PT87306B

PT87306B - Processo para a preparacao de encastinas, novos glicopeptidos de accao inibidora de encefalinase, e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT87306B
Application number: PT87306A
Authority: PT
Inventors: Laszlo Vertesy; Herbert Kogler; Hans-Wolfram Fehlhaber; Peter Schindler; Francoise Devallee
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-04-25
Filing date: 1988-04-22
Publication date: 1992-08-31
Also published as: EP0288897A2; DE3883055D1; NO881778L; NO172351B; IL86168A; HUT47600A; NO172351C; NO881778D0; AU607486B2; JP2610646B2; IL86168A0; CN1030766A; HU198953B; KR880012643A; EP0288897B1; PT87306A; DK222488D0; AU1509888A; EP0288897A3; FI881869A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

A invenção refere-se a novos glicopéptidos bio lógicamente activos. Possuem propriedades inibitórias da ence falinase e podem por isso utilizar-se por exemplo como analgésicos na medicina humana e veterinária. Descrevem-se ainda processos para a sua preparação.

As encastinas são compostos nos quais um monos sacarido se encontra ligado a um aminoácido ou a um dipeptido através de um átomo de azoto de amina. Compostos deste tipo, com um L-aminoácido, encontram-se descritos por K. Henys e H.

N

Paulsen (Liebigs Ann. Chem. 622 (1959)» 160-174) e por H. Ro per e K. Henys (Carbohydrat e Research 116 (19θ3)» 180-195)· Compostos como N- (1-d esoxi-/6-D-f rutopiranoso-l-il)-Gly-Gly-0H e N- (l-desoxi-/3-D-f rutopiranoso-l-il)-Gly-Ser-OH, são já conhecidos de B. N. Stepanenko e N. N. Borodina, Prikl. Bioklim. Mikrobio. 12 (1) (1976), 5-13/C. A. 85:143425 h?.

Encontram-se descritas várias classes de compostos como analgésicos de acção inibitória da encefalinase. Todos possuem em comum um grupo funcional em posição adjacente a um aminoácido lipófilo, que com o Zn essencial à catálise deste metalo-enzima, pode formar um composto de coordena ção. Entre estes grupos funcionais contam-se por exemplo -SH, HO-NH-CO-, -P(=O)OH-R e -COOH (R.E. Chipkin, Drugs of the Future 11 (7) (1986), 593“6o6). Sabe-se além disso, que tais compostos inibem não só a encefalinase, como também o enzima termolisina isolável a partir de bactérias (M. Pozsgay, C. Mi chaud, M. Liebmann e M. Orlowski; Biochemistry 25 (1986), 1292-1299).

É assim um objectivo da invenção encontrar compostos que inibam especificamente a encefalinase. Consegue -se atingir este objectivo, de acordo com a invenção, com os compostos de fórmula geral I,

Sacch - A-B-R (i) em que

Sacch é um grupo monossacarido, em que, conforme o caso, os grupos OH se encontram parcial ou totalmente substituido s,

A é o grupo de um L~ ou D- aminoácido neutro, ou — caso B não exista — é o grupo de um D-aminoácido neutro,

B não existe ou é o grupo de um L- ou D-aminoácido neutro ou de um L- ou D-aminoácido bifuncional ácido ou básico, conforme o caso substituido, e

R é um grupo hidroxilo, alcooxilo (C^-Cg), amino, que,con forme o caso, está substituido por um ou dois grupos

iguais ou diferentes de entre a série alquilo (C^-Cg), cicloalquilo (C^-Cg), heteroalquilo (C^-Cg) ou heteroarilo (C^-Cg), ou representa um outro derivado de ácido, ou com os respectivos sais fisiologicamente assimiláveis, com a condição de se exceptuarem os compostos N-(1-desoxi- -D-frutopiranoso-l-il)-Gly-Gly-OH e N-(l-desoxi- -D-frutopiranesa-l-il)-Gly-Ser-0H.

Como sais referem-se em especial sais alcalinos e alcalinoterrosos, sais com aminas fisiologicamente assimiláveis e sais com ácidos inorgânicos ou orgânicos, como por exemplo HC1, HBr, H^SO^, H^PO^, ácido maleico, ácido fumá rico, ácido cítrico, ácido tartárico e ácido acético.

Os grupos OH dos grupos monossacaridos encontram-se — caso estejam substituídos — de preferência eterificados ou esterifiçados, em especial por meio de alcooxilo (c^-C^) ou alquilcarbonilo · Além disso, os grupos OH podem ainda encontrar-se substituidos (N. do T.í por outros gru pos no seu lugar) por hidrogénio (desoxiaçucar) , alquilo (C^-C^) , heteroátomos com 0, N, Se seus derivados.

Salvo indicação em contrário em casos individuais, os grupos alquilo e alcooxilo podem ser de cadeia linear ou ramificada.

Como compostos heteroalquílicos referem-se em especial compostos heterocíclicos. Deste modo, tal como nos compostos heteroarílicos, referem-se compostos azotadosem par ticular, como por exemplo pirrolidina, piperidina e piridina.

Preferem-se os grupos A e B, derivados de <X-aminoácidos naturalmente ocorrentes (vide por exemplo, Sch.ro der, LUbke, The Peptides, Volume I, New York 15ó5> págs. 137-270 ou Houben-weyl, Methoden der Organischen Chemie, Volume 15/1 e 2, suplemento) dos seus isomeros ópticos ou dos seus metabolitos simples. Os centros de quiralidade nos pepti

dos podem apresentar as configurações R, S ou RS.

Nas descrições seguintes referem-se os aminoácido s por símbolos, na forma utilizada em L. Styrer, Bioehe mistry (w.H. Freeman & Company, San Francisco, 1972, púg. 14 e seguintes). À frente destes símbolos acrescenta-se o símbolo “D nos casos em que se trata de um grupo de um D-aminoácido; os grupos sem símbolo de configuração possuem a configu ração L.

Sacch pode ser por exemplo uma triose, uma te trose ou um grupo furanosilo ou piranosilo, derivado de aldopentoses, aldohexoses, cetopentoses, cetohexoses, desoxialdoses e aminoaldoses, bem como dos estereoisómeros, em especial de monossacaridos D ou L como ribose (Rib), arabinose (Ara), xilose (Xyl), lixose (Lyx), alose (All), altrose (Alt), gluco se (Glc), manose (Man), Guiose (Gul), ido se (ido), gaiato se (Gal), talose (Tal), eritrose (Ery), treose (Thr), psicose (Psi), fruto se (Fru), eorbose (Sor), tagatose (Tag), xilulose (Xyu), fucose (Fuc), ramnose (Rha), olivose (Oli), oliose (Olo), micarose (Myc), rodosamina (RN), N-acetilglucosamina (GlcNAc), N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetiImanosamina (YanNAc), bem como dos respectivos derivados sintéticos como desoxi-, amino-, acetamido-, halo-, de preferência bromo- ou iodo- açúcares ou inositol. 0 grupo Sacch pode existir na for ma cÇ ou /9 , de preferência contudo na formae também como derivado de monossacarido.

Preferem-se os glicopeptidos de fórmula I, em que

Sacch significa o grupo de uma aldohexose ou cetohexose ou os respectivos derivados,

A significa IIe, Phe, Leu, Vai, Thr, Ser, Gly, Gys, Ala ou hexahidrofenilglicina (Hhp) quer na forma L quer na forma D, ou, caso B não exista, significa os grupos aci ma mencionados mas só na forma D;

B nâo existe ou significa Asp, Asn, Gluc, Glx, Ser, Thr

e ou Gly, quer na forma L quer na forma D, significa hidroxilo

bem como os respectivos sais fIsiològicamente assimiláveis, exceptuando-se os compostos N(l-desoxi-/3-D-frutopiranoso-l-il)-Gly~Gly-OH e N-(l-desoxi-/?-D-frutopiranoso-l-il)-Gly-Ser

-OH.

Preferem-se em especial os glicopeptidos de fórmula I, em que

Sacch significa fruto silo ou os seus derivados,

A significa Ile, Phe, leu, Vai, Cys, Ala ou Hhp quer na forma L quer na forma D, ou, caso B não exista, signifi ca os grupos anteriores na forma D,

B não existe ou significa Asp, Asx, Glu ou ^er, quer na forma L quer na forma D, e

R significa hidroxilo, bem como os respectivos sais fisiològicamente assimiláveis.

Preferem-se ainda muito em particular os glicopeptidos de fórmula I, em que

Sacch significa frutosilo ou os seus derivados,

A significa Ile, Leu, Vai, Cys ou Hhp, na forma D.

B significa Asp, Asx, Glu ou Ser quer na forma L quer na forma D, e

R significa hidroxilo, bem como os seus sais fisiològicamente assimiláveis.

Referem-se em particular os glicopeptidos seguintes:

Encastina ID, Encastina (p)lD

i

OH

Encastina VD» Encastina (p)VD

CH -NH-CH-CO-NH-CH-COOH ²1

OHCH “

I

CH₉

2 COOH

N-(1-Desoxifrutopiranosa-l-il)

OH

Encastina AD

H₉-NH-CH-CO-NH-CH-COOH ² | iH CH k

I ²COOH

N-(1-Desoxifrutopiranosa-l-il) - Ala - Asp - OH

Encastina. IE

Encastina VE

H_o-NH-CH-CO-NH-CH-C0 OH 2 |

H CH /\

CHj CH₃

I

CH_

I ²ch₉

I ²COOH

N-(1-Desoxifrutopiranosa-l-il) - Vai - Glu - OH

Encastina AE

N-(1-Desoxifrutopiranosa-l-il) - Ala - Glu - OH

Encastina (d)V

i CH

Z\

CHgCHg

H₂-NH-CH-COOH

N-(1-Desoxifrutopiranosa-l-il) - D - Vai - OH

A invenção refere-se ainda a um processo para a preparação dos compostos de fórmula I, caracterizado por

a) se cultivarem Streptomyces albus (ATCC 21838), bem como os seus variantes e mutantes, num meio nutriente, até que no meio de cultura se acumulem compostos de fórmula I, em que Sacch é um grupo N-(1-desoxifrutopiranoso-l-ilo), A é Ala, Leu, Vai ou Ile, B é Asp ou Glu e R é hidroxilo, e, confor me o caso,

b) se isolarem, purificarem e derivatizarem estes compostos.

Num meio nutriente, que contém uma fonte de carbono e uma fonte de azoto, bem como os sais inorgânicos ha bituais, o Streptomyces albus ATCC 21838 produz, entre outros, encastina ID, encastina CD, encastina AD, encastina IE, encas tina VE, bem como encastina AE.

Em vez da estirpe ATCC 21838 podem, evidentemente, utilizar-se também os seus mutantes e variantes, desde que eles sintetizem pelo menos um destes compostos. Tais mutantes podem produzir-se de modo conhecido, por melo de meios físicos, por exemplo irradiação, como com radiação ultraviole ta ou raios X, ou por meio de mutagénese química, como por

exemplo com éster metílico do ácido etanosulfónico (etilmetil sulfonato, EMS) ou com 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (ΜΟΒ).

Como fontes de carbono preferenciais para a fermentação aeróbica são apropriados hidratos de carbono e al ditois assimiláveis, como glucose, lactose ou D-manitol, bem como produtos naturais ricos em hidratos de carbono, como extracto de malte, bem como óleos e gorduras. Como nutrientes azotados referem-se: aminoácidos, peptidos e proteínas, bem como os seus produtos de degradação, como peptonas ou triptonas, e ainda extractos de carne, sementes moídas, por exemplo milho, trigo, feijão, soja ou sementes de algodão, resíduos de destilação da produção de álcool, farinhas de carne ou extractos de levedura, e ainda sais de amónio e nitratos. Como outros sais inorgânicos a solução nutriente pode conter por exemplo cloretos, carbonatos, sulfatos ou fosfatos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos, ou oligoelementos como por exemplo ferro, zinco, cobalto e manganês.

A formação das encastinas ocorre particularmente bem numa solução nutriente que contém 0,1 a 15% de componentes nutrientes, como farinha de soja, óleo de soja e manitol, em particular 0,1 a 3% em relação ao peso total da solução nutriente, A fermentação processa-se de forma aeróbica, isto é, por exemplo por submersão sob agitação translaccional ou rotacional, em balões de agitação ou fermentadores, confor me o caso com fornecimento de ar ou oxigénio. A fermentação pode efectuar-se numa gama de temperatura entre cerca de 18 e 35°C, de preferência a cerca de 25 a 30°C, em especial a 28 a 30°C. A gama de pH deve situar-se entre 6 e 8, de preferência entre 6,5 e 7»5. Nestas condições o caldo de cultura apresenta um apreciável efeito inibitório da encefalinase, em geral após 6 a 15 dias.

É vantajoso efectuar a cultura em várias etapas, isto é, prepara-se primeiro uma ou mais pré-culturas num meio nutriente líquido, que se inoculam depois no meio de pro .¼...

dução propriamente dito, a cultura principal, por exemplo numa razão de volumes de 1:10. A pré-cultura obtém-se por exemplo inoculando um micélio numa solução nutriente e deixando-o crescer durante cerca de 80 a 400 horas. 0 micélio pode obter -se deixando crescer a estirpe cerca de 12 dias sobre um suporte nutriente sólido ou líquido, por exemplo sobre levedura -malt e-agar.

decurso da fermentação pode seguir-se, em relação ao valor de pH da cultura ou ao volume do micélio,por meio de testes de actividade biológica. As encastinas estão contidas tanto no micélio como no filtrado de cultura. A quan tidade principal de encastinas encontra-se contudo, em geral, no filtrado de cultura.

isolamento dos referidos compostos, a partir do meio de cultura, efectua-se de acordo com métodos conhecidos, atendendo às propriedades químicas, físicas e bioló gicas dos produtos, como por exemplo por cromatografia em per mutadores iónicos, peneiros moleculares, resinas de absorpção e suporte de fase inversa, por meio de eluição com solventes, osmose inversa e outros métodos.

Ê também conveniente separar a fase aquosa do micélio, por exemplo por filtração ou centrifugação, e isolar as encastinas das respectivas fases e purificá-las.

Um processo preferencial consiste em extrair o filtrado de cultura com butanol, para desengorduramento, e concentrar a fase aquosa em vácuo. 0 concentrado aquoso diluí do com 2 a 5 vezes a quantidade de etanol, liberta-se dos com postos de alto peso molecular precipitados, por meio de centrifugação. A partir da fase sobrenadante aquosa-metanólica isolam-se então com permutadores iónicos fortemente ácidos, como por exemplo ^owex 50 WX 2, primeiro as substâncias bási cas, e em seguida, com um permutador aniónico, como por exem. pio '°Amberlite IRA-68, as substâncias anfóteras. Esta fracção contém as encastinas. Após desalinização por meio de um penei ro molecular, como por exemplo, ^Sephadex G-15, obtêm-se os componentes encastínicos individuais, por meio de HPLC preparativa, por exemplo em fase inversa RP-18,

É também possível, contudo, preparar as encas tinas por outro processo (sintético). A invenção refere-se por isso a um outro processo para a preparação dos compostos de fórmula I, caracterizado por

a) se condensar um aminoácido com um grupo amino N-terminal livre, com um aminoácido com um grupo carboxilo C-terminal livre, se remover, conforme o caso, um ou mais grupos protectores eventualmente temporariamente introduzidos para proteger grupos funcionais,

b) se condensar o dipaptido ou um aminoácido com um grupo ami no N-terminal livre, com um monossacarido com um grupo hidroxilo do centro anomérico livre, se remover, conforme o caso, um ou mais grupos protectores eventualmente temporariamente introduzidos para proteger grupos funcionais,

c) se transformar o N-glicósido assim obtido, conforme o caso, por meio da transposição de Amadori, nas iso-açúcar-aminas N-substituidas, e se transformar a encastina assim obtida, conforme o caso, num dos seus sais fisiològicamente assimiláveis ou num dos seus derivados, sendo também possível trocar a sequência destas reacções e — caso em b) se utilize um aminoácido — prescindir da reacção a).

No entanto, são também apropriadas as reacções, em si conhecidas, para a formação da ligação peptídica-NHdos açúcares.

A escolha dos grupos protectores e da estraté gia de síntese depende do tipo e da configuração dos aminoáci dos bem como das condições de acoplamento.

A condensação dos aminoácidos aos dipeptidos, segundo os processos de acordo com a invenção, efectua-se de acordo com os métodos gerais da química dos peptidos, de preferência segundo o método dos anidridos mistos, o método do éster activado, da azida ou da carbodiimida, em particular sob adição de substâncias aceleradoras da reacção e inibidoras da racemização, como por exemplo 1-hidroxibenzotriazole, N-hidro xisuccinimida, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazina, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida, ou utilizando ainda derivados activados do 1-hidroxibenzotriazole ou anidri dos dos ácidos fosfórico, fosfónico e fosfínico, a uma temperatura reaccional entre -10°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, de preferência entre -5 e 4o°C .

Solventes apropriados para tal fim são dimetilformamida, dimetilacetamida, hexametilfosfotriamida, N-metilpirrolidona ou sulfóxido dimetílico. Desde que a solubilidade dos componentes o permita, podem também utilizar-se solventes como cloreto de metileno ou clorofórmio. Os métodos re feridos encontram-se descritos por exemplo em Meienhof er-Gross: The Peptides, Academic Press, Vol I, (1979).

Para se condensar o grupo glicosilo com o ami noácido ou com o dipeptido, pode proteger-se primeiro, adequa damente, o grupo carboxilo ou outros grupos funcionais que não participam na reacção. Para tal fim, revelam-se particularmente convenientes os grupos protectores que se podem remover por hidrogenação catalítica, como por exemplo o éster benzílico (-OBzl) ou p-nitrobenzílico(-ONBzl)· Outros grupos protectores adequados são por exemplo os descritos por Hubbuch, Kontakte Merck 3 (1979), pág. 14 a 23 e por Bílllesbach, Kontakte Merck 1 (1980), pág. 23 a 25·

Por grupos protectores habituais na química dos hidratos de carbono entendem-se por exemplo os grupos pro tectores de acilo (C^-Ο^θ), como alcanoilo (C^-Cg) (por exemplo ac etilo, tricloroac etilo , trifluoroac etilo), benzoilo ou

p-nitrobenzoilo , bem como grupos metilo, metiloximetilo, benzilo, tetrahidropiranilo, benzilideno, isopropilideno ou tritilo, eventualmente modificados, preferindo-se em especial os grupoà protectores acilo, em particular o grupo acetilo (Ac).

Na síntese das encastinas procede-se à ligação de dois reagentes polifuncionais (hidrato de carbonoeami noácido ou dipeptido). Ambos devem poder ser bloqueados e des bloqueados selectivamente. No componente glicosílico o centro anomérico deve ser possível de libertar e funcionalizar e no componente aminoácido o grupo amino só deve ser desbloqueado para a necessária reacção de ligação. Conforme o tipo da liga ção glicosídica desejada (glicósido 1,2-cis ou 1,2-trans) 4 necessário introduzir grupos protectores para bloquear os gru pos hidroxilo ou amino no componente glicosílico e, conforme o caso, conseguir condições reaccionais para o passo de acoplamento que conduzam estereoselectivamente a apenas um dos dois anómeros possíveis.

A síntese de N-(l-desoxifrutoso-l-il)-L-aminoácidos foi já várias vezes descrita (vide por exemplo B. H. RÕper et al. Carbohydrate Research, 116 (1983), 183-195). Para tal dissolvem-se os reagentes não substituídos em água ou em água-metanol e aquecem-se com diversos tampões ou aditivos como por exemplo pirosulfito de sódio. Os rendimentos, confor me o tipo dos reagentes de partida, atingem em média os 20%.

Descobriu-se então surpreendentemente que a reacção de açúcares com aminoácidos ou peptidos com grupos amino livres para se obterem os produtos de Amadori desejados, na presença, isto é, sob catálise de compostos azotados alifá ticos ou aromáticos, secundários ou terciários, como por exem pio piridina, dimetilaminopiridina, dialquilaminas (C^-Cg) e trialquilaminas (C^-Cg) , aril (C^-C₁₂)alquil(C^-Οθ) aminas, tampão de Tris, dimetilformamida ou imidazole, se pode efectuar com excelentes rendimentos, isto é, muitas vezes superio res a 90%· Como solventes utilizam-se piridina, água, metanol

aquoso, metanol, etanol, sulfóxido dimetílico (DMSo) ou outros bem como as suas misturas, de preferência contudo piridina ani. dra ou esta em misturas com metanol anidro, DMSO e outros sol ventes. A temperatura reaccional pode variar numa larga gama. São possíveis temperaturas entre 0 e 25O°C . Trabalha-se contu do de preferência entre a temperatura ambiente e 120°C. 0 tem po de reacção varia, em dependèhcia da temperatura, desde alguns segundos até alguns dias. Uma experiência reaccional tí pica efectua-se a 65°C e dura 2 horas. 0 decurso da reacção manifesta-se pela coloração amarela dourada dos reagentes ini cialmente incolores. A continuação da reacção leva a uma cor castanha cada vez mais escura da mistura reaccional, que pros segue com redução do rendimento (reacção de Mailland).

Como reagentes podem utilizar-se açúcares não protegidos ou parcialmente derivatizados com grupos aldeído ou ceto não substituídos, bem como aminoácidos e peptidos não protegidos ou derivatizados com grupos amino livres. Como açú cares referem-se todas as trioses, tetroses, pentoses, hexoses, heptoses, desoxiaçúcares, etc. conhecidas.

A transposição de Amadori (vide Weygand/Hilge tag, Organischchemische Experimentierkunst, J.A. Barth-Ed., Leipzig (1964), 980) efectua-se deixando o N-glicósido em repouso durante 10 minutos a 10 dias — de preferência de 0,5 a 3 dias — a uma temperatura de 0^o a 200°C — em especial a 40 a 70°C — , seguido por remoção da agua — conforme o caso por destilação azeotrópica — novo repouso e secagem final da isoaçúcaramina N-substituída.

Os inibidores de encefalinase de acordo com a invenção são de grande interesse, em particular para o tratamento de estados dolorosos como por exemplo dores de dentes, dores relacionadas colicólicas, dores provocadas pelo calor e por ácidos, dores de stress, bem como dores nas dases finais do cancro. Além disso, referem-se também os inibidores de encefalinase de fórmula I para o tratamento de estados de ten- 13 emocional.

à dor e os estados de ansiedade conduzem a uma rápida produção endógena de encefalina que, por meio de um efeito de troca com os chamados receptores de Opiat suprimem o efeito destes estímulos. Aliás, as encefalinas, de acordo com o seu papel como neurotransmissores, são rapidamente degradadas a peptidos inactivos, através de peptidases específicas da encefa lina, mas em particular através do enzima encefalinase /EC 3.4.24.117. Uma inibição desta degradação, através dos inibidores de encefalinase de fórmula I, tem assim como consequência que as encefalinas endógenas produzidas podem manifestar o seu efeito sobre os receptores de Opiat e com isso o seu efeito supressor de dor ou de ansiedade, durante um maior período de tempo.

As propriedades especiais dos compostos que estão na base desta invenção podem ainda caracterizar-se por não só inibirem a degradação de encefalinas pela encefalinase mas também por possuírem um efeito analgésico próprio. Parece assim possível que os inibidores de encefalinase caracterizados pela fórmula I tenham também um efeito directo sobre os receptores de Opiat.

Teste da encefalinase

As propriedades inibidoras da encefalinase das encastinas determinaram-se por meio de métodos conhecidos da literatura, como os descritos por exemplo por Roques, B.P. et al. /Life Sciences (1982), 1749-1752/. Como enzima utilizou-se uma preparação de encefalinase solubilizada, de rim de rato, de acordo com métodos conhecidos /Mumford, R.A. et al. 1982, Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, 1303-1309/. A inibi ção de 50% da encefalinase pelos compostos de acordo com a in venção, isto é o valor 50, calculou-se pelo processo conhecido, por meio de uma série de concentrações, em que os inibi

dores, que constituem o bjectivo da invenção» se prá-incubaram durante 60 minutos com o enzima A temperatura ambiente, antes de se inloiar a reacção ensimátioa por adição do substraoto, Utilizaram-se controles adequados para a reacção não inibida na austecia de um inibidor.

Inibição da encefalinase

	^IC50 /mol/17
1· N-(1-desoxifrutoso-l-il)-D-Vai-Asp	1.3.1O-⁹
2. N-(l-desoxifrutoso-l-il)-D-Ile-Asp	1.8.1O⁹
3· N- (1 -deso xif ruto so-1 -i 1) -11 e-Asp	1,8-10*9
4. N-(l-desoxi fruto so-l-il)-Vai-Asp	6,3.1 ’“⁹
5. N-(1-deso xif ruto so-l-il)-Phe-Olu	5,6.1Γ⁸
6» N- (1-deso xifrutoso-l-il)-Val-Grlu	3,4.1o*⁸
7· N-(1-desoxifrutoso-l-il)-TIe-Asp	3,4.1o⁸
8. N-(1-desoxifrutoso-l-i1)-Ile-Jlu	5,6.1o’⁸
9. N-(1-deso xifrutoso-l-il )-Ile-A«p( OtBu)	7,O.1O*⁸
10. N-(1-deso xifrutoso-l-il)-Hhp-Asp	7,5.1O⁸
11. N-(1-desoxifrutoso-l-il)-£le-Ser	2,1.10*7
12. N-(1-desoxifrutoso-l-il)-D-Val	2,3.1 >⁷
13· N-(1-desoxitagatos-1-i1)-Val-Asp	3,2.10’7
14. N-(1-desoxi frutoso-l-i1)-D-Ile	3,4.10’7

As encastinas podem administrar-se isoladamen te ou em oombinação, por via parenteral (i.v,. A.C., i.m.) ou oral, num msio fisiolAgicamente assimilável. A dose a adminis trar oscila em geral entre 0,1 e 10 mg/Kg.

Preparação fermentativa das enoastinas (200) 1)

Para a obtenção fermentativa dos inibldores de snoefalinase de acord > com a invenção, efectuou-se o crescimento do micro organismo streptomyces albus ATCC 21838 a pro duzir, como 6 habitual em microbiologia, a partir de uma forma oongelada desta estirpe. Efectuou-se primeiro o crescimen

- 15 to sobre um meio nutriente sólido em caixas de Petri esterili sadas. Cultivaram-se em seguida as colónias isoladas em tubos inclinados e a partir destas efectuou-se a produção em massa de esporos, necessários para a fermentação, em balões de Roux.

Meio de agar para as experiências sobre nutrientes sólidos:

Dextrina	15,3	g/1
Açúcar de cana	2,0	g/1
Extracto de carne	1,0	g/1
Extracto de levedura	2,0	g/1
Cloreto de sódio	0,5	g/1
k₂hpo₄	0,5	g/1
FeSO₄*7H₂O	0,01	g/1
Agar-agar	2,0	g/1

Valor de pH 7,3

Esterilização a 120°C, 20 minutos

Incubação a 3θ°C , 9 dias

Tomou-se a camada sobrenadante de esporos de

um balão de Roux em 100 ml de água esterilisada e utilizou-se
como inoculante para tação vegetativa sub	a preparação do mersa (volume de	primeiro passo de fermen trabalho 1,2 1).
Meio para o primeiro	passo de	f ermentação:
Amido solúvel		4,0	g/1
Glucose		1,0	g/1
Peptona da caseína		1,0	g/1
Infusão de cereais,	líquida	0,4	g/1
Farinha de soja		0,0	g/1
(nh₄)₂s_O1(		0,8	g/1
Valor de pH		8,3
Esterilisação a		120°C ,	2θ minutos
Incubação a		18° C ,	2 dias
		Aparelho de agitação com 150
		UpM e	5 cm de amplitude

Após 48 horas utilizou-se o conteúdo de um ba Ião de Fembach com a primeira pré-cultura assim obtida (s.o.) como inoculante para a segunda pré-cultura de 200 1, tendo-se utilizado também para este fim o meio de pré-cultura (s.o.). 0 tempo de esterilização foi de 30 minutos. A incubação efectuou-se durante 48 horas a 28°C, sob agitação com uma velocidade linear de 5 m/segundo e uma razão de arejamento de 0,1 vvm.

conteúdo da segunda pré-cultura serviu como inoculante para os 2000 1 do meio de fermentação principal.

^Meio de fermentação	principal
Farinha de amendoim		30,0	g/1
Infusão de cereais,	sólida	10,0	g/1
Amido de milho		20,0	g/1
bext rina		4o,o	g/1
(nh₄)₂so₄		5,0	g/1
MgSO₄-7H₂O		5,0	g/1
CaC0₃		8,0	g/1
Valo r d e pH		6,8
Esterilização a		120°C ,	50 minuto s

A fermentação principal efectuou-se a 28°C sob agitação com uma velocidade linear de 4 m/segundo e uma razão de arejamento de 0,6 vvm. A formação dos inibidores de acordo com a invenção iniciou-se após 4 dias e atingiu o seu máximo após 10 a 20 dias. Após se atingir o máximo da fermentação *

procedeu-se a colheita do fermentador. 0 rendimento em comple

A xo de encastinas de fórmula I foi de 5 a 10 pg/1 de solução de cultura.

Exemplo 2

Isolamento das encastinas a partir da solução de cultura

Removeu-se a massa delular de 2000 1 da solu- 17 -

ção de fermentação de acordo com o exemplo 1 por meio de um filtro prensa e extraiu-se o líquido límpido duas vezes com 600 1 de n-butanol de cada vez. Em seguida, concentraram-se as fases aquosas desengorduradas em vácuo num evaporador, ate ao volume de 15θ 1 e diluiu-se este concentrado com 600 1 de metanol. Obteve-se assim um precipitado claro floculento que se separou e rejeitou. A camada aquosa-metanolica concentrou-se de novo em vácuo e secou-se obtendo-se 18 kg de uma massa castanha viscosa. Em seguida adsorveu-se em meio aquoso em 70 1 de permutador cationico ^owex 50 WX 2 (forma ácida), lavou -se o permutador carregado com água pura e desorveram-se os inibidores com uma solução 0,5 M de hidróxido de amónio. Reuniram-se os eluidos inibidores de encefalinase e liofilizaram -se (3,5 kg). A partir d estes, de acordo com um método análogo, separaram-se os compostos anfoteros em 70 1 de um permuta dor anionico ®Amberlite IRA-68. A eluição das encastinas efectuou-se neste caso com ácido acético 0,5 Μ. A liofilização dos eluidos de acção inibitória deu origem a 320 g de produto seco. Por cromatografia de gel em ^Sephadex G-15 bem como por liofilização do material activo obtiveram-se 30 g de complexo bruto de encastinas.

Exemplo 3

Separação das encastinas componentes

Dissolveram-se 150 mg do material obtido de acordo com o exemplo 2 em 1 ml de água e colocaram-se numa co luna de aço (com as dimensões interiores 3»2 x 25 cm2), cheia com sílica gel RP-18 de fase inversa. Efectuou-se a eluição primeiro com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,05%, e em segui da, após 40 minutos de eluição, com um gradiente linear de acetonitrilo em TFA a 0,05%. 0 fluxo de saída da coluna controlou-se pela determinação da absorção no ultravioleta a 200 nm. Durante o decurso da eluição eluiram-se numerosas substân cias isoladas a partir da coluna que se recolheram separadamen te. Estas fracções liofilizaram-se e testaram-se. Os picos 2, 3, 5, 7» 8> 11» 13» 16, 18 e 21 apresentaram um efeito ini

bidor em relação à encefalinase.

pico 3 (tempo de retenção 5 minutos e 8 segundos) continha a encastina AD. A análise de aminoácidos revelou quantidades equimolares de alanina e de ácido asparagínico. 0 peso molecular, calculado a partir do espectro de mas sa FAB, foi de 366, correspondendo à fórmula molecular θ·^HggNgOio* P°^r meio de experiências de ²D-NMR identificou-se a estrutura acima mencionada.

pico 4 (tempo de gundos) continha pequenas quantidades da encastina VD peso molecular 394 correspondendo à fórmula molecular C ^N2°10* & 1 mostra o espectro de ^H-NMR de 270 MHz encastina VD.

retenção 5 minutos e 21 se com o

15^H26 da pico 7 (tempo de retenção 7 minutos e 20 se gundos) continha a encastina AE, de peso molecular 3θ0 e fórmula molecular θχί/^ί/^θΙΟ* pico 11 (tempo de retenção 8 minutos e 10 segundos) continha a encastina VE, de peso molecular 408, fór mula molecular θχ6^Η28^2θ10’ com os aminoácidos como o pico 13 (tempo de retenção 18 minutos e 40 segundos) que continha a encastina ID, de peso molecular 4o8, fórmula molecular ^cq^^H28^N2°10’ ^{com e As}P ^como aminoácidos.

Vai e Glu, bem pico 16 (tempo de retenção 22 minutos) continha a encastina IE, de peso molecular 422, fórmula molecular C,

1/ 30 2 10

Exemplo 4

Síntese do ácido N-(1-desoxif rutopiranoso-l-il)-isoleucilasparagínico

Dissolveram-se 3θ g de D-glucose anidra con- 19 >

juntamente com 3 g de ácido isoleucilasparagínico em 1,2 1 de metanol e adicionaram-se 200 mg de NaHCOg. Em seguida aqueceu -se durante 2 horas sob refluxo. Destilou-se depois a água formada com butanol e aqueceu-se durante mais 2 horas a mistu ra reaccional diluída em metanol. A solução reaccional pronta evaporou-se em vácuo para remover o solvente e, diluída em 300 ml de água, colocou-se numa coluna de separação de 600 ml de volume (diâmetro 5 cm) cheia com QAE- ^Sephadex A-25. No decurso da eluição, enquanto a glucose se encontrava em exces so, pode obter-se selectivamente o ácido N-(1-desoxifrutopira noso-l-il)-isoleucilasparagínico, com um gradiente de ácido acético (0 a 0,5 molar). Recolheram-se e liofilizaram-se as fracçôes eluídas da coluna.

Rendimentos 720 mg de um pó branco amorfo.

Espectro de ¹H-NMR /ppm?s 4,43; 2,69; 2,48;

3,84; 1,93; l»50; 1,26; 0,93 e 0,89» resultante da parte peptí dica da molécula; 3»93; 3,91; 3» 79» 3,66; 3.65; 3»17» bem como 3,14 da parte glicosílica do inibidor correspondendo aos sinais do composto natural da encastina ID

37»13»

96,555

Espectro de ^^C-NMR /ppm7: 54,63; 40,49; 66,79;

26,12; 14,61 e 11,75 (parte peptídica) bem como a

70,91; 70,40; 69,96; 64,87 e 53,43 (parte glicosílica).

espectro de absorção no infravermelho apresenta bandas a 3400, 2920, 286o, 1595, 1400 e 1080 cm \

Exemplo 5

Síntese do ácido N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-fenilalanilasparagínido

Fez-se uma papa com 200 mg de ácido fenilalanilasparagínico e 1,5 g de D-glucose em 100 ml de metanol, adi cionaram-se 20 mg de NaHCOg e aqueceu-se durante 2 horas à ebulição. Tratou-se em seguida a mistura reaccional como descrito no exemplo 4 e purificou-se numa coluna de QAE-®^epha dex A25 (1,8 cm x 23 cm, 6o ml) e dessalinizou-se em seguida. Obtiveram-se 26 mg de ácido N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-fe nilalanilasparagínico.

Espectro de ^H-NMR de 270 MHz (D^O) da encastina FDí 3,03; 2,96; 3,65; 3,81; 3,94; 3,99; 3,67; 3,84; 3,17; 3,08; 7,36; 4,43; 2,71; 2,51 ppm.

Exemplo 6

Síntese d a N-(l-desoxifrutopiranoso-l-il)-isoleucilserina

Fizeram-se reagir 200 mg de isoleucilserina com 1,5 g de D-glucose como descrito no exemplo 5 e purificou -se o produto da reacção. Obtiveram-se 12 mg de N-(l-desoxifrutopiranoso-l-il)-Ile-Ser-OH. Confirmou-se a estrutura por meio de testes químicos e espectroscopicos.

Espectro de ^H-NMR de 27'JMHz (D^O) da ^encasti na IS; 3,38; 3,34; 3,85; 3,98; 4,15; 4,09; 3,82; 4,45; 4,00; 3,95; 3,97; 2,15; 1,08; 1,79; 1,43; 1,06 ppm.

Exemplo 7

Síntese da N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)~isoleucilasparagina

Fizeram-se reagir 300 mg de isoleucilasparagi na com 1,5 g de D-glucose como descrito no exemplo 5 e purifi cou-se o produto da reacção. Obtiveram-se 90 mg de N-(1-desoxif rutopiranoso-l-il)-II e-Asn.

espectro de ^H-NMR de 270 MHz (DgO) apresen tou os seguintes sinais característicos da encastina IN;3,05; 4,07; 3,95; 3,79; 4,08; e 3,78 ppm, bem como 3,60; 1,89; 1,53; 1,28; 0,97 e 0,93 ppm e ainda 4,54; 2,84 e 2,69 ppm.

Síntese doácido N-(l-desoxitagatopiranoso-l-il)-valilasparagínico

Fizeram-se reagir 150 mg de ácido valilaspara gínico com 1 g de galatose como descrito no exemplo 5 e purificou-se o produto. Obtiveram-se 22 mg de ácido N-(l-desoxitogatopirano so-1-il)-valilasparagínico.

O espectro de ^H-NMR de 270 MHz medido em D^O apresenta os seguintes sinais;

3,16; 3,17» 4,02; 3,91! 2,68; 3,66 e 3,86 ppm, bem como 2,63; 2,22; 1,09; e 1,05 ppm e ainda 4,56; 2,81 e 2,60 ppm.

Exemplo 9

Síntese da N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-valina

Dissolveram-se 10 g de D-valina e 75 g de D-glucose anidra numa mistura de 500 ml de metanol seco, 100 ml de sulfóxido dimetílico e ainda 150 ml de piridina e aqueceu-se sob refluxo durante 2,5 horas. Após este tempo concentrou-se a solução reaccional cor de mel em vácuo num evaporador rotativo para remover o metanol e a água formada durante a reacção. 0 concentrado, contendo ainda piridina, deixou-se em repouso durante a noite à temperatura ambiente, sob protec ção contra a humidade, de modo a completar-se a reacção.

Rara a purificação do produto dissolveu-se a mistura reaccional em água, ajustou-se o valor de pH a 9 com hidróxido de sódio e colocou-se a solução numa coluna prepara da de ^IjAE-Sepharose FF (5 cm x 5θ cm), equilibrada a pH 9· Eluiu-se então o permutador iónico primeiro com uma solução de acetato de amónio a 0,1%, pH 9 e em seguida com um gradien te de ácido acético 0,2 molar. Recolheram-se as fracções eluí das e analizaram-se isoladamente. As fracções com um pH de 5,3 a 5,5 continham o novo inibidor sintetisado puro. Recolhe ram-se estas fracções e secaram-se. Por dessalinizaçao com a • ajuda do peneiro molecular ^Sephadex G-15 obteve-se o produto

isento de sal. Após recristalização de água-metanol obtiveram -se 7 g de N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-valina.

Ponto de fusão: 125-12ó°C.

Exemplo 10

Síntese da N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-isoleucina

Misturaram-se 100 mg de D-isoleucina seca e 300 mg de glucose anidra com uma mistura seca de 4o ml de metanol e 10 ml de piridina, efectuou-se a reacção como descri) to no exemplo 9 e purificou-se o produto, tendo-se utilizado, contudo, colunas de separação com menores volumes.

A recristalização do produto final originou 110 mg de N-(l-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-isoleucina. Ponto de fusão: 142-144°C.

Exemplo 11

Síntese do ácido N-(l-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-valilasparagínico

Misturaram-se 10 g de ácido D-valilasparagíni I co e 50 g de D-glucose anidra com 300 ml de piridina e 3 litros de metanol e aqueceu-se à ebulição, sob agitação, durante 2,5 horas. Durante este tempo os reagentes dissolveram-se a pouco e pouco e a mistura reaccional tomou uma coloração amarelo dourado. Após terminada a reacção concentrou-se a mis tura em vácuo e continuou-se o tratamento como descrito no exemplo 9. Após liofilização obtiveram-se 13,5 g de ácido N-(1-desoxifrutopiranoso-1-il)-D-valilasparagínico amorfo.

A fig. 2 mostra o espectro de de 27θ

MHz (bgO) da encastina (D)VD.

Exemplo 12 ' Síntese do ácido N-(l-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-isoleucil- 23 4 ι

asparagínico

Fez-se reagir 1 g de ácido D-isoleucilasparagínico com 5 g de D-glucose em 100 ml de metanol e 10 ml de piridina como descrito no exemplo 10 e purificou-se o produto. Após liofilização obtiveram-se 790 mg de um material puro amor f o.

espectro de ^-NMR de 270 MHz (^D ₂°) ^{da en} castina D(lD) apresenta-se na figura 3.

Síntese do éster mono ter-butílico do ácido N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-isoleucilasparagínico

Fizeram-se reagir 7 S ^de éster mono-ter-butílico do ácido isoleucilasparagínico como descrito no exemplo 11 e purificou-se o produto. Obtiveram-se 5»8 g de um produto de liofilização amorfo do éster mono-ter-butílico do ácido N-(1-deso xifrutopirano so-l-il)-isoleucilasparagínico.

espectro de infravermelho da encastina ID-OtBu apresenta-se na figura 4.

Exemplo 14

Síntese do ácido N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-Hexahidrofenilglicilasparagínico

Fiz eram-se reagir 300 mg de ácido D-hexahidro fenilglicilasparagínico (D-Hhp-Asp) com 1,5 g de D-glucose co mo descrito no exemplo 10. Obtiveram-se 260 mg de N-(l-desoxi frutopiranoso-l-il)-D-Hhp-Asp.

A figura 5 apresenta o espectro de infraverme lho.

índice das figuras:

Figura 1: espectro de ¹H-NMR da encastina VD (Fru-Val-Asp) do

exemplo 3;

ι

Figura 2: espectro de H-NMR da encastina (d)VD (Fru-D-Val-Asp) do exemplo 11;

Figura 3: espectro de ^H-NMR da encastina (D)lD (Fru-D-Ile-Asp) do exemplo 12;

Figura 4: espectro de IV da encastina ID- )tBu (Fru-Ile-Asp-OtBu) do exemplo 13í

Figura 5$ espectro de IV da (Fru-D-Hhp-Asp) do exemplo 14.

Os espectros de ^H-NMR foram traçados em D^O a 270 MHz.

Os espectros de IV (infravermelho) são espectros de absorção FTIR (transformada de Fourier-infravermelho), traçados com pastilhas de KBr.

Claims

- 1» Processo para a preparação de um composto de fórmula I,

Sacch - A - B - R (l) na qual

Sacch 4 um grupo monossacarido em que, conforme o caso,os gru pos OH estão parcial ou totalmente substituídos,

A é um grupo de aminoácido L ou D neutro, ou — caso B exis ta — o grupo de um aminoácido D neutro,

B não existe ou é o grupo de um aminoácido L ou D neutro ou de um aminoácido L ou D ácido ou básico bifuncional, conforme o caso, (jU-substituí do e

R e hidroxilo, alcooxilo (C^-Cg), um grupo amino, que es25 tá substituido, conforme o caso, por um ou dois grupos iguais ou diferentes de entre alquilo(c^-Οθ), cicloalquilo(C^-Cg), heteroalquilo (C^-Cg) ou heteroarilo (C^-Cg), ^{ou um} outro derivado de ácido, ou dos respectivos sais fisiològicamente assimiláveis, com a condição de se exceptuarem os compostos N-(l-desoxi-/%-D-f ruto piranoso-l-il)-Gly-Gly-OH e N-(1-d esoxi-/$-D-f rutopiranoso-1-il)-Gly-Ser-OH, caracterizado por

A) a) se cultivarem Streptomyces albus (áTCC 21838), bem como as suas variantes e mutantes, num meio nutriente, até se acumular na cultura o composto de formula I, em que Sacch. é um grupo N-(1-desoxif rutopiranoso-l-ilo ), A é Ala, Leu, Vai ou Ile, B é Asp ou Glu e R é hidroxilo e, conforme o caso,

b) se isolar este composto, se purificar e derivatizar, ou

B) a) se condensar um aminoácido com um grupo amino N-terminal livre com um aminoácido com um grupo carboxilo C-terminal livre, se remover um ou mais grupos protectores, con forme o caso, introduzidos temporariamente para proteger grupos funcionais.

b) se condensar o dipeptido ou um aminoácido com um grupo amino N-terminal livre com um monossacarido com um grupo hidroxilo livre do centro anomérico, se remover um ou mais grupos protectores, conforme o caso, temporariamente introduzidos para proteger grupos funcionais,

c) se transformar o N-glicásido assim obtido, conforme o ca so, através da transposição de Amadori, nas iso-açucaraminas N-substituídas, e se transformar a encastina assim obtida, conforme o caso, num seu sal fisiològicamente assimilável ou num seu derivado, sendo também possível alterar a ordem destas reacções e — caso em b) se utilize um aminoácido — prescindir-se a).

- 28 26 -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um composto de fórmula I, na qual Sacch significa o grupo de uma aldohexose ou cetohexose ou os respectivos derivados,

A significa Ile, Phe, Leu, Vai, Thr, Ser, Gly, Cys, Ala ou hexahidrofenilglicina (Hhp), quer na forma L quer na forma D, ou — caso B não exista — os grupos acima mencionados se encontram sempre na forma D,

B não existe uu significa Asp, Asx, Glu, Glx, Ser, Thr ou

Gly, quer na forma L quer na forma D, e ou os respectivos sais fisiológicamente assimiláveis, exceptuando-se os compostos N- (1-desoxi-X^-D-f rutopiranoso-l~ -il)-Gly-Gly-OH e N- (l-desoxi-,^-D-f rutopiranoso-l-il)-Gly-Ser -OH.

significa

Processo de acordo com uma ou ambas as reivin dicações 1 e 2, caracterizado por se preparar um composto de formula I, na qual

Sacch significa fruto silo ou os seus derivados,

A significa Ile, Phe, Leu, Vai, Cys, Ala ou Hhp, quer na forma L quer na forma D, ou — caso B não exista -os grupos anteriores se encontram sempre na forma D,

B não existe ou significa Asp, Asx, Glu ou Ser, quer na forma L quer na forma D, e

R significa hidroxilo, ou os respectivos sais fisiológicamente assimiláveis,

- M -

Processo de acordo com uma ou mais das reivin dicações 1 a 3» caracterizado por se preparar um composto de fórmula I, na qual

Sacch significa fruto silo ou os seus derivados,

A significa Ile, Leu, Vai, Cys ou Hhp, sempre na forma D,

B significa Asp, Asx, (llu ou Ser, quer na forma L quer na forma D, e

R significa hidroxilo, bem como os respectivos sais fisiológicamente assimiláveis.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-(1-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-Val-Asp, bem como os respectivos sais fisiológicamente assimiláveis.

- 6* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-(l-desoxifrutopiranoso-l-il)-D-Ile-Asp, bem con» os respectivos sais fisiológicamente assimiláveis .

- 7» Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, contendo um composto de fórmula I quando preparado de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, cara cterizado por se incorporar um composto de fórmula geral I ou um dos seus sais fisiológicamente assimiláveis, com um veícu• lo fisiológicamente adequado e, conforme o caso, outros aditi . vos, adjuvantes e/ou conservantes apropriados, de modo a ob28 ter-se uma forma de administração adequada.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal Alemã em 25 de Abril de 1987 e em 20 de Novembro de 1987, sob os nú meros P 37 13 873·! e P 37 39 376.6, respectivamente.