CN108727443A - 提高莱鲍迪苷a1g含量的结晶法、其产品及用途 - Google Patents

Abstract

本文涉及提高莱鲍迪苷A1G含量的结晶法、其产品及用途。本文中采用多次结晶的方法(例如二次、三次等)，对于甜菊糖苷莱鲍迪苷A(RA)衍生产物RA1G进行了纯化，获得了口感改善的高纯度RA1G。并且，结晶液相还可循环利用到进一步生产中，节约了生产成本。本发明的方法操作简单，生产工艺绿色环保，成本低，周期短，转化效率高，所得产品口感好，于食品与饮料等行业具有重要的应用价值。

Description

提高莱鲍迪苷A1G含量的结晶法、其产品及用途

技术领域

本发明属于生物技术和食品化工技术领域。具体而言，本发明涉及一种用于提高莱鲍迪苷A酶改性产物中莱鲍迪苷A1G含量的结晶方法及其产品和用途。

背景技术

甜菊糖苷是一系列从菊科草本植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的叶中提取出的糖苷类物质，其中天然产物中占主要含量的为甜菊苷(Stevioside，缩写为Stv)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，缩写为RA，也称为甜菊双糖苷A)。

莱鲍迪苷A的分子结构如下所示，是一种含20个碳原子的四环二萜类糖苷物质，其由二萜核心在C19位上连接一个葡糖基和C13为上连接3个葡糖基而形成：

研究表明，莱鲍迪苷A的甜度是蔗糖的200-300倍，热量仅为蔗糖的1/300，对酸、碱、热都很稳定，长期储存不易变质，加入食品中经热处理也不会有褐变现象，且不容易造成龋齿。我国在《GB8270-2014食品安全国家标准》和《GB2760-2014食品安全国家标准》的国家标准中对其做作为食品添加剂的使用进行了详细说明。2009年，美国食品药品监督管理局FDA也认可莱鲍迪苷A为“GRAS(Generally Recognized as Safe，总体认为是安全的)”的级别。甜菊糖苷类物质作为蔗糖的天然替代品，不仅可以降低成本，同时也符合食品、饮料逐渐向低糖低热量化发展的要求，是一类非常理想的具有多种用途的绿色甜味剂。

然而，莱鲍迪苷A有严重的苦涩后味，影响其在食品中的应用。为了改善其口感，现有技术中利用生物酶改性的方法，以莱鲍迪苷A为受体底物，在其二萜核心C19和C13位上加入不同数量和不同键型的葡萄糖、半乳糖等，以获得口味改善的酶改性产物。莱鲍迪苷A的酶催化改性的产物通常为不同位点和不同数量的糖基化产物的混合物，这就造成了产物组分复杂，口感不均一等问题。并且，由于产物混合物中的组分具有相同的母核，分子结构和极性都非常相近，常规手段很难分离纯化。为提高有效产物的浓度，对生产工艺的创新和优化提出了更高的要求。

因此，进一步开发具有较高纯度和改善口感的甜菊糖苷衍生产品，并提供其生产工艺以提高有效产物的含量，成为甜菊糖苷工业化生产的发展趋势。

发明内容

本文正是提供了一种新型甜菊糖衍生物(即莱鲍迪苷A1G)的纯化方法以及纯化产物，以改善原料口感，以较低的成本和较短的生产周期产出优质的甜菊糖苷衍生物R1G。

在本发明的一些方面中，提供了一种纯化如下结构所示的化合物莱鲍迪苷A1G(RA1G)的方法，

所述方法包括：

(a)可选地，对包含RA1G的原料进行纯化前预处理；

(b)采用甲醇水溶液为溶剂，对经或未经预处理的包含RA1G的原料进行第一次结晶并进行固液分离；

(c)取前一次结晶所得固相，采用甲醇水溶液为溶剂溶解，并在适当条件下，进行第二次结晶得到纯化产物；

(d)可选地，对前次结晶得到的纯化产物重复结晶纯化一次或多次或采用其他纯化方式进行进一步纯化；

(e)可选地，将结晶纯化步骤中所余的液相循环利用到包含RA1G的原料的制备过程中。

在一些实施方式中，所述包含RA1G的原料采用酶催化法制得，所述酶催化法包括：(1)提供莱鲍迪苷A和葡萄糖基供体；(2)通过环糊精糖基转移酶和淀粉酶的催化产生莱鲍迪苷A1G。

在一些实施方式中，所述酶催化法包括选自下组的一种或多种条件：

所述莱鲍迪苷A为选自下组的一种或多种：存在于天然植物中的莱鲍迪苷A、提取的莱鲍迪苷A、合成的莱鲍迪苷A；

所述葡萄糖基供体为选自下组的一种或多种：淀粉，如可溶淀粉；糊精；麦芽糊精；α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精；麦芽糖；

所述环糊精糖基转移酶选自：α-环糊精糖基转移酶、β-环糊精糖基转移酶和γ-环糊精糖基转移酶；

所述淀粉酶为选自下组中的一种或多种：糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶；

所述环糊精糖基转移酶的用量为0.1～30kNU/L，例如0.5～20kNU/L，1～15kNU/L，或5000～50000U/mL，例如10000～40000U/mL，15000～35000U/mL；和/或所述淀粉酶的用量为30～300U/mL，例如50～250U/mL，80～220U/mL；和/或所述酶为固定化酶；

所述莱鲍迪苷A的起始浓度为5～200g/L，例如8～150g/L，10g～120g/L；所述葡萄糖基供体的起始浓度为10～800g/L，例如20～700g/L，30～600g/L，30～300g/L；

步骤(2)在水相体系中进行，例如在水(如纯水、蒸馏水、超纯水，pH 6)中进行；

步骤(2)的反应温度为35～90℃，如40～90℃，45～85℃，50～70℃，45～85℃；和/或

步骤(2)的反应时间为0.5～72小时，如1～48小时，1.5～36小时，5～20小时。

在一些实施方式中，步骤(a)的纯化前预处理包括选自下组的一个或多个处理：过滤、吸附和洗脱、浓缩和干燥。也可以采用其它方法如：溶剂沉淀法、微孔滤膜过滤法等去除小分子杂质(如残留的葡萄糖)。

在一些实施方式中，所述预处理通过如下一个或多个处理进行：

(a1)可选地，对包含莱鲍迪苷A1G的原料进行过滤，例如，采用滤板、滤纸、滤芯进行过滤，优选采用精细滤板，更优选孔径为5～10μm的精细滤板；

(a2)可选地，采用大孔树脂对包含莱鲍迪苷A1G的原料进行吸附，并对其进行洗脱，例如：

用苯乙烯类或丙烯酸酯类大孔吸附树脂进行吸附，例如孔径为6-15nm，比表面积为600-1300㎡/g的大孔吸附树脂；可采用如下的吸附条件：进样液浓度0.5-20％，pH4-8，进样流速0.5-5BV/h；

用水(如2～10倍树脂体积的水)对吸附了原料的大孔树脂进行洗涤，例如用纯化水洗涤，流速0.5-5BV/h；

用乙醇洗脱剂对吸附在树脂上的物质进行洗脱，如可采用30～90％(v/v)(优选≥60％)的乙醇洗脱剂，体积为≥1.5倍，如1.5～4倍柱床体积，洗脱溶剂为乙醇水溶液，无需调节pH(约6左右)，洗脱流速0.5-2BV/h；

(a3)可选地对原料、经过滤、和/或经吸附和洗脱的产物进行浓缩和/或干燥，如喷雾干燥、真空干燥，例如在-0.06～0.09MPa，60～85℃的条件下浓缩乙醇洗脱液，例如以65～90℃的出风温度进行喷雾干燥。

在一些实施方式中，步骤(b)的第一次结晶包括选自下组的一个或多个处理：

(b1)用所述溶剂溶解固体形式的原料；

(b2)进行第一次结晶；

(b3)对第一次结晶产物进行固液分离，以获得用于下一步纯化或用作纯化产物的固相。

在一些实施方式中，所述第一次结晶包括选自下组的一个或多个条件：

采用甲醇水溶液为溶剂溶解固体形式的原料，例如，采用浓度为80～99％(v/v)，如浓度≥90％，例如95％的甲醇水溶液为溶剂；溶剂与固体形式的原料的质量体积比为1:2～5，如溶剂体积为干品重量的3～5倍，例如3倍；

结晶温度为15～30℃，例如室温，例如20～25℃，例如25℃；

结晶时间为10～40小时，例如15～30小时，例如20～24小时；

结晶过程中的搅拌转速为10～60rpm，例如20～50rpm，例如30～45rpm；

通过过滤(如抽滤)和/或离心等方式对第一次结晶产物进行固液分离；

可选地，对晶体进行洗涤，洗涤剂为60～90％(v/v)的甲醇水溶液，晶体湿重与洗涤剂的体积比优选1∶0.5～2，洗晶时间为10～30min；

可选地，对所得固相进行干燥。

在一些实施方式中，步骤(c)的第二次结晶包括选自下组的一个或多个处理：

(c1)用所述溶剂溶解第一次结晶所得的固相；

(c2)进行第二次结晶；

(c3)对第二次结晶产物进行固液分离，以获得用于下一步纯化或用作纯化产物的固相。

在一些实施方式中，所述第二次结晶包括选自下组的一个或多个条件：

采用甲醇水溶液为溶剂将第一次结晶纯化产物固相溶解，例如，采用浓度为50～90％(v/v)，如浓度为60～80％，例如65％的甲醇水溶液为溶剂；该溶剂与固相的质量体积比可为1:1.5～5，如溶剂体积为干品重量的1.5～3倍，例如2～2.5倍；可选地，步骤(c)中所用甲醇水溶液的浓度低于步骤(b)中所用甲醇水溶液的浓度；

第二次结晶温度为20～35℃，例如室温，例如20～25℃，例如20℃；

第二次结晶时间为10～40小时，例如15～30小时，例如20～24小时；

结晶过程中的搅拌转速为10～60rpm，例如20～50rpm，例如10～30rpm；

通过过滤(如抽滤)和/或离心等方式对第二次结晶产物进行固液分离；

可选地，对所得固相进行干燥，例如以65～90℃的出风温度进行喷雾干燥。

在一些实施方式中，步骤(d)的进一步纯化方式选自下组中的一种或多种：结晶纯化、制备HPLC纯化。

在一些实施方式中，步骤(e)的循环利用包括选自下组的一种或多种处理：

循环利用某一次结晶的液相(例如第一次结晶或第二次结晶)、多次结晶所得液相的混合物(例如第一次和第二次结晶液相的混合物)、多批结晶所得液相的混合物(例如多批经第一次和/或第二次结晶步骤获得的液相的混合物)；

将纯化过程中所获得的液相循环用于权利要求2所述的双酶法过程中；

在循环利用前，可对液相进行混合、浓缩、干燥等前处理；

将循环利用后生产得到的包含RA1G的原料用到权利要求1所述的纯化方法中。

在本发明的一些方面中，提供了一种组合物，其包含：

(i)采用如前所述方法获得的莱鲍迪苷A1G；以及

(ii)药学上、食品学上、保健品学上或日用化学品学上可接受的载体、赋形剂和/或辅料；

(iii)可选地，其他甜味剂或矫味剂，例如罗汉果苷、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠、木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸。

在本发明的一些方面中，提供了通过本发明的方法获得的莱鲍迪苷A1G或者其组合物，其用做甜味剂、矫味剂和/或遮味剂，例如用于制备食品、饮料、烟草产品、调味品、日用化工产品、药物组分、营养保健产品、口腔卫生产品和/或化妆品。

在本发明的一些方面中，提供了一种产品，其包含：通过本发明的方法获得的莱鲍迪苷A1G或者其组合物。

优选地，所述产品选自下组：食品，饮料，烟草产品，调味品，日用化工产品，药物组分，营养保健产品，口腔卫生产品和/或化妆品。

在本发明的一些方面中，提供了一种包装品，其包含：

通过本发明的方法获得的莱鲍迪苷A1G或者其组合物；以及

包装物和/或容器，例如所述包装物和/或容器可选自下组：柔性包装物或容器，例如袋(如纸袋、塑料袋，优选密封袋)和瓶(如塑料瓶)；刚性包装物或容器，例如玻璃容器、金属容器、陶瓷容器等。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1.双酶法制备莱鲍迪苷A1G的流程示意图。

图2A.双酶法改性第一步反应产物的高效液相色谱图；

图2B.双酶法改性第二步反应产物的高效液相色谱图。

图3A.RA1G的质谱图；

图3B.RA1G的核磁氢谱图；

图3C.RA1G的核磁碳谱图。

图4.第一次结晶后固相成分的高效液相色谱图。

图5.第一次结晶后液相成分的高效液相色谱图。

图6.第二次结晶后固相成分的高效液相色谱图。

图7.第二次结晶后液相成分的高效液相色谱图。

图8.第三次结晶后固相成分的高效液相色谱图。

图9.第三次结晶后液相成分的高效液相色谱图。

图10.结晶液相循环进入酶改性工艺所得产物的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明涉及新型莱鲍迪苷A衍生物莱鲍迪苷A1G(即RA1G)的纯化方法。RA1G是本申请人在前期所开发的新型莱鲍迪苷A衍生物(可参见同日提交的、发明名称为“甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷A1G的双酶法制备及其应用”的专利申请，以下简称“同日申请”，以其全文作为参考纳入本文)，其在莱鲍迪苷A二萜核心的C19位连接的葡萄糖上通过α-1,4键连接了一个葡萄糖基，故将其命名为莱鲍迪苷A1G。在该同日申请中详细记载了RA1G的制备方法及表征，其中以莱鲍迪苷A为原料，通过两步酶催化进行，且与原料莱鲍迪苷A相比，新型莱鲍迪苷A1G具有提高的甜度、改善的口感。

应理解本发明的纯化方法可不仅适用于通过如下所述或如同日申请中所述的酶催化改性制备方法获得的包含莱鲍迪苷R1G的原料，还可包括通过其他方法获得的包含莱鲍迪苷R1G的原料。同样，本发明结晶方法中所余的液相也可循环利用到莱鲍迪苷R1G的生产中，而并不限于具体的制备方法。

本发明的纯化方法主要包括：(a)可选地，对包含RA1G的原料进行纯化前预处理；(b)采用适当溶剂、在适当条件下，对经或未经预处理的包含RA1G的原料进行第一次结晶并进行固液分离；(c)取前一次结晶所得固相，采用适当溶剂溶解，并在适当条件下，进行第二次结晶得到纯化产物；(d)可选地，对前次结晶得到纯化产物重复结晶纯化一次或多次；(e)可选地，将结晶纯化步骤中所余的液相循环利用到RA1G制备过程中。

例如，本发明的一些实施方式中提供了一种用于提高莱鲍迪苷A酶改性产物中莱鲍迪苷A1G含量的生产的方法，步骤如下：将莱鲍迪苷A的酶催化改性产物通过精细板框过滤，大孔树脂分离，单效蒸发器浓缩，浓缩液喷雾干燥，添加溶剂进行结晶；上述结晶溶液进行固液分离，固相重新溶于溶剂进行二次结晶，二次结晶溶液再次进行固液分离，固相加纯化水溶解后喷雾干燥获得精制酶改性产品。两次结晶的液相混合后重新作为莱鲍迪苷A的酶催化改性的原料，进行酶改性反应，本步产物可以再次循环进入过滤→分离→浓缩→喷雾干燥→结晶→二次结晶的工艺流程。该二次结晶循环生产工艺，可以将莱鲍迪苷A的酶催化改性产物中的一种具有更好口感的新型产物莱鲍迪苷A1G含量大幅提高，最后产品中莱鲍迪苷A1G含量达到70％以上；通过循环工艺，可进一步提高生产原料的利用率，极大降低生产成本和废料排放。

如本文所用，术语“莱鲍迪苷A”和“RA”可互换使用，均是指如下结构式所示的化合物。

如本文所用，术语“莱鲍迪苷A1G”和“RA1G”可互换使用，均是指在莱鲍迪苷A的二萜核心C19位连接的葡萄糖上通过α-1,4键又连接了一个葡萄糖基的莱鲍迪苷A衍生物(其结构如下所示)。

如本文所用，术语“莱鲍迪苷A2G”和“RA2G”可互换使用，均是指在莱鲍迪苷A上又连接了2个葡萄糖的莱鲍迪苷A衍生物。

如本文所用，术语“莱鲍迪苷A3G”和“RA3G”可互换使用，均是指在莱鲍迪苷A上又连接了3个葡萄糖的莱鲍迪苷A衍生物。

如本文所用，术语“莱鲍迪苷D”和“RD”可互换使用，均是指具有莱鲍迪苷A二萜核心C19位连接的葡萄糖上通过β-1,2键连接了一个葡萄糖基的莱鲍迪苷A衍生物。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

莱鲍迪苷A的酶催化改性

如本文所用，术语“双酶法”是指以莱鲍迪苷A和葡萄糖基供体为原料，采用两种酶进行催化反应以获得莱鲍迪苷A1G的方法。关于双酶法中所用的反应原料、酶、反应条件、反应产物等的具体描述可参见下文。更详细内容可参见同日申请。

用于双酶法生产莱鲍迪苷A1G的莱鲍迪苷A原料可为各种来源的莱鲍迪苷A。可选用的莱鲍迪苷A原料包括但不限于：从天然植物中提取并直接用于本发明方法的莱鲍迪苷A，例如以甜叶菊叶为原料，通过浸提、除杂、脱色、干燥等工艺获得；市售的莱鲍迪苷A；合成的莱鲍迪苷A，例如通过微生物发酵(如重组毕赤酵母、重组酿酒酵母、重组大肠杆菌)合成。可将粉末、晶体、溶液等状态的莱鲍迪苷A用于本发明的反应体系中。

用于双酶法生产莱鲍迪苷A1G的葡萄糖基供体可为能作为糖基转移酶(如环糊精糖基转移酶，CGT)的底物通过酶促反应将其中所含的糖分子转移到受体上的任何多糖和/或低聚糖。可用于本发明的葡萄糖基供体包括但不限于：淀粉(优选可溶淀粉)、β-环糊精、α-环糊精或者γ-环糊精、麦芽糊精、麦芽糖。

用于生产莱鲍迪苷A1G的酶有两类，分别为催化转糖基和催化水解反应的酶，优选糖基转移酶(如环糊精糖基转移酶)和淀粉酶。

环糊精糖基转移酶(CGT酶)是一种能催化不同反应的多功能型酶，其可将葡萄糖基供体上的糖基转移到受体(在本发明中为莱鲍迪苷A)上。关于环糊精糖基转移酶的特性、制备和应用可参见吴敬等，《环糊精葡萄糖基转移酶的制备与应用》(2011年，化学工业出版社)。环糊精糖基转移酶(CGT)可为各种来源的酶，例如市售CGT酶、基因工程化生产的CGT酶等。可用于双酶法中的淀粉酶包括但不限于：糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3)，它能把淀粉从非还原性未端水解α-1,4和α-1,6葡萄糖苷键产生葡萄糖，同时该酶还能水解糊精、糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

这两种酶均可市售获得，例如购自日本天野酶制品株式会社、诺维信(中国)生物技术有限公司、江西百盈生物技术有限公司等；也可通过微生物发酵等方式获得，只要其具有所需的催化活性。优选采用酶活力高、稳定性高的酶制剂，也可采用固定化形式的酶。

制备莱鲍迪苷A1G的酶促反应在水相体系中进行，以莱鲍迪苷A为受体底物，以可溶淀粉、β-环糊精或者α-环糊精、麦芽糖等为葡萄糖基供体底物，在环糊精糖基转移酶(CGT)催化作用下进行转糖基反应，生成莱鲍迪苷A衍生物的混合体系，再通过淀粉酶(例如糖化酶)催化混合体系中各成分的水解反应，最终获得均一性更高的新型莱鲍迪苷A衍生物，即莱鲍迪苷A1G。

可将本发明的两种原料溶于水(如纯水、蒸馏水、超纯水等)中，形成水相体系。莱鲍迪苷A原料在反应体系中的初始浓度可为5～200g/L，例如8～150g/L，10g～120g/L。葡萄糖基供体底物原料在反应体系中的初始浓度可为10～800g/L，例如20～700g/L，30～600g/L，30～300g/L。通常所用莱鲍迪苷A原料与葡萄糖基供体原料的比例可为1:2～4重量比。

在水相体系中加入环糊精糖基转移酶(CGT)催化转糖基反应以生成一系列转糖基的莱鲍迪苷A衍生物的混合体系。CGT酶在反应体系中的终浓度可为0.1～30kNU/L，例如0.5～20kNU/L，1～15kNU/L，或5000～50000U/mL，例如10000～40000U/mL，15000～35000U/mL。CGT酶在反应体系中的含量可为5～200kNU/kg莱鲍迪苷A，例如10～150kNU/kg莱鲍迪苷A。根据反应产物生成情况，可选择将CGT酶的反应温度设置在35～90℃范围内，例如40～90℃，45～85℃，50～70℃，可根据所用的具体酶以及工业成本等对此进行调整。可将CGT酶反应体系的pH设置为该酶最适pH左右，例如pH 4～7，pH 4.5～6.5，pH 5～6，可根据所用的具体酶对此进行调整。CGT酶反应的时间可根据反应进程进行调整，例如反应0.5～72小时，1～48小时，1.5～36小时，5～20小时。

GCT酶反应完成后，可通过各种方式终止酶反应(例如较简单的方式是通过煮沸(如100℃煮沸5分钟)使该酶变性以终止反应)。可选地，对所得反应产物进行离心并分离上清液以用于下一步反应。也可将所得反应产物不经分离和纯化直接用于下一步反应。

在GCT酶反应产物中加入淀粉酶(如糖化酶)以将莱鲍迪苷A衍生物混合体系中的成分催化分解为在莱鲍迪苷A二萜核心C19位上的葡萄糖通过α-1,4键连接了一个葡萄糖基的莱鲍迪苷A1G。在一些实施方式中，所述淀粉酶的用量为30～300U/mL，例如50～250U/mL，80～220U/mL。在一些实施方式中，所述淀粉酶的用量为300～3000U/g莱鲍迪苷A，例如800～2200U/g莱鲍迪苷A。

根据反应产物生成情况，可选择将淀粉酶的反应温度设置在35～90℃的范围内，例如40～90℃，45～85℃，50～70℃，可根据所用的具体酶以及工业成本等对此进行调整。可将淀粉酶反应体系的pH设置为该酶最适pH左右，例如pH 4～7，pH 4.5～7，pH 5～7，可根据所用的具体酶对此进行调整。淀粉酶反应的时间可根据反应进程进行调整，例如反应0.5～72小时，1～48小时，1.5～36小时，2～10小时。

淀粉酶反应完成后，可通过各种方式终止酶反应(例如较简单的方式是通过煮沸(如100℃煮沸5分钟)使该酶变性以终止反应)。可对所得反应产物进行进一步分离、干燥、鉴定等步骤，以获得莱鲍迪苷A1G。

例如，可通过离心分离反应上清液和沉淀物，如12000rpm，离心5分钟等。例如，可通过色谱法分离反应产物，如采用HPLC。一种可选的HPLC仪器和条件为：Agilent 1200HPLC系统Phenomenex Luna 5μm C18(2)4.6mm×250mm色谱柱，流动相为乙腈-磷酸二氢钠水溶液(pH 2.6)。根据本发明，上述的进一步分离的单次上样量为5μL，流速为1.0mL/min，流动相为乙腈：磷酸二氢钠水溶液(pH 2.6)体积比68:32，紫外检测波长为210nm。例如，可通过冻干法对所得产物进行干燥。

本领域普通技术人员也应理解上述反应可采用固定化酶体系进行，可采用固定化的CGT酶和/或固定化的淀粉酶。

通过高分辨质谱法、核磁共振等方法对用本发明的双酶法获得的产物进行表征，确定所得产物为莱鲍迪苷A二萜核心的C19位上的葡萄糖通过α-1,4键连接了葡萄糖基，即所得为莱鲍迪苷A1G。

示例性制备方法

制备莱鲍迪苷A1G的一个示例性的方法如下所述，应理解该示例性方法仅用于说明本发明纯化方法原料制备的一种情况而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对制备方法进行适当的修改、变动和选择，这些修改、变动和选择都在本发明的范围之内。

由莱鲍迪苷A通过生物酶法制备甜菊糖衍生物莱鲍迪苷RA1G的示例性方法，包括如下步骤：

(1)在水相体系中，以莱鲍迪苷A为受体底物，反应初始浓度为10g～120g/L，以可溶淀粉、β-环糊精或者α-环糊精、麦芽糖为葡萄糖供体底物，反应初始浓度为30～300g/L，在α-环糊精糖基转移酶(CGT)催化作用下进行转糖基反应，生成系列莱鲍迪苷A的衍生物；(2)将步骤(1)制得的反应体系于45～85℃水浴中反应1～48小时，煮沸终止反应，离心，取上清液；(3)将步骤(2)获得的上清液，加入糖化酶，以步骤(2)中混合体系中的所有成分为底物，进行水解反应；(4)将步骤(3)制得的反应体系于45～85℃水浴中反应1～48小时，煮沸终止反应，离心，取上清液；(5)将步骤(4)制得的上清液，经分离、干燥后，制得一种莱鲍迪苷A的衍生物莱鲍迪苷A1G。

在一个实例中，所述步骤(1)中的水相体系为蒸馏纯水，pH 6.0。

在一个实例中，所述步骤(1)中的α-环糊精糖基转移酶可购自江西百盈生物技术有限公司、诺维信(中国)生物技术有限公司和日本天野酶制品株式会社，终浓度为0.05～2g/L。

在一个实例中，所述步骤(1)中的葡萄糖供体底物为可溶淀粉、糊精、麦芽糖

在一个实例中，所述步骤(2)中的反应条件为60℃水浴，反应时间为15小时。

在一个实例中，所述步骤(2)中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

在一个实例中，所述步骤(2)中的离心转速为12000rpm，时间为5分钟。

在一个实例中，所述步骤(3)中的糖化酶可购自陕西森弗天然制品有限公司和上海源叶生物技术有限公司，终浓度为0.5～20g/L

在一个实例中，所述步骤(4)中的反应条件为60℃水浴，反应时间为3小时

在一个实例中，所述步骤(4)中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

在一个实例中，所述步骤(4)中的离心转速为12000rpm，时间为5分钟。

在一个实例中，所述步骤(5)中的分离采用Agilent 1200HPLC系统PhenomenexLuna 5μm C18(2)4.6mm×250mm色谱柱，流动相为乙腈-磷酸二氢钠水溶液(pH 2.6)。

根据本发明进一步在一个实例中，上述的进一步分离的单次上样量为5μL，流速为1.0mL/min，流动相为乙腈：磷酸二氢钠水溶液(pH 2.6)体积比68:32，紫外检测波长为210nm。

在一个实例中，所述步骤(5)中的干燥为冷冻干燥。

莱鲍迪苷A的改性产物的结晶纯化方法

对于莱鲍迪苷A改性产物中莱鲍迪苷A1G的纯化可通过结晶法进行(如一次结晶、二次结晶、三次结晶、四次结晶等，优选二次结晶)进行。

A.纯化前预处理

在结晶纯化前，可选地通过过滤、吸附和洗脱、干燥、浓缩等步骤，对包含RA1G的原料进行前期处理，以例如减少污染物对结晶纯化的干扰和/或相对富集结晶原料中的RA1G。

在一些实施方式中，对包含莱鲍迪苷A1G的原料进行过滤。例如，使得该混合物通过滤器(如滤板、滤纸、滤芯等)进行过滤。在一些实例中，采用滤板进行过滤，例如采用精细滤板，优选孔径为5～10μm的精细滤板。

在一些实施方式中，采用大孔树脂对包含莱鲍迪苷A1G的原料进行吸附，并对其进行洗脱。该步骤可分离原料中的部分小分子杂质，例如游离的葡萄糖等。所用大孔树脂可为苯乙烯类或丙烯酸酯类大孔吸附树脂。例如可采用孔径6-15nm，比表面积600-1300㎡/g的大孔吸附树脂。进样液的浓度可为0.5-20％，pH4-8。进样流速可为0.5-5BV/h。

可用大量的水(优选纯化水)对吸附了原料的大孔树脂进行洗涤，以确保洗去或基本洗去原料中的小分子，例如可采用体积≥2倍，例如2～10倍柱床体积(即树脂体积)的水进行洗涤。洗涤流速可为0.5-5BV/h。然后，可用乙醇洗脱剂对吸附在树脂上的物质进行洗脱，例如可采用30～90％(v/v)(优选≥60％)的乙醇洗脱剂(pH约6，洗脱流速可为0.5-2BV/h)，体积为≥1.5倍，如1.5～4倍柱床体积。

在一些实施方式中，可选地对原料或经过滤或经吸附和洗脱等前处理步骤的前处理产物进行浓缩和/或干燥。例如，可采用-0.06～0.09MPa，60～85℃的条件对如前所述的乙醇洗脱液进行浓缩。例如，可通过喷雾干燥、真空干燥等方式对产物进行干燥。

在一些实施方式中，使原料干燥以获得固相原料。

应理解，可对预处理步骤进行增减、改进或修改而不脱离本发明的构思和保护范围。例如，可采用溶剂沉淀法、微孔滤膜过滤法等去除小分子杂质(如残留的葡萄糖)。

B.第一次结晶纯化

可对经或未经前处理的原料进行第一次结晶纯化。通常对于固体形式的原料，可采用甲醇水溶液为溶剂将其溶解。例如，可采用浓度为80～99％(v/v)(如浓度≥90％，例如95％)的甲醇水溶液为溶剂。该溶剂与固相(即干品)的质量体积比可为1:2～5，如溶剂体积为干品重量的3～5倍，例如3倍。

使得原料的甲醇溶液在15～30℃，例如室温，例如20～25℃，例如25℃的结晶温度下进行结晶。结晶时间通常为10～40小时，例如15～30小时，例如20～24小时。结晶过程中可进行搅拌，转速通常为10～60rpm，例如20～50rpm，例如30～45rpm。

例如，在一些实施方式中，采用了如下的第一次结晶条件：溶剂为3倍体积的95％(V/V)甲醇水溶液，结晶温度为25℃，时间为20小时，搅拌速度为30rpm。

可对第一次结晶产物进行固液分离，例如通过过滤(如抽滤)和/或离心等方式进行分离。可选地，对所得固相进行干燥。其中，可将所得固相用于进一步的结晶纯化；可将液相循环到原料生产中。

C.第二次结晶纯化

在获得第一次结晶纯化产物固相后，可对其进行溶解和第二次结晶纯化。

可采用甲醇水溶液为溶剂将第一次结晶纯化产物固相溶解。例如，可采用浓度为50～90％(v/v)(如浓度为60～80％，例如65％)的甲醇水溶液为溶剂。在一些实施方式中，第二次结晶溶剂的浓度低于第一次结晶溶剂的浓度。

该溶剂与固相(即干品)的质量体积比可为1:1.5～5，如溶剂体积为干品重量的1.5～3倍，例如2～2.5倍。使得原料的甲醇溶液在20～35℃，例如室温，例如20～25℃，例如20℃的结晶温度下进行结晶。结晶时间通常为10～40小时，例如15～30小时，例如20～24小时。结晶过程中可进行搅拌，转速通常为10～60rpm，例如20～50rpm，例如10～30rpm。

例如，在一些实施方式中，采用了如下的第二次结晶条件：溶剂为65％(V/V)的甲醇水溶液，结晶温度为20℃，时间为15小时结晶，搅拌速度为15rpm。

可对第二次结晶产物进行固液分离，例如通过过滤(如抽滤)和/或离心等方式进行分离。其中，可将所得固相用于进一步的结晶纯化或后处理用作结晶纯化终产品；可将液相循环到原料生产中。

例如，可选地，可在分离得到第二次结晶产物的固相后进行洗晶。如可采用60～90％(v/v)的甲醇水溶液作为洗晶时的洗涤剂，以晶体湿重与洗涤剂为1:0.5～2的体积比进行洗涤，洗晶时间可为10～30min。

例如，可选地，可在分离得到第二次结晶产物的固相后将其溶解到水(优选纯水)中，使得晶体湿重与水的体积比为1:0.5～1，然后在65～90℃喷雾干燥，获得一种RA1G含量达70％以上的纯化产品。

D.进一步纯化

在第二次结晶纯化后，可基本按照第二次结晶纯化的方法，对第二次结晶纯化产物进行进一步的纯化。例如，可根据需要，进行第三次、第四次或更多次结晶纯化步骤。

也可根据需要，采用其他纯化方法对本发明的第二次结晶纯化产物进行进一步的纯化，例如采用制备HPLC等方法。

E.纯化产物液相的循环利用

可将本发明纯化过程中所获得的液相循环用于莱鲍迪苷A衍生物的生产中。

例如，可循环利用某一次结晶的液相(例如第一次结晶或第二次结晶)、多次结晶所得液相的混合物(例如第一次和第二次结晶结晶液相的混合物)、多批结晶所得液相的混合物(例如多批经第一次和/或第二次结晶步骤获得的液相的混合物)。

例如，可将本发明纯化过程中所获得的液相循环用于双酶法制备莱鲍迪苷A衍生物的生产中。

在循环利用前，可对液相进行混合、浓缩、干燥等前处理。例如，可对两次结晶的液相进行混合。例如，可在-0.06～0.09MPa，60～85℃的条件下对液相进行浓缩，优选浓缩至固含量30～60％。例如，可在混合和/或浓缩后对液相进行干燥，如采用喷雾干燥等方式，并将干燥物料作为酶改性原料循环参加催化反应。

可对利用循环液相获得的包含RA1G的产物，再次进行结晶纯化，以获得高纯度RA1G。

莱鲍迪苷A1G的应用及相关产品

本发明的莱鲍迪苷A1G具有高纯度、高甜度、口感佳、绿色健康等多种优点，由此可广泛应用于食品、饮料、药物、保健品、烟草产品、调味品、日用化工产品、口腔卫生产品、化妆品等各种领域中。

可根据需要用各种形式提供莱鲍迪苷A1G，例如干粉、结晶、溶液、组合物等形式。例如，可将本发明的莱鲍迪苷A1G制成便于储存、运输和使用的包装物。例如，可将本发明的莱鲍迪苷A1G与可接受的辅料或赋形剂组合，以形成本发明的组合物。本发明的组合物包含有效量的莱鲍迪苷A1G，并且可任选地包含水、食品添加剂、食品辅料、药物辅料等可接受的辅料或赋形剂。在一个实施方式中，所述食品添加剂可选自但不限于：香精香料、乳化剂、抗氧化剂、食用色素。

可将本发明的莱鲍迪苷A1G与其他甜味剂或矫味剂复配以进一步改善其口味或达到所需味觉要求，例如用于复配的其他甜味剂或矫味剂包括但不限于：罗汉果苷、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠、木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸。

如本文所用，术语“可接受的”成分是适用于人和/或动物而没有或无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可产生所需甜味、矫味和/或遮味效果的且可被人和/或动物所接受的量。

可将本发明的组合物配制成粉剂、颗粒剂、悬乳剂、水乳剂、乳油剂、微胶囊剂等可用的剂型。本领域普通技术人员可根据具体应用的需要对其剂型和施用形式进行选择。

本发明的莱鲍迪苷A1G或莱鲍迪苷A1G组合物可以应用在各类需要甜味或矫味或遮味的产品中。以产品的重量计，莱鲍迪苷A1G或莱鲍迪苷A1G组合物的加入量可为例如，0～0.064％或0％～0.085％。在一些应用中，所述产品为液态，以所述产品的总体积为基准计，莱鲍迪苷A1G或莱鲍迪苷A1G组合物的浓度可例如远低于蔗糖的使用浓度，例如可为0～0.56g/L或0～0.84g/L。

本领域技术人员也可根据具体需要对莱鲍迪苷A1G或其组合物的加入量、加入时间或加入方式等进行适当的调整，以获得最佳的效果。

有益效果

本发明的方法和产品具有如下一种或多种优异效果：

(1)本文所揭示的方法可用于新型甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷A1G(RA1G)的纯化，该衍生物结构世界范围内未见报道，其具有口感明显优于莱鲍迪苷A的特点，为甜菊糖苷这类多功能的甜味剂的开发和应用提供了极具潜力的方法和产品；

(2)本文所揭示的方法可将莱鲍迪苷A的改性甜菊糖苷产物中含量仅为40％～50％的产物莱鲍迪苷A1G含量提高至70％以上，进而获得莱鲍迪苷A1G含量达70％以上的新产品，该产品具有明显改善原料的整体品质；

(3)本发明中结晶产生的液相，可以循环利用，继续用于生产，溶剂可蒸馏后循环利用，实现了较好的经济效益和较低的废液排放；并且，本发明生产工艺能耗较低，操作简单，易于规模化、连续化生产。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。例如，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对实施方案或实施例中的纯化和结晶条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法或按照供应商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：莱鲍迪苷A双酶法改性产物莱鲍迪苷A1G的制备和鉴定

根据图1所示的简要流程，采用双酶法制备莱鲍迪苷A改性产物。具体而言：

向反应釜(无锡红旗压力容器制造有限公司，500KG乳化锅，设备代码21701098220170001)中加入100L纯化水。称取6Kg莱鲍迪苷A(浩天药业有限公司，RA97)和6Kgβ-环糊精(曲阜天利药用辅料有限公司，170805)，投入反应釜，加热溶解。加入酶改性第一步反应所需的环糊精糖基转移酶(购自诺维信(中国)生物技术有限公司，Toruzyme3.0L，ACN00216，3kNU/mL)600kNU。将料液温度维持在60℃，搅拌转速30rpm/min，反应24h。100℃煮沸终止反应。反应液经HPLC检测(谱图如图2A中所示)。具体检测条件如下：所用HPLC为Thermo U3000，流动相为乙腈-磷酸二氢钠水溶液(pH 2.6)，流速为1.0mL/min，配合Thermo C18 4.6mm×250mm(5um)柱和紫外检测器检测(210nm)。

然后，向上述反应液中加入酶改性第二步反应所需的糖化酶(购自陕西森弗生物技术有限公司，批号01080011，150000U/g)15×10⁶U，60℃，搅拌转速20rpm/min，反应2h，100℃煮沸终止反应。反应液经HPLC检测衍生物生成情况，检测条件如上所述，谱图如图2B中所示。

在上述制备过程中产物中各主要组分的含量如下表1中所示。

表1.莱鲍迪苷A双酶法改性100L反应体系中产物分析结果

组分	RA(％)	RA1G(％)	RA2G(％)	RA3G(％)
					酶改性第一步产物	16.02	11.78	13.20	10.03
酶改性第二步产物	37.03	47.10	4.05	2.95

取酶改性第二步产物，使用HPLC(DAC50高压制备色谱)分离纯化，流动相为乙腈：水溶液＝29:71，流速为70mL/min)配合10μm C18(500g)50mm×500mm柱和紫外检测器检测(210nm)。

对制备纯化所得产物进行质谱和核磁共振谱分析以确定其结构。质谱使用日本岛津高效液相色谱仪耦联离子阱飞行时间质谱(LCMS-IT-TOF)，在负离子模式收集数据，流动相为乙腈:水(68:32)，流速为1ml/min，分辨率为10000半高全宽。核磁共振检测使用BrukerDRXAvance 600MHz spectrometer(Switzerland)收集数据，1H谱检测频率为600MHz，13C谱为150MHz，两者检测温度均为25℃。

所得产物RA1G的质谱(图3A)和核磁共振谱(图3B：核磁氢谱，图3C：核磁碳谱)结果表明：RA1G为莱鲍迪苷A二萜核心的C19位的葡萄糖基上通过α-1,4键连接了一个葡萄糖基。

实施例2.莱鲍迪苷A酶改性产物的第一次结晶

取莱鲍迪苷A酶改性产物(即实施例1中煮沸终止反应后的反应体系)100L，用孔径5～10μm的精密滤板(沈阳长城过滤纸板有限公司，产品编号1001)分离后，通过100L的大孔树脂(蓝晓科技新材料股份有限公司，LX-28；新树脂需如下预处理：200L 85％乙醇溶液洗涤，然后用纯化水洗至流出液无醇味，流速100L/h)吸附2小时。吸附有样品的树脂先用300L纯水洗涤，洗去产物中混有的葡萄糖等小分子，再用200L的60％(v/v)乙醇洗脱，收集洗脱液，-0.07MPa，75℃浓缩。浓缩至固含量50％后进喷雾干燥器干燥，出风温度75℃，得干品7.5Kg。加入干品重量3倍体积的95％(V/V)甲醇水溶液，控制温度为25℃，搅拌速度为30rpm，时间为20小时结晶。将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，得到第一次结晶的固相和液相。

对所得固相用双蒸水溶解后进行HPLC分析检测，检测条件如实施例1所述，谱图如图4所示，测得第一次结晶产物固相中莱鲍迪苷A1G的含量为61.41％，湿重7.5Kg(表2)。对于所得液相，也进行HPLC检测(检测条件如实施例1所述)(谱图如图5所示)，测得第一次结晶产物液相中莱鲍迪苷A1G的含量为32.01％(表2)。

表2.莱鲍迪苷A酶改性产物第一次结晶产物的分析结果

组分	RA	RA1G	RA2G	RA3G
					第一次结晶固相	28.00	61.41	2.49	1.83
第一次结晶液相	44.37	32.01	10.54	3.86

实施例3.莱鲍迪苷A酶改性产物第二次结晶

取第一次结晶的湿品(即实施例2中所得的未干燥固相)7Kg在15L、65％(V/V)甲醇水溶液中加热溶解。将溶液水浴温度控制在20℃，搅拌速度为15rpm，时间为15小时结晶。将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，得到第二次结晶固相和液相。

所得固相加超纯水溶解后，用HPLC液相检测(检测条件如实施例1所述)(谱图如图6所示)，测得新产物莱鲍迪苷A1G的含量为72.55％，湿重5Kg(表3)。

第二次结晶固相湿品加纯化水2.5L溶解，75℃喷雾干燥，得最终产品2.25Kg。对于过滤所得液相，也进行HPLC检测(检测条件如实施例1所述)(谱图如图7所示)，测得第二次结晶产物液相中莱鲍迪苷A1G的含量为46.33％(表3)。

表3.莱鲍迪苷A酶改性产物第二次结晶的产物分析结果

组分	RA	RA1G	RA2G	RA3G
					第二次结晶固相	15.25	72.55	3.64	0.81
第二次结晶液相	41.59	46.33	1.61	2.24

实施例4.莱鲍迪苷A酶改性产物的第三次结晶

取第二次结晶的干品2Kg在10L、65％(V/V)甲醇水溶液中加热溶解，溶液水浴控制温度为20℃，搅拌速度为15rpm，时间为10小时结晶。将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，得到第三次结晶固相和液相。

所得固相超纯水溶解后，用HPLC液相检测(检测条件如实施例1所述)(谱图如图8所示)，测得莱鲍迪苷A1G的含量为85.30％，湿重3Kg(表4)。第三次结晶固相湿品加纯化水1.5L溶解，75℃喷雾干燥，得最终产品1.5Kg。

对于过滤所得液相，也进行HPLC检测(检测条件如实施例1所述)(谱图如图9所示)，测得第三次结晶产物液相中莱鲍迪苷A1G的含量为46.83％(表4)。

表4.莱鲍迪苷A酶改性产物第三次结晶的产物分析结果

组分	RA	RA1G	RA2G	RA3G
					第三次结晶固相	10.25	85.30	2.33	0.52
第三次结晶液相	25.20	46.83	6.00	1.36

实施例5.结晶液相循环进入酶改性反应工艺

将实施例2～4中每次结晶所得的液相混合后浓缩，浓缩条件-0.07MPa，75℃，浓缩至固含量50％，进喷雾干燥器干燥，出风温度75℃，得干品5.8Kg。

将该干品循环进入酶改性反应工艺：加入环糊精葡萄糖基转移酶(来源及货号同实施例1)50g、β-环糊精(来源同实施例1)3Kg、纯化水70L，60℃反应24h，100℃煮沸中止反应。60℃水浴，加入糖化酶(来源及货号同实施例1)20g，反应2h，100℃煮沸中止反应。

取如上所得酶改性产物，经孔径5～10μm的精密滤板分离后，通过100L的大孔树脂吸附2小时。吸附树脂先用300L的纯水洗涤，洗去产物中混有的葡萄糖等小分子，再用200L的60％(v/v)乙醇洗脱。收集洗脱液，-0.07MPa，75℃浓缩。浓缩至固含量50％后进喷雾干燥器干燥，出风温度75℃，获得酶改性的产物5.5Kg。产物超纯水溶解后，用HPLC液相检测(检测条件如实施例1所述)，谱图如图10所示。测得新产物莱鲍迪苷A1G的含量为47.81％(表5)。

由该结果可知，采用结晶液相作为酶改性反应的原料可同样有效地制得所需的RA1G产物，由此节约了生产成本。

表5.结晶的液相循环进入酶改性反应产物分析结果

组分	RA	RA1G	RA2G	RA3G
					酶改性产物	37.81	47.81	3.18	4.0

实施例6：莱鲍迪苷A1G的感官评价实验

感官评价实验采用的甜菊糖苷原料，其中RA1G如实施例2、3、4制备，其余测试品均来自浩天药业有限公司，其中莱鲍迪苷A(RA)纯度为97％，莱鲍迪苷D(RD)纯度为95％。

为了达到代糖使用目的，本行业使用同甜度下对食品添加剂进行感官评价比较。将甜菊糖苷原料按照不同的配比(表6)溶解在纯净水中，配成360～560ppm样品溶液，分别取10mL样品溶液于30mL一次性试饮杯中，由8位经过培训且经验丰富的感官人员进行感官品评(盲评)，评定结果取感官人员所打分数的平均值。

测评中，甜度以质量分数为10％蔗糖水溶液(10g/100ml)为标准，按10分计(甜度同10％的蔗糖为10分，同9％的蔗糖为9分，以此类推)，完全察觉不出甜味为0分。

苦度以很苦为10分，完全觉察不出苦味为0分的标准进行评分。

综合评价根据总体口感给予0-100分，100分代表9％蔗糖的口感，出现苦味、涩味及其它杂味为扣分项，杂味是指甜、苦、涩味之外的其它不良味道，如醇味、塑料味、金属味、甘草味、化学味等不良味道。品尝时保证各样品的甜度基本一致，比较它们除了甜度之外的其它味道，如苦、杂味等。

由表6可以知，600ppm纯度为72.55％的RA1G溶液和560ppm纯度85.30％的RA1G溶液，综合评价接近，甜度与7％蔗糖溶液相似，后苦味及其他不良口感远低于RA，其口感明显优越于原料RA；660ppm纯度61.44％的RA1G溶液口感比高纯度的RA1G溶液差，但也优于原料莱鲍迪苷A。

虽然RA1G二次结晶和三次结晶的产品纯度不同，但二者的感官评价结果相差很小。因此，考虑到生产成本问题，在实际生产应用中可采取二次结晶循环工艺用于提高莱鲍迪苷A酶改性产物中莱鲍迪苷A1G含量。

表6.莱鲍迪苷A1G的感官评价结果

* * * * * * * *

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种纯化如下结构所示的化合物莱鲍迪苷A1G(RA1G)的方法，

所述方法包括：

(a)可选地，对包含RA1G的原料进行纯化前预处理；

(b)采用甲醇水溶液为溶剂，对经或未经预处理的包含RA1G的原料进行第一次结晶并进行固液分离；

(c)取前一次结晶所得固相，采用甲醇水溶液为溶剂溶解，并在适当条件下，进行第二次结晶得到纯化产物；

(d)可选地，对前次结晶得到的纯化产物重复结晶纯化一次或多次或采用其他纯化方式进行进一步纯化；

(e)可选地，将结晶纯化步骤中所余的液相循环利用到包含RA1G的原料的制备过程中。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述包含RA1G的原料采用酶催化法制得，所述酶催化法包括：

(1)提供莱鲍迪苷A和葡萄糖基供体；

(2)通过环糊精糖基转移酶和淀粉酶的催化产生莱鲍迪苷A1G。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述酶催化法包括选自下组的一种或多种条件：

所述莱鲍迪苷A为选自下组的一种或多种：存在于天然植物中的莱鲍迪苷A、提取的莱鲍迪苷A、合成的莱鲍迪苷A；

所述葡萄糖基供体为选自下组的一种或多种：淀粉，如可溶淀粉；糊精；麦芽糊精；α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精；麦芽糖；

所述环糊精糖基转移酶选自：α-环糊精糖基转移酶、β-环糊精糖基转移酶和γ-环糊精糖基转移酶；

所述淀粉酶为选自下组中的一种或多种：糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶；

所述环糊精糖基转移酶的用量为0.1～30kNU/L，例如0.5～20kNU/L，1～15kNU/L，或5000～50000U/mL，例如10000～40000U/mL，15000～35000U/mL；和/或所述淀粉酶的用量为30～300U/mL，例如50～250U/mL，80～220U/mL；和/或所述酶为固定化酶；

所述莱鲍迪苷A的起始浓度为5～200g/L，例如8～150g/L，10g～120g/L；所述葡萄糖基供体的起始浓度为10～800g/L，例如20～700g/L，30～600g/L，30～300g/L；

步骤(2)在水相体系中进行，例如在水(如纯水、蒸馏水、超纯水，pH 6)中进行；

步骤(2)的反应温度为35～90℃，如40～90℃，45～85℃，50～70℃，45～85℃；和/或

步骤(2)的反应时间为0.5～72小时，如1～48小时，1.5～36小时，5～20小时。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)的纯化前预处理包括选自下组的一个或多个处理：过滤、吸附和洗脱、浓缩和干燥，也可以采用其它方法如：溶剂沉淀法、微孔滤膜过滤法等去除小分子杂质(如残留的葡萄糖)。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述预处理通过如下一个或多个处理进行：

(a1)可选地，对包含莱鲍迪苷A1G的原料进行过滤，例如，采用滤板、滤纸、滤芯进行过滤，优选采用精细滤板，更优选孔径为5～10μm的精细滤板；

(a2)可选地，采用大孔树脂对包含莱鲍迪苷A1G的原料进行吸附，并对其进行洗脱，例如：

用苯乙烯类或丙烯酸酯类大孔吸附树脂进行吸附，例如孔径为6-15nm，比表面积为600-1300㎡/g的大孔吸附树脂；

用水(如2～10倍树脂体积的水)对吸附了原料的大孔树脂进行洗涤，例如以0.5-5BV/h的流速洗涤；

用乙醇洗脱剂对吸附在树脂上的物质进行洗脱，如可采用30～90％(v/v)(优选≥60％)的乙醇洗脱剂，体积为≥1.5倍，如1.5～4倍柱床体积；

(a3)可选地对原料、经过滤、和/或经吸附和洗脱的产物进行浓缩和/或干燥，如喷雾干燥、真空干燥，例如在-0.06～0.09MPa，60～85℃的条件下浓缩乙醇洗脱液，例如以65～90℃的出风温度进行喷雾干燥。

6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)的第一次结晶包括选自下组的一个或多个处理：

(b1)用所述溶剂溶解固体形式的原料；

(b2)进行第一次结晶；

(b3)对第一次结晶产物进行固液分离，以获得用于下一步纯化或用作纯化产物的固相。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述第一次结晶包括选自下组的一个或多个条件：

采用甲醇水溶液为溶剂溶解固体形式的原料，例如，采用浓度为80～99％(v/v)，如浓度≥90％，例如95％的甲醇水溶液为溶剂；溶剂与固体形式的原料的质量体积比为1:2～5，如溶剂体积为干品重量的3～5倍，例如3倍；

结晶温度为15～30℃，例如室温，例如20～25℃，例如25℃；

结晶时间为10～40小时，例如15～30小时，例如20～24小时；

结晶过程中的搅拌转速为10～60rpm，例如20～50rpm，例如30～45rpm；

通过过滤(如抽滤)和/或离心等方式对第一次结晶产物进行固液分离；

可选地，对晶体进行洗涤，洗涤剂为60～90％(v/v)的甲醇水溶液，晶体湿重与洗涤剂的体积比优选1∶0.5～2，洗晶时间为10～30min；

可选地，对所得固相进行干燥。

8.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)的第二次结晶包括选自下组的一个或多个处理：

(c1)用所述溶剂溶解第一次结晶所得的固相；

(c2)进行第二次结晶；

(c3)对第二次结晶产物进行固液分离，以获得用于下一步纯化或用作纯化产物的固相。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述第二次结晶包括选自下组的一个或多个条件：

采用甲醇水溶液为溶剂将第一次结晶纯化产物固相溶解，例如，采用浓度为50～90％(v/v)，如浓度为60～80％，例如65％的甲醇水溶液为溶剂；该溶剂与固相的质量体积比可为1:1.5～5，如溶剂体积为干品重量的1.5～3倍，例如2～2.5倍；

步骤(c)中所用甲醇水溶液的浓度低于步骤(b)中所用甲醇水溶液的浓度；

第二次结晶温度为20～35℃，例如室温，例如20～25℃，例如20℃；

第二次结晶时间为10～40小时，例如15～30小时，例如20～24小时；

结晶过程中的搅拌转速为10～60rpm，例如20～50rpm，例如10～30rpm；

通过过滤(如抽滤)和/或离心等方式对第二次结晶产物进行固液分离；

可选地，对所得固相进行干燥，例如以65～90℃的出风温度进行喷雾干燥。

10.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)的进一步纯化方式选自下组中的一种或多种：结晶纯化、制备HPLC纯化。

11.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)的循环利用包括选自下组的一种或多种处理：

循环利用某一次结晶的液相(例如第一次结晶或第二次结晶)、多次结晶所得液相的混合物(例如第一次和第二次结晶液相的混合物)、多批结晶所得液相的混合物(例如多批经第一次和/或第二次结晶步骤获得的液相的混合物)；

将纯化过程中所获得的液相循环用于权利要求2所述的双酶法过程中；

在循环利用前，可对液相进行混合、浓缩、干燥等前处理；

将循环利用后生产得到的包含RA1G的原料用到权利要求1所述的纯化方法中。

12.一种组合物，其包含：

(i)如权利要求1～11中任一项所述方法获得的莱鲍迪苷A1G；以及

(ii)药学上、食品学上、保健品学上或日用化学品学上可接受的载体、赋形剂和/或辅料；

(iii)可选地，其他甜味剂或矫味剂，例如罗汉果苷、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠、木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸。

13.通过如权利要求1～11中任一项所述方法获得的莱鲍迪苷A1G，或者，如权利要求12所述的组合物的应用，其用做甜味剂、矫味剂和/或遮味剂，例如用于制备食品、饮料、烟草产品、调味品、日用化工产品、药物组分、营养保健产品、口腔卫生产品和/或化妆品。

14.一种产品，其包含：如权利要求1～11中任一项所述方法获得的莱鲍迪苷A1G，或者，如权利要求12所述的组合物；

优选地，所述产品选自下组：食品，饮料，烟草产品，调味品，日用化工产品，药物组分，营养保健产品，口腔卫生产品和/或化妆品。

15.一种包装品，其包含：

如权利要求1～11中任一项所述方法获得的莱鲍迪苷A1G，或者，如权利要求12所述的组合物；以及

包装物和/或容器，例如所述包装物和/或容器可选自下组：柔性包装物或容器，例如袋(如纸袋、塑料袋，优选密封袋)和瓶(如塑料瓶)；刚性包装物或容器，例如玻璃容器、金属容器、陶瓷容器等。