CN107857828A - 一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于克服常规技术提取率相对较低、提取纯度低等缺点，提供一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法。本发明应用超高压技术是在常温及近常温条件下对原料施加以压力大于100流体静压力的一种处理方法，超高压力可使溶剂进入植物细胞内部，泄压后溶剂可带着有效成分而溢出，实现植物有效成分的高提取效率，利用大孔树脂进行吸附纯化灵芝多糖，对灵芝多糖的吸附选择性良好，吸附快解析也快，吸附容量较大。

Description

一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法

技术领域：

本发明属于天然有机化学领域，涉及一种灵芝多糖的纯化方法，特别是涉及一种超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法。

背景技术：

灵芝又称林中灵，以林中生长的为最佳，药效最高。目前也有人工大棚种植，主要生长在较湿润的地方。灵芝属高温性菌类，在15～35℃之间均能生长，适温为25～30℃。子实体在10～32℃的范围内均能生长，但原基分化和子实体发育的最适温度为25～28℃。低于25℃，子实体生长缓慢，皮壳色泽也差；高于35℃，子实体会死亡。灵芝生长需要较高的湿度。随着昼夜温差的增大，菌丝长满袋的时间延长。菌丝生长期，要求培养基含水量为55％～60％，空气相对湿度为70％～80％。子实体发育期，空气相对湿度要求在90％～95％。如果低于80％，子实体会生长质量不良，菌盖边缘的幼嫩生长点将会变成暗灰色或暗褐色。

灵芝是好气性真菌，它的整个生长发育过程中都需要新鲜的空气。尤其是子实体生长发育阶段，对二氧化碳更为敏感。当空气中二氧化碳含量增至0.1％时，子实体就不能开伞，长成鹿角状分枝，含量达1％时，子实体发育极不正常，无任何组织分化，形成畸形。

灵芝在生长发育过程中对光线非常敏感，光线对菌丝生长有明显的抑制作用，无光黑暗条件生长速度最快，当照度增加到3000勒克斯时，生长速度只有全黑暗条件下的一半。子实体生长发育不可缺少光照，在1500～5000勒克斯，菌柄、菌盖生长迅速，粗壮，盖厚。

灵芝的大小及形态变化很大，大型个体的菌盖为20×10厘米，厚约2厘米，一般个体为4×3厘米，厚0.5～1厘米，下面有无数小孔，管口呈白色或淡褐色，每毫米内有4～5个，管口圆形，内壁为子实层，孢子产生于担子顶端。菌柄侧生，极少偏生，长于菌盖直径，紫褐色至黑色，有漆样光泽，坚硬。孢子卵圆形，8～11×7厘米，壁两层，内壁褐色，表面有小疣，外壁透明无色。

灵芝多糖是由三股单糖链构成的、具有螺旋状立体构形(三级结构)的葡聚糖，其立体构形与脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)相似，是一种大分子化合物，其分子量从数千到数十万，它是一种从灵芝孢子粉或灵芝中提取的物质。不溶于高浓度的酒精，微溶于低浓度的酒精及冷水，在热水中能全部溶解。灵芝多糖都存在于灵芝的细胞壁内壁。灵芝多糖中除含有葡萄糖外，大多还含有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖等单糖，但含量较少。单糖间糖苷键连接有1，3、1，4和1，6数种。大多为β型结构，少数为α-型结构。α-型多糖没有药理活性(药效)。多数多糖链有分支，部分多糖链含有小分子肤链。多糖链分枝密度高或含有肤链的其药理活性也高。灵芝多糖在水溶液中多糖链一般由三股糖链组成，在o.1摩/升氢氧化纳溶液中时多糖链的三股糖链离解为单股单糖链。

多糖的药理活性与单糖间糖苷键的结合形式有关。单糖间以β-1，3、1.6或β-1.4、1.6-糖苷键连接是有效的即具有药理活性，而纯β-1.4-糖背键连接的则没有药理活性。此外，多糖的药理活性还与其立体构形有关，若螺旋形立体结构被破坏，其活性则大大下降。淀粉、纤维素、糊精也是多糖，但其构形与灵芝多糖(或其他真菌多糖)不同。淀粉、纤维素等多糖没有螺旋形立体结构，单糖间的连接全是β-1，4-连接。纤维素是β-型多糖，淀粉、糊精是α-型多糖。由于其构形不同，所以淀粉、糊精、纤维素都没有药理活性。

灵芝多糖灵芝多糖是灵芝的最有效成分之一，因此，也特别受到药科技工作者的重视，对它的研究报道也最多。已分离到的灵芝多糖有200多种，其中有数十种的结构已被搞清，分子量已被测定。

灵芝多糖有多方面的药理活性：能提高机体免疫力，加速血液微循环，提高血液供氧能力，降低机体静止状态下的无效耗氧量，消除体内自由基，提高机体细胞膜的封闭度，抗放射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA，RNA，蛋白质的能力，延长寿命等。灵芝的多种药理活性大多和灵芝多糖有关。

发明内容：

本发明的目的在于克服常规技术提取率相对较低、提取纯度低等缺点，提供一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其步骤如下：

(1)将干灵芝粉碎过60-80目筛后，放入耐压袋中，加入10-12倍体积的浓度为70％-90％的乙醇，在超高压200-300MPA，10-15min、18-20℃条件下处理，回收乙醇，在60℃真空干燥得粗品；

(2)将所得灵芝多糖粗品粉末，加适量75％乙醇溶解，调节其PH值3.0～7.5，加热至40～60℃，加入果胶酶(100万u/ml)1.0～2.0％，混匀后保持酶解0.5～3h。冷却至室温，静置、过滤、弃去滤渣，减压浓缩滤液得灵芝多糖粗提物；

(3)将所得灵芝多糖粗提物用大孔吸附树脂进行吸附；

(4)用不同浓度的乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱，用薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(5)将灵芝多糖各阶段洗脱液浓缩回收乙醇，得灵芝多糖半成品，其含量为40％以上；

(6)将所得灵芝多糖半成品上硅胶层析柱，并以正丁醇、氯仿以不同体积比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(7)将产品用6-8倍体积的60-80％乙醇溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜得晶体；分离晶体将剩余物用50％-60％乙醇溶解，再次浓缩，重结晶，如此反复两次，得到精制的灵芝多糖，其含量在90％以上。

步骤(3)中所用的大孔吸附树脂为X-5、NKA-9、S-8、D3520、D4006、H103、D4020、AB-8H和LX-100型树脂中的一种，吸附为静态吸附或动态吸附。

步骤(4)中所述的洗脱为用70～90％的乙醇进行洗脱。

本发明应用超高压技术是在常温及近常温条件下对原料施加以压力大于100流体静压力的一种处理方法，超高压力可使溶剂进入植物细胞内部，泄压后溶剂可带着有效成分而溢出，实现植物有效成分的高提取效率，利用大孔树脂进行吸附纯化灵芝多糖，对灵芝多糖的吸附选择性良好，吸附快解析也快，吸附容量较大；

本发明选用理化性质稳定、表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定性好的大孔吸附树脂，不容于酸、碱及有机媒，对有机物选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响，可以通过物理吸附从溶液中有选择地吸附灵芝多糖，吸附快、解析也快，吸附容量较大。

具体实施方式：

实施例1：一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其步骤如下：

(1)将干灵芝粉碎过60目筛后，放入耐压袋中，加入10倍体积的浓度为70％的乙醇，在超高压200MPA，10min、18℃条件下处理，回收乙醇，在60℃真空干燥得粗品；

(2)将所得灵芝多糖粗品粉末，加适量75％乙醇溶解，调节其PH值5.5，加热至60℃，加入果胶酶(100万u/ml)2.0％，混匀后保持酶解0.5h。冷却至室温，静置、过滤、弃去滤渣，减压浓缩滤液得灵芝多糖粗提物；

(3)将所得灵芝多糖粗提物用LX-100型大孔吸附树脂进行吸附；

(4)用70％、80％、90％的乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱，用薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(5)将灵芝多糖各阶段洗脱液浓缩回收乙醇，得灵芝多糖半成品，其含量为46.3％；

(6)将所得灵芝多糖半成品上硅胶层析柱，并以正丁醇、氯仿以1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(7)将产品用6倍体积的60％乙醇溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜得晶体；分离晶体将剩余物用50％乙醇溶解，再次浓缩，重结晶，如此反复两次，得到精制的灵芝多糖，其含量在92.5％以上。

实施案例2：一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其步骤如下：

(1)将干灵芝粉碎过80目筛后，放入耐压袋中，加入12倍体积的浓度为90％的乙醇，在超高压300MPA，15min、20℃条件下处理，回收乙醇，在60℃真空干燥得粗品；

(2)将所得灵芝多糖粗品粉末，加适量75％乙醇溶解，调节其PH值7.5，加热至60℃，加入果胶酶(100万u/ml)2.0％，混匀后保持酶解1.5h。冷却至室温，静置、过滤、弃去滤渣，减压浓缩滤液得灵芝多糖粗提物；

(3)将所得灵芝多糖粗提物用AB-8H大孔吸附树脂进行吸附；

(4)用70％、80％、90％不同浓度的乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱，用薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(5)将灵芝多糖各阶段洗脱液浓缩回收乙醇，得灵芝多糖半成品，其含量为41.4％以上；

(6)将所得灵芝多糖半成品上硅胶层析柱，并以正丁醇、氯仿以1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(7)将产品用8倍体积的80％乙醇溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜得晶体；分离晶体将剩余物用60％乙醇溶解，再次浓缩，重结晶，如此反复两次，得到精制的灵芝多糖，其含量在91.7％。

实施案例3：一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其步骤如下：

(1)将干灵芝粉碎80目筛后，放入耐压袋中，加入12倍体积的浓度为80％的乙醇，在超高压200MPA，12min、18℃条件下处理，回收乙醇，在60℃真空干燥得粗品；

(2)将所得灵芝多糖粗品粉末，加适量75％乙醇溶解，调节其PH值4.5，加热至50℃，加入果胶酶(100万u/ml)1.5％，混匀后保持酶解2h。冷却至室温，静置、过滤、弃去滤渣，减压浓缩滤液得灵芝多糖粗提物；

(3)将所得灵芝多糖粗提物用H103大孔吸附树脂进行吸附；

(4)用70％、80％、90％不同浓度的乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱，用薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(5)将灵芝多糖各阶段洗脱液浓缩回收乙醇，得灵芝多糖半成品，其含量为42.6％；

(6)将所得灵芝多糖半成品上硅胶层析柱，并以正丁醇、氯仿以1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(7)将产品用8倍体积的70％乙醇溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜得晶体；分离晶体将剩余物用60％乙醇溶解，再次浓缩，重结晶，如此反复两次，得到精制的灵芝多糖，其含量在93.6％。

Claims (3)

1.一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其步骤如下：

(1)将干灵芝粉碎过60-80目筛后，放入耐压袋中，加入10-12倍体积的浓度为70％-90％的乙醇，在超高压200-300MPA，10-15min、18-20℃条件下处理，回收乙醇，在60℃真空干燥得粗品；

(2)将所得灵芝多糖粗品粉末，加适量75％乙醇溶解，调节其PH值3.0～7.5，加热至40～60℃，加入果胶酶(100万u/ml)1.0～2.0％，混匀后保持酶解0.5～3h。冷却至室温，静置、过滤、弃去滤渣，减压浓缩滤液得灵芝多糖粗提物；

(3)将所得灵芝多糖粗提物用大孔吸附树脂进行吸附；

(4)用不同浓度的乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱，用薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(5)将灵芝多糖各阶段洗脱液浓缩回收乙醇，得灵芝多糖半成品，其含量为40％以上；

(6)将所得灵芝多糖半成品上硅胶层析柱，并以正丁醇、氯仿以不同体积比例进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集灵芝多糖各阶段洗脱液；

(7)将产品用6-8倍体积的60-80％乙醇溶解，浓缩到原体积的十分之一，放置过夜得晶体；分离晶体将剩余物用50％-60％乙醇溶解，再次浓缩，重结晶，如此反复两次，得到精制的灵芝多糖，其含量在90％以上。

步骤(3)中所用的大孔吸附树脂为X-5、NKA-9、S-8、D3520、D4006、H103、D4020、AB-8H和LX-100型树脂中的一种，吸附为静态吸附或动态吸附。

步骤(4)中所述的洗脱为用70～90％的乙醇进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其特质是：所述的步骤(1)中，灵芝粉后过60～80目筛再进行超高压提取。

3.根据权利要求l所述的一种利用超高压技术提取灵芝中灵芝多糖的方法，其特征是：在所述的步骤(2)中，超高压提取完后利用酶解技术再次提取。