JP3431575B2 - メナキノン−７の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，大麦又は／及び該
大麦の粉砕物を培地に用いてAspergillus属の糸状菌を
培養することにより麹菌培養物を得、該麹菌培養物を糖
化することにより得られる大麦麹糖化液を主たる構成成
分とする培地を使用して、Bacillus subtilisに属する
メナキノン-7生産菌を培養することにより、アンモニア
の生成を著しく抑制しつつ、メナキノン-7を高収率で製
造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＫは血液の正常な凝固能を維持
するのに不可欠な栄養素である。一般にビタミンＫと称
されるものには、合成されたものを含めてビタミンＫ1
〜ビタミンＫ7までが知られている。これらのうち、ビ
タミンK1（フィロキノン）及びビタミンK2（メナキノ
ン）は天然に存在するものである。ビタミンK1は主に植
物の葉緑体で合成されることから、緑黄色野菜に多く、
他に植物油、豆類、海藻類及び魚介類に比較的多く含ま
れている。一方、ビタミンＫ2は一般細菌や腸内細菌が
生産するもので、納豆等の発酵食品、あおのり、鶏卵、
肉類及び乳製品に比較的多く含まれる。ビタミンＫ2は
その側鎖構造の違いによってメナキノン−1〜メナキノ
ン−14に類別される。これらのうち特に納豆に多く含ま
れるビタミンK2は、主としてメナキノン−７（以下、
“MK−7"と略称する）から成るものであり、当該MK−7
は納豆菌によって生産されることが知られている。MK−
7は血液凝固能の維持に関わるだけでなく、骨芽細胞に
よる骨形成を促進すると同時にカルシウムの骨からの溶
出を抑制し、骨のカルシウム量の減少を抑制する作用を
有することが知られている。こうしたことからMK−7は
骨粗鬆症の治療薬として既に利用されており、その需要
は益々高まっている。

【０００３】ところで、MK−7の工業的製造について
は、以下に述べるように、（１）蒸煮大豆、大豆煮汁ま
たは豆腐粕等の大豆由来の材料を培地として使用する
か、或いは（２）大豆煮汁または醤油火入れオリ等の大
豆由来の材料に特定の物質を混合して培地として使用
し、納豆菌を培養することによりMK−7を製造する方法
が提案されている。

【０００４】前記（１）の方法については、特開平8-99
16号公報、特開平8-19378号公報、特開平8−73396号公
報方法、及び特開平11−196820号公報に記載されてい
る。即ち、特開平8−9916号公報には、蒸煮大豆に納豆
菌を植菌し、42乃至50℃で24乃至48時間培養して納豆を
得ることによりMK−7を製造する方法が記載されてい
る。特開平8-19378号公報には、納豆製造時に副生する
大豆煮汁をpH7に調整して滅菌し、これに納豆菌を接種
し、培養温度48℃、攪拌数120rpmで4日間振とう培養す
ることによりMK−7を製造する方法が記載されている。
また当該公報には、豆腐製造時に副生された豆腐粕を滅
菌し、これに納豆菌を接種し、培養温度48℃で、5日間
静置培養することによりMK−7を製造する方法が記載さ
れている。特開平8−73396号公報には、納豆製造時に副
生する大豆煮汁に納豆菌を接種し培養することによりMK
−7を製造する方法が記載されている。特開平11−19682
0号公報には、豆腐の製造過程で発生した豆腐粕（オカ
ラ）を滅菌し、これに納豆菌Bacillussp TT-52を接種
し、ステンレス製金網上に厚さ約1cmの層として載置
し、37℃で48時間発酵させ、その後25℃で17時間発酵さ
せて培養することによりMK−7を製造する方法が記載さ
れている。

【０００５】前記（２）の方法については、特開平10-2
95393号公報及び特開平11−32787号公報に記載されてい
る。即ち、特開平10-295393号公報には、ブリックス濃
度を5乃至10%に調整した大豆煮汁に3〜10重量%のグリセ
ロールを添加して滅菌し、これに納豆菌を接種し、培養
温度40℃、通気量0.5L/min、攪拌速度500rpmで4日間培
養することによりMK−7を製造する方法が記載されてい
る。特開平11−32787号公報には、醤油火入れオリ7%(W/
V)、グルコース5%(W/V)、K₂HPO₄ 0.25%(W/V)、MgSO₄・7
H₂O 0.05%(W/V)、NaCl 2%(W/V)からなる組成の培地をpH
8.0に調整して滅菌し、これにBacillus subtilisに属す
るMK-7生産菌を接種して、ジャーファーメンターにて、
培養温度40℃、攪拌数400rpm、通気量1vvmの条件で、培
養液のpH値を2ＮのNaOHで7.0に保ちながら、48時間培養
することによりMK−7を製造する方法が記載されてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
た従来のMK−7の製造方法は、いずれの場合において
も、得られる培養液中のMK−7濃度が十分に高いとは言
えない。即ち、通常の市販納豆に含まれるMK−7含量は
約10〜20ppmである。これに対して、上述した公報に記
載の方法では、いずれの場合においても、得られる培養
物中のMK−7含量は、当該市販納豆中のMK−7含量と大差
ないものである。即ち、特開平8−9916号公報に記載の
方法では納豆中のMK−7濃度は5.8mg/100g（即ち、58mg/
kg）であり、特開平8−73396号公報に記載の方法では、
培養生産物中のMK−7濃度は17.2mg/kgであり、特開平11
−32787号公報に記載の方法では、培養生産物中のMK−7
濃度は29.8mg/kgである。また、特開平10−295393号公
報に記載の方法では、培養生産物中のMK−7濃度は40.6m
g/Lであり、特開平11−196820号公報に記載の方法で
は、培養生産物中のMK−7濃度は、豆腐粕（オカラ）発
酵物1g当たり29636ng（即ち、29.6mg/kg）である。特開
平8-19378号公報に記載には、培養生産物中のMK−7の濃
度は11.7mg/100mL（即ち117mg/L）である旨記載されて
いるが、この値は途方もなく高い濃度であり、当該公報
に記載された内容の方法で達成できるものとは到底考え
られない。因みに、本発明者らが当該公報に記載の方法
に従って、後述する比較例３に記載の追試を行った結
果、得られた培養液中のMK-7濃度は10.3mg/Lであった。
このことから、当該公報に記載の方法ではそこに記載の
MK-7濃度117mg/Lを達成できないことが判明した。従っ
て、上述した従来のMK-7の製造方法は、いずれの場合に
おいても得られる培養液中のMK-7濃度が低く、工業的製
造方法として十分なものとは言えない。こうしたことか
ら、MK-7の高収率での生産を可能にするMK-7の製造方法
の早期提案が切望されている。

【０００７】ところで、上述した特開平8−9916号公報
には、納豆菌を培養することによりMK−7を製造する場
合、MK−7濃度の上昇に伴って培地中のアンモニア濃度
が高まる旨記載されている。こうしたことから、従来の
MK−7製造方法に従って納豆菌の培養を行った場合に
は、上述したようにMK−7の生成量が低いにも拘わら
ず、アンモニアの生成量が高い、即ち、得られる培養液
については、含有するMK−7の濃度は、上述したよう
に、低いにも拘わらず、含有するアンモニアの濃度は高
い、と云う問題がある。従って、 培養中のアンモニア
の生成を抑制しつつ、MK−7の高収率での生産を可能に
するMK−7の製造方法についても早期提供が切望されて
いる。本発明は，上述した課題に鑑みて、本発明者らが
鋭意研究の結果完成に至ったものである。本発明の主た
る目的は，従来のMK−7の製造方法における上述の問題
点を解決し、アンモニアの生成を著しく抑制し、MK−7
の効率的且つ高収率での生産を可能にする方法を提供す
ることにある。本発明の方法により製造されるMK−7含
有物質は、MK−7濃度の十分高いものであり、しかもア
ンモニア濃度が著しく低いため、そのまま食品として或
いはビタミン剤として使用することができる。本発明の
方法により製造される該MK−7含有物質は、公知の精製
方法により精製して、高純度のMK−7含有物質とするこ
とができる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明を完成するに当た
り、本発明者らは、まず初めに、多くの場合に廃棄に付
される大麦焼酎蒸留残液の使用が、従来のMK-7の製造方
法における上述した問題点の解決を図れるのではないか
との推測に立って、実験を介して鋭意研究を行った。即
ち、本発明者らは、大麦を使用する焼酎製造において副
生する焼酎蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフ
ェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分
を得、該液体分のみを培地に用いて、Bacillus subtili
sに属するMK−7生産菌である納豆菌の培養を行った。そ
の結果、前記液体分に、他の栄養成分を何ら添加するこ
となくして、従来から納豆菌の培養の際に一般的に用い
られてきた大豆煮汁、グリセロールを添加した大豆煮
汁、豆腐粕、蒸煮大豆、或いは醤油火入れオリを添加し
た合成培地などを培地に用いた場合と比較して、増殖菌
体の量が著しく増加するだけでなく、培養液中において
納豆菌が生産するMK−7の濃度も飛躍的に高まることが
判明した。

【０００９】そこで、本発明者らは、前記焼酎蒸留残液
と比較して、大麦や麹菌に由来する成分、及び炭素源と
してのグルコースを豊富に含有する大麦麹糖化液におい
ても同様の効果が得られるのではないかと考えて次の実
験を行った。即ち、Aspergillus属の糸状菌である焼酎
麹菌AspergillusKawachiiを精麦大麦に接種して培養す
ることにより大麦麹を得、該大麦麹を糖化することによ
り大麦麹糖化液を得、該大麦麹糖化液に含まれる酸を実
質的に中和処理して調製液を得、該調製液を滅菌処理す
ることにより得られた培地を使用して、Bacillus subti
lisに属するMK-7生産菌である納豆菌の培養を行った。
その結果、該大麦麹糖化液から得た該調整液に、他の栄
養成分を何ら添加することなくして、従来から納豆菌の
培養の際に一般的に用いられてきた大豆煮汁、グリセロ
ールを添加した大豆煮汁、豆腐粕、蒸煮大豆、或いは醤
油火入れオリを添加した合成培地などを培地に用いた場
合と比較して、増殖菌体の量が著しく増加するだけでな
く、培養液中において納豆菌が生産するMK−7の濃度も
飛躍的に高まることが判明した。更に驚くべきことに、
該培養液中のアンモニア濃度を調べたところ、該アンモ
ニア濃度は、従来から使用されてきた前記培地、或いは
前記焼酎蒸留残液から得た培地を用いて培養した培養液
中のアンモニア濃度よりも大幅に低くなっていた。

【００１０】図１は、本発明者らが、後述する実施例１
と同様にして、大麦麹糖化液から得た本発明の培地を使
用して納豆菌を培養し、また、後述する比較例１と同様
にして、従来のMK−7の製造方法において最も一般的に
使用する大豆煮汁を培地に使用して納豆菌を培養し、そ
れぞれの場合における培養時間との関係での納豆菌培養
液中のMK−7の生成状況（即ち、MK−7の濃度）及びアン
モニアの生成状況（即ち、アンモニアの濃度）を調べ、
得られた結果をグラフ化して示したものである。図１に
示した結果から次のことが判明した。即ち、従来のMK−
7の製造方法において最も一般的に使用する大豆煮汁を
培地に使用した場合には、MK−7の生成量（即ち、得ら
れる培養液中のMK−7濃度）が低いのに対して、アンモ
ニアの生成量（即ち、得られる培養液中のアンモニア濃
度）はMK−7の生成量よりは遥かに高く、MK−7の生成量
の２倍以上に達してしまう。一方、大麦麹糖化液から得
た本発明の培地を使用した場合は、MK−7の生成量（即
ち、得られる培養液中のMK−7濃度）は極めて高く、と
ころがアンモニアの生成量（即ち、得られる培養液中の
アンモニア濃度）は著しく低く図１に示すように極めて
僅かである。このことから、本発明の培地を使用した場
合、アンモニアの生成は、上述の大豆煮汁を使用した場
合におけるようにMK−7の生成を卓越することは全く無
く、MK−7の生成が極めて高いにも拘わらず、格段に低
く極めて僅かであることが理解される。即ち、本発明の
培地を使用する場合、アンモニアの生成が著しく抑制さ
れて、極めて高い収率でのMK−7の生産が達成できる。

【００１１】このように本発明の方法により製造される
MK−７含有物質（即ち、高濃度MK−７含有物質）は、ア
ンモニアを殆ど含まないか或は極めて僅かに含むもので
ある。従って、該MK−７含有物質は、そのまま食品或い
はビタミン剤として使用することができる。尚、該MK−
７含有物質が多少なりともアンモニアを含む場合、該MK
−７含有物質をアルカリ性に保持しながら曝気すること
により該MK−７含有物質に含まれる前記アンモニアを容
易に除去することができる。これによりアンモニアを全
く含まないMK−７含有物質を得ることができる。また本
発明の方法により製造される該MK−7含有物質は、公知
の精製方法によりアンモニアを除去するとともに精製し
て、アンモニアを全く含まない高純度のMK−7含有物質
とすることができる。

【００１２】本発明は、上述の判明した事実に基づいて
完成に至ったものである。以下に、本発明の好ましい態
様について述べるが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。本発明のMK-7の製造方法は、Aspergillus属
の糸状菌を大麦又は／及び該大麦の粉砕物に接種して培
養することにより麹菌培養物を得る第1の工程、該麹菌
培養物を糖化することにより糖化液を得る第2の工程、
該糖化液に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を
得る第3の工程、該調製液から成る培地を用いてBacillu
s subtilisに属するMK-7生産菌を培養する第4の工程か
らなるものである。以下に本発明のMK-7の製造方法を実
施する際に原料として用いる大麦及び大麦麹、及び各工
程について詳述する。

【００１３】本発明において言う麹菌培養物を得る際に
使用する糸状菌株は、焼酎製造で使用する白麹菌（Aspe
rgillus Kawachii）や泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspe
rgillus awamorii）などのAspergillus属の菌株を用い
ることができる。本発明において使用する大麦には、玄
麦、及び精麦大麦のいずれを用いても良く、該精麦大麦
はどのような精麦歩合であってもよい。本発明の麹菌培
養物とは、麹菌の液体培養により得られる液体培養液或
いは麹菌の固体培養により得られる固体培養物を意味す
る。従って、該麹菌培養物を得るための培養方法として
は、麹菌の液体培養或いは麹菌の固体培養のいずれを用
いても良い。また、前記麹菌培養物として大麦焼酎製造
の際に使用する大麦麹を用いることもできる。本発明に
おいて言う「糖化液」は、前記麹菌培養物に適量の水を
加えて55℃程度で一定時間保持することにより得られる
ものを意味する。

【００１４】このように本発明のMK-7の製造方法におい
て使用する麹菌培養物の糖化液から得られる培地は、大
麦、及び大麦麹に由来する成分を含有するものである。
即ち、本発明において使用する麹菌培養物の糖化液から
得られる培地は、従来のMK−7の製造に用いられる、大
豆煮汁、蒸煮大豆、豆腐粕、及び醤油火入れオリなどの
大豆に由来する材料の液体培地又は固体培地とは全く異
なるものである。この点具体的には、表1に示すよう
に、本発明において用いる麹菌培養物の糖化液から得ら
れる培地は、グルコースは勿論のこと、マルトース、コ
ハク酸、クエン酸、酢酸、及びグリセロールなどの納豆
菌の培養に好ましい栄養成分を含有する。よって本発明
のMK-7の製造方法において使用する培地は、従来のMK-7
製造方法において使用する培地から客観的に区別される
明らかに別異のものである。

【００１５】第2の工程で得られた前記糖化液に含まれ
る酸を実質的に中和処理して調製液を得る第3の工程に
おいては、適当な中和剤を用いて中和処理することがで
き、こうした中和剤としては，水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム等を使用することができる。

【００１６】第3の工程で得られる前記調製液を培地に
用いてBacillus subtilisに属するMK−7生産菌を培養す
る第4の工程においては、該MK−7生産菌としては、Baci
llussubtilisに属するMK−7生産能を有する菌株であれ
ばいずれの菌株であっても用いることができる。特に好
ましくは、Bacillus subtilisに属する代表的なMK−7生
産菌である納豆菌を用いることができる。該納豆菌の具
体例としては、市販納豆菌である成瀬菌、宮城野菌、及
び高橋菌等を挙げることができる。これらの他に、MK−
7生産能の高い納豆菌菌株を用いることができる。前記
培地を用いた該納豆菌の培養は、公知の液体培養法によ
り行うことができるが、好ましくは、ジャーファーメン
ターなどを用いた通気攪拌培養により、培養温度40℃〜
50℃の温度範囲で行うことが望ましい。この際、培養中
の培養液のpH値は水酸化ナトリウム等を用いて7.0程度
に保持するのが好ましい。

【００１７】本発明においては、前記第３の工程におい
て得られる納豆菌の培養液、即ちMK−7を含有する培養
液は、上述したようにアンモニアを殆ど含まないか或は
極めて僅かに含むものである。従って、該培養液（即
ち、MK−７含有物質）は、そのまま食品或いはビタミン
剤として使用することができる。尚、該培養液（即ち、
MK−７含有物質）が多少なりともアンモニアを含む場
合、該MK−７含有物質をアルカリ性に保持しながら曝気
することにより該培養液に含まれる前記アンモニアを容
易に除去することができる。これによりアンモニアを全
く含まないMK−７含有物質を得ることができる。また公
知の精製方法により、該培養液からアンモニアを除去す
るとともにMK−7を抽出してアンモニアを全く含まない
高純度のMK−7含有物質とすることができる。その場合
の精製方法としては、例えば特開平8-73396号公報に記
載されている、アルコールやエーテルなどの有機溶媒を
用いる溶媒抽出法、活性炭を用いた吸着分別法、分子蒸
留や水蒸気蒸留等の高真空蒸留を用いる蒸留法、合成吸
着剤などを用いたクロマトグラフィー法等を用いること
ができる。この他、特開平11-32787号公報に記載されて
いる、限外濾過膜や逆浸透膜を用いた分離濃縮法、及び
乾燥操作により脱水する方法を用いることができる。こ
の場合、有機溶媒の不存在下で脱水処理することによ
り、光に対する安定性の優れた高純度のMK−7含有物を
得ることができる。

【００１８】

【実施例】 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが，本発明はこれらの実施例によって何ら限定さ
れるものではない。

【００１９】

【実施例1】1．麹菌培養物（大麦麹）の取得 大麦（70%精白）1Kgに400mlの脱イオン水を完全に吸水
させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、1gの種麹（As
pergillus Kawachii）を接種し、38℃、ＲＨ95％で24時
間、32℃、ＲＨ92％で20時間保持することにより、大麦
麹を製造した。 2．調製液の取得 前記大麦麹に適量の脱イオン水を添加して、攪拌しなが
ら55℃で一晩保持して糖化液を得、該糖化液に水酸化ナ
トリウムを添加してそのpH値を7.0に調整して調製液を
得、得られた調製液にさらに脱イオン水を加えてブリッ
クス濃度を6に調製したものを滅菌処理して納豆菌培養
用の培地に使用した。 3．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、水酸化
ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、
15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉
エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管
に加えて攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前
培養液を得た。 4．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、上記2で得た培地1Lと上
記3で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、
攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を
行った。これにより、MK-7を含有する納豆菌培養液を得
た。なお、培養により生産するMK-7（ビタミンK）は光
により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメン
ターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２０】

【比較例1】本比較例においては、実施例1において使用
する大麦麹の糖化液から得た培地に代えて、納豆製造時
に副生する大豆煮汁廃液を使用する以外は、実施例1と
同様にしてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。 １．大豆煮汁廃液からの培地の調製 納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に水酸化ナトリウ
ムを加えてそのpH値を7.0に調整して調整液を得、得ら
れた調整液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。 ２．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た溶液に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 ３．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと前
記２で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vv
m、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培
養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液
を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により
分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの
周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２１】

【比較例2】本比較例においては、上述した従来のMK-7
製造方法の中で、大豆煮汁廃液にグリセロールを添加す
ることにより、得られた培養液中のMK−7濃度を高める
ことができる旨記載されている特開平10-295393号公報
に記載の方法に従って、納豆菌培養液を得た。即ち、実
施例1において使用する大麦麹糖化液から得られる培地
に代えて、大豆煮汁廃液にグリセロールを添加したもの
を使用する以外は、実施例1と同様にしてMK−7を含有す
る納豆菌培養液を得た。 １．大豆煮汁廃液からの培地の調製 ブリックス濃度を10%に調整した大豆煮汁廃液に５重量
％のグリセロールを添加し、得られた液体に水酸化ナト
リウムを添加してそのpH値を7.0に調整して調整液を得
た。得られた調整液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地
を得た。 ２．納豆菌の前培養 肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られ
た液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に
調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキ
ス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城
野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間
振とう培養して納豆菌前培養液を得た。 ３．納豆菌の本培養 2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと前
記２で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vv
m、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培
養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液
を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により
分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの
周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。

【００２２】

【実施例2】上述した従来のMK-7製造方法の中で、最も
高いMK-7濃度を達成できる旨述べている特開平8-19378
号公報に記載の方法に従って、納豆菌培養液を得た。但
し、本実施例においては当該公報に記載の納豆製造時に
副生された大豆煮汁廃液の代わりに、本発明において使
用する大麦麹の糖化液から得られた培地を用いた。 1．麹菌培養物（大麦麹）の取得 大麦（70%精白）1kgに400mlの脱イオン水を完全に吸水
させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、1gの種麹（As
pergillus Kawachii）を接種し、38℃、ＲＨ95％で24時
間、32℃、ＲＨ92％で20時間保持することにより、大麦
麹を製造した。 2．調製液の取得 前記大麦麹に適量の脱イオン水を添加して、攪拌しなが
ら55℃で一晩保持して糖化液を得、該糖化液に水酸化ナ
トリウムを添加してそのpH値を7.0に調整して調製液を
得、得られた調製液にさらに脱イオン水を加えてブリッ
クス濃度を6に調製したものを滅菌処理して納豆菌培養
用の培地に使用した。 ３．納豆菌の本培養 該培地100mlを500ml容の三角フラスコに導入した後、綿
栓をし、オートクレーブにて121℃×20minで蒸気加圧滅
菌を行い、O.D.660nmが10.0の納豆菌胞子を無菌的に10
μl接種し、48℃において120rpmで4日間振盪培養を行な
うことによりMK-７を含有する納豆菌培養液を得た。な
お、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れ
があるため、前記三角フラスコの周囲を予めアルミホイ
ルで覆って培養を行った。

【００２３】

【比較例3】本比較例では、特開平8-19378号公報に記載
の方法に従って納豆菌培養液を得た。即ち、納豆製造時
に副生された大豆煮汁廃液に水酸化ナトリウムを添加し
てそのpH値を7に調整して調整液を得た。該調整液を500
ml容の三角フラスコに100ml導入した後、綿栓をし、オ
ートクレーブにて121℃×20minで蒸気加圧滅菌を行い、
培地を得た。該培地にO.D.660nmが10.0の納豆菌胞子を
無菌的に10μl接種し、48℃において120rpmで4日間振盪
培養を行うことによりMK−7を含有する納豆菌培養液を
得た。なお、培養により得られるMK−7は光により分解
する恐れがあるため、前記三角フラスコの周囲を予めア
ルミホイルで覆って培養を行った。

【００２４】

【MK-7の定量】実施例1、実施例2、比較例1、比較例2、
及び比較例3で得られたそれぞれの納豆菌培養液中のMK-
7濃度を以下の方法により定量した。即ち、実施例1、実
施例2、比較例1、比較例2、及び比較例3で得られたそれ
ぞれの納豆菌培養液について、その1.5mlに、1.5mlのイ
ソプロピルアルコールと5mlのヘキサンを添加し、振と
う後、1710g×10minの条件で遠心分離を行い、有機層と
水層を得、該有機層4mlを回収し、該有機層4ml中に含ま
れるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除いた
後、残った黄褐色の油を97%エタノール500μlに溶解
し、以下に示す条件の高速液体クロマトグラフィーを用
いてMK−7濃度を定量した。即ち、カラムにInertsil OD
S 4.6×250mm（GLサイエンス社製）、ポストカラムに白
金-アルミナ触媒（ビーズ）カラム4.6×50mm（白金-ア
ルミナビーズは和光純薬工業株式会社製）を用い、97%
エタノールを溶離液として、流速0.7ml/min、カラム温
度40℃、サンプル注入量10μlとし、蛍光検出器（励起3
20nm、蛍光430nm）を用いて分析を行った。なお、MK−7
の検量線作成のために、100ppmのMK-7標準試料を用い
た。

【００２５】

【アンモニアの定量】実施例1乃至実施例11、及び比較
例1乃至比較例5で得られたそれぞれの納豆菌培養液中の
アンモニア濃度を以下の方法により定量した。即ち、実
施例1乃至実施例11、及び比較例1乃至比較例5で得られ
たそれぞれの納豆菌培養液について、マイクロフィルタ
ー(0.45μm)を通した該納豆菌培養液に等量の5%TCAを添
加後、遠心分離して上清を得、得られた上清を0.02N HC
lで25倍希釈したものをサンプルとして、（株）日立製
作所製L-8500型高速アミノ酸分析計を用いて測定した。

【００２６】

【評価1】前記実施例1、比較例1及び比較例2で得られた
培養液中のMK-7の定量結果を表2に示す。表2に示した結
果から明らかなように、本実施例1で得られた培養液中
のMK-7濃度が110.8mg/Lであったのに対して、比較例1で
得られた培養液中のMK-7濃度は12.2mg/L、比較例2で得
られた培養液中のMK-7濃度は33.8mg/L、であった。即
ち、本発明の実施例1で得られた培養液中のMK-7濃度
は、比較例1で得られた培養液中のMK-7濃度の約9.1倍に
達し、比較例2で得られた培養液中のMK-7濃度の約3.3倍
に達することが判明した。前記実施例1、比較例1及び比
較例2で得られた培養液中のアンモニアの定量結果を表2
に示す。表2に示した結果から明らかなように、本実施
例1で得られた培養液中のアンモニア濃度が4.3mg/Lであ
ったのに対して、比較例1で得られた培養液中のアンモ
ニア濃度は30.5mg/L、比較例2で得られた培養液中のア
ンモニア濃度は84.7mg/L、であった。即ち、本発明の実
施例1で得られた培養液中のアンモニア濃度は、比較例1
で得られた培養液中のアンモニア濃度の約1/7にまで減
少し、比較例2で得られた培養液中のアンモニア濃度の
約1/20にまで減少していることが判明した。即ち、大麦
麹糖化液から得られた培地を用いた場合には、納豆製造
時に副生された大豆煮汁廃液から得られた培地を用いた
場合に比べて、アンモニアの生成を著しく抑制しつつ、
培養液中のMK−7の生成量（MK−7濃度）が顕著に高まる
ことが判明した。

【００２７】

【評価2】前記実施例2及び比較例3で得られた培養液中
のMK-7の定量結果を表3に示す。表3に示した結果から明
らかなように、実施例2の大麦麹糖化液から得た培地を
用いることにより得られた培養液中のMK-7濃度が30.6mg
//Lであったのに対して、比較例3の特開平8-19378号公
報に記載の方法により得られた培養液中のMK-7濃度は1
0.3mg/Lであった。即ち、特開平8-19378号公報に記載の
方法によれば、培養生産物中のMK−7の濃度は11.7mg/10
0mL（すなわち117mg/L）である旨記載されているが、こ
の値は途方もなく高い濃度であり、当該公報に記載の方
法により達成することは全く不可能であることが判っ
た。また、大麦麹糖化液から得られた培地を用いた場合
には、納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液から得られ
た培地を用いた場合に比べて、得られる培養液中のMK−
7濃度は、顕著に高まることが判明した。前記実施例2、
及び比較例3で得られた培養液中のアンモニアの定量結
果を表3に示す。表3に示した結果から明らかなように、
本実施例2で得られた培養液中のアンモニア濃度が1.2mg
/Lであったのに対して、比較例3で得られた培養液中の
アンモニア濃度は25.5mg/Lであった。即ち、本発明の実
施例2で得られた培養液中のアンモニア濃度は、比較例3
で得られた培養液中のアンモニア濃度の約1/20にまで減
少することが判明した。以上の結果から、本発明の大麦
麹糖化液から得られた培地を用いることを特徴とするMK
−7含有物質の製造方法によれば、従来のMK−7製造方法
に比べて、アンモニアの生成を著しく抑制しつつ、MK−
7濃度が飛躍的に高いMK−7高含有物が得られることが判
明した。

【００２８】

【実施例3】実施例1及び実施例2で得られたそれぞれの
納豆菌培養液からMK-7を含有する油状物質を抽出した。
即ち、実施例1及び実施例2で得られたそれぞれの納豆菌
培養液に、該納豆菌培養液と同量のイソプロピルアルコ
ールを導入し、次に該納豆菌培養液の３倍量のヘキサン
を導入し、振とう後、1710g×10minの条件で遠心分離を
行い、有機層と水層を得、該有機層を回収後、該有機層
に含まれるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除
くことにより、アンモニアを全く含まない黄褐色の油状
物質を得た。

【００２９】

【比較例4】比較例1、比較例2及び比較例3で得られたそ
れぞれの納豆菌培養液からMK-7を含有する油状物質を抽
出した。即ち、比較例1、比較例2 及び比較例3で得られ
たそれぞれの納豆菌培養液に、該納豆菌培養液と同量の
イソプロピルアルコールを導入し、次に該納豆菌培養液
の３倍量のヘキサンを導入し、振とう後、1710g×10min
の条件で遠心分離を行い、有機層と水層を得、該有機層
を回収後、該有機層に含まれるヘキサンをエバポレータ
ーを用いて完全に除くことにより、アンモニアを全く含
まない黄褐色の油状物質を得た。

【００３０】

【評価3】前記実施例3及び前記比較例4で得た、実施例
1、実施例2、比較例1、比較例2及び比較例3 の夫々にお
いて得た納豆菌培養液から抽出したそれぞれの油状物質
について、重量を測定し、更に上述したMK-7の定量法に
よりMK-7濃度を測定した。得られた測定結果を表4に示
す。表4に示した結果から以下の事実が判明した。 （１）実施例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度
は、26380ppmであるのに対して、比較例1の培養液から
得た油状物質中のMK-7濃度は1258ppmであり、比較例2の
培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は3414ppmであ
る。即ち、実施例1の培養液から得た油状物質中のMK-7
濃度は、比較例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃
度の約20.1倍であり、比較例2の培養液から得た油状物
質中のMK-7濃度の約7.7倍であることが判明した。 （２）実施例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度
は7116ppmであるのに対して、比較例3の培養液から得た
油状物質中のMK-7濃度は1084ppmである。即ち、実施例2
の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、比較例3の
培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の約6.6倍である
ことが判明した。 以上のことから、本発明の大麦麹糖化液から得られた培
地を使用した場合には、大豆煮汁廃液から得た培地、或
いは大豆煮汁廃液にグリセロールを添加することにより
得た培地を用いた場合に比べて、著しく高いMK-7濃度の
油状物質が得られることが判明した。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【表２】

【００３３】

【表３】

【００３４】

【表４】

【００３５】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明のMK-7含有
物の製造方法によれば、以下の効果を奏する。即ち、As
pergillus属の糸状菌を大麦又は／及び該大麦の粉砕物
を培地に用いて培養を行うことにより麹菌培養物を得、
該麹菌培養物を糖化することにより糖化液を得、該糖化
液に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得、該
調製液を滅菌処理することにより得られた培地を使用し
て、Bacillus subtilisに属するメナキノン-7生産菌を
培養することにより、アンモニアの生成を著しく抑制し
つつ、MK-7濃度の極めて高いMK-7含有物を効率的に安定
して得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図1】従来のMK−7の製造方法において最も一般的に使
用する大豆煮汁からなる培地、及び大麦麹糖化液から得
た本発明の培地、をそれぞれ個別に使用して納豆菌を培
養することにより得られる培養液中のＭＫ−７濃度及び
アンモニア濃度と培養時間との関係についての実験結果
をグラフ化して示したものである。

【図２】本発明のMK-7の製造工程を示す製造工程図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｒ 1:125） (56)参考文献 特開 平11−131399（ＪＰ，Ａ) 特開2001−204459（ＪＰ，Ａ) 特開2001−204400（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−32787（ＪＰ，Ａ) 特開2001−136959（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−73396（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 3/00 - 11/00 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項1】 大麦又は／及び該大麦の粉砕物を培地に
   用いてAspergillus属の糸状菌を培養をすることにより
   麹菌培養物を得、該麹菌培養物を糖化することにより糖
   化液を得、該糖化液に含まれる酸を実質的に中和処理し
   て得られる調製液を培地に用いてBacillus subtilisに
   属するメナキノン-7生産菌を培養することを特徴とする
   メナキノン-7含有物質の製造方法。
2. 【請求項２】アンモニアの生成を著しく抑制して、前記
   培地中に前記メナキノン−7を高収率で生産する請求項1
   に記載のメナキノン−7含有物質の製造方法。
3. 【請求項３】 前記麹菌培養物が大麦麹である請求項1
   又は２に記載のメナキノン-7含有物質の製造方法。
4. 【請求項４】前記メナキノン−7含有物質を精製して高
   純度のメナキノン−7含有物質にする工程を包含する請
   求項１乃至３のいずれかに記載のメナキノン−7含有物
   質の製造方法。