JP2003164268A - 甘味料およびその製造方法 - Google Patents
甘味料およびその製造方法Info
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Abstract
ら、砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がり
が速く、甘味の切れが良好で、ステビア甘味料特有の後
味の苦味や渋味を低減させた甘味料およびその製造方法
を提供すること。 【解決手段】 ステビオール配糖体を含有する甘味料で
あって、β−1,4−ガラクトシルレバウディオサイド
AとレバウディオサイドAの合計含有率(GRA+R
A)のステビオール配糖体含有率(X)に対する重量比
が0.4以上で、かつ、β−1,4−ガラクトシルレバ
ウディオサイドA(GRA)含有率のレバウディオサイ
ドA(RA)の含有率に対する重量比が1.0以上の甘
味料およびその製造方法。
Description
な甘味質とを有し、種々の飲食物の甘味剤として有用
な、レバウディオサイドAとβ−1,4−ガラクトシル
レバウディオサイドAとを主成分として含有する甘味料
およびその製造方法に関する。
味料として広く利用されている。特に、缶入りコーヒー
をはじめとするコーヒー飲料等や炭酸飲料等の清涼飲料
水には多量の砂糖が用いられている。しかし、近年、健
康志向や低カロリー志向の影響を受けて、肥満、糖尿
病、ムシ歯の原因となる砂糖を減量したり、砂糖の替わ
りに高甘味度甘味料が利用される傾向にある。
パラグアイを原産地とするキク科の多年生植物、ステビ
ア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia re
baudiana BERTONI)の抽出物由来のス
テビア甘味料が挙げられる。
出物と称する)から得られるステビア甘味料は、砂糖の
数百倍の優れた甘味度を有するが、砂糖に比較して、甘
味の発現が遅いという特徴、いわゆる甘味の立ち上がり
が遅いという特徴と、後味として比較的長く甘味が残る
という特徴、いわゆる、甘味の切れが悪いという特徴と
がある。また、該ステビア甘味料に多量に含まれるステ
ビオサイドには、甘味とは別に、後味に独特の渋味や苦
味を伴う欠点があり、コーヒー飲料や清涼飲料水に用い
ると、明らかに違和感を感じる。
為に種々の研究がなされてきた。例えば、特開昭58−
094367号公報には、ステビオサイドを主成分とし
たステビア抽出物とβ−1,4−ガラクトシル糖化合物
とを有する水溶液に、β−1,4−ガラクトシル転移酵
素を作用させて、ステビオサイドにガラクトシル基をβ
−1,4−結合させたβ−1,4−グルコシルステビオ
サイドを主成分とする甘味料の製造方法が開示されてい
る。
改善され、さらに甘味の切れも比較的良くなり、苦味や
渋味も低減されたものの、甘味質の改善効果は充分では
なく、特にコーヒー飲料や清涼飲料水に使用するには、
未だ不十分であった。
は、レバウディオサイドAを主成分としたステビア抽出
物にグルコースをα−付加反応させる方法が開示されて
いる。しかし、酵素反応が進むとレバウディオサイドA
に付加したグルコースから長鎖のグルコース鎖が形成さ
れ、得られるα−グルコシルレバウディオサイドAの甘
味度はレバウディオサイドAと比較して45%程度も低
下してしまう、という問題があった。
は、糖付加により、ある程度甘味質は改善されるもの
の、甘味度は低下し、また、ステビア甘味料特有の欠点
である甘味の立ち上がりの遅さや、後味に苦味や渋味を
伴う点の改善は未だ十分ではなく、コーヒー飲料や清涼
飲料水等への使用に際して違和感が残っていた。
ビア甘味料の高い甘味度を残しながら、砂糖に似たまろ
やかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れ
が良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味を低
減させた甘味料およびその製造方法を提供することにあ
る。
した結果、次の知見を見出した。 (A)甘味料中に含まれるβ−1,4−ガラクトシル基
を1分子中に1〜3個有するβ−1,4−ガラクトシル
レバウディオサイドAの重量割合(GRA)と、甘味料
中に含まれるレバウディオサイドAの重量割合(RA)
と、甘味料中に含まれるステビオール配糖体の重量割合
(X)が特定の関係にある甘味料は、砂糖に似たまろや
かな甘味質で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも
良好で、ステビア甘味料特有の後味の苦味や渋味が低減
された甘味料である。 (B)β−1,4−ガラクトシル基を1分子中に1〜3
個有するβ−1,4−ガラクトシルレバウディオサイド
Aは、レバウディオサイドAに付加したガラクトシル基
にさらにガラクトシル基が付加重合することがないため
に甘味度の低下がレバウディオサイドAの30%程度に
抑えられる。 (C)前記甘味料は、レバウディオサイドAを40重量
%以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分
重量の5〜20倍量のβ−1,4−ガラクトシル糖化合
物とを含む水溶液に、β−1,4−ガラクトシル転移酵
素を作用させることにより容易に製造できる。 本発明は、上記知見に基づき完成された。
を含有し、かつ、下記式(1)および式(2)を満足するこ
とを特徴とする甘味料を提供するものである。 〔(GRA+RA)/(X)〕≧0.4 (1) 〔(GRA)/(RA)〕≧1.0 (2) 〔式中、GRAは甘味料中に含まれるβ−1,4−結合
ガラクトシル基を1分子中に1〜3個有するβ−1,4
−ガラクトシルレバウディオサイドAの重量割合を表
し、RAは甘味料中に含まれるレバウディオサイドAの
重量割合を表し、Xは甘味料中に含まれるステビオール
配糖体の重量割合を表す。〕
40重量%以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出
物固形分重量の5〜20倍量のβ−1,4−ガラクトシ
ル糖化合物とを含む水溶液に、β−1,4−ガラクトシ
ル転移酵素を作用させることを特徴とする甘味料の製造
方法を提供するものである。
ら、前記式(3)と共に下記式(6)および式(7)を満足す
るものであることが最も好ましい。 5.0≧〔(GRA)/(RA)〕≧1.1 (6) 〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≧1.5 (7) (式中、GRA、RA、GSTおよびSTは、前記と同
じである。)
限定はないが、なかでも、レバウディオサイドAを40
重量%以上含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固
形分重量の5〜20倍量のβ−1,4−ガラクトシル糖
化合物とを含む水溶液に、β−1,4−ガラクトシル転
移酵素を作用させるという、前記本発明の製造方法が、
前記式(1)および式(2)を満足する甘味料であって、砂
糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立ち上がりが速
く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料特有の後味の
苦味や渋味が低減された甘味料を、容易に得ることがで
きることから好ましい。
Aを40重量%未満の範囲で含有するステビア抽出物を
用いた製造方法では、β−1,4−結合ガラクトシル基
を1分子中に1〜3個有するβ−1,4−ガラクトシル
レバウディオサイドA(以下、β−1,4−ガラクトシ
ルレバウディオサイドAと称する。)の重量割合とレバ
ウディオサイドAの重量割合との合計(GRA+RA)が
低くなり、同時に、β−1,4−結合ガラクトシル基を
1分子中に1〜2個有するβ−1,4−ガラクトシルス
テビオサイド(以下、β−1,4−ガラクトシルステビ
オサイドと称する。)の重量割合とステビオサイドの重
量割合との合計(GST+ST)が高くなることから、
前記式(1)および式(2)を満足する甘味料とすることが
困難となり、まろやかな甘味質が低下し、甘味の立ち上
がりが遅く、甘味の切れも悪くなり、ステビア甘味料特
有の後味の苦味や渋味を伴うようになることから、好ま
しくない。
ド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドC、ズ
ルコサイドA等のステビオール配糖体からなる甘味成分
が含有されており、ステビオサイドは以下の構造を有す
るものである。
ビオサイドの構造中の13−G1で示されるグルコース
残基に、さらにグルコースが結合した、以下の構造を有
するものである。
−ガラクトシル糖化合物の代表例としては、ガラクトー
スとグルコースとが結合した二糖類、例えば、乳糖(ラ
クトース)、α−D−ガラクトース等が挙げられる。こ
れらは、以下の構造を有するものである。
ガラクトシルレバウディオサイドAとしては、例えば、
レバウディオサイドAのステビオール骨格の13位に結
合したグルコース残基(13−G1と称する。)、該ス
テビオール骨格の13位に結合したグルコース残基に結
合した2つのグルコース残基(13−G2、13−G3
と称する。)、および、ステビオール骨格の19位に結
合したグルコース残基(19−G1と称する。)の4個
のグルコース残基のうちの1〜3個のグルコース残基の
おのおのに、1個のガラクトシル基がβ−1,4−結合
で結合しているもの等が挙げられる。
中でも、β−1,4−ガラクトシル転移酵素の作用によ
りガラクトシル基がβ−1,4−転移しやすいのは、1
3−G2、13−G3および19−G1の3つのグルコ
ース残基であると推定される。実際、後記する実施例に
示したように、高速液体クロマトグラフィーによる分析
では、レバウディオサイドAに3つまでのガラクトシル
基が結合したβ−1,4−ガラクトシルレバウディオサ
イドAのピークが確認されている。
前記の13−G2、13−G3および19−G1の3つ
のグルコース残基に各々1つずつβ−1,4−結合して
おり、酵素反応の進行に伴い、レバウディオサイドAに
1つβ−1,4−ガラクトシル基が結合したもの(β−
1,4−モノガラクトシルレバウディオサイドA)か
ら、次に2つβ−1,4−ガラクトシル基が結合したも
の(β−1,4−ジガラクトシルレバウディオサイド
A)、さらに3つのβ−1,4−ガラクトシル基が結合
したもの(β−1,4−トリガラクトシルレバウディオ
サイドA)が、順次生成するものと推定され、本発明で
提供する甘味料中のβ−1,4−ガラクトシルレバウデ
ィオサイドAは、それらの複数のβ−1,4−ガラクト
シルレバウディオサイドAの混合物から成る。
−1,4−ガラクトシル転移酵素の作用によりβ−1,
4−ガラクトシル糖化合物からガラクトシル基をレバウ
ディオサイドAに転移させて得られるガラクトシルレバ
ウディオサイドAであれば、前記した主たるβ−1,4
−ガラクトシルレバウディオサイドAの他に、例えば、
前記の13−G1にガラクトシル基がβ−1,4−付加
したβ−1,4−ガラクトシルレバウディオサイドA
や、他の少量のガラクトシルレバウディオサイドAが含
まれていても差し支えない。
で用いるステビア抽出物としては、レバウディオサイド
Aを40重量%以上含むステビア抽出物であることが必
須であるが、なかでも、まろやかな甘味質で、甘味の立
ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料
特有の後味の苦味や渋味が低減された甘味料をさらに容
易に得ることができることから、レバウディオサイドA
を50重量%以上含むステビア抽出物であることが好ま
しく、レバウディオサイドAを70〜95重量%含むス
テビア抽出物であることがより好ましい。さらに、本発
明の製造方法で用いるステビア抽出物としては、ステビ
オサイドに対して1.5重量倍以上のレバウディオサイ
ドAを含むステビア抽出物であることが特に好ましい。
これは、β−1,4−ガラクトシル転移酵素によりレバ
ウディオサイドAにガラクトシル基が転移したβ−1,
4−ガラクトシルレバウディオサイドAの甘味度は、元
のレバウディオサイドAよりも低下するが、その甘味度
低下率は、ステビオサイドにガラクトシル基が結合した
β−1,4−ガラクトシルステビオサイドの甘味度の低
下率よりもかなり小さいことに起因するものと思われ
る。なお、ステビア抽出物中のレバウディオサイドAの
含量比率が40重量%未満であると、得られる甘味料の
甘味度と甘味質が低下し、甘味質が優良でなくなるた
め、好ましくない。
る方法としては、以下に示す2つの方法が一般的である
が、これらの方法に限定されるものではない。
0重量%以上含み、ステビオサイドに対して1.5重量
倍以上のレバウディオサイドAを含むステビア レバウ
ディアナ ベルトニー(Stevia rebaudi
ana BERTONI)の植物体または乾燥葉を水ま
たは含水メタノール、含水エタノール等の含水有機溶媒
で抽出し、得られた抽出液から非甘味成分を除去する方
法である。
意の比率でレバウディオサイドAを含むステビア レバ
ウディアナ ベルトニー(Stevia rebaud
iana BERTONI)の植物体または乾燥葉を水
または含水メタノール、含水エタノール等の含水有機溶
媒で抽出し、得られた抽出液から非甘味成分を除去した
後に、レバウディオサイドAを40重量%以上含み、レ
バウディオサイドAがステビオサイドに対して1.5重
量倍以上になる様に、再結晶やカラム精製などの一般的
な方法で分離・精製取得する方法である。これら第1と
第2の方法は組み合わせて実施することもできる。
甘味成分を除去する方法としては、例えば、ステビア抽
出液を陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂でイオ
ン性不純物を除去した後、吸着樹脂に甘味成分を吸着さ
せ、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で溶離
し、溶離液を減圧濃縮する方法、逆に、吸着樹脂に甘味
成分を吸着させ、メタノール、エタノール等の親水性有
機溶媒で溶離後、溶離液を減圧濃縮して該有機溶媒を除
去し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂でイオ
ン性不純物を除去する方法等の一般的な精製方法等が挙
げられる。
ば、アンバーライトIR−120B(オルガノ株式会社
製品)等が挙げられ、陰イオン交換樹脂としてはオルガ
ノ株式会社製のアンバーライトIRA−93等が挙げら
れる。吸着樹脂としては、例えば、オルガノ株式会社製
のアンバーライトXAD−2等が挙げられる。
ら非甘味成分を除去した後に、レバウディオサイドAを
40重量%以上含み、レバウディオサイドAがステビオ
サイドに対して1.5重量倍以上になる様に分離・精製
する工業的な方法としては、例えば、非甘味成分を除去
したステビア抽出物を、メタノール、エタノール等の親
水性有機溶媒に飽和濃度になるまで溶解し、濃縮、冷却
等の手段によりレバウディオサイドAを選択的に析出さ
せた後、濾過などの方法により、結晶を分離する再結晶
方法等が挙げられる。
糖化合物は、β−1,4−ガラクトシル転移酵素の基質
になり、該β−1,4−ガラクトシル糖化合物からβ−
1,4−ガラクトシル基をレバウディオサイドAに転移
できるものであればよく、特に限定されないが、入手の
容易さなどから乳糖(ラクトース)が最も好ましい。
転移酵素としては、β−1,4−ガラクトシル転移活性
を有する酵素であればよく、例えば、β−1,4−ガラ
クトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物由来の
酵素が挙げられ、なかでも、該微生物を培養した培養菌
体から抽出した酵素が、取り扱いが容易であることから
好ましいが、このようなβ−1,4−ガラクトシル転移
酵素の代わりに、β−1,4−ガラクトシル転移活性を
有する酵素を産生する微生物を培養した菌体懸濁液をそ
のまま用いても良いし、該微生物を固定した固定化菌体
を用いても良い。前記培養菌体から抽出した酵素として
は、乳糖を加水分解するラクターゼ、例えば、大和化成
株式会社製のビオラクタなどが挙げられる。
有する酵素を産生する微生物としては、ロドトルラ属微
生物が好ましく用いられ、特にロドトルラ ミヌタ(R
hodotorula minuta)IFO−154
0、ロドトルラ マリナ(Rhodotorula m
arina)IFO−1421、ロドトルラ ラクトサ
(Rhodotorula lactosa)IFO−
1424が好ましい。
ことができ、特に、バシルス サーキュランス(Bac
illus circulans)が好ましく用いられ
る。さらに、前記β−1,4−ガラクトシル転移活性を
有する酵素を産生する微生物としては、病原性などの飲
食物として好ましくない性質を有しない限り、β−1,
4−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生
物であれば上記以外の属や種に属する微生物であっても
よい。
適した培地、例えば、炭素源としてはグルコース、シュ
クロース、ラクトース、グリセリン等を、窒素源として
は硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、酢酸ア
ンモニウム等を、含窒素天然物としては、酵母エキス、
コーンスティーブリカー等を、無機塩類としてはリン酸
カリウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マ
グネシウム等を含有し、更にビタミン類、微量金属塩等
を含有した培地で成育することにより得られる。
レバウディオサイドAへのガラクトシル基の転移とβ−
1,4−付加反応は、レバウディオサイドAを含むステ
ビア抽出物とβ−1,4−ガラクトシル糖化合物とを含
有する水溶液に、β−1,4−ガラクトシル転移酵素を
添加することにより進行する。
サイドAを40重量%以上含むステビア抽出物とβ−
1,4−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液は、該ス
テビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の5〜2
0倍量のβ−1,4−ガラクトシル糖化合物とを含めば
良いが、なかでも、6〜16倍量のβ−1,4−ガラク
トシル糖化合物を有するのが好ましい。
濃度は、通常0.1〜15重量%で良いが、経済性を考
慮すると1〜5重量%が好ましい。また、該水溶液中で
のβ−1,4−ガラクトシル糖化合物の濃度は、通常
0.1〜30重量%で良いが、経済性と生産性を考慮す
ると5〜20重量%が好ましい。
量は、β−1,4−ガラクトシル転移酵素が作用してβ
−1,4−ガラクトシルレバウディオサイドAを生成さ
せる量であれば制限はないが、反応効率が良好なことと
経済的なことから、ステビア抽出物固形分1gあたり1
〜1000ユニット(U)用いるのが好ましく、5〜5
00U用いるのがより好ましい。ここで、1ユニット
(U)とは、1μmolのo−ニトロフェニル−β−D
−ガラクトピラノシド(以下、ONPGという。)とβ
−1,4−ガラクトシル転移酵素とを反応させた時、該
ONPG中のβ−ガラクトシド結合を加水分解し、1μ
molのo−ニトロフェノールを1分間に生成するのに
要する該ガラクトシル転移酵素の量を言う。
ットの測定は、濃度5mmol/l(リットル)のON
PG水溶液2.5mlと濃度100mmol/lのリン
酸カリウム・ナトリウム緩衝液(pH7.25)4.9
mlとを混合した溶液に、酵素液0.1mlを加えて4
0℃で10分間反応させた後、濃度1.0mol/lの
炭酸ナトリウム(Na2CO3)水溶液2.5mlを加えて反
応を停止させ、必要があれば適量の純水で希釈し、生成
したo−ニトロフェノールの波長420nmに於ける吸
収を測定し、得られた吸光度から該ニトロフェノールの
生成量を定量したのち、その生成量を10で割り、1分
間に生成した該ニトロフェノールの量を求めることによ
り行った。
酵素を作用させる際の系のpHは、β−1,4−ガラク
トシル転移酵素が作用してβ−1,4−ガラクトシルレ
バウディオサイドAを生成させうる条件であれば特に制
限されるものではないが、通常pH3〜10であり、な
かでも酵素反応効率に優れることから、pH4〜7が好
ましい。この際の温度も、β−1,4−ガラクトシル転
移酵素が作用してβ−1,4−ガラクトシルレバウディ
オサイドAを生成させうる条件であれば特に制限される
ものではないが、通常20〜70℃であり、なかでも酵
素反応効率に優れることから、40〜60℃が好まし
い。該水溶液にβ−1,4−ガラクトシル転移酵素を作
用させる時間は、通常3〜48時間であるが、経済性と
生産性を考慮すると9〜24時間が好ましい。
によるβ−1,4−ガラクトシル糖化合物からのガラク
トシル基のレバウディオサイドAへのβ−1,4−転移
は、β−1,4−ガラクトシル糖化合物からのガラクト
シル基の切断と、β−1,4−転移とが同時に生じるも
のであり、一度レバウディオサイドAのグルコース残基
に転移したガラクトシル基の4位の水酸基へは新たなガ
ラクトシル基はβ−1,4−転移できず、α−1,4−
グルコシダーゼやグルコシルトラスフェラーゼのよう
に、先に転移したグルコース残基の4位の水酸基に、さ
らに新たなグルコシル基が次々にα−1,4−付加重合
して長鎖のグルコース鎖を形成し、得られる甘味料の甘
味度を低下させることがないという利点を有する。
ル糖化合物とを含む水溶液にβ−1,4−ガラクトシル
転移酵素を作用させた後の水溶液は、そのまま甘味料と
して使用することもできるが、通常は、β−1,4−ガ
ラクトシル転移酵素を加熱失活させた後(ただし、β−
1,4−ガラクトシル転移酵素の代わりに、β−1,4
−ガラクトシル転移活性を有する酵素を産生する微生物
を培養した菌体懸濁液等を用いた場合は、該微生物の加
熱殺菌も行った後)、スチレンジビニルベンゼン系合成
吸着樹脂、例えばダイヤイオンHP−21(三菱化学株
式会社製品)、アンバーライトXAD−2(オルガノ株
式会社製品)や、陽イオン交換樹脂や、陰イオン交換樹
脂を用いて不純物を除去した後、濃縮してシロップ状の
甘味料としたり、乾燥して粉末状の甘味料として使用す
る。この際、濃縮、乾燥、粉末化の手段は公知慣用の方
法、例えば減圧濃縮、膜濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥等の
各種の方法が採用できる。
れる甘味料は、単独で用いることもできるが、ソルビト
ール、マルチトール、還元水飴、キシリトール、トレハ
ロース、エリスリトール等の砂糖より甘味度の低い低カ
ロリー甘味料と併用することができ、これらの甘味料の
特性を損なうことなくさらに強い甘味を付与することが
可能であり、良質の低カロリー甘味料製剤とすることが
できる。
で得られる甘味料の乾燥物は、淡黄色〜白色を呈する無
臭の粉末である。この為、該甘味料は、例えば、乾燥物
単独、若しくは、希釈剤として砂糖、果糖、ブドウ糖、
乳糖、異性化糖、水飴、デキストリン、澱粉等の糖質系
甘味料と併用した状態で好適に使用することもできる。
またさらに、甘草抽出物、サッカリン、アスパルテー
ム、アセスルファムカリウム、スクラロース等の非糖質
系高甘味度甘味料と組み合わせて好適に使用することも
できる。
び(3)で用いるX〔甘味料中に含まれるステビオール
配糖体の重量割合〕は、日本食品添加物協会の化学的合
成品以外の食品添加物自主規格(第二版、平成5年10
月1日発行)第119〜121頁「酵素処理ステビア」
に記載された定量法〔(1)ステビオール定量法、
(2)配糖体中の糖定量法、および、(4)含量の計
算〕に準拠して測定した重量割合(%)である。
定量法はα−グルコシルステビオサイド等のグルコース
付加反応物を対象とした定量法であり、β−1,4−ガ
ラクトシルレバウディオサイドA等のガラクトース付加
反応物を対象とした定量法ではないが、本発明では、こ
の方法に準拠してXを測定した。
〔甘味料に含まれるレバウディオサイドAの重量割
合〕、および、前記式(5)と(7)におけるST〔甘
味料中に含まれるステビオサイドの重量割合〕は、いず
れも、日本食品添加物協会の化学的合成品以外の食品添
加物自主規格(第二版、平成5年10月1日発行)第1
22〜123頁「ステビア抽出物」に記載された定量法
および前記「酵素処理ステビア」に記載された定量法
〔(3)未反応ステビオール配糖体定量法〕に準拠して
測定した重量割合(%)である。
RA〔甘味料中に含まれるβ−1,4−結合ガラクトシ
ル基を1分子中に1〜3個有するβ−1,4−ガラクト
シルレバウディオサイドAの重量割合〕およびGST
〔甘味料中に含まれるβ−1,4結合ガラクトシル基を
1分子中に1〜2個有するβ−1,4−ガラクトシルス
テビオサイドの重量割合〕は、測定方法が日本食品添加
物協会の化学的合成品以外の食品添加物自主規格に記載
されていないが、前記RAとSTを測定する際に同時に
測定した。
A、GSTの各重量割合は、前記した「酵素処理ステビ
ア」および「ステビア抽出物」に記載された定量法に準
拠しているが、下記の点で変更してある。変更点と、そ
の理由を以下に示す。
ール定量法」における変更点。 (1)−試料の乾燥処理工程 「(1)ステビオール定量法」では、試料の乾燥につい
ての記載はないが、厳密な分析を行うために、標準品と
同様に、105℃で2時間の乾燥を行った。
有率の計算は、標準品のステビオサイドの純度は考慮し
ていないが、厳密にステビオールの含有率を計算するた
めに、用いた標準品のステビオサイドの純度を考慮し、
以下の式を用いてステビオールの重量割合を求めた。 A=(As×S×標準品のステヒ゛オサイト゛の純度×100×K)/(Ast×X) ・・・・・・式(8) ここで、 A :試料のステビオールの重量割合(%)、 As:検液のイソステビオールメチルエステルのスタワ
ランに対する面積比、 Ast:標準液のイソステビオールメチルエステルのス
タワランに対する面積比、 S :ステビオサイド採取量(mg)、 X :試料採取量(mg)、 K :ステビオールへの換算係数 318.46/804.88=
0.3957 である。
の糖定量法」における変更点。 (2)−試料液の調製 「(2)配糖体中の糖定量法」におけて、試料の調製方
法は以下の通りである。即ち、試料約1.0gを精密に
量り、水50mlに溶解する。この溶液を酵素処理ステ
ビア用吸着樹脂50mlを用いて作った直径約2.5c
mの樹脂柱に注ぎ、1分間に3ml以下の速さで流出さ
せ、次いで水250mlで洗浄する。次に、50v/v
%エタノール(エタノールと水の混合溶液100mL中
のエタノールの含有量が50mlである混合溶液)又は
90v/v%メタノール(メタノールと水の混合溶液1
00mL中のエタノールの含有量が90mlである混合
溶液)250mlを1分間に3ml以下の速さで通液
し、吸着されている成分を溶出する。この液をロータリ
ーエバボレーターで濃縮乾固し、残留物を得るという処
理操作を行った後、該残留物に水を加えて溶解し全量を
正確に500mlとし、これを試料液とする。
は、酵素処理ステビアに糖類が添加されているものにつ
いて、該糖類を除去した試料を調製するための方法であ
る。本発明においては、酵素処理したステビアに糖類を
添加しないことから、前記した試料の調製方法におい
て、前記した処理操作を行わず、試料約1.0gを精密
に量り、水を加えて溶解し全量を正確に500mlと
し、これを試料液とした。尚、厳密な測定を行うため
に、試料は、105℃、2時間の条件で乾燥処理した。
燥についての記載はないが、本発明においては、厳密な
分析を行うために標準品と同じ105℃、2時間の乾燥
を行った。
マトグラフィーの移動相としてアセトニトリル・水混液
(80:20)(体積比)を使用している。この溶媒組
成は、ステビオサイド及びレバウディオサイドAの定量
を目的に規定されており、ステビオサイドのピークの保
持時間は10分前後、レバウディオサイドAのピークの
保持時間は20分前後と、30分以内でこれらの成分が
溶出される。
4−ガラクトシルレバウディオサイドA組成物を分析す
ると、β−1,4−トリガラクトシルレバウディオサイ
ドAのピークの保持時間は170分前後となり、全糖付
加成分の溶出に3時間以上を要する為、分析方法として
現実的ではない。
グラフィーの効率化の為、移動相としてアセトニトリル
・水混液(78:22)(体積比)を用いた。この移動
相を用いると、ステビオサイドのピークの保持時間は5
分前後、レバウディオサイドAのピークの保持時間は8
分前後、最も遅いβ−1,4−トリガラクトシルレバウ
ディオサイドAのピークの保持時間は45分前後とな
り、全糖付加成分の溶出は1時間以内で完了する。
準品(ステビオサイド、レバウディオサイド)の純度は
考慮されていないが、厳密な定量を行うために、用いた
標準品の純度を考慮し、標準品の採取量に純度を乗じ
た。これは、後述するβ−1,4−ガラクトシルステビ
オサイド、β−1,4−ガラクトシルレバウディオサイ
ドAについても同様である。
ド、β−1,4−ガラクトシルレバウディオサイドAの
重量割合の算出。 β−1,4−ガラクトシルステビオサイド、β−1,4
−ガラクトシルレバウディオサイドAの重量割合は、
「ステビア抽出物」に記載された定量法と、分子量換算
法を組み合わせて測定した。β−1,4−ガラクトシル
ステビオサイドの重量割合は、ステビオサイドを標準物
質とし、ステビオサイドの重量割合を求める計算式にお
いて、検液のステビオサイドのピーク面積に代えてβ−
1,4−ガラクトシルステビオサイドである、β−1,
4モノガラクトシルステビオサイド、β−1,4−ジガ
ラクトシルステビオサイドのそれぞれのピーク面積を用
い、更に、ステビオサイドの重量割合を求める計算式
に、下記第1表に示したステビオサイドとβ−1,4−
ガラクトシルステビオサイド各成分との分子量比を乗じ
て算出した。
イドAの重量割合は、レバウディオサイドAを標準物質
とし、レバウディオサイドAの重量割合を求める計算式
において、検液のレバウディオサイドAのピーク面積に
代えてβ−1,4−ガラクトシルレバウディオサイドA
である、β−1,4−モノガラクトシルレバウディオサ
イドA、β−1,4−ジガラクトシルレバウディオサイ
ドA、β−1,4−トリガラクトシルレバウディオサイ
ドAのそれぞれのピーク面積を用い、更に、レバウディ
オサイドAの重量割合を求める計算式に、下記第2表に
示したレバウディオサイドAとβ−1,4−ガラクトシ
ルレバウディオサイドA各成分との分子量比を乗じて算
出した。
方法において、ステビオサイド、レバウディオサイド
A、β−1,4−モノガラクトシルステビオサイド、β
−1,4−ジガラクトシルステビオサイド、β−1,4
−モノガラクトシルレバウディオサイドA、β−1,4
−ジガラクトシルレバウディオサイドA、β−1,4−
トリガラクトシルレバウディオサイドAの重量割合を測
定するには、液体クロマトグラフィーにて得られる、前
記したステビオサイド、β−1,4モノガラクトシルス
テビオサイド等の各成分のピークを特定する必要がある
ため、本発明においては、以下の条件による液体クロマ
トグラフィー(HPLC)を行い、ピーク保持時間を得
た後、下記第3表に示した実施例1の測定結果の様に、
ピーク保持時間毎に順次各成分を特定した。
NH2 ジーエルサイエンス株式会社製) カラム管:内径4.6mm、長さ150mm カラム槽温度:40℃ 移 動 相:アセトニトリル・水混液(78:22) 流 速:2.0ml/分 注 入 量:5μl 測定波長:210nm
に実施例1として例示してある。
明を具体的に説明する。例中「%」とあるのは、断りの
ない限り重量基準である。なお、使用したステビア抽出
物A1、ステビア抽出物A1、ステビア抽出物B中のそ
れぞれのステビオサイド重量割合、レバウディオサイド
A重量割合は、日本食品添加物協会の化学的合成品以外
の食品添加物自主規格(第二版、平成5年10月1日発
行)第122〜123頁「ステビア抽出物」に記載され
た定量法に準拠して測定した重量割合(%)である。
移酵素を産生する微生物を培養した菌体懸濁液の調製) リン酸二水素カリウム0.4%、硫酸アンモニウム0.
5%、硫酸マグネシウム0.06%、硫酸亜鉛0.00
1%、硫酸第一鉄0.005%、酵母エキス0.1%、
グルコース1.0%、およびラクトース0.5%の培地
組成からなる液体培地(pH5.2)3リットルを容量
10リットルのジャーファーメンターに仕込み、加圧蒸
気滅菌した。放冷後、ロドトルラ マリナ菌を接種し、
30℃で24時間通気攪拌培養し、菌体を生産した。得
られた培養液を遠心分離して菌体を捕集し、濃度0.0
5mol/lのリン酸緩衝液にて菌体を2回洗浄した
後、同緩衝液600mlに懸濁して、菌体懸濁液を調製
した。この菌体懸濁液のβ−1,4−ガラクトシル転移
酵素の総活性は3420Uであった。
移酵素の粗酵素液の調製) 参考例1と同じ液体培地3リットルを容量10リットル
のジャーファーメンターに仕込み、加圧蒸気滅菌した。
放冷後、バシルス サーキュランス菌を接種し、30℃
で24時間通気攪拌培養して菌体を生産した。得られた
培養液を遠心分離しして菌体を捕集し、濃度0.05m
ol/lのリン酸緩衝液にて菌体を2回洗浄した後、同
緩衝液100mlに懸濁して、菌体懸濁液を調製した。
これを超音波破砕により菌体を破砕した後に遠心分離し
て、菌体破砕物を除去し、上清液を硫酸アンモニウム7
0%飽和で塩析し生成した沈殿物を遠心分離によって回
収した。回収した沈殿物を濃度0.05mol/lのリ
ン酸緩衝液100mlに懸濁して粗酵素液を調製した。
この粗酵素液のβ−1,4−ガラクトシル転移酵素の総
活性は2988Uであった。
8%、レバウディオサイドAの重量割合58.5%)1
0.0gとガラクトシル糖化合物として乳糖100gと
を純水500mlで加温溶解した後、室温まで放冷し、
濃度1mol/lの水酸化ナトリウム水溶液を用いてp
H6.0に調整した。これに参考例1で得たβ−1,4
−ガラクトシル転移酵素活性を有する菌体懸濁液100
mlを加え、50℃で24時間反応させた。反応後、こ
の反応液を95℃に30分間保持して酵素を加熱失活さ
せた。
後、濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着樹脂
(ダイヤイオンHP−21)500mlを充填したカラ
ムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水洗し
て本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度80%の含水
メタノール1000mlを通液し、β−1,4−ガラク
トシルレバウディオサイドAを含む甘味成分を溶出さ
せ、溶出液を減圧濃縮、乾燥し、淡黄色粉末状の甘味料
(以下、甘味料1という)11.2gを得た。
学的合成品以外の食品添加物自主規格(第二版、平成5
年10月1日発行)122〜123頁「ステビア抽出
物」に準拠して、甘味料1中のレバウディオサイドAの
重量割合(RA)、β−1,4−ガラクトシルレバウデ
ィオサイドAの重量割合(GRA)、ステビオサイドの
重量割合(ST)及びβ−1,4−ガラクトシルステビ
オサイドの重量割合(GST)を測定した。具体的な方
法を以下に示す。
1.52205gを純水に溶かして正確に100mlと
し、検液を調製した。ステビオサイド標準品として和光
純薬工業株式会社製の純度99.4%のステビオサイド
を用い、該ステビオサイドを105℃で2時間乾燥し、
その52.26mgを移動相に溶かして正確に100m
lとし、ステビオサイド標準液を調製した。
和光純薬工業株式会社製の純度99.6%のレバウディ
オサイドAを用い、該レバウディオサイドAを105℃
で2時間乾燥し、その50.78mgを移動相に溶かし
て正確に100mlとし、レバウディオサイドA標準液
を調製した。
件で液体クロマトグラフィー法による分析を行った。 検 出 器:紫外部吸収検出器(測定波長210nm) カラム:粒径5μmのNH2基結合シリカ(Unisil Q
NH2 ジーエルサイエンス株式会社製) カラム管:内径4.6mm、長さ150mm カラム槽温度:40℃ 移 動 相:アセトニトリル・水混液(78:22) 流 速:2.0ml/分 注 入 量:5μl
って得られた検液の高速液体クロマトグラムを図1に、
該液体クロマトグラム中の各ピークの保持時間と成分名
との関係を第4表に示す。また、検液中の各成分のピー
ク面積と、標準液のステビオサイド、標準品のレバウデ
ィオサイドAのピーク面積を測定した結果を第5表に示
す。
て、甘味料1中の各成分の重量割合(ST、ST−G
1、ST−G2、RA、RA−G1、RA−G2、RA
−G3)を算出した。具体的な計算例を以下に示す。
尚、ST−G1は、β−1,4−モノガラクトシルステ
ビオサイドの重量割合を、ST−G2は、β−1,4−
ジガラクトシルステビオサイドの重量割合を、RA−G
1は、β−1,4−モノガラクトシルレバウディオサイ
ドAの重量割合を、RA−G2は、β−1,4−ジガラ
クトシルレバウディオサイドAの重量割合を、RA−G
3は、β−1,4−トリガラクトシルレバウディオサイ
ドAの重量割合をそれぞれ表す。
(g)×標準品の純度×検液のステビオサイドのピーク
面積×100)÷(試料の採取量(g)×標準液のステ
ビオサイドのピーク面積)=(0.05226×0.9
94×1429012×100)÷(1.52205×
361605)=13.5(%)
取量(g)×標準品の純度×検液のβ−1,4−モノガ
ラクトシルステビオサイドのピーク面積×分子量換算係
数×100)÷(試料の採取量(g)×標準液のステビ
オサイドのピーク面積)=(0.05226×0.99
4×670704×1.20×100)÷(1.522
05×361605)=7.6(%)
取量(g)×標準品の純度×検液のβ−1,4−ジガラ
クトシルステビオサイドのピーク面積×分子量換算係数
×100)÷(試料の採取量(g)×標準液のステビオ
サイドのピーク面積)=(0.05226×0.994
×76874×1.40×100)÷(1.52205
×361605)=1.0(%)
取量(g)×標準品の純度×検液のレバウディオサイド
Aのピーク面積×100)÷(試料の採取量(g)×標
準液のレバウディオサイドAのピーク面積)=(0.0
5078×0.996×1923081×100)÷
(1.52205×324814)=19.7(%)
品の採取量(g)×標準品の純度×検液のβ−1,4−
モノガラクトシルレバウディオサイドAのピーク面積×
分子量換算係数×100)÷(試料の採取量(g)×標
準液のレバウディオサイドAのピーク面積)=(0.0
5078×0.996×1346498×1.17×1
00)÷(1.52205×324814)=16.1
(%)
品の採取量(g)×標準品の純度×検液のβ−1,4−
ジガラクトシルレバウディオサイドAのピーク面積×分
子量換算係数×100)÷(試料の採取量(g)×標準
液のレバウディオサイドAのピーク面積)=(0.05
078×0.996×802268×1.34×10
0)÷(1.52205×324814)=11.0
(%)
品の採取量(g)×標準品の純度×検液のβ−1,4−
トリガラクトシルレバウディオサイドAのピーク面積×
分子量換算係数×100)÷(試料の採取量(g)×標
準液のレバウディオサイドAのピーク面積)=(0.0
5078×0.996×162466×1.50×10
0)÷(1.52205×324814)=2.5(%)
学的合成品以外の食品添加物自主規格(第二版、平成5
年10月1日発行)119〜121頁「酵素処理ステビ
ア」に準拠して、甘味料1中のステビオール配糖体の重
量割合Xを測定した。
合の定量 甘味料1を105℃で2時間乾燥し、110.1mg
を、フラスコに量り、20v/v%硫酸(硫酸と水の混
合溶液100mL中の硫酸の含有量が20gである混合
溶液)10mlを加え、還流冷却器をつけて水浴上で2
時間加熱した流水中で冷却後内容物を分液漏斗に移し、
フラスコは水10mlで洗って分液漏斗に加えた。フラ
スコはさらにエーテル30mlずつで3回洗い、洗液を
分汲漏斗に合わせ、よく振り混ぜた後、静置した。水層
を除きエーテル層を水20mlずつで2回洗浄した後水
層を除いた。ついでエーテル層を別のフラスコに移し、
分液漏斗はエーテル10mlずつで2回洗い、洗液はフ
ラスコに合わせ、硫酸ナトリウム(無水)15gを加
え、よく振り混ぜた後、傾斜してエーテル層を更に別の
フラスコに移した。残った硫酸ナトリウムは、エーテル
10mlずつで2回洗い、洗液をフラスコに合わせた。
エーテルを留去した後、残留物に酢酸エチル10mlを
加えて溶かし、2w/v%ジアゾメタン・エーテル溶液
(ジアゾメタンとエーテルの混合溶液100mL中のジ
アゾメタンの含有量が2gである混合溶液)3mlを加
え、密栓して時々振り混ぜ、20分間放置した。
混ぜた後、スタワラン・n−ブタノール試液(スタワラ
ン2.5gをn−ブタノールに溶解し、最終的にn−ブタ
ノールで200mlにしたもの)2mlを正確に加え、
検液とした。
9.4%のステビオサイドを105℃で2時間乾燥し、
42.1mgをフラスコに量り、甘味料1の場合と同様
の操作を行い、標準液を調製した。
スクロマトグラフイー法による分析を行った。 検出器:水素炎イオン化検出器 カラム充填剤:液相が、担体に対して2%の50%フェ
ニルメチルシリコーンポリマーで、担体が、177〜2
50μmのガスクロマトグラフィー用ケイソウ土〔Si
licone OV−17 2%Chromosorb
WAW−DMCS 60/80(ジーエルサイエンス
株式会社製)〕 カラム管:3.2mmφ×2.1mのガラス管 カラム槽温度:245℃ 注入口温度:260℃ キャリアーガス:窒素ガス 流速:50ml/min 注入量:2μl
ルエステルのピーク面積、及び標準液のスクワラン、イ
ソステビオールメチルエステルのピーク面積を測定した
結果を第6表に示す。
1中のステビオールの重量割合を求めた。 A=(As×S×標準品ステヒ゛オサイト゛の純度×100×K)/(Ast×X) ・・・・・式(8) ここで、 A :試料のステビオールの重量割合(%)、 As :検液のイソステビオールメチルエステルのスタ
ワランに対する面積比、 Ast:標準液のイソステビオールメチルエステルのス
タワランに対する面積比、 S :ステビオサイド採取量(mg)、 X :試料採取量(mg)、 K :ステビオールへの換算係数 318.46/804.88=
0.3957 である。
40=1.330、Ast=3082803/3926785=0.78
5である。従って、ステビオールの重量割合は、(1.
330×42.1×0.994×100×0.395
7)/(0.785×110.1)=25.5%であ
る。
割合の定量 甘味料1を105℃で2時間乾燥し、1.0074gを
量り、水500mlに溶解し、試料液を調製した。
mlに溶かし、これを氷令しながら水20ml中に徐々
に加えて混合し、アントロン試液を調製した。試料液を
水で50倍に希釈し、検液とした。検液2mlを正確に
共栓付試験管にとり、これを氷水中で冷却しつつ、アン
トロン試液6mlを正確に加え、二液が完全に混合する
までよく振り混ぜた。ついで沸騰水浴中で正確に16分
間加熱した。氷冷後、水を対照として、波長620nm
の吸光度を測定したところ0.313となった。
ら、検液のグルコース濃度(μg/ml)を求めた。グ
ルコース検量線は,グルコース10.96μg/ml、
32.88μg/ml、54.80μg/mlの溶液に
つき検液と同様に操作し、得られたそれぞれの吸光度と
濃度から作成した。本実施例で用いたグルコース検量線
のグルコース濃度と吸光度を第7表に示す。
31×吸光度−2.15という式で表された。検液の波
長620nmにおける吸光度(0.313)と検量線か
ら、検液中の糖濃度を求めた。 検液の糖濃度(μg/ml)=96.31×0.313
−2.15=28.0。
糖の重量割合を求めた。 配糖体中の糖の重量割合(%)=〔検量線より求めた糖
濃度(μg/ml)×0.9×50×500×100〕
÷〔試料採取量(g)×1000×1000〕=(2
8.0×0.9×50×500×100)÷(1.00
74×1000×1000)=62.5%。
計算 ステビオールの重量割合と配糖体中の糖の重量割合の値
の和をもって、ステビオール配糖体の重量割合とする。
甘味料1中のステビオール配糖体の重量割合は、25.
5+62.5=88.0(%)であった。
A、ST−G1、ST−G2、RA−G1、RA−G
2、RA−G3およびX)、〔(GRA+RA)/
(X)〕の値および〔(GRA)/(RA)〕の値を第
8表に示す。
8%、レバウディオサイドAの重量割合58.5%)1
0.0gとガラクトシル糖化合物として乳糖100gと
を純水500mlに加温溶解した後、室温まで放冷し、
濃度1mol/lの水酸化ナトリウム水溶液を用いてp
H6.0に調整した。これに参考例2で調製したβ−
1,4−ガラクトシル転移酵素活性を有する粗酵素液全
量を加え、50℃で24時間反応させた。反応後、この
反応液を95℃に30分間保持して酵素を加熱失活させ
た。
後、反応濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着
樹脂(ダイヤイオンHP−21)500mlを充填した
カラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水
洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度80%の
含水メタノール1000mlを通液し、β−1,4−ガ
ラクトシルレバウディオサイドAを含む甘味成分を溶出
させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥し、淡黄色粉末である甘
味料(以下、甘味料2という。)11.1gを得た。
分の定量を行った。その結果を、第8表に示す。
含むステビア抽出物A2(ステビオサイドの重量割合
1.1重量%、レバウディオサイドAの重量割合91.
3重量%)10.0gとガラクトシル糖化合物として乳
糖100gとを純水500mlに加熱溶解した後、室温
まで放冷し、濃度1mol/lの水酸化ナトリウム水溶
液を用いてpH6.0に調節した。これにβ−1,4−
ガラクトシル転移酵素活性を有する酵素製剤〔ビオラク
タN5、大和化成(株)製〕を1.0g(2477U)
加え、50℃で24時間反応させた。反応後、この反応
液を95℃に30分間保持して酵素を加熱失活させた。
後、反応濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着
樹脂(ダイヤイオンHP−21)500mlを充填した
カラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水
洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度80%の
含水メタノール1000mlを通液し、β−1,4−ガ
ラクトシルレバウディオサイドAを含む甘味成分を溶出
させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥させ、淡黄色粉末である
甘味料(以下、甘味料3という)10.4gを得た。
分の定量を行った。その結果を、第8表に示す。
%、レバウディオサイドAの重量割合11.1%)1
0.0gとガラクトシル糖化合物として乳糖100gと
を純水500mlに加温溶解した後、室温まで放冷し、
濃度1mol/lの水酸化ナトリウム水溶液を用いてp
H6.0に調節した。これに参考例1で得たβ−1,4
ガラクトシル転移酵素活性を有する菌体懸濁液100m
lを加え、50℃で24時間反応させた。反応後、この
反応液を95℃に30分間保持して酵素を加熱失活させ
た。
後、反応濾過液をスチレンジビニルベンゼン系合成吸着
樹脂(ダイヤイオンHP−21)500mlを充填した
カラムに通液し甘味成分を吸着させた。固定相を十分水
洗して本反応で用いた乳糖を除去した後、濃度80%の
含水メタノール1000mlを通液し、β−1,4−ガ
ラクトシルレバウディオサイドAを含む甘味成分を溶出
させ、溶出液を減圧濃縮、乾燥させ、淡黄色粉末である
甘味料(以下、甘味料1′という。)11.0gを得
た。
成分の定量を行った。その結果を、第8表に示す。
味度の評価) 甘味料1、甘味料2、甘味料3、甘味料1′、原料とし
て用いたステビア抽出物A1、ステビア抽出物A2およ
びステビア抽出物Bを用いて、甘味度の評価を行った。
とした。甘味料1、甘味料2、甘味料3、甘味料1′、
原料として用いたステビア抽出物AA1、ステビア抽出
物A2およびステビア抽出物Bの0.025〜0.08
0%濃度の水溶液を0.005%段階濃度で8種類の試
料水溶液を作製し、それぞれの水溶液と標準水溶液とを
比較して甘味度を測定した。試験は試料水溶液と砂糖標
準水溶液との二点比較法で、20人のパネラーにより室
温25℃で行った。結果を第9表及び第10表に示す。
砂糖濃度8%に相当する濃度は、甘味料1は0.060
%(甘味度133倍)、甘味料2は0.0575%(甘
味度139倍)、甘味料3は0.0525%(甘味度1
52倍)、甘味料1′は0.0650%(甘味度123
倍)であった。また、ステビア抽出物A1は0.042
5%(甘味度188倍)、ステビア抽出物A2は0.0
350%(甘味度229倍)、ステビア抽出物Bは0.
0475%(甘味度168倍)であった。
1,4結合させた甘味料の甘味度は、原料であるステビ
ア抽出物A1、ステビア抽出物A2、ステビア抽出物B
のそれぞれの甘味度の70%程度を保持しており、高い
甘味度を有することが明らかとなった。
評価) 甘味料1、甘味料2、甘味料3および甘味料1´を用い
て、甘味質の評価を行った。
濃度の各甘味料の水溶液を調製し、甘味質として主に前
味として感じられるまろやかさ、および後味として感じ
られる苦味や渋味等の嫌味、さらに、甘味の立ち上が
り、切れ、およびシャープさについて同等の甘味度を有
する砂糖と比較して評価した。結果を第11表に示す。
は甘味質のシャープさはほぼ同等の評価であったが、苦
味、甘味の切れ、甘味の立ち上がりの項目では低い評価
であり、味質の改善効果が少ないことが明らかとなっ
た。これに対して甘味料1、甘味料2および甘味料3
は、甘味料1´に比べ主に前味のまろやかさが改善さ
れ、後味の苦味や渋味等の嫌味をさらに抑えることがで
き、全体として砂糖に類似した良質な甘味質に改善され
た。
0g、クエン酸ナトリウム0.20g、サイダーエッセ
ンス0.20g、甘味料1の0.22g、および炭酸水
を混合し、2リットルのサイダーを調製した。20名の
パネラーによる呈味試験の結果、甘味料1を用いたサイ
ダーはあっさりした甘味で残味の切れが良好なサイダー
であった
30g用いた以外は、応用例1と同様にして、サイダー
を作製した。応用例1と同様に呈味試験を行ったとこ
ろ、甘味の立ち上がりや切れの悪さが感じられるサイダ
ーであった。
20g、脱脂粉乳76g、甘味料1の0.26gおよび
温水を混合し2リットルのコーヒーを調製した。20名
のパネラーによる呈味試験の結果、コーヒーの苦味とマ
ッチした良好な甘味を有するコーヒーであった。
30g用いた以外は、応用例2と同様にして、コーヒー
を作製した。応用例2と同様に呈味試験を行ったとこ
ろ、コーヒーの苦味と甘味との感じられるタイミングが
一致せず不自然さが感じられるコーヒーであった。
ウディオサイドAの存在の確認) 実施例1の液体クロマトグラフィー法による分析と同じ
条件で、甘味料3を液体クロマトグラフィー法にて分画
し、β−1,4−ガラクトシルレバウディオサイドAの
推定ピーク留分を単離した。これらを粉末化し、純水に
溶解し2%水溶液を作成した。この溶液1mlを試験管
にとり、これにβ−D−ガラクトシダーゼ(和光純薬工
業株式会社製品)を10unit/mlとなるように添
加後、30℃で24時間反応させた。
をシリカゲルプレート60F254TLCプレート(メ
ルク社製品)にスポットし、対照としてステビオサイ
ド、レバウディオサイドA、分取したβ−1,4−ガラ
クトシルレバウディオサイドA、およびD−ガラクトー
スを併せてスポットした。このプレートをクロロホル
ム:メタノール:水=30:20:4(体積比)の展開
溶媒に展開した。十分に風乾後、0.2%アニスアルデ
ヒドを含有させた濃硫酸を噴霧し、100℃で10分間
加熱して発色させた。この薄層クロマトグラムを図2に
示す。
トしたもの、(b)はレバウディオサイドAをスポット
したもの、(c)は分取したβ−1,4−ガラクトシル
レバウディオサイドAの推定成分をスポットしたもの、
(d)は分取したβ−1,4−ガラクトシルレバウディ
オサイドAのβ−D−ガラクトシダーゼ処理物をスポッ
トしたもの、(e)はD−ガラクトースをスポットした
ものをそれぞれ展開したものを示す。
1,4−ガラクトシルレバウディオサイドAの推定ピー
ク留分をスポットした(c)は、Rf値0.35付近か
ら0.53付近までの連続した発色スポットが観察され
たのに対して、β−D−ガラクトシダーゼ処理して得ら
れた試料をスポットした(d)は、Rf値0.35付近
から0.53付近までの連続した発色スポットが殆ど消
失し、わずかにRf値0.48の残存スポットと、新た
にレバウディオサイドAの発色スポット(b)と一致す
るRf値0.55のスポットと、D−ガラクトースの発
色スポット(e)と一致するRf値0.25のスポット
とが出現した。
0.53付近までの連続した発色スポットが、レバウデ
ィオサイドAとD−ガラクトースとが結合している物
質、即ちβ−1,4−ガラクトシルレバウディオサイド
A誘導体であると確認できた。
るから、以下に記載されるような効果を奏する。本発明
の甘味料は、甘味料中に含まれるβ−1,4−ガラクト
シルレバウディオサイドAの重量割合(GRA)と、甘
味料中に含まれるレバウディオサイドAの重量割合(R
A)の合計(GRA+RA)のステビオール配糖体の含
有割合(X)に対する比が0.4以上で、かつ、GRA
のRAに対する比が1.0以上という関係を有している
ことにより、砂糖に似たまろやかな甘味質で、甘味の立
ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ステビア甘味料
特有の後味の苦味や渋味も低減している。
ディオサイドAは、レバウディオサイドAに付加したガ
ラクトシル基にさらにガラクトシル基が付加重合するこ
とがないために甘味度の低下がレバウディオサイドAの
30%程度に抑えられる。
バウディオサイドAを40重量%以上含むステビア抽出
物と、該ステビア抽出物の重量の5〜20倍のβ−1,
4−ガラクトシル糖化合物とを含む水溶液に、β−1,
4−ガラクトシル転移酵素を作用させるという容易な製
造方法であり、本発明の砂糖に似たまろやかな甘味質
で、甘味の立ち上がりが速く、甘味の切れも良好で、ス
テビア甘味料特有の後味の苦味や渋味も低減した甘味料
を好適に製造することができる。
ムである。
ドAの薄層クロマトグラムである。
オサイドAの推定成分をスポットしたもの (d) 分取したβ−1,4−ガラクトシルレバウディ
オサイドAのβ−D−ガラクトシダーゼ処理物をスポッ
トしたもの (e) D−ガラクトースをスポットしたもの
Claims (9)
- 【請求項1】 ステビオール配糖体を含有し、かつ、下
記式(1)および式(2)を満足することを特徴とする甘味
料。 〔(GRA+RA)/(X)〕≧0.4 (1) 〔(GRA)/(RA)〕≧1.0 (2) 〔式中、GRAは甘味料中に含まれるβ−1,4−結合
ガラクトシル基を1分子中に1〜3個有するβ−1,4
−ガラクトシルレバウディオサイドAの重量割合を表
し、RAは甘味料中に含まれるレバウディオサイドAの
重量割合を表し、Xは甘味料中に含まれるステビオール
配糖体の重量割合を表す。〕 - 【請求項2】 下記式(3)および(4)を満足する請求項
1記載の甘味料。 0.95≧〔(GRA+RA)/(X)〕≧0.5 (3) 10.0≧〔(GRA)/(RA)〕≧1.1 (4) (式中、GRA、RAおよびXは前記と同じである。) - 【請求項3】 下記式(5)を満足する請求項1または2
記載の甘味料。 〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≧1.0 (5) 〔式中、GRAおよびRAは前記と同じである。また、
GSTは甘味料中に含まれるβ−1,4−結合ガラクト
シル基を1分子中に1〜2個有するβ−1,4−ガラク
トシルステビオサイドの重量割合を表し、STは甘味料
中に含まれるステビオサイドの重量割合を表す。〕 - 【請求項4】 下記式(3)、(6)および(7)を満足する
請求項1記載の甘味料。 0.95≧〔(GRA+RA)/(X)〕≧0.5 (3) 5.0≧〔(GRA)/(RA)〕≧1.1 (6) 〔(GRA+RA)/(GST+ST)〕≧1.5 (7) (式中、GRA、RA、X、GSTおよびSTは前記と
同じである。) - 【請求項5】 レバウディオサイドAを40重量%以上
含むステビア抽出物と、該ステビア抽出物固形分重量の
5〜20倍量のβ−1,4−ガラクトシル糖化合物とを
含む水溶液に、β−1,4−ガラクトシル転移酵素を作
用させることを特徴とする甘味料の製造方法。 - 【請求項6】 前記水溶液中のレバウディオサイドAを
40重量%以上含むステビア抽出物固形分濃度が1〜5
重量%であり、且つ、β−1,4−ガラクトシル転移酵
素を前記ステビア抽出物固形分1gに対して1〜100
0ユニット用いる請求項5記載の甘味料の製造方法。 - 【請求項7】 前記レバウディオサイドAを40重量%
以上含むステビア抽出物が、ステビオサイドに対して
1.5重量倍以上のレバウディオサイドAを含むステビ
ア抽出物である請求項5または6記載の甘味料の製造方
法。 - 【請求項8】 前記β−1,4−ガラクトシル糖化合物
が、乳糖である請求項7記載の甘味料の製造方法。 - 【請求項9】 前記β−1,4−ガラクトシル転移酵素
が、バシルス属微生物由来の酵素である請求項7記載の
甘味料の製造方法。
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