) aufgetragen, die mit Reversed- Phase-Kieselgel RP-18 gefüllt war. Die Elution geschah zunächst mit 0,05%iger Trifluoressigsäure (TFA), der nach 40 Minuten Laufzeit ein linearer Acetonitrilgradient in 0,05%iger TFA folgte. Den Säulenausfluß kontrollierte man durch Bestimmen der Ultraviolettabsorption bei 200 nm. Im Verlauf der Elution wurden zahlreiche scharfgetrennte Substanzen von der Säule eluiert, die jeweils separat gesammelt wurden. Sie wurden gefriergetrocknet und untersucht. Die Peaks 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11, 13, 16, 18 und 21 erwiesen sich hemmaktiv gegen die Enkephalinase.

Peak 3 (Retentionszeit 5 Minuten 8 Sekunden) enthielt das Enkastin AD. Die Aminosäureanalyse ergab äquimolare Mengen Alanin und Asparaginsäure. Das, durch FAB-Massenspektrum bestimmte Molekulargewicht, betrug 366, entsprechend der Summenformel C₁₃H₂₂N₂O₁₀. Durch ²D-NMR Experimente wurde die o.a. Struktur ermittelt. Fig. 1 ergibt das 270 MHz¹H-NMR- Spektrum des Enkastins AD wieder.

Peak 4 (Retentionszeit 5 Minuten 21 Sekunden) ergab geringe Mengen des Enkastin VD mit dem Molekulargewicht 394 entsprechend der Summenformel C₁₅H₂₆N₂O₁₀. Die Fig. 2 zeigt das 270 MHz-¹H-NMR-Spektrum, des Enkastin VD.

Peak 7 (Retentionszeit 7 Minuten 20 Sekunden) enthielt das Enkastin AE, Molekulargewicht 380, Summenformel C₁₄H₂₄N₂O₁₀.

Peak 11 (Retentionszeit 8 Minuten 10 Sekunden) ergab das Enkastin VE, Molekulargewicht 408, C₁₆H₂₈N₂O₁₀, mit den Aminosäuren Val und Glu sowie Peak 13 (Retentionszeit 18 Minuten 40 Sekunden) das Enkastin ID, Molekulargewicht 408, C₁₅H₂₈N₂O₁₀, mit Ile und Asp als Aminosäuren.

Peak 16 (Retentionszeit 22 Minuten) beinhaltete das Enkastin IE, Molekulargewicht 422, C₁₇H₃₀N₂O₁₀.

Beispiel 4 Synthese der N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-isoleucyl- asparaginsäure

30 g Glucose, wasserfrei, wurden zusammen mit 3 g Isoleucyl-Asparaginsäure in 1,2 l Methanol gelöst und mit 200 mg NaHCO₃ versetzt. Anschließend erhitzte man 2 Stunden unter Rückfluß. Danach wurde das gebildete Wasser mit Butanol abdestilliert und die mit Methanol verdünnte Reaktionsmischung nochmals 2 Stunden erwärmt. Die fertige Reaktionslösung wurde im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und in 300 ml Wasser auf eine, mit QAE-Sephadex® A-25 gefüllte Trennsäule von 600 ml Inhalt (Durchmesser 5 cm) gegeben. Während sich im Durchlauf die überschüssige Glucose befand, konnte mit einem Essigsäuregradienten (0 bis 0,5 Molar) selektiv die N-1-Desoxyfructopyranos-1-yl- isoleucyl-asparaginsäure, gewonnen werden. Diese Säuleneluate wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 720 mg eines weißen, amorphen Pulvers.

¹H-NMR-Spektrum [ppm]: 4,43; 2,69; 2,48; 3,84; 1,93; 1,50; 1,26; 0,93 und 0,89, verursacht vom Peptidteil des Moleküls; 3,93; 3,91; 3,79; 3,66; 3,65; 3,17; sowie 3,14 vom Glycanteil des Inhibitors entsprechend den Signalen der natürlichen Verbindung des Enkastin ID.

¹³C-NMR-Spektrum [ppm]: 54,63; 40,49; 66,79; 37,13; 26,12; 14,61 und 11,75 (Peptidteil) sowie bei 96,55; 70,91; 70,40; 69,96; 64,87 und 53,43 (Glycanteil).

Das Infra-Rot-Absorptionsspektrum zeigt Banden bei 3400, 2920, 2960, 1595, 1400 und 1080 cm^-1.

Beispiel 5 Synthese der N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-phenylalanyl- asparaginsäure

200 mg Phenylalanyl-asparaginsäure wurden mit 1,5 g D-Glucose in 100 ml Methanol aufgeschlämmt, 20 mg NaHCO₃ hinzugesetzt und 2 Stunden zum Sieden erhitzt. Danach wurde die Reaktionsmischung, wie in Beispiel 4 beschrieben, weiter bearbeitet und auf einer QAE Sephadexsäule® A 25 (1,8 cm × 23 cm, 60 ml) gereinigt, anschließend entsalzt. Man erhielt 26 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-phenylalanyl- asparaginsäure.

Das in D₂O gemessene 270 MHz-¹H-NMR-Spektrum des Enkastin FD ist in Fig. 3 wiedergegeben: 3,03; 2.96; 3,65; 3,81; 3,94; 3,99; 3,67; 3,84; 3,17; 3,08; 7,36; 4,43; 2,71; 2,51 ppm.

Beispiel 6 Synthese des N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-isoleucyl-serins

200 mg Isoleucyl-serin wurden mit 1,5 g D-Glucose wie im Beispiel 5 beschrieben umgesetzt und das Reaktionsprodukt gereinigt. Es entstanden 12 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)- Ile-Ser-OH. Die Struktur wurde durch chemische und spektroskopische Untersuchungen bestätigt. Fig. 4 zeigt das 270 MHz-¹H-NMR-Spektrum der Enkastin IS:
3,38; 3,34; 3,85; 3,98; 4,15; 4,09; 3,82; 4,45; 4,00; 3,95; 3,97; 2,15; 1,08; 1,79; 1,43; 1,06 ppm.

Beispiel 7 Synthese des N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)-isoleucyl- asparagins

300 mg Isoleucyl-asparagin wurden mit 1,5 g D-Glucose wie im Beispiel 5 beschrieben umgesetzt und das Reaktionsprodukt gereinigt. Es entstanden 90 mg N-(1-Desoxyfructopyranos-1-yl)- Ile-Asn.

Das 270-MHZ-¹H-NMR-Spektrum zeigt folgende charakteristische Signale des Enkastin IN:
3,05; 4,07; 3,95; 3,79; 4,08 und 3,78 ppm sowie 3,60; 1,89; 1,53; 1,28; 0,97 und 0,93 ppm darüber hinaus 4,54; 2,84 und 2,69 ppm.

Beispiel 8 Synthese der N-(1-Desoxytagatopyranos-1-yl)-valyl- asparaginsäure

150 mg Valyl-asparaginsäure werden mit 1 g Galactose wie im Beispiel 5 beschrieben umgesetzt und gereinigt. Es resultierten 22 mg N-(1-Desoxytagatopyranos-1-yl)-valyl- asparaginsäure.

Das in D₂O gemessene 270 MHZ-¹H-NMR-Spektrum weist folgende Signale auf:
3,16; 3,17; 4,02; 3,91; 2,68; 3,66 und 3,86 ppm sowie 2,63; 2,22; 1,09 und 1,05 ppm, darüber hinaus 4,56; 2,81 und 2,60 ppm.

Claims

1. Verbindung der Formel I Sacch - A - B - R (I)in welcher
Sacchfür einen Monosaccharid-Rest, Afür den Rest einer neutralen Aminosäure, Bfür den Rest einer neutralen Aminosäure oder einer gegebenenfalls ω-substituierten bifunktionellen sauren oder basischen Aminosäure und Rfür Hydroxyl, (C₁-C₈)-Alkoxy einen Amin-Rest, der gegebenenfalls durch ein oder zwei gleiche oder verschiedene Reste aus der Reihe (C₁-C₈)-Alkyl, (C₅-C₈)-Cycloalkyl, (C₅-C₈)-Heteroalkyl oder (C₅-C₈)-Heteroaryl substituiert ist, oder ein anderes Säurederivat stehenoder deren physiologisch verträgliche Salze, mit der Maßgabe, das die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D- fructopyranos-1-yl)-Gly-Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D- fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.

2. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1, in welcher Sacchder Rest einer Aldohexose oder Ketohexose, AIle, Phe, Leu, Val, Thr, Ser, Gly oder Ala, BAsp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr oder Gly und oder deren physiologisch verträgliches Salz, wobei die Verbindungen N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly- Gly-OH und N-(1-Desoxy-β-D-fructopyranos-1-yl)-Gly-Ser-OH ausgenommen sind.

3. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, in welcher SacchFructosyl AIle, Phe, Val oder Ala, BAsp, Glu oder Ser und RHydroxy bedeuten,oder dessen physiologisch verträgliche Salze.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Streptomyces albus (ATCC 21838), sowie seine Varianten und Mutanten in einem Nährmedium kultiviert werden bis sich die Verbindungen der Formel I, in der Sacch. für einen N-(1- Desoxyfructopyranos-1-yl)-Rest, A für Ala, Val oder Ile, B für Asp oder Glu und R für Hydroxyl stehen, in der Kultur anhäuft, und diese gegebenenfalls
b) isoliert, gereinigt und derivatisiert wird.

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Aminosäure mit N-terminaler freier Aminogruppe mit einer Aminosäure mit C-terminaler freier Carboxylgruppe kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
b) das Dipeptid mit N-terminaler freier Aminosäure mit einem Monosaccharid mit freier Hydroxygruppe des anomeren Zentrums kondensiert, gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz funktioneller Gruppen gegebenenfalls temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet,
c) das so erhaltene N-Glycosid gegebenenfalls mittels Amadori-Umlagerung in die N-substituierte Iso- Zuckeramine überführt,

und das so erhaltene Enkastin gegebenenfalls in sein physiologisch verträgliches Salz oder sein Derivat überführt, wobei es auch möglich ist, die Reihenfolge dieser Reaktion zu vertauschen.

6. Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung als Heilmittel.

7. Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung als Heilmittel bei der Behandlung von schmerzhaften Zuständen.

8. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 oder dessen physiologisch verträgliches Salz.

9. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I, oder dessen physiologisch verträgliches Salz zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Träger und gegebenenfalls weiteren Zusatz-, Hilfs- und/oder Konservierungsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.