JPH0527392B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キク科に属するステビアレバウデイ
アナ・ベルトニー（Stevia rebaudiana
BERTONI）の葉や茎に含まれる甘味成分であ
るレバウデイオサイドＡの酵素法による製造法に
関するものである。更に詳しくは、ステビオサイ
ドとラミナリペンタオース（G₅）を含む水溶性
のG₃〜G₁₁の直鎖β−１，３グルコシルオリゴ糖
化合物とを含有する水溶液に、ストレプトミセス
属に属し、ステビオサイドと上記β−１，３グル
コシルオリゴ糖との間におけるβ−１，３グルコ
シル転移活性を有する酵素を産生し、ステビオサ
イドをレバウデイオサイドＡに転換し得る能力を
有する微生物の培養液、菌体、それらの菌体処理
物またはその微生物から分離された前記β−１，
３グルコシル転移活性を有する酵素を作用させる
ことを特徴としたレバウデイオサイドＡの製造法
に関する。

（従来技術） レバウデイオサイドＡ（β−１，３−モノグル
コシルステビオサイド）はステビア葉や茎に２〜
６％程度含まれ、主成分であるステビオサイド
（６〜12％）に次いで含量が高い。これまでステ
ビア甘味料としてはこの両者の混合物として使用
されているが、ステビオサイドは苦味を有し後味
が残るのに対し、レバウデイオサイドＡは苦味の
ないまろやかな甘味を有し、蔗糖に対比した甘味
倍率も高い。これまでのステビア甘味料の呈味質
の改善法としては天然糖類、アミノ酸を添加する
方法等が多く試みられてきたが、最近ステビオサ
イドに糖を付加させ、カロリーを上げることなく
苦味を解消した新規なステビア甘味料が開発され
ている。（特開昭54−5070号公報） しかしながら、ステビオサイドに比べ甘味倍率
が低下するという欠点を有していた。このことよ
りレバウデイオサイドＡが単独あるいは高含有量
のステビア甘味料の開発が熱望されている。従
来、レバウデイオサイドＡを得る方法としては、
ステビア乾燥葉から抽出、精製して得られたステ
ビオサイドとレバウデイオサイドＡの混合状態か
らステビオサイドを晶析除去後、再結晶をくり返
す方法で行われているが、収率が悪いため、レバ
ウデイオサイドＡを抽出時に高含有にする必要が
ある。

そこで本発明者らは、ステビア葉抽出液中に最
も多く存在するステビオサイドに発酵法又は酵素
法によりグルコースを付加しステビオサイドをレ
バウデイオサイドＡに変換させることを目的とし
た発明を既に完成し、特開昭58−149697号公報と
して出願済である。その先願発明は、ステビオサ
イドとβ−１，３グルコシル糖化合物例えばカー
ドラン、パキマン、ラミナリン等のβ−１，３結
合を有する糖化合物を含有する水溶液に、これら
β−１，３グルコシル化合物からグルコースをス
テビオサイドのアグリコンであるステビオールの
水酸基に結合したβ−Ｄ−グルコースのC₃位に
転移しうる活性すなわちβ−１，３グルコシル転
移活性を有する微生物の培養液、菌体または菌体
処理物を反応させてレバウデイオサイドＡを生成
させることを目的とするものである。

しかしながら、この先願発明の方法では、レバ
ウデイオサイドＡを含む２種以上のβ−１，３グ
ルコシルステビオサイドを生成するが、レバウデ
イオサイドＡへのモル変換率は20％以下であり満
足できるものではなかつた。そこで本発明者らは
更にステビオサイドを著しい選択性を以てレバウ
デイオサイドＡに高変換する能力を有する微生物
を検索すべく、広く自然土壌界から多くの微生物
を分離し、その中から、ストレプトミセス属に属
し、強いβ−１，３グルコシルトランスフエラー
ゼ活性を有している微生物を見出すとともに、該
微生物により高モル変換率でステビオサイドをレ
バウデイオサイドＡのみに変換する能力を見出
し、特開昭59−17996号として出願している。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、使用されたβ−１，３グルコシ
ル糖化合物が高分子の為に水になかなか溶解せず
懸濁液とするために反応に時間がかかるという欠
点、つまりレバウデイオサイドＡの時間当りの生
産量が少ないという欠点があつた。

（問題点を解決する為の手段） そこで本発明者らは先の発明におけるβ−１，
３グルコシル転移酵素がステビオサイドを受容体
として糖を転移させ、レバウデイオサイドＡを生
成させるのに最も適した供給糖基質であるβ−
１，３グルコシル糖化合物について研究を行つた
ところ、グルコース(G)がβ−１，３位で直鎖状に
結合し、しかもその鎖長がグルコース３〜11個の
水溶性β−１，３グルコシルオリゴ糖化合物であ
ることがステビオサイドとの反応に優れているこ
と、その中でも特にグルコースが５個β−１，３
結合したラミナリペンタオースが最も優れてお
り、以下G₅を中心とした近辺のオリゴ糖の順に
反応性に優れていることを見出し、本発明を完成
するに至つた。

即ち本発明は、β−１，３グルコシル糖化合物
とステビオサイドとを含む溶液に、ストレプトミ
セス属に属し、β−１，３グルコシル転移活性を
有する酵素を産生し、ステビオサイドをレバウデ
イサイドＡに転換する能力を有する微生物の培養
液、菌体処理物又はその微生物から分離された前
記β−１，３グルコシル転移活性を有する酵素を
作用させてレバウデイオサイドＡを製造する方法
において、β−１，３グルコシル糖化合物とし
て、グルコース(G)が３〜11個の水溶性直鎖β−
１，３グルコシルオリゴ糖化合物を用いることを
特徴とするレバウデイオサイドＡの製造法であ
る。

本発明で使用されるストレプトマイセス属の菌
株は、β−１，３グルコシルトランスフエラーゼ
を含有し、ステビオサイドとラミナリペンタオー
スを含むG₃〜G₁₁のラミナリオリゴ糖化合物とに
よりレバウデイオサイドＡを生産する菌であれば
いずれでも良いが、ここでは好ましい菌としてス
トレプトマイセス・マテンシスDIC−108菌が挙
げられる。また他の好ましいものとしてこれらの
菌株を人工的に変異処理即ち化学的、物理的手段
による変異誘発処理を行うことにより得られる人
為的突然変異株、あるいは自然変異株も全て含ま
れる。

本発明で好ましく使用される前述の菌学的性質
は次のとおりである。

〔ストレプトミセス・マテンシスDIC−108の菌
学的性質〕 (1) 形態特徴 使用した培地（ISP培地を含む）上での栄養
菌糸の生育は優れており、デンプン無機塩、オ
ートミール寒天、イースト麦芽寒天培地上で豊
富な気菌糸を形成する。胞子形成気菌糸は直状
又は直曲状である。胞子は楕円体で大きさは、
短径×長径0.7〜0.8μ×1.0〜1.2μである。走査
型電子顕微鏡による観察により観察では胞子の
表面構造はイボ状（Warty）である。

(2) 各種培地における生育状態 (1) シユクロース硝酸塩寒天培地（37℃） 薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成
し、溶解性色素はみとめられない。

(2) グルコース・アスパラギン寒天培地（37
℃） 薄黄白色の生育で気菌糸の形成はみとめら
れない。また溶解性色素はみとめられない。

(3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
培地−No.５ 37℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられ
ない。又、溶解性色素はみとめられない。

(4) スターチ・無機塩寒天培地（ISP培地 37
℃） 無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。

(5) チロシン寒天培地（ISP培地−No.７、37
℃） 薄茶色の発育上に培養７日目では気菌糸は
着生せず、14日目で白灰色の気菌糸を着生す
る。溶解性色素はみとめられない。

(6) 栄養寒天培地（37℃） 緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着
生し、溶解性色素はみとめられない。

(7) イースト麦芽寒天培地（ISP培地−No.２、
37℃） 薄茶色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生
する。水溶性色素の生成はみとめられない。

(8) オートミール寒天培地（ISP培地−No.３、
37℃） 無色の生育上に緑茶灰色の気菌糸を着生
し、水溶性色素の生成はみとめられない。

(3) 生理的性質 (1) 生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生
育試験では、30℃〜50℃で生育するが、至適
温度は37℃〜45℃である。

(2) ゼラチンの液化：陰性 (3) 脱脂乳の凝固及び脱脂乳のペプトン化：陰
性 (4) メラニン色素の生成（ペプトン・イース
ト・鉄寒天培地、ISP培地６）：陰性 (5) デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白
いリングを形成） (6) 炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリーブ
寒天培地−９、37℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、Ｄ−フルクトース、イノシトー
ル、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、ガ
ラクトースをよく利用して生育し、シユクロ
ース、ラフイノース、サリシンは利用しな
い。

(7) 細胞壁組成 ISPに記載されている糖組成Typeとして
はTypeIに属する。

なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請し、微工研菌寄第6593号として受託
されている。

本発明の直鎖β−１，３グルコシルオリゴ糖化
合物は、水溶性のG₃〜G₁₁（グルコースが３〜11
個）の直鎖β−１，３グルコシルオリゴ糖化合物
であればいずれから得られたものでも良く、中で
もラミナリペンタオースを含むのが特に好まし
い。

ラミナリペンタオースは、G₃〜G₁₁の直鎖β−
１，３グルコシルオリゴ糖化合物中において20重
量％以上含まれるのが良い。好ましくは50重量％
以上、より好ましくは70重量％以上含まれるのが
良い。

こうしたラミナリペンタオースを含む特定のβ
−１，３グルコシルオリゴ糖化合物を得るには、
β−１，３グルコシル糖化合物又はその部分分解
物をラミナリペンタオースを含むβ−１，３グル
コシルオリゴ糖化合物に分解する能力を有する微
生物あるいはそれらの酵素で分解させて得れば良
い。こうしたβ−１，３糖分解能を有する微生物
としては、例えばリゾクトニア属、リゾープス
属、フラボバクテリウム属、アースロバクター
属、オエルスコビア属、ストレプトミセス属等が
挙げられる。

例えば前述のストレプトミセス・マテンシス
DIC−108を培養して得られた培養液中には、β
−１，３グルカナーゼFiIとβ−１，３グルコシ
ルトランスフエラーゼを含む他のグルカナーゼの
両者を同時に生産するので、培養液を濃縮後、弱
陰イオン交換樹脂であるDEAE−セルロース又は
DEAE−セフアデツクスカラムを通過させること
により、両者は分離される。すなわちβ−１，３
グルカナーゼFiIは未吸着分として回収され、β
−１，３グルコシルトランスフエラーゼ及び他の
グルカナーゼは0.2M以上のNaCl溶液で溶出する
ことにより得られる。

まずβ−１，３グルコシル糖化合物として例え
ば１〜20wt％のカードランにβ−１，３グルカ
ナーゼFiIを作用させ、通常PH３〜10好ましくは
５〜８、温度20〜70℃好ましくは30〜60℃で0.5
〜24時間反応することにより、収率70重量％以上
でラミナリペンタオースが得られるが、この場合
カードランに限つたものはなく、酵母細胞壁、パ
キマン、ラミナリン等任意のβ−１，３グルコシ
ル糖化合物を用いてラミナリペンタオース含有生
成物を生成させることも可能であることは勿論で
ある。こうして得られたラミナリペンタオースを
含む0.1〜30wt％のラミナリオリゴ糖に対し0.1〜
10wt％のステビオサイドを溶解させた液に、β
−１，３グルコシルトランスフエラーゼを作用さ
せると、水不溶性の高分子であるカードランを糖
基質として用いた場合の少なくとも、２〜15倍の
速度で反応率20〜60％、ステビオサイドからのモ
ル変換率40〜80％でレバウデイオサイドＡを生産
する。

本発明で使用するβ−１，３グルコシル糖化合
物を分解するのに好ましく用いられるβ−１，３
分解酵素は前述したストレプトミセス・マテンシ
スDIC−108から得られるものである。

そこで次にβ−１，３グルカナーゼFiI（β−
１，３糖分解酵素）の性質を示す。

(1) 作用：β−１，３グルコシル糖化合物、例え
ばカードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細
胞壁、又はその部分分解物のどからラミナリペ
ンタオースを主成分とする糖分物を生成する。

(2) 作用PH範囲及び最適作用PH：PH３〜９の範囲
に作用し、最適PHは６付近である。

(3) 作用温度範囲及び最適作用温度：約70℃まで
作用し、最適作用温度は約60℃である。

(4) 精製方法 本酵素は培養濾過液から硫安65％飽和で沈殿
物として回収後、DEAE−Sephadex Ａ−25カ
ラムクロマトグラフイー（0.01Mトリス−HCl
緩衝液、PH7.5で平衡化）を行い、その未吸着
区分を集める。次いでCM−セフアデツクスＣ
−25カラムクロマトグラフイー（0.01M酢酸バ
ツフアー、PH6.0で平衡化）を行い、NaCl
0.1M溶液で溶出される区分を集め、硫安50〜
70％飽和としてその沈殿物を回収する。その
後、セフアデツクスＧ−100（フアルマシア社
製）ゲルクロマトグラフイー（0.01Mリン酸バ
ツフアー、PH7.0で平衡化）を行うことにより、
クロマト的に単一酵素に精製できる。

(5) 分子量：セフアデツクスＧ−100ゲルクロマ
トグラフイーによる分子量は約31000と推定で
きる。

本発明で使用されるβ−１，３グルカナーゼ及
びβ−１，３トランスフエラーゼは、これら好ま
しい微生物を、通常の微生物が利用し得る炭素
源、窒素源、無機成分など公知の栄養源を含有す
る液体倍地で好気的条件で常法により培養して得
られる。

炭素源としては、例えばスターチ、アミロー
ス、カードラン、パキマン、ラミナリン、アミロ
ペクチンなどの多糖類、メタノール、グリセリ
ン、高級アルコール等のアルコール類、コハク
酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸類およびその塩
類、澱粉、麦芽糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖
類があげられ、好ましくはパキマン、カードラ
ン、ラミナリンである。窒素源としては、例えば
硫安、塩安、リン安、硫酸ナトリウム、尿素、ペ
プトン、カゼイン等有機無機いずれも使用でき
る。

炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含む
天然栄養源としては、例えば各種糖密、コーンス
テイープリーカー、オートミール、味液、魚粉、
肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦
芽エキスなどがあげられる。無機物としては、例
えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、硫
酸マグネシウム、微量金属類などが挙げられる。
その他、必要に応じてビタミン類等を添加するこ
ともできる。使用濃度としては、0.1〜40重量％
が用いられる。また酵素中の発泡を抑制するため
1.0重量％以下の消泡剤を添加してもよい。消泡
剤としては、シリコーン、大豆油など通常の消泡
剤を用いる。

培養方法は、振盪培養、通気培養などの好気的
液体培養が適しており、PH5.0〜8.0、20℃〜50℃
で１〜６日、望ましくはPH6.5〜7.5、35℃40℃で
２日前後培養する。

本発明に用いるステビオサイドとは、高度に精
製されたステビオサイドに限られることなく、ス
テビオサイドとレバウデイオサイドＡの混合物で
あつても良く、さらに他の夾雑物を含有している
粗製品であつても、同様に本発明を実施すること
ができる。

本発明の方法に用いるβ−１，３グルコシル糖
化合物としては、好ましく使用されるストレプト
ミセス・マテンシスDIC−108によつてステビオ
サイドからレバアウデイオサイドＡを生成するも
のであればいずれでも良いが、例えば、パキマ
ン、カードラン、ラミナリン、酵母細胞壁又は酵
母細胞壁の部分分解物、ここで言う酵母とは、例
えばサツカロマイセス属、キヤンデイダ属、ピヒ
ア属、シゾサツカロマイセス属、トルロプシス
属、ハイセヌラ属等を言うものであり、更にリユ
ウコシン（珪藻類の細胞壁）、カロース（高等植
物ハセオラス細胞壁）、パラミロン（単細胞藻類
の細胞壁）、リケナン（コケの抽出物）、イネ科植
物の種子胚乳より得られる糖類（ここで言うイネ
科植物とはイネ、オオムギ、コムギ等を指称す
る）、などのβ−１，３グルコシル糖化合物含有
物が挙げられる。それらのうち好適なものとして
は、パキマン、カードランやラミナリンが挙げら
れ、これらは入手し易い点からもより好ましい。
尚、カードランとは、β−１，３グルコシド結合
を主体とする水不溶性のβ−グルカンであり、そ
の懸濁液を加熱するとかたい弾力性のある熱不可
逆性のゲルをつくる多糖の総称である。このもの
は現在のところ微生物によつてつくられたものが
市販されている。（Agr.Biol.Chem.、29、757、
“65又は発酵と工業36、２、”78参照）。

本発明で好ましく使用されるストレプトミセ
ス・マテンシスDIC−108を培養した培養液及び
菌体はバツチ式で反応させてもよいし、公知の方
法により菌体を固定化して連続的に変換反応を行
わせることもできる。

本発明の転移反応条件は、ステビオサイドとβ
−１，３グルコシル糖化合物とを含有する水溶液
に、ストレプトミセス・マテンシスDIC−108の
培養液、菌体、菌体処理物、又はこれらより分離
されたβ−１，３グルコシル転移活性を有する酵
素を反応させればよい。反応に用いるステビオサ
イドは、精製ステビオサイドの場合、反応液中の
ステビオサイドの濃度を約0.1〜約10重量％とし、
β−１，３グルコシル糖化合物の濃度を約0.1〜
約30重量％とすればよい。これらの反応液のPHと
温度はβ−１，３グルコシルトランスフエラーゼ
が反応してレバウデイオサイドＡを生成させうる
条件であればよいが、通常PH３〜10好まくはPH５
〜８、温度20〜70℃好ましくは30〜50℃が適当で
ある。このようにしてレバウデイオサイドＡを生
成せしめた反応溶液は、そのままでも甘味料とし
て使用できる。また必要に応じて、酵素あるいは
菌体を加熱失活させた後、スチレンとジビニルベ
ンゼンの重合吸着樹脂例えばダイヤイオンHP−
20（商品名、三菱化成社製）、アンバーライト
XAD−２（商品名、オルガノ社製）等、又はイオ
交換樹脂（例えばＨ型強酸性イオン交換樹脂およ
びOH型弱塩基性イオ交換樹脂）を用いて脱塩
し、これを濃縮してシラツプ状の甘味料とする
か、又は乾燥、粉末化して粉末状の甘味料とする
こともできる。

更に脱塩した反応溶液を精製してレバウデイオ
サイドＡを分離採取して甘味料とすることもでき
る。この際、濃縮、乾燥、粉末化は公知の方法、
例えば減圧濃縮、膜濃縮、真空乾燥、噴霧乾燥等
の各種方法が自由に用いられる。このようにして
得られたレバウデイオサイドＡの甘味度は、甘味
度の測定条件によつても異なるが一般には、反応
に用いたステビオサイドの固型物重量に見合う甘
味度に比べおよそ1.3倍強い。またその甘味の質
は、苦味や渋味等の嫌味がなく、まろやかな甘味
であつて砂糖に似ており、残味の切れもよい。

このレバウデイオサイドＡは、苦味、嫌味、ア
ク味等が全くない無臭、白色の粉末で水に可溶で
あるためステビオシド及びグリチルリチンと共存
比率、又液体、粉末状の条件下で任意に共存させ
ることができる。また、レバウデイオサイドＡ
は、サツカリン及びその塩類、サイクラミン酸ナ
トリウム、ジヒドロカルコン、アスパラテーム等
の周知の合成甘味物質と共用してその呈味特性を
有効利用することが可能であり、これらの合成甘
味物質の１種又は２種以上に本化合物を添加使用
すれば、合成甘味物質特有の苦味、嫌味等の不快
味を改良することが可能となる。

また、レバウデイオサイドＡを賦形剤、希釈
剤、吸着剤的に使用されている砂糖、果糖、ブド
ウ糖、乳糖、水飴、デキストリン、デンプン等の
周知の糖類甘味に添加使用することにより、甘味
が増強され、従来の使用量よりも、大幅にその使
用量を削減することが可能となる。更に本化合物
をソルビツト、マルテトール、マンニトール、キ
シリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリ
ー甘味物質に添加使用すれば甘味物質の長所を損
なうことなく甘味を増強することが出来、良質の
低カロリー甘味量が得られる。

レバウデイオサイドＡはこの様に一般食品及び
ダイエツト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼料
等の甘味源として使用できることはいうまでもな
い。

例えば、しよう油、粉末しよう油、みそ、粉末
みそ、もろみ、マヨネーズ、ドレツシング、食
酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、め
んつゆ、ソース、ケチヤツプ、焼肉のタレ、カレ
ールー、シチユーの素、スープの素、ダシの素、
複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシラツ
プ等の各種の調味料、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゆう、ういろう、あん類、羊か
ん、水羊かん、ゼリー、カステラ、餅等の各種和
菓子、パン、ビスケツト、クラツカー、クツキ
ー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタード
クリーム、シユークリーム、ワツフル、スポンジ
ケーシ、ドーナツ、チヨコレート、チユーインガ
ム、キヤラメル、キヤンデー等の各種洋菓子、ア
イスクリーム、シヤーベツト、アイスキヤンデー
等の氷菓、果実のシロツプ漬、水密等のシロツプ
類、フラワーペースト、ピーナツツペースト、フ
ルーツペースト等のペースト類、ジヤム、マーマ
レード、シロツプ漬、糖菓などの果実、野菜の加
工食品類、福神漬、千枚漬、らつきよう漬等の漬
物類、ハム、ソーセージ等の畜肉製品類、食肉ハ
ム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷら
等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さきするめ、
ふぐのみりん干等の各種珍味類、のり、山菜、す
るめ、小魚、貝等で製造されるつくだ煮類、煮
豆、ポテトサラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚
肉、畜内、果実、野菜のビン詰、缶詰類、合成
酒、果実酒、洋酒等の酒類、コーヒー、ココア、
ジユース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料等の
清涼飲料水、プリンミツクス、ホツトケーキミツ
クス、即席ジユース、即席コーヒー、即席しるこ
等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物の甘味付に
使用できる。その他、医薬品及び医薬部外品とし
ては練歯みがき、口紅、リツプクリーム、内服
薬、トローチ、肝油ドロツプ、口中清涼剤、口中
香錠、うがい薬等への甘味剤として使用すること
も自由に行いうる。

以下に、本発明の方法およびそれによつて得ら
れる甘味料について実施例により具体的に説明す
るが、以下の％は重量基準とする。

実施例 １ (1) β−１，３−グルカナーゼFiI及びβ−１，
３グルコシルトランスフエラーゼの調製 ストレプトミセス・マテンシスDIC−108（微工
研菌寄第6593号）を酵母エキス0.2W／Ｖ％、ポ
リペプトン0.2W／Ｖ％、MgSO₄・7H₂O 0.1W／
Ｖ％、K₂HPO₄ 0.2W／Ｖ％からなる培地５に
植菌し、同時に別殺菌したカードラン50ｇを加え
て10Jarにて35℃で60時間通気撹拌培養した。
得られた培養液3.8を遠心分離してその上清液
を硫安0.65飽和で塩折し、β−１，３グルカナー
ゼFiIとβ−１，３グルコシルトランスフエラー
ゼ活性を含有する粗酵素標品（）を得た。

（）よりβ−１，３グルカナーゼFiIを分
離・精製するには、（）を0.01Mトリス緩衝液
（PH7.5）にて溶解し、同緩衝液にて透析脱塩後、
同緩衝液にて平衡化したDEAE−セフアデツクス
Ａ−25（100ml）カラムに吸着させ、その未吸着部
分を回収することにより得られる。又、β−１，
３グルコシルトランスフエラーゼは同カラムの吸
着分を0.2M NaCl溶液にて溶出し、さらにハイ
ドロキシアパタイトカラムに吸着後、0.1Mのリ
ン酸緩衝液で溶出することにより得られる。この
ときのβ−１，３グルカナーゼFiIの酵素活性は
約2413単位であり、β−１，３グルコシルトラン
スフエラーゼ活性は約1600単位であつた。尚、こ
こでいうβ−１，３グルカナーゼFiIの酵素活性
１単位とは、0.01Mの酢酸バツフアー（PH6.0）
にカードラン１％を懸濁させ、それに適量の酵素
を加えて、水で5.0mlとし45℃で反応させる。こ
の条件で１時間に１mgのグルコースに相当する還
元力を生成する酵素量をいう。また、β−１，３
グルコシルトランスフエラーゼの酵素活性１単位
とは、PH7.0、0.1Mのリン酸緩衝液で0.5％のステ
ビオサイドと２％のカードランを懸濁させ、それ
に適量の酵素を加えて、水で5.0mlとし、45℃で
反応させる。この条件で１時間に1μモルのレバ
ウデイオサイドＡを生成させる酵素量をいう。

(2) ラミナリペンタオースの製造 カードラン（和光純薬工業株式会社販売）100
ｇを水道水（PH6.6）２に懸濁させ、β−１，
３グルカナーゼFiI88単位を添加して、45℃で16
時間反応させた。その後、ブフナーにて濾過後、
ロータリーエバポレーターにて濃縮し、凍結乾燥
を行つて、固型物として82ｇを得た。このものの
糖成分を高速液体クロマトグラフイー〔充填剤；
Lichrosorb NH₂（メルク社：5μｍ）〕、溶出液
（アセトニトリル60％、水40％）で分離定量を行
つた結果、ラミナリペンタオースが95％で残り５
％はラミナリトリオース、ラミナリテトラオー
ス、ラミナリヘキサオース等であつた。

(3) 転移反応（レバウデイオサイドＡの製造） ステビオサイド（純度98％）10ｇ、ラミナリペ
ンタオース（純度95％）20ｇ、先に調製したβ−
１，３グルコシルトランスフエラーゼ10単位を
0.01M酢酸緩衝液（PH6.0）１に溶解し、45℃
で16時間反応させた。その後、90℃で10分間加熱
し、酵素を失活させた。この溶液を合成吸着樹脂
ダイヤオンHP−20にS.V.＝２で通し、ステビオ
サイド類を吸着させた後、95％エタノールで脱着
した。脱着液のエタノールを減圧留去した後、強
酸性イオン交換樹脂であるアンバーライト−IR
−120B（Ｈ型、商品名、ロームアンドハース社製
品）、弱塩基性イオン交換樹脂であるアンバーラ
イト−IRA−93（OH型、商品名、ロームアンド
ハース社製品）にS.V.＝２で通して脱塩した。つ
いでこれを70℃以下で減圧濃縮し、真空乾燥して
粉末のレバウデイオサイドＡを3.6ｇ、及びステ
ビオサイドを3.2ｇを得た。

比較例 １ 実施例１のラミナリペンタオースの代りにカー
ドラン20ｇを入れた以外は全く同様の操作を行つ
たところ、粉末のレバウデイオサイドA1.3ｇ、
ステビオサイド5.4ｇを得た。

実施例 ２ ラミナリペンタオースの含量が30％、その他の
G₃〜G₁₁のオリゴ糖が70％のβ−１，３グルコシ
ル糖化合物を用いる以外実施例１と同様に反応を
行い精製を行つたところ、レバウデイオサイド
A3.0ｇ、ステビオサイド2.5ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ β−１，３グルコシル糖化合物とステビオサ
   イドとを含む溶液に、ストレプトミセス属に属
   し、β−１，３グルコシル転移活性を有する酵素
   を産生し、ステビオサイドをレバウデイオサイド
   Ａに転移する能力を有する微生物の培養液、菌体
   処理物又はその微生物から分離された前記β−
   １，３グルコシル転移活性を有する酵素を作用さ
   せてレバウデイオサイドＡを製造する方法におい
   て、β−１，３グルコシル糖化合物として、グル
   コース(G)が３〜11個の水溶性直鎖β−１，３グル
   コシルオリゴ糖化合物を用いることを特徴とする
   レバウデイオサイドＡの製造法。