JPS6196995A - レバウデイオサイドａの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キク科に屈するステビアレバウディアナ・べ
　　・ルトニー（Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ
　ＢＥＲＴＯＮＩ　）の葉や茎に含まれる甘味成分であ
るレバウディオサイドＡの酵素法による製造法に関する
ものである。更に詳しくは、ステビオサイドとラミナリ
ベンタオース（Ｇｓ　）を含む水溶性の０３〜Ｇｌｌの
直鎖β−１，３グルコシルオリゴ糖化合物とを含有する
水溶液に、ストレプトミセス属に属し、ステビオサイド
と上記β−１，３グルコシルオリゴ糖との間におけるβ
−１，３グルコシル転移活性を有する酵素を産生し、ス
テビオサイドをレバウディオサイドＡに転換し得る能力
を有する微生物の培養液、菌体、それらの菌体処理物ま
たはその微生物から分離された前記β−１，３グルコシ
ル転移活性を存する酵素を作用させることを特徴とした
レバウディオサイドＡの製造法に関する。

（従来技術） レバウディオサイドＡ（β−１，３−モノグルコシルス
テビオサイド）はステビア葉や茎に２〜６％程度含まれ
、主成分であるステビオサイド（６〜１２％）に次いで
含量が高い、これまでステビア甘味料としてはこの両者
の混合物として使用されているが、ステビオサイドは苦
味を有し後味が残るのに対し、レバウディオサイドＡは
苦味のないまろやかな甘味を有し、蔗糖に対比した甘味
倍率も高い。

これまでのステビア甘味料の呈味質の改善法としては天
然糖類、アミノ酸を添加する方法等が多く試みられてき
たが、最近ステビオサイドに糖を付加させ、カロリーを
上げることなく苦味を解消した新規なステビア甘味料が
開発されている。（特開昭５４−５０７０号公報）しか
しながら、ステビオサイドに比べ甘味倍率が低下すると
いう欠点を有していた。このことよりレバウディオサイ
ドＡが単独あるいは高含有量のステビア甘味料の開発が
熱望されている。従来、レバウディオサイドＡを得る方
法としては、ステビア乾燥葉から抽出、精製して得られ
たステビオサイドとレバウディオサイドＡの混合状態か
らステビオサイドを晶析除去後、再結晶をくり返す方法
で行われているが、収率が悪いため、レバ・ウディオサ
イドＡを抽出時に高含有にする必要がある。

そこで本発明者らは、ステビア葉抽出液中に最も多く存
在するステビオサイドに発酵法又は酵素法によりグルコ
ースを付加しステビオサイドをレバウディオサイドＡに
変換させることを目的とした発明を既に完成し、特開昭
５８−１４９６９７号公報として出願済である。その先
願発明は、ステビオサイドとβ−１，３グルコシル糖化
合物例えばカードラン、バキマン、ラミナリン等のβ−
１，３結合を有する糖化合物を含有する水溶液に、これ
らβ−１，３グルコモ ンであるステビオールの水酸基に結合したβ−Ｄ−グル
コースの０３位に転移しうる活性すなわちβ−１，３グ
ルコシル転移活性を有する微生物の培養液、面体または
菌体処理物を反応させてレバウディオサイドＡを生成さ
せることを目的とするものである。

しかしながら、この先願発明の方法では、レバウディオ
サイドＡを含む２種以上のβ−１，３グルコシルステビ
オサイドを生成するが、レバウディオサイドＡへのモル
変換率は２０％以下であり満足できるものではなかった
。そこで本発明者らは更にステビオサイドを著しい選択
性を以てレバウディオサイドＡに高変換する能力を有す
る微生物を検索すべく、広く自然土壌界から多くの微生
物を分離し、その中から、ストレプトミセス属に属し、
強いβ−１，３グルコシルトランスフエラーゼ活性を有
している微生物を見出すとともに、該微生物により高モ
ル変換率でステビオサイドをレバウディオサイドＡのみ
に変換する能力を見出し、特開昭５９−１７９９６号と
して出願している。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、使用されたβ−１，３グルコシル糖化合
物が高分子の為に水になかなか熔解せず懸濁液とするた
めに反応に時間がかかるという欠点、つまりレバウディ
オサイドＡの時間当りの生成量が少ないという欠点があ
った。

（問題点を解決する為の手段） そこで本発明者らは先の発明におけるβ−１，３グルコ
シル転移酵素がステビオサイドを受容体として糖を転移
させ、レバウディオサイドＡを生成させるのに最も適し
た供給糖基質であるβ−１，３グルコシル糖化合物につ
いて研究を行ったところ、グルコース（Ｇ）がβ−１，
３位で直鎖状に結合し、しかもその鎖長がグルコース３
〜１１個の水溶性β−１，３グ、ルコシルオリゴ糖化合
物であることがステビオサイドとの反応に優れているこ
と、その中でも特にグルコースが５個β−１，３結合し
たラミナリペンタオースが最も優れており、以下ａＳを
中心とした近辺のオリゴ糖の順に反応性に優れているこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、β−１，３グルコシル糖化合物とステビ
オナイドとを含む溶液に、ストレプトミセス属に属し、
β−１，３グルコシル転移活性を有する酵素を産生し、
ステビオサイドを、レバウディサイドＡに転換する能力
を有する微生物の培養液、菌体処理物又はその微生物か
ら分離された前記β−１，３グルコシル転移活性を存す
る酵素を作用させてレバラブ１４イドＡを製造する方法
において、β−１，３グルコシル糖化合物として、グル
コース（Ｇ）が３〜１１個の水溶性直鎖β−１，３グル
コシルオリゴ糖化合物を用いることを特徴とするレバウ
ディオサイドＡ（７）＃進法である。

本発明で使用されるストレプトマイセス属の菌株は、β
−１，３グルコシルトランスフエラーゼを含有し、ステ
ビオサイドとラミナリペンタオースを含む０３〜Ｇ／／
のラミナリオリゴ塘化合物とによりレバウディオサイド
Ａを生産する菌であればいずれでも良いが、ここでは好
ましい菌としてストレプトマイセス・マテンシスＤＩＣ
−１０８菌が挙げられる。また他の好ましいものとして
これらの菌株を人工的に変異処理即ち化学的、物理的手
段による変異誘発処理を行うことにより得られる人為的
突然変異株、あるいは自然変異株も全て含まれる。

本発明で好ましく使用される前述の菌学的性質は次のと
おりである。

〔ストレプトミセス・マテンシスＤＩＣ−１０８の菌学
的性質〕（１）　　形態的特徴 使用した培地（ＩＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の生
育は優れており、デンプン無機塩、オートミール寒天、
イースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。胞
子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は楕円体で
大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ×１．０〜１．
２μである。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表
面構造はイボ状（Ｗａｒｔｙ　）である。

（２）各種培地における生育状態 １）シュクロース硝酸塩寒天培地（３７℃）薄茶色の基
生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色素はみとめ
られない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃）ｍ黄
白色の生育で気菌糸の形成はみとめられない。

また溶解性色素はみとめられない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（Ｉ　ＳＰ培地
−隊５３７℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられない、又、熔
解性色素はみとめられない。

４）スターチ・無機塩寒天培地（Ｉ　ＳＰ培地　３７℃
）無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解他色薄
茶色の発育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１４
日目で白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素はみとめ
られない。

６）栄養寒天培地（３７℃） 緑灰黒色の発育上に薄縁灰色の気菌糸を着生し、溶薄茶
色の発育上に薄縁灰色の気菌糸を着生する。水熱色の生
育上に緑茶灰色の気菌糸を着生し、水溶性色素の生成は
みとめられない。

（３）　　生理的性質 １）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
３０℃〜５０℃で生育するが、至適温度は３７℃〜４５
℃である。

２）ゼラチンの液化；陰性 ３）脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陰性 ４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ培地６）：陰性 ５）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリング
を形成） ６）炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリーブ寒天培地
−９，３７℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ
−マンニトール、ガラクトースをよ（利用して生育し、
シェフロース、ラフィノース、サリシンは利用しない。

７）細胞壁組成 ＩＳＰに記載されている糖組成ＴｙｐｅとしてはＴｙｐ
ｅ　Ｉに属する。

なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請し、微工研菌寄第６５９３号として受託されている
。

本発明の直鎖β−１，３グルコシルオリゴ糖化合物は、
水溶性のＧ３　＝Ｇｚｌ　　（グルコースが３〜１１個
）の直鎮β−１，３グルコシルオリゴ糖化合物であれば
いずれから得られたものでも良く、中でもラミナリペン
タオースを含むのが特に好ましい。

ラミナリペンタオースは、Ｇ３〜Ｇｔ７の直鎖β−１，
３・グルコシルオリゴ糖化合物中において２０重量％以
上含まれるのが良い、好ましくは５０重量％以上、より
好ましくは７０重量％以上含まれるのが良い。

こうしたラミナリペンタオースを含む特定のβ−１，３
グルコシルオリゴ糖化合物を得るには、β−１，３グル
：ｔシル糖化合物又はその部分分解物をラミナリベンタ
オースを含むβ−１，３グルコシルオリゴ糖化合物に分
解する能力を有する微生物あるいはそれらの酵素で分解
させて得れば良い。こうしたβ−１，３糖分解能を有す
る微生物としては、例えばりジフトニア属、Ｖ、ゾーブ
ス属、フラボバクテリウム属、アースロバフタ−属、オ
エルスコビア属、ストレプトミセス属等が挙げられる。

例えば前述のストレプトミセス・マテンシスＤＩＣ−１
０８を培養して得られた培養液中には、β−１，３グル
カナーゼＦｉｒとβ−１，３グルコシルトランスフエラ
ーゼを含む他のグルカナ−、ゼの両者を同時に生産する
ので、培養液を濃縮後、弱陰イオン交換樹脂であるＤＥ
ＡＥ−セルロース又はＤＥＡＥ−セファデックスカラム
を通過させることにより、両者は分離される。すなわち
β−１，３グル力ナーゼＦｉ日よ未吸着分として回収さ
れ、β−１１，３グルコシルトランスフエラーゼ及び他
のグルカナーゼは０．２Ｍ以上のＮａＣｌ溶液で溶出す
ることにより得られる。

まずβ−１，３グルコシル糖化合物として例えば１〜２
０れ％のカードランにβ−１，３グルカナーゼＦｉｌを
作用させ、通常ｐｔｒ３〜１０好ましくは５〜８、温度
２０〜７０℃好ましくは３０〜６０℃で０．５〜２４時
間反応することにより、収率７０重量％以上でラミナリ
ペンタオースが得られるが、この場合カードランに限っ
たものではなく、酵母細胞壁、バキマン、ラミナリン等
任意のβ−１，３グルコシル糖化合物を用いてラミナリ
ペンクオース含有生成物を生成させることも可能である
ことは勿論である。こうして得られたラミナリペンタオ
ースを含む０．１〜３０れ％のラミナリオリゴ糖に対し
０．１〜１０１１ｔ％のステビオサイドを溶解させた液
に、β−１，３グルコシルトランスフエラーゼを作用さ
せると、水不溶性の高分子であるカードランを糖基質と
して用いた場合の少な（とも、２〜１５倍の速度で反応
率２０〜６０％、ステビオサイドからのモル変換率４０
〜８０％でレバウディオサイドＡを生産する。

本発明で使用するβ−１，３グルコシル糖化合物を分解
するのに好ましく用いられるβ−１，３分解酵素は前述
したストレプトミセス・マテンシスＤＩＣ−１０８から
得られるものである。

そこで次にβ−１，３グルカナーゼＦｉｌ（β−１，３
糖分解酵素）の性質を示す。

１１１　　作用：β−１，３グルコシル糖化合物、例え
ばカードラン、ラミナリン、バキマン、酵母細胞壁、又
はその部分分解物などからラミナリペンタオースを主成
分とする糖分解物を生成する。

（２ン　　作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ：ｐＨ３〜９
の範囲に作用し、最適ｐＨは６付近である。

（３）　　作用温度範囲及び最適作用温度：約７０℃ま
で作用し、最適作用温度は約６０℃である。

（４）精製方法 本酵素は培養濾過液から硫安６５％飽和で沈殿物として
回収後、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　−
２５カラムクロマトグラフイー（０，ＯＩＭ）リスーＭ
ＣＩ緩衝液、ｐＨ７，５で平衡化）を行い、その未吸着
区分を集める０次いでＣＭ−セファデックスＣ−２５カ
ラムクロマトグラフイー（０，０１Ｍ酢酸バッファー、
ｐＨ６，０で平衡化）を行い、ＮａＣ１０，１Ｍ溶液で
溶出される区分を集め、硫安５０〜７０％飽和としてそ
の沈殿物を回収する。その後、セファデックスＧ−１０
０（）７）レマシア社製）ゲルクロマトグラフィー（０
，０１Ｍリン酸ノマッファー、ｐＨ７，０で平衡化）を
行うことにより、クロマト的に単一酵素に精製できる。

（６）分子量：セファデツクスｃ−ｔｏｏゲルクロマト
グラフィーによる分子量は約３１０００と推定できる。

本発明で使用されるβ−１，３グルカナーゼ及びβ−１
゜３トランスフエラーゼは、これら好ましい微生物を、
通常の微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機成分な
ど公知の栄養源を含有する液体培地で好気的条件で常法
により培養して得られる。

炭素源としては、例えばスターチ、アミロース、カード
ラン、バキマン、ラミナリン、アミロペクチンなどの多
糖類、メタノール、グリセリン、高級アルコール等のア
ルコール類、コハク酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸類
およびその塩類、澱粉、麦芽糖、ブドウ糖、ラムノース
等の糖類があげられ、好ましくはパキマン、カードラン
、ラミナリンである。窒素源としては、例えば硫安、塩
安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、カゼイ
ン等有機無機いずれでも使用できる。

炭素源、窒素源およ、びその他の栄＃物質を含む天然栄
養源としては、例えば各種機密、コーンステイーブリー
カー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母、酵
母エキス、ポテトエキス、麦弗エキスなどがあげられる
。無機物としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸−
ナトリウム、硫酸マグネシウム、微量金属類などが挙げ
られる。その他、必要に応じてビタミン類等を添加する
こともできる。使用濃度としては、０．１〜４０重量％
が用いられる。また酵素中の発泡を抑制するため１．Ｏ
ｉｉ量％以下の消泡剤を添加してもよい、消泡剤として
は、シリコーン、大豆油など通常の消泡剤を用いる。

培養方法は、振盪培養、通気培養などの好気的液体培養
が適しており、ｐＨ５，０〜８．０．２０℃〜５０℃で
１〜６日、望ましくはｐ１１６．５〜７．５．３５℃〜
４０℃で２日前後培養する。

本発明に用いるステビオサイドとは、高度に精製された
ステビオサイドに躍られることなく、ステビオサイドと
レバウディオサイドＡの混合物であっても良く、さらに
他の夾雑物を含有している粗製品であっても、同様に本
発明を実施することができる。

本発明の方法に用いるβ−１，３グルコシル糖化合物と
しては、好ましく使用されるストレプトミセス・マテン
シスＤＩＣ−１０８によってステビオサイドからレバウ
ディオサイドＡを生成する°ものであればいずれでも良
いが、例えば、パキマン、カードラン、ラミナリン、酵
母細胞壁又は酵母細胞壁の部分分解物、ここで言う酵母
とは、例えばサツカロマイセス属、キャンディダ属、ピ
しア属、シゾサッカロマイセス属、トルロプシス属、ハ
イセヌラ屈等を言うものであり、更にリュウコシン（珪
藻類の細胞壁）、カロース（高等植物ハセオラス細胞壁
）、パラミロン（単細胞藻類の細胞壁）、リケナン（コ
ケの抽出物）、イネ科植物の種子胚乳より得られる糖類
（ここで言うイネ科植物とはイネ、オオムギ、コムギ等
を指称する）、などのβ−１゜３グルコシル糖化合物含
有物が挙げられる。それらのうち好適なものとしては、
バキマン、カードランやラミナリンが挙げられ、これら
は入手し易い点からもより好ましい。

尚、カードランとは、β−１，３グルコシド結合を主体
とする水不溶性のβ−グルカンであり、その懸濁液を加
熱するとかたい弾力性のある熱不可逆性のゲルをつくる
多糖の総称である。このものは現在のところ微生物によ
ってつくられたものが市販されているｍ　　（Ａｇｒ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋　２９＋７５７、　’６５又は
発酵と工業３６，２．”７８参照）。

本発明で好ましく使用されるストレプトミセス・マテン
シスＤＩＣ−１０８を培養した培養液及び菌体はバッチ
式で反応させてもよいし、公知の方法により菌体を固定
化して連続的に変換反応を行わせることもできる。

本発明の転移反応条件は、ステビオサイドとβ−１，３
グルコシル糖化合物とを含有する水溶液に、ストレプト
ミセス・マテンシスＤＩＣ−１０８の培養液、菌体、菌
体処理物、又はこれらより分離されたβ−１，３グルコ
シル転移活性を有する酵素を反応させればよい０反応に
用いるス　　。

テビオサイドは、精製ステビオサイドの場合、反応液中
のステビオサイドの濃度を約０．１〜約１０重量％とし
、β−１，３グルコシル糖化合物の濃度を約０．１〜約
３０重量％とすればよい。これらの反応液のｐＨと温度
はβ−１，３グルコシルトランスフエラーゼが反応して
レバウディオサイドＡを生成させうる条件であればよい
が、通常ｐＨ３〜１０好ましくはｐＨ５〜８、温度２０
〜７０℃好ましくは３０〜５０℃が適当である。このよ
うにしてレバウディオサイドＡを生成せしめた反応溶液
は、そのままでも甘味料として使用できる。また必要に
応じて、酵素あるいは菌体を加熱失活させた後、スチレ
ンとジビニルベンゼンの重合吸着樹脂例えばダイヤイオ
ンＨＰ−２０（商品名、三菱化成社製）、アンバーライ
）ＸＡＤ−２（商品名、オルガノ社製）等、又はイオン
交換樹脂（例えばＨ型強酸性イオン交換樹脂およびＯＨ
型弱塩基性イオン交換樹脂）を用いて脱塩し、これを濃
縮してシラフプ状の甘味料とするか、又は乾燥、粉末化
して粉末状の甘味料とすることもできる。

更に脱塩した反応溶液を精製してレバウディオサイドＡ
を分離採取して甘味料とすることもできる。この際、濃
縮、乾燥、粉末化は公知の方法、例えば減圧濃縮、膜濃
縮、真空乾燥、噴霧乾燥等の各種方法が自由に用いられ
る。このようにして得られたレバウディオサイドＡの甘
味度は、甘味度の測定条件によっても異なるが一般には
、反応に用いたステビオサイドの固型物重量に見合う甘
味度に比べおよそ１．３倍強い、またその甘味の質は、
苦味や渋味等の嫌味がなく、まろやかな甘味であって砂
糖に僚ており、残株の切れもよい。

このレバウディオサイドＡは、苦味、嫌味、アク味等が
全くない無臭、白色の粉末で水に可溶であるためステビ
オシト及びグリチルリチンの共存比率、又液体、粉末状
の条件下で任意に共存させることができる。また、レバ
ウディオサイド人は、サッカリン及びその塩類、サイク
ラミン酸ナトリウム、ジヒドロカルコン、アスパラテー
ム等の周知の合成甘味物質と共用してその呈味特性を有
効利用することが可能であり、これらの合成甘味物質の
ＩＮ又は２［以上に本化合物を添加使用すれば、合成甘
味物質特有の苦味、嫌味等の不快味を改良することが可
能となる。

また、レバウディオサイドＡを賦形剤、希釈剤、吸着剤
的に使用されている砂糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、水飴
、デキストリン、デンプン等の周知の糖類甘味に添加使
用することにより、甘味が増強され、従来の使用量より
も、大幅にその使用量を削減することが可能となる。更
に本化合物をソルビット、マルチトール、マンニトール
、キシリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリー
甘味物質に添加使用すれば甘味物質の長所を損なうこと
なく甘味を増強することが出来、良質の低カロリー甘味
料が得られる。

レバウディオサイドＡはこの様に一般食品及びダイエツ
ト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼料等の甘味源とし
て使用できることはいうまでもない。

例えば、しょう油、粉末しよう油、みそ、粉末みそ、も
ろみ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末
すし酢、中華の素、天つゆ、めんつゆ、ソース、ケチャ
ツプ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシラツブ等の各種の調味料、せんべい、あられ、お
こし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊かん、
水手かん、ゼリー、カステラ、飴等の各種和菓子、パン
、ビスケット、クラッカー、クツキー、パイ、プリン、
バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム
、ワ・ノフル、スポンジケーキ、ドーナ゛へチョコレー
ト、チューインガム、キャラメル、キャンデー等の各種
洋菓子、アイスクリーム、シャーベット、アイスキャン
デー等の氷菓、果実のシロップ漬、水密等のシロップ類
、フラワーペースト、ビーナツツペースト、フラーペー
スト等のペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ
漬、糖菓などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、千枚
漬、らっきょう漬等の漬物類、）−ム、ソーセージ等の
畜肉製品類、食肉ノ飄ム、魚肉ソーセージ、カマボコ、
チクワ、天ぷら等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さき
するめ、ふぐのみりん干等の各種珍味類、のり、山菜、
するめ、小魚、貝等で製造されるつくだ煮類、煮豆、ポ
テトサラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚肉、畜肉、果
実、野菜のビン詰、缶詰類、合成酒、果実酒、洋酒等の
酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲
料、乳酸菌飲料等の清涼飲料水、プリンミックス、ホ・
ノドケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即
席しるこ等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物のせ味付
に使用できる。

その他、医薬品及び医薬部外品としては線画みがき、口
紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、肝油ドロップ
、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬等への甘味剤として
使用することも自由に行いうる。

以下に、本発明の方法およびそれによって得られる甘味
料について実施例により具体的に説明するが、以下の％
は重量基準とする。

実施例１ （１）β−１，３グルカナーゼＦＩＩ及びβ−１，３グ
ルコシルトランスフエラーゼの調製 ストレプトミセス・マテンシスＤＥＣ−１０８（１＆工
研菌寄第６５９３号）を酵母エキス０．２Ｗ／Ｖ％、ポ
リペ７’）ｙｏ、２Ｗ／Ｖ！４、Ｍｇ　３０４　・７　
Ｈ２００，ＩＷ／Ｖ％、Ｋ２　ＨＰＯ４０，２Ｗ／Ｖ％
からなる培地５ｊに植菌し、同時に別殺菌したカードラ
ン５０ｇを加えて１０４Ｊａｒにて３５℃で６０時間通
気攪拌培養した。得られた培養液３．８１を遠心分離し
てその上清液を硫安０．６５飽和で塩析し、β−１，３
グルカナーゼＦｉＩとβ−１，３グルコシルトランスフ
エラーゼ活性を含有する粗酵素標品（ｒ）を得た。

（Ｉ）よりβ−１，３グルカナーゼＦｉｌを分離・精製
するには、（１）を０．０１Ｍ１−リス緩衝液（ｐＨ７
，５）にて溶解し、同緩衝液にて透析税塩後、同緩衝液
にて平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（１
００ｍｊｌ）カラムに吸着させ、その未吸着部分を回収
することにより得られる。又、β−１，３グルコシルト
ランスフエラーゼは同カラムの吸着分を０．２Ｍ　　Ｎ
ａＣ１溶液にて溶出し、さらにハイドロキシアパタイト
カラムに吸着後、０．１Ｍのリン酸緩衝液で溶出するこ
とにより得られる。このときのβ−１，３グルカナーゼ
ＦＩＩの酵素活性は約２４１３単位であり、β−１，３
グルコシルトランスフエラーゼ活性は約１６００単位で
あった。尚、ここでいうβ−１，３グルカナーゼＦｉｌ
の酵素活性１単位とは、０．０１Ｍの酢酸バッファー（
ｐＨ６，０）にカードラン１％を懸濁させ、それに適量
の酵素を加えて、水で５．０　ｍ　ｊとし４５℃で反応
させる。

この条件で１時間に１■のグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量をいう、また、β−１，３グルコシル
トランスフエラーゼの酵素活性１単位とは、ＰＨ７，０
，０，１Ｍのリン酸緩衝液中で０．５％のステビオサイ
ドと２％のカードランを懸濁させ、それに適量の酵素を
加えて、水で５．０　ｍｌとし、４５℃で反応させる。

この条件で１時間に１ＭモルのレバウディオサイドＡを
生成させる酵素量をいう。

（２）ラミナリベンタオースの製造 カードラン（和光純薬工業株式会社販売）１００ｇを水
道水（ｐＨ６，６）　２１に懸濁させ、β−１，３グル
力ナーゼＦＩＩ８８単位を添加して、４５℃で１６時間
反応させた。その後、ブフナーにて濾過後、ロータリー
エバポレーターにて濃縮し、凍結乾燥を行って、固型物
として８２ｇを得た。このものの糖成分を高速液体クロ
マトグラフィー〔充填剤；　Ｌｉｃｈｒｏａｏｒｂ　　
Ｎ　Ｈ２（メルク社：５μｍ）］、溶出液（アセトニト
リル６０％、水４０％）で分離定量を行った結果、ラミ
ナリペンタオースが９５％で残り５％はラミナリトリオ
ース、ラミナリテトラオース、ラミナリヘキサオース等
であった。

＋３１　転移反応（レバウディオサイドＡの製造）ステ
ビオサイド（純度９８％）Ｌｏｇ、ラミナリペンタオー
ス（純度９５％）２０ｇ、先に調製したβ−１，３グル
コシルトランスフ工ラーゼ１０単位を０．０１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ６，０）　　Ｉ　Ｊに熔解し、４５℃で１６
時間反応させた。その後、９０℃で１０分間加熱し、酵
素を失活させた。

この溶液を合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０にＳ、
Ｖ。

−２で通し、ステビオサイド類を吸着させた後、９５％
エタノールで説着した。ｌ！ｌ１着液のエタノールを減
圧留去した後、＋！Ａ酸性イオン交換樹脂であるアンバ
ーライト−ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ型、商品名、ロームアン
ドハース社製品）、弱塩基性イオン交換樹脂であるアン
バーライト−ＩＲＡ−９３（ＯＨ型、商品名、ロームア
ンドハース社製品）にＳ、Ｖ、−２で通して脱塩した。

ついでこれを７０℃以下で減圧濃縮し、真空乾燥して粉
末のレバウディオサイドＡを３．６ｇ、及びステビオサ
イドを３．２ｇを得た。

比較例１ 実施例１のラミナリペンタオースの代りにカードラン２
０ｇを入れた以外は全く同様の操作を行ったところ、粉
末のレバウディオサイドＡ１．３ｇ、ステビオサイド５
．４ｇを得た。

実施例２ ラミナリベンタオースの含量が３０％Ｃ１・その他の０
３〜Ｇ〃のオリゴ糖が７０％のβ−１，３グルコシル糖
化合物を用いる以外実施例１と同様に反応を行い精製を
行ったところ、レバウディオサイドＡ３．Ｏｇ、ステビ
オサイド２．５ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. β−１，３グルコシル糖化合物とステビオサイドとを含
   む溶液に、ストレプトミセス属に属し、β−１，３グル
   コシル転移活性を有する酵素を産生し、ステビオサイド
   をレバウディオサイドＡに転移する能力を有する微生物
   の培養液、菌体処理物又はその微生物から分離された前
   記β−１，３グルコシル転移活性を有する酵素を作用さ
   せてレバウディオサイドＡを製造する方法において、β
   −１，３グルコシル糖化合物として、グルコース（Ｇ）
   が３〜１１個の水溶性直鎖β−１，３グルコシルオリゴ
   糖化合物を用いることを特徴とするレバウディオサイド
   Ａの製造法。