BR112020009838A2 - produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes - Google Patents

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BR112020009838A2
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Veronique Douchin
Swee Chuang Lim Hallwyl
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Abstract

A invenção refere-se a micro-organismos recombinantes e métodos para a produção de glicosídeos de esteviol e precursores de glicosídeo de esteviol.

Description

“PRODUÇÃO DE GLICOSÍDEOS DE ESTEVIOL EM HOSPEDEIROS RECOMBINANTES”
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da invenção
[001]Esta divulgação refere-se à produção recombinante de glicosídeos de esteviol, glicosídeos de precursores de esteviol e precursores de glicosídeo de esteviol em hospedeiros recombinantes. Particularmente, a divulgação refere-se à produção de glicosídeos de esteviol compreendendo esteviol-13-O-giclosídeo (13-SMG), esteviol-19-O-glicosídeo (19-SMG), esteviol-1,2-biosídeo, esteviol-1,3-biosídeo, 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo, rubusosídeo, Rebaudiosídeo A (RebA), Rebaudiosídeo B (RebB), Reabudiosídeo C (RebC), Rebaudiosídeo D (RebD), Rebaudiosídeo E (RebE), Rebaudiosídeo F(RebF), Rebaudiosídeo M (RebM), Rebaudiosídeo Q (RebQ), Rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A, ácidos ent-caurenoicos monoglicosilados, ácidos ent-caurenoicos diglicosilados, ácidos ent-caurenoicos triglicosilados, ent-caurenos, ent-caurenos diglicosilados, ent-caurenos triglicosilados, glicosídeos de esteviol triglicosilados, glicosídeos de esteviol tetraglicosilados, glicosídeos de esteviol pentaglicosilados, glicosídeos de esteviol hexaglicosilados, glicosídeos de esteviol heptaglicosilados ou isômeros destes em hospedeiros recombinantes.
Descrição da Técnica Relacionada
[002]Os adoçantes são bem conhecidos como ingredientes usados mais comumente nas indústrias de alimentos, bebidas ou confeitos. O adoçante pode ser incorporado em um produto alimentar final durante a produção ou para uso autônomo, quando adequadamente diluído, como adoçante de mesa ou substituição caseira de açúcares para massas assadas. Os adoçantes incluem adoçantes naturais, como sacarose, xarope de milho de alta frutose, melaço, xarope de bordo e mel e adoçantes artificiais, como aspartame, sacarina e sucralose. O extrato de estévia é um adoçante natural que pode ser isolado e extraído de um arbusto perene. Stevia rebaudiana. A estévia é comumente cultivada na América do Sul e na Ásia para produção comercial de extrato de estévia. O extrato de estévia, purificado em vários graus, é usado comercialmente como adoçante de alta intensidade em alimentos e em misturas ou sozinho como adoçante de mesa.
[003]As estruturas químicas para vários glicosídeos de esteviol são mostradas na Figura 2, incluindo o esteviol de diterpeno e vários glicosídeos de esteviol. Os extratos da planta de estévia geralmente compreendem glicosídeos de esteviol que contribuem para o sabor doce, embora a quantidade de cada glicosídeo de esteviol varie frequentemente, inter alia, entre diferentes lotes de produção.
[004]A recuperação e a purificação de glicosídeos de esteviol da planta de estévia provaram ser trabalhosas e ineficientes. Além disso, as composições de glicosídeo de esteviol obtidas a partir de um extrato de estévia derivado de plantas geralmente contêm componentes derivados de plantas de estévia que podem contribuir para sabores desagradáveis. Como tal, permanece a necessidade de um sistema de produção recombinante que possa acumular altos rendimentos dos glicosídeos de esteviol desejados, como RebA, RebD e/ou RebM e produzir composições de glicosídeo de esteviol que são enriquecidas para um ou mais glicosídeos de esteviol desejados em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol da planta de estévia com um nível reduzido de componentes derivados da planta de estévia em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol obtida a partir de um extrato de estévia derivado da planta. Existe também a necessidade de uma produção aprimorada de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes para uso comercial. Também existe a necessidade de aumentar a formação de uridina difosfato glicose (UDP-glicose) em hospedeiros recombinantes para produzir altos rendimentos de glicosídeos de esteviol, incluindo RebA, RebD e/ou RebM.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005]É contra os fundamentos acima que a presente invenção forneça certas vantagens sobra a técnica anterior.
[006]Embora esta invenção, conforme divulgada neste documento, não se limite a vantagens ou funcionalidades específicas (como, por exemplo, a capacidade de aumentar a produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou de um precursor de esteviol, purificar um ou mais glicosídeos de esteviol ou glicosídeos do precursor de esteviol e produzir composições de glicosídeo de esteviol nas quais as proporções diferentes dos vários glicosídeos de esteviol fornecem a vantagem de ter um nível reduzido de componentes derivados da planta de estévia relacionados a uma composição de glicosídeo de esteviol obtida a partir de um extrato de estévia derivado da planta), a invenção fornece uma célula hospedeira capaz de produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular, compreendendo: (a) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio; e/ou (b) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato.
[007]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio é capaz de atividade de 4-α-glucanotransferase e atividade de α-1,6-amiloglucosidase.
[008]Em um aspecto, as células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento compreendem adicionalmente: (c) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina-5'-trifosfato (UTP) a partir de uridina difosfato (UDP); (d) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato; e/ou (e) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina difosfato glicose (UDP-glicose) a partir de UTP e glicose-1-fosfato.
[009]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento: (a) o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; (b) o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; (c) o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; (d) o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 119 ou 143 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 141, 145 ou 147; e/ou (e) o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 121 ou 127, um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139 ou um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 131.
[010]Em um aspecto, as células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento compreendem adicionalmente: (a) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicolisar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 deste; (b) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol; (c) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 deste; (d) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol; (e) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar pirofosfato de geranilgeranil (GGPP) a partir de farnesil difosfato (FPP) e difosfato de isopentenil (IPP); (f) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP; (g) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de difosfato de ent-copalil; (h) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico a partir de ent-caureno; (i) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; e/ou (j) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol a partir de ácido ent- caurenoico; em que pelo menos um dos genes é um gene recombinante.
[011]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento:
(a) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol seu grupo hidroxila C-13 deste compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:7; (b) o polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambos 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:9;
(c) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol seu grupo carbonila C-19 deste compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4;
(d) o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambos 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo que possui pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;
(e) o polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, ou 116;
(f) o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 34, 36, 38, 40, 42 ou 120; (g) o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 50 ou 52; (h) o polipeptídeo capaz de sintetizar o ácido ent-caurenoico compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 60, 62, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 117; (i) o polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92; e/ou (j) o polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 94, 97, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112 ou 114.
[012]Em um aspecto, as células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento compreendem: (a) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; (b) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; (c) o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina-5'-trifosfato (UTP) a partir de uridina difosfato (UDP) com pelo menos 60%
de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ
ID NO: 123;
(d) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 ou 119; e
(e) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121; e um ou mais de:
(f) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de glicolisar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 deste que possui pelo menos
55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO:7; (g) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambos 13-O-glicose e
19-O-glicose do glicosídeo de esteviol que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:9;
(h) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 deste que possui pelo menos
55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO:4;
(i) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende o polipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; o polipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:13; ou o polipeptídeo que possui pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; em que pelo menos um dos genes é um gene recombinante.
[013]Em um aspecto, as células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento compreendem: (a) o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou (b) o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; em que o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e/ou o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato são superexpressos em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[014]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, o gene que codifica o polipeptídeo capaz de desfazer o glicogênio e/ou o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato são superexpressos em pelo menos 10% ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[015]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[016]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, ou pelo menos 250% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[017]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[018]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[019]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade de RebA, RebD e/ou RebM produzida pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou em pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos
30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[020]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade de um de um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[021]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol acumulados pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[022]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui uma quantidade de 13-SMG acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[023]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[024]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pela célula em menos de 10%, ou menos de 5%, ou menos de 2,5% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[025]Em um aspecto da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, um ou mais glicosídeos de esteviol é, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13-O-glucosídeo (13-SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O-glucosídeo (19-SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B (RebB), rebaudiosídeo C (RebC), rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero deste.
[026]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a célula hospedeira recombinante é uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica do gênero Aspergillus ou uma célula de levedura de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorphe, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous, ou da espécie Candida albicans, uma célula de alga ou uma célula bacteriana da espécie Escherichia coli ou gênero Bacillus.
[027]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a célula hospedeira recombinante é uma célula de
Saccharomyces cerevisiae.
[028]Em um aspecto das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento, a célula hospedeira recombinante é uma célula de Yarrowia lipolytica.
[029]A invenção também fornece um método para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular, compreendendo a cultura da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento na cultura celular, sob condições nas quais os genes são expressos e em que um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol é produzida pela célula hospedeira recombinante.
[030]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, os genes são expressos constitutivamente.
[031]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a expressão dos genes é induzida.
[032]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a quantidade de RebA, RebD e/ou RebM produzida pela célula é aumentada em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[033]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a quantidade de 13-SMG acumulada pela célula é diminuída em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[034]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula é aumentada em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125% ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[035]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a quantidade de glicosídeos totais de esteviol produzidos pela célula é diminuída em menos de 10%, ou menos de 5%, ou menos de 2,5% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[036]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a célula hospedeira recombinante é cultivada em um fermentador a uma temperatura durante um período de tempo, em que a temperatura e o período de tempo facilitam a produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol.
[037]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, ou pelo menos 250% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[038]Em um aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem adicionalmente isolar um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol da cultura celular.
[039]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a etapa de isolamento compreende separar uma fase líquida da cultura celular de uma fase sólida da cultura celular para obter um sobrenadante compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol e: (a) colocar em contato o sobrenadante com uma ou mais resinas adsorventes para obter pelo menos uma porção de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol; ou (b) colocar em contato com o sobrenadante com uma ou mais colunas de cromatografia de permuta iônica ou de fase reversa, a fim de obter pelo menos uma porção de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou da composição de glicosídeo de esteviol; ou (c) cristalizar ou extrair um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol; isolando assim um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol.
[040]Em um aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem adicionalmente recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol da cultura celular.
[041]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, um ou mais glicosídeos de esteviol recuperados ou a composição de glicosídeo de esteviol são enriquecidos para um ou mais glicosídeos de esteviol em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol da planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados da planta de estévia em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol obtida a partir de um extrato de estévia derivado de plantas.
[042]A invenção também fornece um método para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol, compreende a bioconversão de célula inteira de esteviol derivados de plantas ou sintéticos e/ou glicosídeos de esteviol em uma cultura celular de uma célula hospedeira recombinante usando:
(a) um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, compreendendo um polipeptídeo que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou
(b) um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato, compreendendo um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; e opcionalmente, um ou mais de:
(c) um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123;
(d) um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 119 ou 143 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 141, 145 ou 147; e/ou (e) um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 121 ou 127; pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das
SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139; ou pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 131, e um ou mais de:
(f) um polipeptídeo capaz de glicosilar esteviol ou um glicosídeo de esteviol no seu grupo hidroxila C-13 deste;
(g) um gene capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose,
19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol; (h) um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 deste; e/ou (i) um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; em que pelo menos um dos polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante expresso na célula hospedeira recombinante; e produzindo assim um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol.
[043]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento: (f) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol seu grupo hidroxila C-13 deste compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:7; (g) o polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambos 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:9; (h) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol seu grupo carbonila C-19 deste compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4; (i) o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambos 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo que possui pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16.
[044]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a célula hospedeira recombinante é uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica do gênero Aspergillus ou uma célula de levedura de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorphe, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous, ou da espécie Candida albicans, uma célula de alga ou uma célula bacteriana da espécie Escherichia coli ou gênero Bacillus.
[045]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, a célula hospedeira recombinante é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.
[046]Em um aspecto dos métodos recombinantes divulgados neste documento, a célula hospedeira recombinante é uma célula de Yarrowia lipolytica.
[047]Em um aspecto dos métodos divulgados neste documento, um ou mais glicosídeos de esteviol é, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13-O-glucosídeo (13-SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O-glucosídeo (19-SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B (RebB), rebaudiosídeo C (RebC), rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero deste.
[048]A invenção também fornece uma cultura de células, compreendendo a célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, compreendendo adicionalmente a cultura celular: (a) um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira recombinante; (b) glicose, frutose, sacarose, xilose, ramnose, UDP-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glicosamina; e (c) nutrientes suplementares compreendendo metais vestigiais, vitaminas, sais, YNB e/ou aminoácidos; em que um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol estão presentes a uma concentração de pelo menos 1 mg/litro de cultura celular; em que a cultura celular é enriquecida para um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia em relação a um extrato de estévia derivado de plantas.
[049]A invenção também fornece uma cultura de células, compreendendo a célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, compreendendo adicionalmente a cultura celular: (a) um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira recombinante; (b) glicose, frutose, sacarose, xilose, ramnose, UDP-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glicosamina; e (c) nutrientes suplementares compreendendo metais vestigiais, vitaminas, sais, YNB e/ou aminoácidos; em que UDP-glicose está presente na cultura celular a uma concentração de pelo menos 100 µM; em que o meio de cultura de células é enriquecido para a UGP-glicose em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol da planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia relativamente a um extrato de estévia derivado de plantas.
[050]A invenção também fornece um lisado celular da célula hospedeira recombinante divulgada neste documento cultivada na cultura celular, compreendendo: (a) um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira recombinante; (b) glicose, frutose, sacarose, xilose, ramnose, UDP-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glicosamina; e/ou (c) nutrientes suplementares compreendendo metais vestigiais, vitaminas, sais, base nitrogenada de fermento, YNB e/ou aminoácidos; em que um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante estão presentes a uma concentração de pelo menos 1 mg/litro da cultura celular.
[051]A invenção também fornece um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pelas células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento; em que um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante estão presentes em quantidades relativas que são diferentes de uma composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia em relação a um extrato de estévia derivado de plantas.
[052]A invenção também fornece um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pelos métodos divulgados neste documento; em que um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante estão presentes em quantidades relativas que são diferentes de uma composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia em relação a um extrato de estévia derivado de plantas.
[053]A invenção também fornece uma composição adoçante, compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol divulgados neste documento.
[054]A invenção também fornece um produto alimentar compreendendo a composição adoçante divulgada neste documento.
[055]A invenção também fornece uma bebida ou um concentrado de bebida, compreendendo a composição de adoçante divulgada neste documento.
[056]Estas e outras características e vantagens da presente invenção serão mais completamente compreendidas a partir da seguinte descrição detalhada, tomada em conjunto com as reivindicações anexas. Note-se que o alcance das reivindicações é definido pelas recitações nelas contidas e não pela discussão específica de características e vantagens apresentadas na presente descrição.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[057]A descrição detalhada das modalidades da presente invenção que se segue pode ser melhor entendida quando liga juntamente com as figuras a seguir, onde uma estrutura semelhante vem indicada com números de referência semelhantes e onde:
[058]A Figura 1 mostra a via bioquímica para produzir esteviol a partir de geranilgeranil difosfato usando geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS), ent-copalil difosfato sintase (CDPS), ent-caureno sintase (KS), ent-caureno oxidase (KO) e polipeptídeos de ácido ent-caurenoico hidroxilase (KAH).
[059]A Figura 2 mostra reações de glicosilação de glicosídeo de esteviol primário representativas catalisadas por enzimas UGT adequadas e estruturas químicas para vários dos compostos encontrados em extratos de estévia.
[060]A Figura 3 mostra reações representativas catalisadas por enzimas envolvidas na via biossintética da UDP-glicose, incluindo uracil permease (FUR4), uracil fosforribosiltransferase (FUR1), orotato fosforibosiltransferase 1 (URA5),
orotato fosforibosiltransferase 2 (URA10), orotidina 5'-fosfato descarboxilase (URA3), uridilato quinase (URA6), nucleosídeo difosfato quinase (YNK1), fosfoglucomutase -1 (PGM1), fosfoglucomutase-2 (PGM2) e UTP-glicose-1-fosfato uridililtransferase (UGP1), glicogenina glicosiltransferase-1 (GLG1), glicogenina glicosiltransferase-2 (GLG-2), sintase de glicogênio-1 (GSY1), sintase de glicogênio-2 (GSY2), enzima de ramificação de glicogênio (GLC3), enzima de desramificação de glicogênio (GDB1) e glicogênio fosforilase (GPH1). ver, por exemplo, Daran et al., 1995, Eur. J. Biochem. 233(2):520-30; François e Parrou, 2001, FEMS Microbiol. Rev. 25(1): 125-45.
[061]Aqueles versados na técnica entenderão que os elementos das Figuras são ilustrados para simplicidade e clareza e não foram necessariamente desenhados em escala. por exemplo, as dimensões de alguns dos elementos nas Figuras podem ser exageradas em relação a outros elementos para ajudar a aprimorar a compreensão das modalidades da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[062]Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste documento estão incorporados neste documento por referência para todos os efeitos.
[063]Antes de se descrever a presente invenção em detalhes, serão definidos vários termos. Conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma e "o(a)" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário. por exemplo, a referência a um "ácido nucleico" significa um ou mais ácidos nucleicos.
[064]Note-se que termos como “preferencialmente”, “comumente” e “tipicamente” não são usados neste documento para limitar o escopo da invenção reivindicada ou para implicar que certas características são críticas, essenciais ou até mesmo importantes para a estrutura ou função da invenção reivindicada. Em vez disso, estes termos destinam-se meramente a realçar características alternativas ou adicionais que podem ou não podem ser usadas em uma modalidade particular da presente divulgação.
[065]Para os propósitos de descrever e definir a presente invenção, é notado que o termo "substancialmente" é usado neste documento para representar o grau de incerteza inerente que pode ser atribuído a qualquer comparação, valor, medida ou outra representação quantitativa. O termo "substancialmente" é também usado neste documento para representar o grau pelo qual uma representação quantitativa pode variar a partir de uma referência definida, sem que resulte em uma alteração na função básica do assunto em questão.
[066]Métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados para construir construtos de expressão genética e células recombinantes de acordo com esta invenção. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, técnicas de recombinação in vivo e técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR). ver, por exemplo, técnicas como descritas em Green & Sambrook, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Quarta edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York; Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova York, e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, São Diego, CA).
[067]Conforme usado neste documento, os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "ácido nucleico" podem ser usados indistintamente para se referir ao ácido nucleico compreendendo DNA, RNA, seus derivados ou combinações, em modalidades de cadeia única ou de cadeia dupla, dependendo do contexto conforme entendido pelo versado na técnica.
[068]Conforme usado neste documento, os termos "micro-organismo",
"hospedeiro de micro-organismo" e "célula hospedeira de micro-organismo" podem ser usados intercambiavelmente. Conforme usado neste documento, os termos "hospedeiro recombinante" e "célula hospedeira recombinante" podem ser usados intercambiavelmente. O versado na técnica apreciará que os termos "micro-organismo", "hospedeiro de micro-organismo"e "célula hospedeira de micro-organismo", quando usados para descrever uma célula compreendendo um gene recombinante, podem ser considerados "hospedeiro recombinante" ou "célula hospedeira recombinante". Conforme usado neste documento, o termo "hospedeiro recombinante" pretende referir-se a um hospedeiro, cujo genoma foi aumentado por pelo menos uma sequência de DNA. Essas sequências de DNA incluem, mas não estão limitadas a genes que não estão naturalmente presentes, sequências de DNA que normalmente não são transcritas em RNA ou traduzidas em uma proteína ("expressas"), e outros genes ou sequências de DNA que se deseja introduzir em um hospedeiro. Será apreciado que, tipicamente, o genoma de um hospedeiro recombinante descrito neste documento é aumentado através da introdução estável de um ou mais genes recombinantes. Geralmente, o DNA introduzido não é originalmente residente no hospedeiro que é o receptor do DNA, mas está dentro do escopo desta divulgação isolar um segmento de DNA de um determinado hospedeiro e, posteriormente, apresentar uma ou mais cópias adicionais desse DNA no mesmo hospedeiro, por exemplo, para aumentar a produção do produto de um gene ou alterar o padrão de expressão de um gene. Em alguns casos, o DNA introduzido modificará ou até mesmo substituirá um gene endógeno ou sequência de DNA por exemplo, recombinação homóloga ou mutagênese direcionada ao sítio.
Em alguns aspectos, o DNA introduzido é introduzido no genoma em um local diferente daquele no qual o segmento endógeno correspondente do DNA residia originalmente. Os hospedeiros recombinantes adequados incluem micro-organismos.
[069]Conforme usado neste documento, o termo "gene recombinante" refere-se a um gene ou sequência de DNA que é introduzido em um hospedeiro receptor, independentemente de um mesmo gene ou sequência de DNA ou gene ou sequência de DNA semelhante já estar presente em um hospedeiro.
"Introduzido", ou "aumentado", neste contexto, é conhecido na técnica significando o que é introduzido ou aumentado pelo ato humano. Portanto, um gene recombinante pode ser uma sequência de DNA de outra espécie ou pode ser uma sequência de DNA originada ou presente na mesma espécie, mas foi incorporada em um hospedeiro por métodos recombinantes para formar um hospedeiro recombinante. Será apreciado que um gene recombinante que é introduzido num hospedeiro pode ser idêntico a uma sequência de DNA que está normalmente presente no hospedeiro a ser transformado e é introduzido para fornecer uma ou mais cópias adicionais do DNA para assim permitir a superexpressão ou modificação expressão do produto genético desse DNA. Em alguns aspectos, os referidos genes recombinantes são codificados por cDNA. Em outras modalidades, os genes recombinantes são sintéticos e/ou otimizados no códon para expressão em S. cerevisiae.
[070]Conforme neste documento, o termo "via biossintética manipulada" refere-se a uma via biossintética que ocorre em um hospedeiro recombinante, conforme descrito neste documento. Em alguns aspectos, uma ou mais etapas da via biossintética não ocorrem naturalmente em um hospedeiro não modificado. Em algumas modalidades, uma versão heteróloga de um gene é introduzida em um hospedeiro que compreende uma versão endógena do gene.
[071]Conforme usado neste documento, o termo gene "endógeno" refere-se a um gene que se origina e é produzido ou sintetizado dentro de um organismo, tecido ou célula em particular. Em algumas modalidades, o gene endógeno é um gene de levedura. Em algumas modalidades, o gene é endógeno para S. cerevisiae, incluindo, mas não limitado à cepa S288C de S. cerevisiae. Em algumas modalidades, um gene de levedura endógeno é superexpresso. Conforme usado neste documento, o termo "superexpressar" é usado para se referir à expressão de um gene em um organismo a níveis superiores ao nível de expressão do gene em um organismo do tipo selvagem. ver, por exemplo, Prelich, 2012, Genetics 190:841-54. ver, por exemplo, Giaever & Nislow, 2014, Genetics 197(2):451-65. Em alguns aspectos, a superexpressão pode ser realizada por integração usando o sistema de clonagem USER; ver, por exemplo, Nour-Eldin et al., 2010, Methods Mol Biol. 643:185-200. Conforme usado neste documento, os termos "deleção", "deletado", "inativação" e "inativado" podem ser usados intercambiavelmente para se referir a um gene endógeno que foi manipulado para não mais ser expresso em um organismo, incluindo, mas não limitado a S.
cerevisiae. Em alguns aspectos, os termos "deleção", "deletado", "inativação" e "inativado" podem ser usados intercambiavelmente para se referir a um gene endógeno que foi mutado para que o gene endógeno tenha atividade reduzida ou nenhuma atividade.
[072]Conforme usado neste documento, os termos "sequência heteróloga" e "sequência de codificação heteróloga" são usados para descrever uma sequência derivada de uma espécie diferente do hospedeiro recombinante. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula de S. cerevisiae e uma sequência heteróloga é derivada de um organismo que não seja S. cerevisiae. Uma sequência de codificação heteróloga, por exemplo, pode ser de um micro-organismo procariótico, um micro-organismo eucariótico, uma planta, um animal, um inseto ou um fungo diferente do hospedeiro recombinante que expressa a sequência heteróloga. Em algumas modalidades, uma sequência de codificação é uma sequência que é nativa ao hospedeiro.
[073]Conforme usado neste documento, os termos "sequência heteróloga"
e "sequência de codificação heteróloga" são usados para descrever uma sequência derivada de uma espécie diferente do hospedeiro recombinante. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula de S. cerevisiae e uma sequência heteróloga é derivada de um organismo que não seja S. cerevisiae. Uma sequência de codificação heteróloga, por exemplo, pode ser de um micro-organismo procariótico, um micro-organismo eucariótico, uma planta, um animal, um inseto ou um fungo diferente do hospedeiro recombinante que expressa a sequência heteróloga. Em algumas modalidades, uma sequência de codificação é uma sequência que é nativa ao hospedeiro.
[074]Conforme usado neste documento, o termo "constitutivo", "expressão constitutiva" ou "constitutivamente expresso" refere-se a uma transcrição contínua de um gene que resulta na expressão contínua de uma proteína.
[075]Conforme usado neste documento, o termo "induzível", "expressão induzível" ou "induzível expresso" refere-se à expressão de um gene em resposta a um estímulo. Os estímulos incluem, entre outros, produtos químicos, estresse ou estímulos bióticos.
[076]Um "marcador selecionável" pode ser um de qualquer número de genes que complementam a auxotrofia das células hospedeiras, fornecem resistência a antibióticos ou resultam em uma mudança de cor. Os fragmentos de DNA linearizados do vetor de substituição do gene são então introduzidos nas células usando métodos bem conhecidos na técnica (ver abaixo). A integração dos fragmentos lineares no genoma e a ruptura do gene podem ser determinadas com base no marcador de seleção e podem ser verificadas, por exemplo, por PCR ou análise de transferência de Southern. Subsequente ao seu uso na seleção, um marcador selecionável pode ser removido do genoma da célula hospedeira por, por exemplo, Sistemas Cre-LoxP (ver, por exemplo, Gossen et al., 2002, Ann. Rev.
Genetics 36:153-173 e U.S. 2006/0014264). Alternativamente, um vetor de substituição de genes pode ser construído de modo a incluir uma porção do gene a ser interrompido, em que a porção é desprovida de qualquer sequência de promotor de gene endógeno e não codifica nada, ou um fragmento inativo, da sequência de codificação do gene.
[077]Conforme usado neste documento, os termos "variante" e "mutante" são usados para descrever uma sequência de proteína que foi modificada em um ou mais aminoácidos, em comparação com a sequência do tipo selvagem de uma proteína em particular.
[078]Conforme usado neste documento, o termo "fragmento inativo" é um fragmento do gene que codifica uma proteína que possui, por exemplo, menos de 10% (por exemplo, menos de 9%, menos de 8%, menos de 7%, menos de 6%, menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, ou 0%) da atividade da proteína produzida a partir da sequência codificadora de comprimento completo do gene. Essa porção de um gene é inserida em um vetor de tal forma que nenhuma sequência promotora conhecida está operacionalmente ligada à sequência do gene, mas de modo que um códon de parada e uma sequência de terminação da transcrição estão operacionalmente ligados à porção da sequência do gene. Este vetor pode ser posteriormente linearizado na porção da sequência do gene e transformado em uma célula. A título de recombinação homóloga única, este vetor linearizado é então integrado na contraparte endógena do gene com inativação deste.
[079]Conforme usado neste documento, o termo "glicosídeo de esteviol" refere-se a rebaudiosídeo A (RebA) (CAS # 58543-16-1), rebaudiosídeo B (RebB) (CAS # 58543-17-2), rebaudiosídeo C (RebC) (CAS # 63550-99-2), rebaudiosídeo D (RebD) (CAS # 63279-13-0), rebaudiosídeo E (RebE) (CAS # 63279-14-1), rebaudiosídeo F (RebF) (CAS # 438045-89-7), rebaudiosídeo M (RebM) (CAS # 1220616-44-3), Rubusosídeo (CAS # 63849-39-4), Dulcosídeo A (CAS #
64432-06-0), rebaudiosídeo I (Rebl) (registro no MassBank: FU000332), rebaudiosídeo Q (RebQ), 1, 2-Esteviosídeo (CAS # 57817-89-7), 1,3-Esteviosídeo (RebG), Esteviol-1,2-Biosídeo (registro no MassBank: FU000299), Esteviol-1,3-Biosídeo, Esteviol-13-O- glicosídeo (13-SMG), Esteviol-19-O-glicosídeo (19-SMG), um glicosídeo de esteviol tri-glicosilado, um glicosídeo de esteviol tetra-glicosilado, um glicosídeo de esteviol pentaglicosilado, um glicosídeo de esteviol pentaglicosilado, um glicosídeo de esteviol pentaglicosilado, um glicosídeo de esteviol hexa-glicosilado, um glicosídeo de hexa-glicosilado, um hepta-glicosilado glicosídeo de esteviol e isômeros destes.
Ver Figura 2; ver também, Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, preparado por Harriet Wallin, Food Agric. Org.
[080]Conforme usado neste documento, os termos "precursor de glicosídeo de esteviol" e "composto precursor de glicosídeo de esteviol" são usados para se referir a compostos intermediários na via biossintética de glicosídeo de esteviol. Os precursores de glicosídeo de esteviol incluem, mas não estão limitados a difosfato de geranilgeranil (GGPP) ent-copalil-difosfato, ent-caureno, ent-caurenol, ent- caurenal, ácio ent-carenoico e esteviol. Ver Figura 1. Em algumas modalidades, os precursores de glicosídeo de esteviol são eles mesmos compostos de glicosídeo de esteviol. por exemplo, 19-SMG, rubusosídeo, 1-2-esteviosídeo e RebE são precursores de glicosídeo de esteviol de RebM. Ver Figura 2. Conforme usado neste documento, os termos "precursor de esteviol" e "composto precursor de esteviol" são usados para se referir a compostos intermediários na via biossintética de esteviol. Precursores de esteviol também podem ser precursores de glicosídeo de esteviol e incluem, mas não estão limitados a, difosfato de geranilgeranil (GGPP), ent-copalil-difosfato, ent-caureno, ent-caurenol, ent-caurenal e ácido ent-caurenoico.
[081]Conforme usado neste documento, o termo "contato" é usado para se referir a qualquer interação física entre dois objetos. por exemplo, o termo "contato" pode se referir à interação entre uma enzima e um substrato. Em outro exemplo, o termo "contato" pode se referir à interação entre um líquido (por exemplo, um sobrenadante) e uma resina adsorvente.
[082]Os glicosídeos de esteviol e/ou os precursores de glicosídeo de esteviol podem ser produzidos in vivo (ou seja, em um hospedeiro recombinante), in vitro (ou seja, enzimaticamente) ou por bioconversão de células inteiras.
Conforme usado neste documento, os termos "produzir" e "acumular" podem ser usados indistintamente para descrever a síntese de glicosídeos de esteviol e precursores de glicosídeo de esteviol in vivo, in vitro, ou por bioconversão de células inteiras.
[083]Conforme usado neste documento, os termos “caldo de cultura”, “meio de cultura” e “meio de crescimento” podem ser usados intercambiavelmente para se referir a um líquido ou sólido que suporta o crescimento de uma célula. Um caldo de cultura pode compreender glicose, frutose, sacarose, traços de metais, vitaminas, sais, base azotada de levedura (YNB) e/ou aminoácidos. Os traços de metais podem ser cátions divalentes, incluindo, mas não se limitando a, Mn2+ e/ou Mg2+. Em algumas modalidades, o Mn2+ pode estar na forma de di-hidrato de MnCl2 e variar de aproximadamente 0,01 g/L a 100 g/L. Em algumas modalidades, o Mg2+ pode estar na forma de MgSO4 hepta-hidratado e variar de aproximadamente 0,01 g/L a 100 g/L. por exemplo, um caldo de cultura pode compreender i) aproximadamente 0,02-0,03 g/L de MnCl2 di-hidratado e aproximadamente 0,5-3,8 g/L de MgSO4 hepta-hidratado, ii) aproximadamente 0,03-0,06 g/L de MnCl2 di-hidratado e aproximadamente 0,5-3,8 g/L de MgSO4 hepta-hidratado e/ou doente iii) aproximadamente 0,03-0,17 g/L de MnCl2 di-hidratado e aproximadamente 0,5-7,3 g/l de MgSO4 hepta-hidratado. Adicionalmente, um caldo de cultura pode compreender um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos por um hospedeiro recombinante, conforme descrito neste documento.
[084]Cepas de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) produtoras de glicosídeo de esteviol recombinante são descritas em WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227 e WO 2014/122328, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade. Os métodos de produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes, por bio-conversão de células inteiras e in vitro são também descritos em WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227 e WO 2014/122328.
[085]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar pirofosfato de geranilgeranil (GGPP) a partir de difosfato de farnesil (FPP) e difosfato de isopentenil (IPP) (por exemplo, um polipeptídeo de geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP (por exemplo, um polipeptídeo ent-copalil difosfato sintase (GDPS)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato (por exemplo, um polipeptídeo de sintase de caureno (KS)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno (por exemplo, um polipeptídeo de caureno oxidase (KO)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 (por exemplo, um polipeptídeo do citocromo P450 redutase (CPR) ou um polipeptídeo da oxidorredutase P450 (POP)); por exemplo, mas não limitado a um polipeptídeo capaz de transferência de elétrons do NADPH para o complexo do citocromo P450 durante a conversão de NADPH em NADP+, que é usado como cofator para biossíntese de terpenoides); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol a partir do ácido ent-caurenoico (por exemplo, um polipeptídeo da esteviol sintase (KAH)); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP e sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato (por exemplo, um polipeptídeo de sintase de ent-copalil difosfato (GDPS), sintase de ent-caureno (KS)) pode produzir esteviol in vivo. ver, por exemplo, Figura 1. O versado na técnica apreciará que um ou mais desses genes podem ser endógenos para o hospedeiro desde que pelo menos um (em algumas modalidades, todos) desses genes seja um gene recombinante introduzido no hospedeiro recombinante.
[086]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 (por exemplo, um polipeptídeo UGT85C2); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, um polipeptídeo UGT76G1); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19 (por exemplo, um polipeptídeo UGT74G1); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, um polipeptídeo UGT91D2 ou EUGT11) pode produzir um glicosídeo de esteviol in vivo. O versado na técnica apreciará que um ou mais desses genes podem ser endógenos para o hospedeiro desde que pelo menos um (em algumas modalidades, todos) desses genes seja um gene recombinante introduzido no hospedeiro recombinante.
[087]Em algumas modalidades, os glicosídeos de esteviol e/ou precursores de glicosídeos de esteviol são produzidos in vivo através da expressão de uma ou mais enzimas envolvidas na via biossintética do glicosídeo de esteviol em um hospedeiro recombinante. por exemplo, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP a partir de FPP e IPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP e sintetizar ent-caureno a partir de difosfato de ent-copalil; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2’ da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol pode produzir um glicosídeo de esteviol e/ou precursores de glicosídeo de esteviol in vivo. ver, por exemplo, Figuras 1 e 2. O versado na técnica apreciará que um ou mais desses genes podem ser endógenos para o hospedeiro desde que pelo menos um (em algumas modalidades, todos) desses genes seja um gene recombinante introduzido no hospedeiro recombinante.
[088]Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produtor de esteviol compreende ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13; um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19; e um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol.
[089]Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produtor de esteviol compreende ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13, um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol e um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um polipeptídeo de glicosídeo de esteviol.
[090]Em alguns aspectos, um polipeptídeo capaz de glicosilar esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13, um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol, um polipeptídeo capaz de glicosilar esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 e/ou um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol, transfere uma molécula de glicose da uridina difosfato de glicose (UDP-glicose) para esteviol e/ou um glicosídeo de esteviol.
[091]Em alguns aspectos, a glicose UDP é produzida in vivo através da expressão de uma ou mais enzimas envolvidas na via biossintética da UDP-glicose em um hospedeiro recombinante. por exemplo, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de transportar uracil nas células hospedeiras (por exemplo, uracil permease (FUR4)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar monofosfato de uridina (UMP) a partir de uracil (por exemplo, uracil fosforibosiltransferase (FUR1)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar monofosfato de orotidina (OMP) a partir de orotato ou ácido orótico (por exemplo, orotato fosforibosiltransferase 1 (URA5) e orotato fosforibosiltransferase 2 (URA10)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UMP a partir de OMP (por exemplo, oritidina 5’-fosfato descarboxilase (URA3)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar difosfato de uridina (UDP) a partir de UMP (por exemplo, uridilato quinase (URA6)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina 5’-trifosfato (UTP) a partir de UDP (ou seja, um polipeptídeo capaz de catalisar a transferência de fosfatos gama a partir de trifosfatos de nucleosídeo, por exemplo, difosfato de nucleosídeo quinase (YNK1)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, fosfoglicomutase-1 (PGM1) e fosfoglicomutase-2 (PGM2)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio (por exemplo, enzima desagregadora de glicogênio (GDB1)); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, glicogênio fosforilase (GPH1)); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP- glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, UTP-glicose-1-fosfato uridililtransferase (UGP1)) pode produzir UDP-glicose in vivo. ver, por exemplo, Figura 3. O versado na técnica saberá que um ou mais destes genes podem ser endógenos ao hospedeiro.
[092]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP. Em alguns aspectos, o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP é um gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro. Em outros aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica heteróloga. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um terminador, por exemplo, mas não limitado a, tCYC1 (SEQ ID NO: 154) ou tADH1 (SEQ ID NO: 155). Em alguns aspectos, o promotor e terminador conduzem a alta expressão do gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor forte, por exemplo, mas não limitado a, pTEF1 (SEQ ID NO: 148), pPGK1 (SEQ ID NO: 149), pTDH3 (SEQ ID NO: 150), pTEF2 (SEQ ID NO: 151), pTPI1 (SEQ ID NO: 152) ou pPDC1 (SEQ ID NO: 153). Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica que se originou ou está presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante. Em alguns aspectos, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP resulta num nível total de expressão de genes que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP que é superior ao nível de expressão de genes endógenos que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o UTP a partir de UDP, ou seja, uma superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP.
[093]Em alguns aspectos, o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP é um gene presente nas mesmas espécies que o hospedeiro recombinante, ou seja, um gene endógeno. Em algumas modalidades, o promotor do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP pode ser trocado por um promotor forte.
Em alguns aspectos, o promotor forte conduz a alta expressão do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em outras modalidades, o potenciador do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP pode ser trocado por um potenciador forte. Em algumas modalidades, o potenciador forte conduz a uma expressão alta do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em algumas modalidades, tanto o potenciador do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao promotor) e ao promotor do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao gene endógeno) do gene endógeno pode ser trocado por um potenciador forte e promotor forte, respectivamente, resultando em superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP de UDP (ou seja, em relação ao nível de expressão de genes endógenos operacionalmente ligados a potenciadores do tipo selvagem e/ou promotores). O gene endógeno operacionalmente ligado ao potenciador e/ou promotor forte pode estar localizado nos loci nativos e/ou pode estar localizado em outra parte do genoma.
[094]por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno codificando um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP de UDP, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante codificando um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, compreendendo um sequência nucleotídica nativa do hospedeiro, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo para o hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno codificando um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP de UDP, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante codificador de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, compreendendo uma sequência nucleotídica heteróloga, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo para o hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, operacionalmente ligado a, por exemplo, um promotor forte nativo ao hospedeiro, ou um promotor heterólogo.
[095]O versado na técnica apreciará que, por exemplo, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP; a expressão de um gene recombinante e um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP e expressão de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, em que o promotor do tipo selvagem e/ou potenciador do gene endógeno são trocados por um promotor e/ou potenciador forte, cada um resulta na superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP em relação a um hospedeiro correspondente que não expresse um gene recombinante codificando um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP e/ou um hospedeiro correspondente expressando apenas um gene nativo que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, operacionalmente ligado ao promotor e potenciador do tipo selvagem—ou seja, conforme usado neste documento, o termo "expressão" pode incluir "superexpressão".
[096]Em algumas modalidades, um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP é superexpresso de tal modo que o nível de expressão total de genes codificando o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP é pelo menos 5% superior ao nível de expressão de genes endógenos codificando um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP. Em algumas modalidades, o nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP é pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% superior ao nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP.
[097]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato. Em alguns aspectos, o gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato é um gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro. Em outros aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica heteróloga. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um terminador, por exemplo, mas não limitado a, tCYC1 (SEQ ID NO: 154) ou tADH1 (SEQ ID NO: 155). Em alguns aspectos, o promotor e terminador conduzem a alta expressão do gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor forte, por exemplo, mas não limitado a, pTEF1 (SEQ ID NO: 148), pPGK1 (SEQ ID NO: 149), pTDH3 (SEQ ID NO: 150), pTEF2 (SEQ ID NO: 151), pTPI1 (SEQ ID NO: 152) ou pPDC1 (SEQ ID NO: 153). Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica que se originou ou está presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante. Em alguns aspectos, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato resulta em um nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1. fosfato que é superior ao nível de expressão dos genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, ou seja, uma superexpressão de um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato.
[098]Em alguns aspectos, o gene que codifica o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato é um gene presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante, ou seja, um gene endógeno. Em algumas modalidades, o promotor do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato pode ser trocado por um promotor forte. Em alguns aspectos, o promotor forte conduz a alta expressão do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em outras modalidades, o potenciador do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato pode ser trocado por um potenciador forte. Em algumas modalidades, o potenciador forte conduz a uma expressão alta do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em algumas modalidades, tanto o potenciador do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao promotor) e ao promotor do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao gene endógeno) do gene endógeno pode ser trocado por um potenciador forte e promotor forte, respectivamente, resultando em superexpressão de um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (ou seja, em relação ao nível de expressão de genes endógenos operacionalmente ligados a potenciadores do tipo selvagem e/ou promotores). O gene endógeno operacionalmente ligado ao potenciador e/ou promotor forte pode estar localizado nos loci nativos e/ou pode estar localizado em outra parte do genoma.
[099]por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno codificando um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante codificador de um polipeptídeo capaz de conversão de glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, compreendendo uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo para o hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante codificador de um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato glicose-1-fosfato, compreendendo uma sequência nucleotídica heteróloga, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo para o hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, operacionalmente ligado a, por exemplo, um promotor forte nativo ao hospedeiro, ou um promotor heterólogo.
[0100]Em algumas modalidades, um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato é superexpresso de tal modo que o nível total de expressão de genes que codificam o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato 5% superior ao nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, o nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato é pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% superior ao nível de expressão dos genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato.
[0101]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desfazer o glicogênio.
Em alguns aspectos, a remoção de glicogênio da ramificação compreende quebra de glicogênio e/ou mobilização de glicose. Em alguns aspectos, a desagregação do glicogênio compreende a decomposição do glicogênio em glicose-1-fosfato. Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio compreende um polipeptídeo capaz de transferir intramolecularmente a glicose ligada a α-1,4 e/ou glicano de glicogênio ligado a α-1,4 para uma nova posição (ou seja, atividade de 4-α-glicanotransferase) e/ou capaz de hidrolisar uma ligação a α-1,6 de glicogênio (ou seja, atividade de α-1,6-amiloglicosidase). Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio compreende um polipeptídeo bifuncional capaz da atividade de 4-α-glicanotransferase e capaz da atividade de α-1,6-amiloglicosidase. Em alguns aspectos, o hospedeiro recombinante pode compreender um primeiro polipeptídeo capaz da atividade de 4-α-glicanotransferase e um segundo peptídeo capaz da atividade de α-1,6-amiloglicosidase. Em alguns aspectos, o gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio é um gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro.
Em outros aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica heteróloga. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um terminador, por exemplo, mas não limitado a, tCYC1 (SEQ ID NO: 154) ou tADH1 (SEQ ID NO: 155). Em alguns aspectos, o promotor e terminador conduzem a alta expressão do gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor forte, por exemplo, mas não limitado a, pTEF1 (SEQ ID NO: 148), pPGK1 (SEQ ID NO: 149), pTDH3 (SEQ ID NO: 150), pTEF2 (SEQ ID NO: 151), pTPI1 (SEQ ID NO: 152), ou pPDC1 (SEQ ID NO: 153). Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica que se originou ou está presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante. Em alguns aspectos, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio resulta em um nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que é maior que o nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, ou seja, uma superexpressão de um polipeptídeo capaz de desregular o glicogênio.
[0102]Em alguns aspectos, o gene que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio é um gene presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante, ou seja, um gene endógeno. Em algumas modalidades, o promotor do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio pode ser trocado por um promotor forte. Em alguns aspectos, o promotor forte conduz a alta expressão do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em outras modalidades, o potenciador do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio pode ser trocado por um potenciador forte. Em algumas modalidades, o potenciador forte conduz a uma expressão alta do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em algumas modalidades, tanto o potenciador do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao promotor) e ao promotor do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao gene endógeno) do gene endógeno pode ser trocado por um potenciador forte e promotor forte, respectivamente, resultando em superexpressão de um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio (ou seja, em relação ao nível de expressão de genes endógenos operacionalmente ligados a potenciadores do tipo selvagem e/ou promotores). O gene endógeno operacionalmente ligado ao potenciador e/ou promotor forte pode estar localizado nos loci nativos e/ou pode estar localizado em outra parte do genoma.
[0103]Por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, compreendendo uma sequência nucleotídica nativa do hospedeiro, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo ao hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, compreendendo uma sequência nucleotídica heteróloga, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo ao hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, operacionalmente ligado a, por exemplo, um promotor forte nativo ao hospedeiro, ou um promotor heterólogo.
[0104]Em algumas modalidades, um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio é superexpresso de modo que o nível total de expressão de genes que codificam o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio seja pelo menos 5% maior que o nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio. Em algumas modalidades, o nível de expressão total dos genes que codificam um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio é de pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% mais alta do que o nível de expressão dos genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio.
[0105]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio.
Em alguns aspectos, o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio compreende um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e uma glicose α-1,4 ligada a glicogênio.
Em alguns aspectos, o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio é um gene recombinante.
Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro.
Em outros aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica heteróloga.
Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor.
Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um terminador, por exemplo, mas não limitado a, tCYC1
(SEQ ID NO: 154) ou tADH1 (SEQ ID NO: 155). Em alguns aspectos, o promotor e terminador conduzem a alta expressão do gene recombinante.
Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor forte,
por exemplo, mas não limitado a, pTEF1 (SEQ ID NO: 148), pPGK1 (SEQ ID NO:
149), pTDH3 (SEQ ID NO: 150), pTEF2 (SEQ ID NO: 151), pTPI1 (SEQ ID NO:
152) ou pPDC1 (SEQ ID NO: 153). Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica que se originou ou está presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante.
Em alguns aspectos, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio resulta em um nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio que é maior do que o nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, ou seja, uma superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio.
[0106]Em alguns aspectos, o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio é um gene presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante, ou seja, um gene endógeno. Em algumas modalidades, o promotor do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio pode ser trocado por um promotor forte. Em alguns aspectos, o promotor forte conduz a alta expressão do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em outras modalidades, o potenciador do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio pode ser trocado por um potenciador forte. Em algumas modalidades, o potenciador forte conduz a expressão do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em algumas modalidades, tanto o potenciador do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao promotor) e ao promotor do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao gene endógeno) do gene endógeno pode ser trocado por um potenciador forte e promotor forte, respectivamente, resultando em superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (ou seja, em relação ao nível de expressão de genes endógenos operacionalmente ligados a potenciadores do tipo selvagem e/ou promotores). O gene endógeno operacionalmente ligado ao potenciador e/ou promotor forte pode estar localizado nos loci nativos e/ou pode estar localizado em outra parte do genoma.
[0107]por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante que codifica de um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, compreendendo uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo ao hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante que codifica de um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, compreendendo uma sequência nucleotídica heteróloga, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo ao hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, operacionalmente ligado a, por exemplo, um promotor forte nativo ao hospedeiro, ou um promotor heterólogo.
[0108]Em algumas modalidades, um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio é superexpresso de modo que o nível de expressão total de genes que codificam o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio seja pelo menos 5% maior que o nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio. Em algumas modalidades, o nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio é pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% superior ao nível de expressão dos genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio.
[0109]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato. Em alguns aspectos, o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato é um gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro. Em outros aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica heteróloga. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um terminador, por exemplo, mas não limitado a, tCYC1 (SEQ ID NO: 154) ou tADH1 (SEQ ID NO: 155). Em alguns aspectos, o promotor e terminador conduzem a alta expressão do gene recombinante. Em alguns aspectos, o gene recombinante está operacionalmente ligado a um promotor forte, por exemplo, mas não limitado a, pTEF1 (SEQ ID NO: 148), pPGK1 (SEQ ID NO: 149), pTDH3 (SEQ ID NO: 150), pTEF2 (SEQ ID NO: 151), pTPI1 (SEQ ID NO: 152) ou pPDC1 (SEQ ID NO: 153).
Em alguns aspectos, o gene recombinante compreende uma sequência nucleotídica que se originou ou está presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante. Em alguns aspectos, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato resulta em um nível total de expressão de genes que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose de UTP e glicose-1- fosfato que é superior ao nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato, ou seja, uma superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato.
[0110]Em alguns aspectos, o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose de UTP e glicose-1-fosfato é um gene presente na mesma espécie que o hospedeiro recombinante, ou seja, um gene endógeno. Em algumas modalidades, o promotor do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo capaz de converter UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato pode ser trocado por um promotor forte. Em alguns aspectos, o promotor forte conduz a alta expressão do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em outras modalidades, o potenciador do tipo selvagem de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato pode ser trocado por um potenciador forte. Em algumas modalidades, o potenciador forte conduz a uma expressão alta do gene endógeno (ou seja, superexpressão do gene). Em algumas modalidades, tanto o potenciador do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao promotor) e ao promotor do tipo selvagem (ou seja, operacionalmente ligado ao gene endógeno) do gene endógeno pode ser trocado por um potenciador forte e promotor forte, respectivamente, resultando em superexpressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato (ou seja, em relação ao nível de expressão de genes endógenos operacionalmente ligados a potenciadores e/ou promotores do tipo selvagem). O gene endógeno operacionalmente ligado ao potenciador e/ou promotor forte pode estar localizado nos loci nativos e/ou pode estar localizado em outra parte do genoma.
[0111]por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante codificador de um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato, compreendendo uma sequência nucleotídica nativa ao hospedeiro, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo para o hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato, operacionalmente ligado a um promotor do tipo selvagem, compreende adicionalmente um gene recombinante codificador de um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato, compreendendo uma sequência nucleotídica heteróloga, operacionalmente ligada a, por exemplo, um promotor do tipo selvagem, um promotor nativo para o hospedeiro ou um promotor heterólogo. Em ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene endógeno que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato, operacionalmente ligado a, por exemplo, um promotor forte nativo ao hospedeiro, ou um promotor heterólogo.
[0112]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato é superexpresso de modo que o nível total de expressão de genes codificando o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose em UTP e glicose-1-fosfato é pelo menos 5% superior ao nível de expressão de genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, o nível de expressão total de genes que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato é pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% superior ao nível de expressão dos genes endógenos que codificam um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato.
[0113]Em alguns aspectos, um hospedeiro recombinante compreendendo um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP, um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio, um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato podem compreender adicionalmente um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de transportar o uracil para a célula hospedeira; um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar monofosfato de uridina (UMP) a partir do uracil; um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar monofosfato de orotidina (OMP) a partir de orotato ou ácido orótico; um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UMP a partir de OMP; e/ou um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina difosfato (UDP) a partir de UMP. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP, um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio, um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato podem superexpressar um gene que codifica um polipeptídeo capaz de transportar o uracil para a célula hospedeira; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar monofosfato de uridina (UMP) a partir de uracil; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar monofosfato de orotidina (OMP) a partir de orotato ou ácido orótico; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UMP a partir de OMP; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o difosfato de uridina (UDP) a partir de UMP.
[0114]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 122).
[0115]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 119 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 118), SEQ ID NO: 141 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 140), SEQ ID NO: 143 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 142), SEQ ID NO: 145 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 144) ou SEQ ID NO: 147 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 146).
[0116]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 156).
[0117]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 158)
[0118]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 120), SEQ ID NO: 125 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 124), SEQ ID NO: 127 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 126), SEQ ID NO: 129 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 128), SEQ ID NO: 131 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 130), SEQ ID NO: 133 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 132), SEQ ID NO: 135 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 134), SEQ ID NO: 137 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 136) ou SEQ ID NO: 139 (codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 138).
[0119]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato e um gene recombinante codificador de um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato.
[0120]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desfazer o glicogênio e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de remover o glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP e um recombinante gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de remover o glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP de UDP e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de remover o glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6 -fosfato em glicose-1-fosfato e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de remover o glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP de UDP, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e fosfato de glicose-1.
[0121]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende dois ou mais genes recombinantes que codificam um polipeptídeo envolvidos na via biossintética da UDP-glicose, por exemplo, um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato que possui uma primeira sequência de aminoácidos e um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato com uma segunda sequência de aminoácidos distinta da primeira sequência de aminoácidos. por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de PGM1 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2) e um gene que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de PGM2 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 147).
Em certas de tais modalidades, os dois ou mais genes que codificam um polipeptídeo envolvido na via biossintética da UDP-glicose compreendem sequências nucleotídicas nativas da célula hospedeira recombinante (por exemplo, um recombinante S. cerevisiae célula hospedeira compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119). Em outras dessas modalidades, um dos dois ou mais genes que codificam um polipeptídeo envolvido na via biossintética da UDP-glicose compreende uma sequência nucleotídica nativa da célula hospedeira recombinante, enquanto um ou mais dos dois ou mais genes que codificam um polipeptídeo envolvido na via biossintética da UDP-glicose compreende uma sequência nucleotídica heteróloga. por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira de S. cerevisiae recombinante que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 (ou seja, um hospedeiro recombinante que superexpressa o polipeptídeo) expressa adicionalmente um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada, por exemplo, nas SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 139. Em outro exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira de S. cerevisiae recombinante que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119 (ou seja, um hospedeiro recombinante que superexpressa o polipeptídeo) expressa adicionalmente um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada, por exemplo, nas SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 147. Em conformidade, conforme usado neste documento, o termo "um gene recombinante" pode incluir "um ou mais genes recombinantes".
[0122]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende duas ou mais cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo envolvido na via biossintética da UDP-glicose ou na via biossintética do glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante é preferencialmente transformado com, por exemplo, duas cópias, três cópias, quatro cópias ou cinco cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo envolvido na via biossintética da UDP-glicose ou na via biossintética do glicosídeo de esteviol. por exemplo, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante é transformado com duas cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), duas cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desorganizar o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157) ou duas cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159). O versado na técnica apreciará que, em algumas modalidades, os genes recombinantes podem ser replicados numa célula hospedeira independentemente da replicação celular; consequentemente, uma célula hospedeira recombinante pode compreender, por exemplo, mais cópias de um gene recombinante do que o número de cópias com as quais a célula foi transformada. Em conformidade, conforme usado neste documento, o termo "um gene recombinante" pode incluir "um ou mais cópias de genes recombinantes".
[0123]Em alguns aspectos, a expressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em uma célula hospedeira recombinante aumenta a quantidade de UDP-glicose produzida pela célula. Em alguns aspectos, a expressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em uma célula hospedeira recombinante mantém, ou até aumentam, o pool de UDP-glicose disponível para, por exemplo, glicosilação de um esteviol ou um glicosídeo de esteviol. Em alguns aspectos, a expressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em uma célula hospedeira recombinante aumenta a velocidade com a qual a UDP-glicose é regenerada, mantendo assim, ou mesmo aumentando, o agrupamento de UDP-glicose, que pode ser usado para sintetizar um ou mais glicosídeos de esteviol.
[0124]Em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157) e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) em uma célula hospedeira recombinante aumenta a quantidade de UDP- glicose produzida pela célula em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200%, ou pelo menos 225%, ou pelo menos 250%, ou pelo menos 275%, ou pelo menos 300%, calculada como um aumento na concentração de UDP-glicose em relação a um hospedeiro correspondente sem os genes recombinantes.
[0125]Em algumas modalidades, expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, ou SEQ ID NO: 147), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desregular glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, SEQ I D NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, ou SEQ ID NO: 139) em uma a célula hospedeira recombinante aumenta a quantidade de UDP-glicose produzida pela célula em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 25% ou pelo menos 50% ou pelo menos 75% ou pelo menos 100% ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200%, ou pelo menos 225%, ou pelo menos 250%, ou pelo menos 275%, ou pelo menos 300%, calculada como um aumento na UDP intracelular concentração de glicose em relação a um hospedeiro correspondente sem os genes recombinantes.
[0126]Em certas modalidades, um ou mais do gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, o gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, o gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, o gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e o gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato compreendem uma sequência nucleotídica nativa à célula hospedeira. por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desfazer o glicogênio com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 em uma célula hospedeira de S. cerevisiae (ou seja, fornecendo um hospedeiro recombinante que superexpressa os polipeptídeos) aumenta a quantidade de UDP-glicose produzida pela célula em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200%, ou pelo menos 225%, ou pelo menos 250%, ou pelo menos 275%, ou pelo menos 300%, calculada como um aumento na concentração de UDP-glicose intracelular em relação a um hospedeiro correspondente sem os genes recombinantes.
[0127]Em outro exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID
NO:2 e/ou SEQ ID NO: 119, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar a ramificação de glicogênio com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 em uma célula hospedeira de S. cerevisiae produtora de glicosídeo de esteviol (ou seja, fornecendo um hospedeiro recombinante que superexpressa os polipeptídeos) aumenta a quantidade de UDP-glicose produzida pela célula em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200%, ou pelo menos 225%, ou pelo menos 250%, ou pelo menos 275%, ou pelo menos 300%, calculada como um aumento na concentração intracelular de UDP-glicose em relação a um hospedeiro correspondente sem os genes recombinantes.
[0128]Em alguns aspectos, a expressão de um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em uma célula hospedeira recombinante produtora de esteviol-glicosídeo que expressa ainda um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3-glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2-glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol, aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula e/ou diminui a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula. Em algumas modalidades, o hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol expressa adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP a partir de FPP e IPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; e um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar esteviol a partir de ácido ent-cauranoico; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato de GGPP e sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato.
[0129]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar piranofosfato de geranilgeranil (GGPP) a partir de difosfato de farnesil (FPP) e difosfato de isopentenil (IPP) compreende um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 19), SEQ ID NO: 22 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 21), SEQ ID NO: 24 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 23), SEQ ID NO: 26 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 25), SEQ ID NO: 28 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 27), SEQ ID NO: 30 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 29), SEQ ID NO: 32 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 31) ou SEQ ID NO: 116 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 115). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar pirofosfato de geranilgeranil (GGPP) a partir de difosfato de farnesil (FPP) e difosfato de isopentenil (IPP) compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ
ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio
(por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio
(por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127,
SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO:
137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de
UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0130]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar o ent-copalil difosfato a partir de GGPP compreende um polipeptídeo que possui uma sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 34 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 33), SEQ ID NO: 36 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 35), SEQ ID NO: 38 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 37), SEQ ID NO: 40 (codificada por a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 39) ou SEQ ID NO: 42 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP não possui um peptídeo de trânsito de cloroplasto. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo com as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de remover o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0131]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent- copalil difosfato compreende um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 44 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 43), SEQ ID NO: 46 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 45), SEQ ID NO: 48 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 47), SEQ ID NO: 50 (codificada por a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 49) ou SEQ ID NO: 52 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 51). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141,
SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo com o aminoácido sequência apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes e codificar um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0132]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato de GGPP e sintetizar ent- caureno de ent-copalil difosfato. Em alguns aspectos, o polipeptídeo bifuncional compreende um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 54 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 53), SEQ ID NO: 56 (codificada por a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 55) ou SEQ ID NO: 58 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 57). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP e sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0133]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal de ent-caureno compreende um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 60 (que pode ser codificada por a sequência nucleotídica apresentada na SEQ
ID NO: 59), SEQ ID NO: 62 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na
SEQ ID NO: 61), SEQ ID NO: 117 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 63 ou SEQ ID NO: 64), SEQ ID NO: 66 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 65), SEQ ID NO: 68
(codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 67), SEQ ID
NO: 70 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 69),
SEQ ID NO: 72 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID
NO: 71), SEQ ID NO: 74 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na
SEQ ID NO: 73) ou SEQ ID NO: 76 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 75). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147),
um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio
(por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0134]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 compreende um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 78 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 77), SEQ ID NO: 80 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 79), SEQ ID NO: 82 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 81), SEQ ID NO: 84 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 83), SEQ ID NO: 86 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 85), SEQ ID NO: 88 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 87), SEQ ID NO: 90 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 89) ou SEQ ID NO: 92 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 91). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP- glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0135]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol a partir do ácido ent-caurenoico compreende um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 94 (que pode ser codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 93), SEQ ID NO: 97 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 96), SEQ ID NO: 100 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 98 ou SEQ ID NO: 99), SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 105), SEQ ID NO: 108
(codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 107), SEQ ID
NO: 110 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 109),
SEQ ID NO: 112 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID
NO: 111) ou SEQ ID NO: 114 (codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 113). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar esteviol a partir de ácido ent-caurenoico compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP
(por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequências de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO:
145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar
UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO:
125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID
NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0136]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 (por exemplo, polipeptídeo UGT85C2) (SEQ ID NO: 7), um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' das 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, polipeptídeo UGT76G1) (SEQ ID NO: 9), um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 (por exemplo, polipeptídeo UGT74G1) (SEQ ID NO: 4), um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, polipeptídeo EUGT11) (SEQ ID NO: 16). Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, o polipeptídeo UGT91D2) pode ser um polipeptídeo UGT91D2e (SEQ ID NO: 11) ou um polipeptídeo UGT91D2e-b (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol compreende adicionalmente um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo com o conjunto de sequências de aminoácidos adiante na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147),
um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é uma célula hospedeira de S. cerevisiae que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0137]Em alguns aspectos, o polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 é codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, o polipeptídeo capaz de beta 1, 3 a glicosilação do C3' das 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol é codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 8, o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 é codificado pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 3, o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol são codificadas pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. O versado na técnica apreciará que a expressão desses genes podem ser necessários para produzir um glicosídeo de esteviol em particular mas um mais desses genes pode ser endógeno para o hospedeiro desde que pelo menos um (em algumas modalidades, todos) desses genes seja um gene recombinante introduzido no hospedeiro recombinante.
[0138]Em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol por exemplo, RebA, RebD e/ou RebM, produzida pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos pelo menos 250%, calculada como um aumento na concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0139]por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desregular glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157) e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) em um hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol, por exemplo, RebA, RebD e/ou RebM, produzido pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, ou pelo menos 250%, calculada como um aumento na concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0140]Em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol, por exemplo, rubusosídeo, RebB, RebA, RebD e/ou RebM, produzido pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, ou pelo menos 250%, calculada como um aumento na concentração de glicosídeo de esteviol intracelular em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0141]por exemplo, em algumas modalidades, expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 147), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 139) em um hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol, por exemplo, rubusosídeo, RebB, RebA, RebD e/ou RebM, produzidos pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 250%, calculadas como um aumento na concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0142]Em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo esteviol diminui a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol, por exemplo, 13-SMG, produzidos pela célula em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 25%, calculada como uma diminuição na concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol correspondente sem os genes recombinantes.
[0143]por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e o glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol diminui a quantidade de 13-SMG produzida pela célula em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 7,5% ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, calculada como diminuição na concentração intracelular de 13-SMG em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0144]Em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol diminui a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol, por exemplo, 13-SMG e RebD, produzidos pela célula em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 25%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 35%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 45% ou pelo menos 50%, calculada como uma diminuição na concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol correspondente sem os genes recombinantes.
[0145]por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e expressão adicional de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada, por exemplo, nas SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 135, em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo esteviol, diminui a quantidade de 13-SMG produzida pela célula em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 7,5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 25%, ou pelo menos 30%, pelo menos 35%, ou pelo menos 50%, calculados como uma diminuição na concentração de 13-SMG intracelular em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0146]Em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol a quantidade total de glicosídeos de esteviol (ou seja, a quantidade total de compostos de esteviol mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, hexa- e heptaglicosilados) em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 7,5%, ou pelo menos 10% ou pelo menos 12,5% ou pelo menos 15% ou pelo menos 17,5% ou pelo menos 20% ou pelo menos 25% ou pelo menos 27,5% ou pelo menos 30% ou pelo menos 35%, calculado como um aumento da concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol correspondente sem os genes recombinantes.
[0147]por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e expressão adicional de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada, por exemplo, nas SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 135, em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade total de glicosídeos de esteviol (ou seja, a quantidade total de mono, di -, tri-, tetra-, penta-, hexa- e hepta- compostos de esteviol glicosilados) em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 7,5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 12,5% ou pelo menos 15%, ou pelo menos 17,5%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 25%, ou pelo menos 27,5%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 35%, calculados como um aumento na concentração intracelular de glicosídeo de esteviol em relação a um correspondente hospedeiro produtor de glicosídeo de esteviol sem os genes recombinantes.
[0148]Em algumas outras modalidades, a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos por uma célula hospedeira recombinante produtora de glicosídeo de esteviol é inalterada (ou seja, aumentada ou diminuída em menos de 5%, ou inferior a 4%, ou inferior a 3%, ou inferior a 2% ou inferior a 1%) por expressão no hospedeiro de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desorganizar glicogênio, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato de fosfato e glicogênio e/ou um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose de UTP e glicose-1-fosfato.
[0149]por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desfazer o glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzido pelo hospedeiro em menos de 5%, por exemplo, menos de 4%, ou menos de 3%, ou menos de 2%.
[0150]Em outro exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato para glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pelo hospedeiro em menos de 5%, por exemplo, menos de 4%, ou menos de 3%, ou menos de 2%.
[0151]O versado na técnica apreciará que, em tais modalidades, a expressão de um ou mais genes que codificam um polipeptídeo envolvido nos envolvidos na via biossintética da UDP-glicose pode afetar os níveis relativos de glicosídeos de esteviol produzidos pelo hospedeiro recombinante, por exemplo, aumentando o nível de glicose UDP disponível como substrato para um polipeptídeo capaz de glicosilar esteviol ou um glicosídeo de esteviol.
[0152]por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pelo hospedeiro em menos de 5%, por exemplo, menos de 4%, ou menos de 3%, ou menos de 2%, aumenta a quantidade de RebA, RebD, e/ou RebM produzidos pelo hospedeiro em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 250%, calculada como um aumento na concentração de glicosídeo de esteviol intracelular em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes e diminui a quantidade de 13-SMG produzido pela célula hospedeira em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, calculada como uma diminuição na concentração de 13-SMG intracelular em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0153]Em outro exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159 e um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pelo hospedeiro em menos de 5%, por exemplo, menos de 4%, ou menos de 3%, ou menos de 2%, aumenta a quantidade de RebM produzido pelo hospedeiro em pelo menos 10%, pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 250%, calculado como um aumento na concentração intracelular de RebM em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes e diminui a quantidade de RebD produzido pelo hospedeiro em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20% ou pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, calculado como uma diminuição na concentração intracelular de RebD em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0154]Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compreende um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compreende um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e /ou SEQ ID NO: 139).
[0155]Em certas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende um ou mais genes recombinantes que possuem uma sequência nucleotídica nativa do hospedeiro que codifica um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP, um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1 -fosfato, um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio, um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e/ou um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP- glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato, ou seja, um hospedeiro recombinante superexpressa um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP, um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio, um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e/ou um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato.
[0156]Em certas modalidades, uma célula hospedeira recombinante superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, uma célula hospedeira de S.
cerevisiae que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, uma célula hospedeira de S.
cerevisiae que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 119), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, uma célula hospedeira de S. cerevisiae que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, uma célula hospedeira de S. cerevisiae que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, uma célula hospedeira de S.
cerevisiae que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121).
[0157]Em um exemplo, uma célula hospedeira de S. cerevisiae recombinante superexpressa um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159. Em outro exemplo, uma célula hospedeira de S. cerevisiae recombinante superexpressa um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123, um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119, um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159.
[0158]Em certas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compreendendo um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 123), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139), compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas
13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
9); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da
13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 16). Em certas modalidades, a célula hospedeira recombinante compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP a partir de FPP e IPP
(por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 40); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 52); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 117); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
78, SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 92); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar esteviol a partir de ácido ent- caurenoico (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 94).
[0159]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante compreende dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147) e/ou dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139).
[0160]Em tais modalidades, um hospedeiro recombinante compreende dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, por exemplo, dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147. Em um exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 119 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139)
[0161]Em tais modalidades, um hospedeiro recombinante compreende dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato, por exemplo, dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139. Em um exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 125. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 127. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
121 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 129. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 131. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e um gene que codifica um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 133. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e um gene que codifica polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 135. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
121 e um gene que codifica polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 137. Em outro exemplo, um hospedeiro recombinante compreende um gene que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121 e um gene que codifica polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 139. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 123), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159) e/ou um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato (por exemplo, um ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147).
[0162]Em certas modalidades, um hospedeiro recombinante compreendendo dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1- fosfato (por exemplo, dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ ID NO: 147) e/ou dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo, dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139) é uma célula hospedeira que superexpressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos envolvidos na via biossintética de UDP-glicose (por exemplo, uma célula hospedeira de S. cerevisiae que expressa um ou mais genes que codificam um ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 157 e/ou SEQ ID NO: 159).
[0163]Em certas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compreendendo dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de converter glicose-6-fosfato em glicose-1- fosfato (por exemplo, dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 e/ou SEQ
ID NO: 147) e/ou dois ou mais genes que codificam dois ou mais polipeptídeos capazes de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato (por exemplo,
dois ou mais polipeptídeos com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ
ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131,
SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 e/ou SEQ ID NO: 139),
compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 159), um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol no seu grupo hidroxila C-13 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3 'da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas
13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
9); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da
13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 16). Em certas modalidades, a célula hospedeira recombinante compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP a partir de FPP e IPP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 40); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 52); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 117); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 92); e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol a partir do ácido ent-caurenoico (por exemplo, um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 94).
[0164]Em algumas modalidades, um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol são produzidos em um método in vitro, compreendendo a adição de um polipeptídeo capaz de descodificar o glicogênio compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; e, opcionalmente, um ou mais dentre: um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 119 ou 143 ou um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 141, 145 ou 147; e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs:
121 ou 127, um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 125,
129, 133, 135, 137 ou 139 ou um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 131; e um ou mais dentre: um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 compreende um polipeptídeo com pelo menos
55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 7; um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da
13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose,
ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; e um esteviol sintético ou derivado de planta, precursores de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol a uma mistura de reação; em que pelo menos um dos polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante; e produzindo um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol.
[0165]Em um aspecto dos métodos in vitro divulgados neste documento, a mistura de reação compreende: (a) um ou mais glicosídeos de esteviol ou composição de glicosídeo de esteviol; (b) um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; e, opcionalmente, um ou mais dentre: um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 119 ou 143 ou um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 141, 145 ou 147; e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 121 ou 127, um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139 ou um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 131; e um ou mais dentre: um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (c) difosfato de uridina (UDP)-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glicosamina; e/ou (d) tampão de reação e/ou sais.
[0166]Em um aspecto dos métodos in vitro divulgados neste documento, um ou mais glicosídeos de esteviol é, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13-O-glucosídeo (13-SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O-glucosídeo (19-SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B
(RebB), rebaudiosídeo C (RebC), rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero deste.
[0167]Em algumas modalidades, um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol são produzidos por bioconversão de células inteiras. Para que a bioconversão de células inteiras ocorra, uma célula hospedeira, que expressa uma ou mais enzimas envolvidas na via de glicosídeo de esteviol capta e modifica um precursor de glicosídeo de esteviol na célula; após modificação in vivo, um glicosídeo de esteviol permanece na célula e/ou é excretado no meio de cultura. Por exemplo, uma célula hospedeira que expressa um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um gene que codifica um polipeptídeo capaz de remover a glicose de um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato; e ainda expressar um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxil C-13; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo C-19 carboxil; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol pode pegar esteviol e glicosilato de esteviol na célula; após glicosilação in vivo, um glicosídeo de esteviol pode ser excretado no meio de cultura. Em certas modalidades, a célula hospedeira pode expressar ainda um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar
GGPP a partir de FPP e IPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol a partir do ácido ent-caurenoico; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP e sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato.
[0168]Em algumas modalidades, o método para a produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol divulgada neste documento compreende a bioconversão de células inteiras de glicosídeos de esteviol sintéticos ou derivados de plantas e/ou esteviol em um meio de cultura celular de uma célula hospedeira recombinante usando: (a) um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e/ou (b) um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio; opcionalmente, um ou mais dentre: (c) um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, (d) um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato e/ou (e) um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato; e um ou mais dentre: (f) um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo C-13 hidroxil; (g) um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; (h) um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo C-19 carboxil deste; e/ou (i) um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; em que pelo menos um dos polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante expresso na célula hospedeira recombinante; e produzindo um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol.
[0169]Em algumas modalidades dos métodos para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol divulgada neste documento compreende a bioconversão de células inteiras de glicosídeos de esteviol sintéticos ou derivados de plantas e/ou esteviol em um meio de cultura celular de uma célula hospedeira recombinante divulgada neste documento, o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio compreende um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio compreende um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159.
[0170]Em algumas modalidades, um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo C-13 hidroxil; um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou glicosídeo do esteviol em seu grupo C-19 carboxil; e/ou um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol pode ser exibido na superfície das células hospedeiras recombinantes divulgadas neste documento fundindo-o com motivos de ancoragem.
[0171]Em algumas modalidades, a célula é permeabilizada para absorver um substrato a ser modificado ou para excretar um produto modificado. Em algumas modalidades, um agente e permeabilização pode ser adicionado para auxiliar a matéria-prima a entrar no hospedeiro e o produto a sair. Em algumas modalidades, as células são permeabilizadas com um solvente tal como tolueno, ou com um detergente tal como Triton-X ou Tween. Em algumas modalidades, as células são permeabilizadas com um surfactante, por exemplo, um surfactante catiônico, tal como brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). Em algumas modalidades, as células são permeabilizadas com um choque mecânico periódico, tal como eletroporação ou um leve choque osmótico. Por exemplo, um lisado bruto dos microrganismos cultivados pode ser centrifugado para obter um sobrenadante.
O sobrenadante resultante pode ser aplicado a uma coluna de cromatografia, por exemplo, uma coluna de C18 e lavado com água para remover compostos hidrofílicos, seguidos por eluição do(s) composto(s) de interesse com um solvente como o metanol. Em seguida, o(s) composto(s) pode(m) ser ainda mais purificado(s) por HPLC preparativa. Veja também, WO 2009/140394.
[0172]Em algumas modalidades, o esteviol, um ou mais precursores de glicosídeo de esteviol, um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol são produzidos pelo cocultivo de dois ou mais hospedeiros.
Em algumas modalidades, um ou mais hospedeiros, cada um expressando uma ou mais enzimas envolvidas na via do glicosídeo de esteviol, produzem esteviol, um ou mais precursores de glicosídeo de esteviol e/ou um ou mais glicosídeos de esteviol.
Por exemplo, um hospedeiro que expressa um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP a partir de FPP e IPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico, ent-caurenol e/ou ent-caurenal a partir de ent-caureno; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol a partir do ácido ent-caurenoico; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo bifuncional capaz de sintetizar ent-copalil difosfato a partir de GGPP e sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato e um hospedeiro que expressa um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato, um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato; e ainda expressar um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou glicosídeo de esteviol no seu grupo C-13 hidroxil; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' de 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo C-19 carboxil; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol, produz um ou mais glicosídeos de esteviol.
[0173]Em algumas modalidades, o glicosídeo de esteviol compreende, por exemplo, mas não limitado a, 13-SMG, esteviol-1,2-biosídeo, esteviol-1,3-biosídeo, 19-SMG, 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, RebF, RebM, RebQ, RebI, dulcosídeo A, esteviol diglicosilado, esteviol tri-glicosilado, esteviol tetraglicosilado, esteviol penta-glicosilado, hexa esteviol-glicosilado, esteviol hepta-glicosilado ou isômeros.
[0174]Em algumas modalidades, um glicosídeo do esteviol ou composição de precursor de glicosídeo de esteviol produzido in vitro, in vivo, ou pela bioconversão de células inteiras não compreende ou compreende uma quantidade reduzida ou nível reduzido de componentes de origem vegetal do que um extrato de, inter alia, uma planta de estévia. Os componentes derivados de planta podem contribuir para sabores estranhos e incluem pigmentos, lipídios, proteínas, compostos fenólicos, sacarídeos, espatulenol e outros sesquiterpenos, diterpenos de labdano, monoterpenos, ácido decanoico, ácido 8,11,14-eicosatrienoico,
2-metiloctadecano, pentacosano, octacosano, tetracosano, octadecanol, estigmasterol, β-sitosterol, α- e β-amirina, lupeol, acetato de β-amirina, triterpenos pentacílicos, centauredina, quercetina, epi-alfa-cadinol, carofilenos e derivados, beta-pineno, beta-sitosterol e giberelina. Em algumas modalidades, os componentes derivados de planta referidos neste documento são compostos de não-glicosídeo.
[0175]Como usado neste documento, os termos "quantidade detectável", "concentração detectável", "quantidade mensurável" e "concentração mensurável" referem-se a um nível de glicosídeos de esteviol medido em AUG, µM/OD600, mg/L, µM ou mM. A produção de glicosídeo de esteviol (isto é, níveis totais de sobrenadante e/ou glicosídeo de esteviol intracelular) pode ser detectada e/ou analisada por técnicas geralmente disponíveis para os versados na técnica, por exemplo, sem limitação, cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectroscopia/espectrofotometria visível-ultravioleta (UV-Vis), espectrometria de massa (MS) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (Nuclear Magnetic Resonance Epectroscopy - NMR).
[0176]Como usado neste documento, o termo "concentração indetectável" refere-se a um nível de um composto que é demasiado baixo para ser medido e/ou analisado por técnicas tais como TLC, HPLC, UV-Vis, MS ou NMR. Em algumas modalidades, um composto de uma concentração "indetectável" não está presente em um glicosídeo do esteviol ou composição de precursor de glicosídeo de esteviol.
[0177]Após o microrganismo recombinante ter crescido em cultura durante o período de tempo, em que a temperatura e o período de tempo facilitam a produção de um glicosídeo de esteviol, o esteviol e/ou um ou mais glicosídeos de esteviol podem então ser recuperados da cultura utilizando várias técnicas conhecidas técnica. Glicosídeos de esteviol podem ser isolados usando um método descrito neste documento. Por exemplo, após a fermentação, um caldo de cultura pode ser centrifugado durante 30 min a 7000 rpm a 4°C para remover as células, ou as células podem ser removidas por filtração. O lisado sem células pode ser obtido, por exemplo, por ruptura mecânica ou ruptura enzimática das células hospedeiras e centrifugação adicional para remover os detritos celulares. A ruptura mecânica dos materiais do caldo seco também pode ser realizada, por exemplo: por sonicação.
Os materiais de caldo dissolvidos ou suspensos podem ser filtrados utilizando um mícron ou submícron antes da purificação adicional, tal como por cromatografia preparativa. O meio de fermentação ou lisado isento de células pode ser opcionalmente tratado para remover compostos de baixo peso molecular, tais como sal; e pode, opcionalmente, ser seco antes da purificação e redissolvido numa mistura de água e solvente.
[0178]O sobrenadante ou lisado isento de células pode ser purificado como se segue: uma coluna pode ser preenchida com, por exemplo, resina HP20 Diaion (adsorvente sintético do tipo aromático; Supelco) ou outra resina de cromatografia não polar adsorvente ou de fase inversa adequada, e uma alíquota de sobrenadante ou de lisado isento de células pode ser carregada na coluna e lavada com água para remover os componentes hidrofílicos. O produto glicosídeo de esteviol pode ser eluído por incrementos graduais na concentração de solvente em água ou um gradiente de por exemplo, 0% (100% metanol). Os níveis de glicosídeos de esteviol, ent-caurenol glicosilado e/ou ácido ent-caurenoico glicosilado em cada fração, incluindo o fluxo, podem então ser analisados por LC-MS. As frações podem então ser combinadas e reduzidas em volume usando um evaporador a vácuo. Etapas adicionais de purificação podem ser utilizadas, se desejado, tais como etapas adicionais de cromatografia e cristalização. Por exemplo, os glicosídeos de esteviol podem ser isolados por métodos não limitados a cromatografia de troca iônica, cromatografia em fase reversa (ou seja, usando uma coluna C18), extração, cristalização e colunas de carbono e/ou etapas de descoloração.
[0179]Em uma modalidade, uma célula hospedeira recombinante capaz de produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular compreende um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio; e/ou um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, em que o polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio é capaz da atividade da 4-α-glucanotransferase e da atividade da α-1,6-amiloglucosidase, em que a célula hospedeira recombinante compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar 5'-trifosfato de uridina (UTP) a partir de difosfato de uridina (UDP); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar difosfato de uridina glicose (UDP-glicose) a partir de UTP e glicose-1-fosfato, em que: o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 2, 119 ou 143 ou um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs:
141, 145 ou 147; e/ou o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 121 ou 127, um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139 ou um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 131.
[0180]Em outra modalidade, a célula hospedeira recombinante discutida acima compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo C-13 hidroxil; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou glicosídeo de esteviol em seu grupo C-19 carboxil; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol; e compreende adicionalmente um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar geranilgeranil pirofosfato (GGPP) a partir de farnesil difosfato (FPP) e isopentil difosfato (IPP); um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar enti-copalil difosfato a partir de GGPP; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent-caurenoico a partir de ent-caureno; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar esteviol a partir de ácido ent-caurenoico, em que o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo C-13 hidroxil compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; o polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3'
da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo
C-19 carboxil compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose,
ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID
NO: 16; o polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 116; o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-copalil difosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 ou 120; o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50 ou 52; o polipeptídeo capaz de sintetizar o ácido ent-caurenoico compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 60, 62, 117, SEQ ID NO: 66, 68,
70, 72, 74 ou 76; o polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92; e/ou o polipeptídeo capaz de sintetizar o esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 94, 97, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112 ou 114.
[0181]Em outra modalidade, a célula hospedeira recombinante discutida acima compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar 5'-trifosfato de uridina (UTP) a partir de difosfato de uridina (UDP) com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato com pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 ou 119; e um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121; e um ou mais dentre: um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou glicosídeo de esteviol em seu grupo C-13 hidroxil com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação de C3' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol com pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou glicosídeo de esteviol em seu grupo C-19 carboxil com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; um gene que codifica um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação de C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16.
[0182]Em outra modalidade, a célula hospedeira recombinante discutida acima compreende um gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; em que o gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e/ou o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio é superexpresso em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que o gene que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e/ou o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio é superexpresso em pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos
40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 100% ou pelo menos 125% ou pelo menos 150% ou pelo menos 175% ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0183]Em outra modalidade, a expressão de um ou mais genes recombinantes compreendendo a célula hospedeira recombinante aumenta a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula hospedeira recombinante em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 250% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição do glicosídeo de esteviol produzido pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 100% ou pelo menos 125% ou pelo menos 150% ou pelo menos 175% ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade de RebA, RebD e/ou RebM produzidos pela célula em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 100% ou pelo menos 125% ou pelo menos 150% ou pelo menos 175% ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade de um ou mais glicosídeos de esteviol acumulados pela célula em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui uma quantidade de 13-SMG acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a expressão de um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pela célula em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 100% ou pelo menos 125% ou pelo menos 150% ou pelo menos 175% ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes e/ou em que a expressão de um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pela célula em menos de 10% ou menos de 5% ou menos de 2,5% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0184]Em uma modalidade das células hospedeiras recombinantes discutidas acima, um ou mais glicosídeos de esteviol são, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13-O-glucosídeo (13-SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O-glucosídeo (19-SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B (RebB), rebaudiosídeo C (RebC), rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero destes.
[0185]Em uma modalidade das células hospedeiras recombinantes discutidas acima, a célula hospedeira recombinante é uma célula de vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de fungo, uma célula de alga ou uma célula de bactéria.
[0186]Em uma modalidade, um método para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular compreende cultivar as células hospedeiras recombinantes discutidas acima na cultura celular sob condições nas quais os genes são expressos e em que um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol são produzidos pelas células hospedeiras recombinantes, em que os genes são expressos constitutivamente ou em que a expressão dos genes é induzida, em que a quantidade de RebA, RebD e/ou RebM produzida pela célula é aumentada em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 100% ou pelo menos 125% ou pelo menos 150% ou pelo menos 175% ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a quantidade de 13-SMG acumulado pela célula diminui em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula é aumentada em pelo menos 5% ou pelo menos 10% ou em pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 30% ou pelo menos 40% ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula diminui a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula em menos de 10% ou menos de 5% ou menos de 2,5% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes, em que a célula hospedeira recombinante é cultivada em um fermentador a uma temperatura por um período de tempo, em que a temperatura e o período de tempo facilitam a produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol e/ou em que a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 250% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
[0187]Em uma modalidade, o método de produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou de uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular compreende adicionalmente o isolamento de um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol da cultura celular, em que a etapa de isolamento compreende separar uma fase líquida da cultura celular de uma fase sólida da cultura celular para obter um sobrenadante compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol e colocar o sobrenadante em contato com uma ou mais resinas adsorventes para obter pelo menos uma porção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol produzidos; ou colocar o sobrenadante em contato com uma ou mais colunas de cromatografia de troca iônica ou de fase reversa, a fim de obter pelo menos uma porção de um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou da composição de glicosídeo de esteviol produzidos; ou cristalizar ou extrair um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzidos; isolando assim um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzidos.
[0188]Em uma modalidade, o método de produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou de uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular compreende adicionalmente recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol da cultura celular, em que um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol são enriquecidos para um ou mais glicosídeos de esteviol em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol de planta Estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de planta Estévia em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol obtida a partir de um extrato de Estévia derivado de planta.
[0189]Em uma modalidade, o método de produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou de uma composição de glicosídeo de esteviol compreende a bioconversão de células inteiras de um glicosídeo derivado de planta ou de esteviol sintético e/ou esteviol em uma cultura celular de uma célula hospedeira recombinante usando um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato a partir de fosfato e glicogênio, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; e opcionalmente, um ou mais dentre um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato,
compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO:
2, 119 ou 143; ou pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 141, 145 ou 147; e/ou um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 121 ou 127; pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das
SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139; ou pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NQ: 131, e um ou mais dentre um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13; um polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose ou de ambas a 13-O-glicose e a 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo esteviol em seu grupo carboxila C-19; e/ou um polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose ou de ambas a 13-O-glicose e a 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; em que pelo menos um dos polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante expresso na célula hospedeira recombinante; e produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol desse modo, em que o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; o polipeptídeo capaz de beta 1,3 glicosilação do C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose ou de ambas a 13-O-glicose e a 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; o polipeptídeo capaz de beta 1,2 glicosilação do C2' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose ou de ambas a 13-O-glicose e a 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16.
[0190]Em uma modalidade, a célula hospedeira recombinante usada no método de produção de um ou mais glicosídeos de esteviol ou de uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura celular é uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de fungo, uma célula de alga ou uma célula de bactéria, em que um ou mais glicosídeos de esteviol são, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13-O-glicosídeo (13-SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo (19-SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B (RebB), rebaudiosídeo C (RebC), rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero destes.
[0191]Como usados neste documento, os termos “ou” e “e/ou” são utilizados para descrever múltiplos componentes em combinação ou exclusivos um do outro. Por exemplo, "x, y e/ou z" pode se referir a "x" sozinho, "y" sozinho, "z" sozinho, "x, y e z" "(x e y) ou z," "x ou (y e z)" ou "x ou y ou z". Em algumas modalidades, "e/ou" é utilizado para se referir aos ácidos nucleicos exógenos que uma célula recombinante compreende, em que uma célula recombinante compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos selecionados de um grupo.
Em algumas modalidades, "e/ou" é usado para se referir à produção de glicosídeos de esteviol e/ou de precursores de glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, "e/ou" é usado para se referir à produção de glicosídeos de esteviol, em que um ou mais glicosídeos de esteviol são produzidos. Em algumas modalidades, "e/ou" é usado para se referir à produção de glicosídeos de esteviol, em que um ou mais glicosídeos de esteviol são produzidos através de uma ou mais das seguintes etapas: cultura de um microrganismo recombinante, síntese de um ou mais glicosídeos de esteviol em um microrganismo recombinante e/ou isolamento de um ou mais glicosídeos de esteviol.
Homólogos Funcionais
[0192]Os homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos acima também são adequados para utilização na produção de glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante. Um homólogo funcional é um polipeptídeo com similaridade de sequência a um polipeptídeo de referência e que realiza uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos de ocorrência natural, e a similaridade de sequência pode ser causada por eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tal, os homólogos funcionais são às vezes designados na literatura como homólogos ou ortólogos ou parálogos. As variantes de um homólogo funcional de ocorrência natural, tal como polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência codificadora do tipo selvagem, podem,
eles mesmos, ser homólogos funcionais. Homólogos funcionais também podem ser criados através de mutagênese dirigida ao sítio da sequência de codificação para um polipeptídeo ou pela combinação de domínios das sequências de codificação para polipeptídeos de ocorrência natural diferentes ("troca de domínio"). Técnicas para modificar genes codificando polipeptídeos funcionais descritos neste documento são conhecidas e incluem, inter alia, técnicas de evolução dirigida, técnicas de mutagênese direcionada ao sítio e técnicas de mutagênese aleatória, e podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alterar especificidade de substrato, alterar os níveis de expressão, alterar localização subcelular ou modificar interações polipeptídeo-polipeptídeo de uma maneira desejada. Tais polipeptídeos modificados são considerados homólogos funcionais.
O termo "homólogo funcional" é às vezes aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homólogo.
[0193]Os homólogos funcionais podem ser identificados pela análise de alinhamentos de sequência de nucleotídeo e de polipeptídeo. Por exemplo, executar uma consulta em um banco de dados de sequências de nucleotídeos ou polipeptídeos pode identificar homólogos de polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol. Análises de sequência pode envolver análises por BLAST, BLAST recíproco ou PSI-BLAST de bancos de dados não redundantes usando uma sequência de aminoácidos UGT como a sequência de referência. A sequência de aminoácidos é, em alguns casos, deduzida a partir da sequência nucleotídica.
Esses polipeptídeos no banco de dados que têm identidade de sequência maior que 40% são candidatos para nova avaliação para adequação como um polipeptídeo de biossíntese de glicosídeo de esteviol. A similaridade da sequência de aminoácidos permite substituições de aminoácidos conservativas, tais como a substituição de um resíduo hidrofóbico por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro. Se desejado, uma inspeção manual desses candidatos pode ser realizada a fim de reduzir o número de candidatos a serem avaliados novamente. A inspeção manual pode ser executada selecionando-se aqueles candidatos que parecem ter domínios presentes em polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol, por exemplo, domínios funcionais conservados. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos e polipeptídeos são identificados a partir de dados de transcriptoma com base nos níveis de expressão, em vez de usar a análise BLAST.
[0194]As regiões conservadas podem ser identificadas através da localização de uma região dentro da sequência primária de aminoácidos de um polipeptídeo de biossíntese de glicosídeo de esteviol que é uma sequência repetida, forma uma estrutura secundária (por exemplo, hélice e folhas beta), estabelece positivamente ou negativamente domínios carregados ou representa um motivo de ou domínio de proteína. Ver, por exemplo, o website do Pfam, que descreve as sequências de consenso para uma variedade de motivos e domínios de proteínas na World Wide Web em sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/. As informações incluídas no banco de dados Pfam são descritas em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260- 262 (1999). As regiões conservadas também podem ser determinadas pelo alinhamento das sequências dos mesmos polipeptídeos ou dos polipeptídeos relacionados de espécies estreitamente relacionadas. As espécies estreitamente relacionadas, preferencialmente, são da mesma família. Em algumas modalidades, o alinhamento de sequências de duas espécies diferentes é adequado para identificar tais homólogos.
[0195]Normalmente, polipeptídeos que exibem pelo menos cerca de 40% de identidade de sequência de aminoácidos são úteis para identificar regiões conservadas. Regiões conservadas de polipeptídeos relacionados exibem pelo menos 45% de sequência de identidade de aminoácido (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido). Em algumas modalidades, uma região conservada exibe pelo menos 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido.
[0196]Por exemplo, polipeptídeos apropriados para produzir esteviol em um hospedeiro recombinante incluem homólogos funcionais de UGTs.
[0197]Métodos para modificar a especificidade de substrato de, por exemplo, uma UGT são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, sem limitação, abordagens de mutagênese direcionada ao sítio/racional, abordagens de evolução dirigida aleatórias e combinações em que técnicas de saturação/mutagênese aleatória são executadas perto do sítio ativo da enzima. Por exemplo, ver Osmani et al., 2009, Phytochemistry 70: 325-347.
[0198]Uma sequência candidata normalmente tem um comprimento que é de 80% a 200% do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200% do comprimento da sequência de referência. Um polipeptídeo homólogo funcional normalmente tem um comprimento que é de 95% a 105% do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115 ou 120% do comprimento da sequência de referência ou qualquer intervalo no meio. Uma porcentagem de identidade para qualquer ácido nucleico ou polipeptídeo candidato em relação a um ácido nucleico ou polipeptídeo de referência pode ser determinada conforme se segue. Uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos ou uma sequência de aminoácidos descrita neste documento) é alinhada a uma ou mais sequências candidatas usando o programa de computador Clustal Omega (versão 1.2.1, parâmetros padrão), que permite que alinhamentos das sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos sejam realizados em toda sua extensão (alinhamento global). Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500.
[0199]O Clustal Omega calcula a melhor correspondência entre uma sequência de referência e uma ou mais sequências candidatas e as alinha para que as identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. As lacunas de um ou mais resíduos podem ser inseridas em uma sequência de referência, em uma sequência candidata ou em ambas para maximizar os alinhamentos de sequência. Para um alinhamento de pares rápido de sequências de ácido nucleico, são utilizados os seguintes parâmetros padrão: tamanho de palavra: 2; tamanho de janela: 4; método de pontuação: porcentagem de idade; número de diagonais superiores: 4; penalidade de lacuna: 5. Para alinhamento múltiplo de sequências de ácidos nucleicos, são utilizados os seguintes parâmetros: penalidade de abertura de lacuna: 10,0; penalidade de extensão de lacuna: 5,0; e transições de peso: sim.
Para o alinhamento de pares rápido de sequências de proteínas, os seguintes parâmetros são usados: tamanho de palavra: 1; tamanho de janela: 5; método de pontuação: porcentagem de idade; número de diagonais superiores: 5; penalidade de lacuna: 3. Para alinhamento múltiplo de sequências de proteínas, são utilizados os seguintes parâmetros: matriz de ponderação: blosum; penalidade de abertura de lacuna: 10,0; penalidade de extensão de lacuna: 0,05; lacunas hidrofílicas: ativado; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg e Lys; penalidades de lacuna específicas de resíduo: ativado. A saída do Clustal Omega é um alinhamento de sequência que reflete a relação entre as sequências. O Clustal Omega pode ser executado, por exemplo, no site Baylor College of Medicine Search Launcher na World Wide Web (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) e no site do European Bioinformtics Institute em http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
[0200]Para determinar a porcentagem de identidade de uma sequência de ácidos nucleicos ou de uma sequência de aminoácidos candidata com uma sequência de referência, as sequências são alinhadas usando o Clustal Omega, o número de correspondências idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência e o resultado é multiplicado por 100. Note-se que o valor da porcentagem de identidade pode ser arredondado para a casa decimal mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 são arredondados para baixo para 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e 78,19 são arredondados para cima para 78,2.
[0201]Será apreciado que as proteínas de UGT funcionais (por exemplo, um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19) podem incluir aminoácidos adicionais que não estão envolvidos nas atividades enzimáticas realizadas pelas enzimas. Em algumas modalidades, as proteínas de UGT são proteínas de fusão. Os termos "quimera", "polipeptídeo de fusão", "proteína de fusão", "enzima de fusão", "construto de fusão," "proteína quimérica", "polipeptídeo quimérico", "construto quimérico" e "enzima quimérica" podem ser usados de forma intercambiável neste documento para se referir a proteínas manipuladas através da junção de dois ou mais genes que codificam proteínas diferentes.
[0202]Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo de UGT (por exemplo, um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19) pode incluir uma sequência de marcação que codifica uma "marcação" concebida para facilitar manipulações (por exemplo, para facilitar a purificação ou detecção), secreções ou localizações subsequentes do polipeptídeo codificado. Sequências de sinalização podem ser inseridas na sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo, tal que a marcação codificada está localizada no terminal amino ou carboxila do polipeptídeo. Exemplos não limitantes de marcações codificadas incluem proteína verde fluorescente (GFP), hemaglutinina de influenza humano (ha), glutationa S transferase (GST), polyhistidina-Tag (HIS Tag), e marcação Flag™ (Kodak, New Haven, CT). Outros exemplos de marcações incluem um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo sinal ou uma marcação de secreção.
[0203]Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é uma proteína alterada por troca de domínio. Como usado neste documento, o termo "troca de domínio" é usado para descrever o processo de substituição de um domínio de uma primeira proteína por um domínio de uma segunda proteína. Em algumas modalidades, o domínio da primeira proteína e o domínio da segunda proteína são funcionalmente idênticos ou funcionalmente semelhantes. Em algumas modalidades, a estrutura e/ou a sequência do domínio da segunda proteína difere da estrutura e/ou da sequência do domínio da primeira proteína. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de UGT (por exemplo, um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19) é alterado por troca de domínio.
[0204]Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é uma proteína alterada por permutação circular, que consiste na ligação covalente das extremidades de uma proteína que seriam abertas em outro lugar posteriormente.
Assim, a ordem da sequência é alterada sem causar alterações nos aminoácidos da proteína. Em algumas modalidades, uma permutação circular direcionada pode ser produzida através, por exemplo, mas sem limitação, da criação de um espaçador para juntar as extremidades da proteína original. Uma vez que o espaçador tenha sido definido, existem várias possibilidades para gerar permutações através de técnicas de biologia molecular aceitas de forma geral através, por exemplo, mas sem limitação, da produção de concatêmeros por meio de PCR e subsequente amplificação de permutações específicas dentro do concatêmero ou através da amplificação de fragmentos discretos da proteína a ser trocada para juntá-los em uma ordem diferente. A etapa de geração de permutações pode ser seguida pela criação de um gene circular ligando as extremidades do fragmento e reduzindo aleatoriamente, formando assim coleções de permutações a partir de um único construto.
Esteviol e Ácidos Nucleicos de Biossíntese de Glicosídeo de Esteviol
[0205]Um gene recombinante que codifica um polipeptídeo descrito neste documento compreende a sequência de codificação para aquele polipeptídeo, operacionalmente ligado na orientação de sentido a uma ou mais regiões reguladoras apropriadas para expressar o polipeptídeo. Uma vez que muitos microrganismos são capazes de expressar vários produtos gênicos de um mRNA policistrônico, múltiplos polipeptídeos podem ser expressos sob o controle de uma única região reguladora para esses microrganismos, se desejado. Uma sequência de codificação e uma região reguladora são consideradas operacionalmente ligadas quando a região reguladora e a sequência de codificação são posicionadas de forma que a região reguladora seja eficaz para regular a transcrição ou a tradução da sequência. Normalmente, o sítio de início de tradução da matriz de leitura de tradução da sequência de codificação é posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região reguladora de um gene monocistrônico.
[0206]Em muitos casos, a sequência de codificação para um polipeptídeo descrita neste documento é identificada em uma espécie diferente do hospedeiro recombinante, ou seja, é um ácido nucleico heterólogo. Assim, se o hospedeiro recombinante é um microrganismo, a sequência de codificação pode ser de outros microrganismos procariotos ou eucariotos, de plantas ou de animais. Em alguns casos, no entanto, a sequência de codificação é uma sequência que é nativa para o hospedeiro e está sendo reintroduzida nesse organismo. Uma sequência nativa pode, muitas vezes, ser distinguida da sequência de ocorrência natural pela presença de sequências não naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas que flanqueiam uma sequência nativa em um construto de ácido nucleico recombinante.
Além disso, os ácidos nucleicos exógenos transformados estavelmente normalmente estão integrados em posições diferentes da posição onde a sequência nativa é encontrada. "Região reguladora" refere-se a um ácido nucleico com sequências nucleotídicas que influenciam a iniciação e a taxa da transcrição ou da tradução, e estabilidade e/ou mobilidade de um produto da transcrição ou da tradução.
As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências acentuadoras,
elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas (UTRs) 5' e
3', sítios de início de transcrição, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, íntrons e combinações destes.
Uma região reguladora normalmente compreende pelo menos um promotor de núcleo (basal). Uma região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência acentuadora, um elemento a montante ou uma região ativadora a montante (UAR). Uma região reguladora é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação através do posicionamento da região reguladora e da sequência de codificação para que a região reguladora seja eficaz para regular a transcrição ou a tradução da sequência.
Por exemplo, para ligar operacionalmente uma sequência de codificação e uma sequência promotora, o sítio de iniciação de tradução da matriz de leitura de tradução da sequência de codificação é normalmente posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da sequência promotora.
Uma região reguladora pode, no entanto, ser posicionada a tanto quanto cerca de 5.000 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação de tradução ou cerca de 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início de transcrição.
[0207]A escolha das regiões reguladoras a serem incluídas depende de vários fatores, incluindo, mas não se limitando a, eficiência, viabilidade de seleção, induzibilidade, nível desejado de expressão e expressão preferencial durante certas fases da cultura. É uma questão de rotina para uma pessoa versada na técnica modular a expressão de uma sequência codificadora selecionando e posicionamento apropriadamente as regiões reguladoras em relação à sequência de codificação. Será entendido que mais de uma região reguladora pode estar presente, por exemplo, íntrons, potenciadores, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição e elementos induzíveis.
[0208]Um ou mais genes podem ser combinados em um construto de ácidos nucleicos recombinantes em "módulos" úteis para um aspecto discreto de esteviol e/ou produção de glicosídeo de esteviol. Combinar uma pluralidade de genes em um módulo, especialmente um módulo policistrônico, facilita o uso do módulo em uma variedade de espécies. Por exemplo, um cluster de genes de biossíntese de esteviol ou um cluster de gene UGT pode ser combinado em um módulo policistrônico tal que, após a inserção de uma região reguladora adequada, o módulo pode ser introduzido em uma grande variedade de espécies. Como outro exemplo, um cluster de gene UGT pode ser combinado tal que cada sequência de codificação de UGT esteja operacionalmente ligada a uma região reguladora separada para formar um módulo de UGT. Tal módulo pode ser usado nas espécies para as quais a expressão monocistrônica é necessária ou desejável.
Além de genes úteis para um esteviol ou produção de glicosídeo do esteviol, um construto recombinante normalmente também contém uma origem de replicação e um ou mais marcadores selecionáveis para manutenção do construto em espécies adequadas.
[0209]Será apreciado que devido à degeneração do código genético, vários ácidos nucleicos podem codificar um polipeptídeo específico; isto é, para diversos aminoácidos, há mais de uma tríade de nucleotídeos que serve como o códon para o aminoácido. Assim, códons na sequência de codificação para um determinado polipeptídeo podem ser modificados de forma que a expressão ideal em um hospedeiro específico é obtida ao utilizar tabelas de viés de códon apropriadas para este hospedeiro (por exemplo, microrganismos). Como ácidos nucleicos isolados, estas sequências modificadas podem existir como moléculas purificadas e podem ser incorporadas em um vetor ou em um vírus para utilização na construção de módulos para construtos de ácidos nucleicos recombinantes.
[0210]Em alguns casos, é desejável inibir uma ou mais funções de um polipeptídeo endógeno para desviar intermediários metabólicos para um esteviol ou biossíntese de glicosídeo de esteviol. Por exemplo, pode ser desejável regular negativamente a síntese de esterois em uma cepa de levedura para aumentar ainda mais a produção de esteviol ou de glicosídeo de esteviol, por exemplo, regulando negativamente esqualeno epoxidase. Como outro exemplo, pode ser desejável inibir funções degradativas de certos produtos de genes endógenos, por exemplo, glico-hidrolases que removem frações de glicose de metabólitos secundários ou fosfatases, conforme discutido neste documento. Em tais casos, um ácido nucleico que superexpressa o produto de polipeptídeo ou de gene pode ser incluído em um construto recombinante que é transformado na cepa.
Alternativamente, mutagênese pode ser usada para gerar mutantes em genes para os quais se deseja aumentar ou potencializar a função.
Microrganismos Hospedeiros
[0211]Hospedeiros recombinantes podem ser usados para expressar polipeptídeos para a produção de glicosídeos de esteviol, incluindo, mas não se limitando a, uma célula vegetal, compreendendo uma célula vegetal que é cultivada em uma planta, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de fungo, uma célula de alga ou uma célula de bactéria.
[0212]Vários procariotos e eucariotos também são adequados para utilização na construção dos microrganismos recombinantes descritos neste documento, por exemplo, bactérias gram-negativas, leveduras e fungos. Uma espécie e cepa selecionada para uso como uma cepa de produção de glicosídeo de esteviol é primeiro analisada para determinar quais genes de produção são endógenos para a cepa e quais genes não estão presentes. Genes para os quais uma contraparte endógena não está presente na cepa são vantajosamente montados em um ou mais construtos recombinantes, que depois são transformados na cepa a fim se fornecer as funções ausentes.
[0213]Normalmente, o microrganismo recombinante é cultivado em um fermentador a uma ou mais temperaturas durante um período de tempo, em que a temperatura e o período de tempo facilitam a produção de um glicosídeo de esteviol. Os microrganismos construídos e geneticamente modificados fornecidos pela invenção podem ser cultivados usando processos de fermentação convencionais, incluindo, inter alia, quimiostato, cultivo descontínuo, cultivo descontínuo alimentado, fermentações semi-contínuas como de processo "draw and fill", fermentação de perfusão contínua e cultura de células de perfusão contínua. Dependendo do microrganismo específico usado no método, outros genes recombinantes como genes de biossíntese de isopentenil e genes de terpeno sintase e ciclase podem também estar presentes e expressos. Níveis de substratos e intermediários, por exemplo, difosfato de isopentenil, difosfato de dimetilalil, GGPP, ent-caureno e ácido ent-caurenoico podem ser determinados por extração de amostras de meios de cultura para análise de acordo com métodos publicados.
[0214]Em alguns aspectos, o microrganismo recombinante é cultivado em uma placa de poço profundo. Será entendido que, embora os dados sobre a produção de glicosídeos de esteviol pelo microrganismo recombinante cultivado em culturas de poços profundos, em alguns aspectos, possam ser mais facilmente coletados do que em culturas de fermentação, o pequeno volume de cultura do poço profundo (por exemplo, 1 ml ou 0,5 ml) pode afetar as diferenças no ambiente do microrganismo e, portanto, sua eficiência e eficácia na produção de glicosídeos de esteviol. Por exemplo, disponibilidade de nutrientes, acúmulo de produtos residuais celulares, pH, temperatura, agitação e aeração podem diferir significativamente entre fermentação e culturas de poços profundos.
Consequentemente, a absorção de nutrientes ou outros substratos enzimáticos pode variar, afetando o metabolismo celular (por exemplo, alterando a quantidade e/ou o perfil de produtos acumulados por um microrganismo recombinante). Ver, por exemplo, Duetz, Trends Microbiol 15(10):469-75 (2007).
[0215]Fontes de carbono para uso neste método incluem qualquer molécula que pode ser metabolizada pela célula hospedeira recombinante para facilitar o crescimento e/ou a produção dos glicosídeos de esteviol. Exemplos de fontes de carbono adequadas incluem, mas não se limitam a, sacarose (por exemplo, tal como encontrada no melaço), frutose, xilose, etanol, glicerol, glicose, celulose, amido, celobiose ou outro polímero que compreende glicose. Em modalidades que empregam levedura como um hospedeiro, por exemplo, fontes de carbonos como sacarose, frutose, xilose, etanol, glicerol e glicose são apropriadas.
A fonte de carbono pode ser fornecida ao organismo hospedeiro durante o período de cultivo ou, alternativamente, o organismo pode ser cultivado por um período de tempo na presença de outra fonte de energia, por exemplo, proteína, e então provido de uma fonte de carbono apenas durante a fase descontínua alimentada.
[0216]Será apreciado que os vários genes e módulos discutidos neste documento podem estar presentes em dois ou mais hospedeiros recombinantes em vez de um único hospedeiro. Quando é utilizada uma pluralidade de hospedeiros recombinantes, estes podem ser cultivados em uma cultura mista para acumular esteviol e/ou glicosídeos de esteviol.
[0217]Alternativamente, os dois ou mais hospedeiros podem ser cultivados em um meio de cultura separado e o produto do primeiro meio de cultura, por exemplo,, esteviol, pode ser introduzido no segundo meio de cultura para ser convertido em um intermediário subsequente ou em um produto final tal como, por exemplo, RebA. O produto produzido pelo segundo ou último hospedeiro é então recuperado. Também será apreciado que, em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante é cultivado usando fontes de nutrientes diferentes de um meio de cultura e utilizando um sistema diferente de um fermentador.
[0218]Espécies procarióticas e eucarióticas exemplificativas são descritas em maior detalhe abaixo. No entanto, será apreciado que outras espécies podem ser adequadas. No entanto, será apreciado que outras espécies podem ser adequadas para expressar polipeptídeos para a produção de glicosídeos de esteviol.
[0219]Por exemplo, espécies adequadas podem estar em um gênero como Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium, Eremothecium, Escherichia, Fusarium/Gibberella. Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia (anteriormente conhecido como Hansuela), Scheffersomyces, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomyces, Humicola, Issatchenkia, Brettanomyces, Yamadazyma, Lachancea, Zygosaccharomyces, Komagataella, Kazachstania, Xanthophyllomyces, Geotrichum, Blakeslee, Dunaliella, Haematococcus, Chlorella, Undaria, Sargassum, Laminaria, Scenedesmus, Pachysolen, Trichosporon, Acremonium, Aureobasidium, Cryptococcus, Corynascus, Chrysosporium, Filibasidium, Fusarium, Magnaporthe, Monascus, Mucor, Myceliophthora, Mortierella, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Pénicillium, Piromyces, Pachysolen, Phanerochaete, Podospora, Pycnoporus,
Rhizopus, Schizophyllum, Sordaria, Talaromyces, Rasmsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Kloeckera, Pachysolen, Schwanniomyces, Trametes, Trichoderma, Acinetobacter, Nocardia, Xanthobacter, Streptomyces, Erwinia, Klebsiella, Serratia, Pseudomonas, Salmonella, Choroflexus, Chloronema, Chlorobium, Pelodictyon, Chromatium, Rhode-spirillum, Rhodobacter, Rhodomicrobium ou Yarrowia.
[0220]Espécies exemplificativas de tais gêneros incluem Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphurous, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Pichia kudriavzevii, Cybedindnera jadinii, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma, Xanthophyllomyces dendrorhous, Issatchenkia orientalis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces carlsbergensis, Hansuela polymorphe, Brettanomyces anomalus, Yamadazyma philogaea. Fusarium fujikuroilGibberella fujikuroi, Candida utilis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida revkaufi, Candida pulcherrima, Candida tropicalis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus. Pénicillium chrysogenum. Pénicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Rasamsonia emersonii (anteriormente conhecido como Talaromyces emersonii), Aspergillus sojae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophtora thermophyla. Candida albicans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens. Bacillius licheniformis. Bacillus pu nt IS.
Bacillius megaterium, Bacillius halofurans, Baciilius punilus, Serratia marcessans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Blakeslee trispora, Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis, Chlorella sp., Undaria pinnatifida, Sargassum.
Laminaria Japonica, Scenedesmus almeriensis, Salmonella typhi, Choroflexus aurantiacus, Chloronema gigateum, Chlorobium limicola, Pelodictyon lutecium, Chromatium okenii, Rhode-spirillum rubrum, Rhodobacter spaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodomicrobium vanellii, Pachysolen tannophilus,
Trichosporon beigelii, e Yarrowia lipolytica.
[0221]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um procarioto, tal como células de bactéria Escherichia, por exemplo, células de Escherichia coli; células de bactéria Lactobacillus; células de bactéria Lactococcus; células de bactéria Comebacterium; células de bactéria Acetobacter; células de bactéria Acinetobacter; ou células de bactéria Pseudomonas.
[0222]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser uma célula de alga, como das espécies Blakeslee trispora, Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis, Chlorella sp., Undaria pinnatifida, Sargassum, Laminaria Japonica, Scenedesmus almeriensis.
[0223]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um fungo dos gêneros que incluem, mas não se limitam a, Acremonium, Arxula, Agaricus, Aspergillus, Agaricus, Aureobasidium, Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Corynascus, Chrysosporium, Debaromyces, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Monascus, Mucor, Myceliophthora, Mortierella, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Pénicillium, Piromyces, Phanerochaete Podospora, Pycnoporus, Rhizopus, Schizophyllum, Schizosaccharomyces, Sordaria, Scheffersomyces, Talaromyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Rasmsonia, Zygosaccharomyces, Thermoascus, Thielavia, Trichosporon, Tolypocladium, Trametes, e Trichoderma. As espécies de fungos incluem, mas não se limitam a, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus.
Pénicillium chrysogenum. Pénicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Rasamsonia emersonii (anteriormente conhecido como Talaromyces emersonii), Aspergillus sojae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophtora thermophyla.
[0224]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um Ascomiceto, como Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis,
Schizosaccharomyces pombe, Geotrichum Aspergillus niger, Yarrowia lipolytica, Ashbya gossypii, Yamadazyma philogaea, Lachancea kluyveri, Kodamaea ohmeri, ou S. cerevisiae.
Agaricus, Gibberella e Phanerochaete spp.
[0225]Agaricus, Gibberella. e Phanerochaete spp. podem ser úteis, pois são conhecidos por produzir grandes quantidades de isoprenoides em cultura.
Assim, os precursores de terpenos para a produção de grandes quantidades de glicosídeos de esteviol já são produzidos por genes endógenos. Assim, módulos compreendendo genes recombinantes para polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol podem ser introduzidos em espécies de tais gêneros sem necessidade de introdução de mevalonato ou genes de via MEP.
Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)
[0226]A Arxula adeninivorans é uma levedura dimórfica (cresce como levedura de brotamento como a levedura de padeiro até uma temperatura de 42 °C, acima desse limite cresce de forma filamentosa) com características bioquímicas incomuns. Pode crescer em uma ampla gama de substratos e pode assimilar nitrato. Tem sido aplicada com sucesso à geração de cepas que podem produzir plásticos naturais ou o desenvolvimento de um biossensor para estrogênios em amostras ambientais.
Rhodotorula so.
[0227]A Rhodotorula é uma levedura unicelular pigmentada. Foi demonstrado que a levedura vermelha oleaginosa, Rhodotorula glutinis, produz lipídios e carotenoides a partir de glicerol bruto (cepas de Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46(1):210-8). Rhodotorula toruloides demonstraram ser um sistema eficiente de fermentação descontínua alimentada para melhorar a produtividade de biomassa e de lipídio (Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41:312-7).
Schizosaccharomvces spp.
[0228]Schizosaccharomyces é um gênero de leveduras de fissão.
Semelhante à S. cerevisiae, Schizosaccharomyces é um organismo modelo no estudo da biologia celular eucariótica. Ele fornece uma comparação evolutiva distante com S. cerevisiae. As espécies incluem, mas não estão limitadas a, S.
cryophilius e S. pombe. (Ver Hoffman et al., 2015, Genetics. 201(2):403-23).
Humicola spp.
[0229]Humicola é um gênero de fungos filamentosos. As espécies incluem, mas não estão limitadas a, H. alopallonella e H. siamensis.
Brettanomyces spp.
[0230]Brettanomyces é um gênero de levedura que não forma esporos. É da família Saccharomycetaceae e é comumente usado nas indústrias de cerveja e vinho. O Brettanomyces produz vários compostos sensoriais que contribuem para a complexidade do vinho, especificamente vinho tinto. As espécies de Brettanomyces incluem, mas não estão limitadas a, B. bruxellensis e B. claussenii. Ver, por exemplo, Fugelsang et al., 1997, Wine Microbiology. Trichosporon spp.
[0231]Trichosporon é um gênero da família dos fungos. As espécies deTrichosporon são leveduras comumente isoladas do solo, mas que também podem ser encontradas na microbiota da pele de humanos e animais. As espécies incluem, por exemplo, mas não se limitando a, T. aquatile, T. beigelii e T. dermatis.
Debaromyces spp.
[0232]Debaromyces é um gênero da família de leveduras ascomicetos, em que as espécies são caracterizadas como espécies marinhas tolerantes ao sal. As espécies incluem, mas não se limitam a, D. hansen a e D. han sen i us.
Physcomitrella spp.
[0233]Os musgos Physcomitrella, quando cultivados em cultura de suspensão, tem características semelhantes a leveduras ou outras culturas fúngicas. Este gênero pode ser usado para a produção de metabólitos secundários de plantas, que podem ser difíceis de produzir em outros tipos de células.
Saccharomyces spp.
[0234]Saccharomyces é um organismo chassis amplamente utilizado em biologia sintética e que pode ser usado como a plataforma de microrganismos recombinantes. Por exemplo, existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador de metabolismo detalhados e outras informações disponíveis sobre a S. cerevisiae, permitindo o projeto racional de vários módulos para melhorar o rendimento do produto. Métodos para criar microrganismos recombinantes são conhecidos. Exemplos de espécies de Saccharomyces incluem S. castellii, também conhecida como Naumoyozyma castelli.
Zyoosaccharomyces spp.
[0235]Zygosaccharomyces é um gênero de levedura. Originalmente classificado sob o gênero Saccharomyces, foi reclassificado desde então. É amplamente conhecido na indústria de alimentos porque várias espécies são extremamente resistentes às técnicas de preservação de alimentos usadas comercialmente. As espécies incluem, mas não estão limitadas a, Z. bisporus e Z.
cidri. (Veja Barnett et al. Yeasts: Characteristics and Identification, 1983).
Geotnchum spp.
[0236]O Geotrichum é um fungo comumente encontrado no solo, na água e no esgoto em todo o mundo. É frequentemente identificado em plantas, cereais e laticínios. As espécies incluem, por exemplo, mas não se limitam a, G. candidum e G. klebahnii (ver Carmichael at al., Mycologica, 1957, 49(6):820-830.) Kazachstania so
[0237]Kazachstania é um gênero de levedura da família Sacchromycetaceae.
Torulaspora spp.
[0238]Torulaspora é um gênero de levedura e as espécies incluem, mas não estão limitadas a, T. franciscae e T. globosa.
Aspergillus spp.
[0239]Espécies de Aspergillus, como A. oryzae. A. niger e A. sojae são microrganismos amplamente utilizados na produção de alimentos e também podem ser usados como plataforma de microrganismos recombinantes. Sequências nucleotídicas estão disponíveis para genomas de A. nidulans. A. fumigatus, A.
oryzae, A. clavatus. A. flavus. A. niger e A. terreus, permitindo projeto e modificação racionais de vias endógenas para melhorar o fluxo e aumentar o rendimento do produto. Modelos metabólicos foram desenvolvidos para Aspergillus, assim como estudos transcriptômicos e estudos proteômicos. O A. niger é cultivado para a produção industrial de uma série de ingredientes de alimentos, tais como ácido cítrico e ácido glucônico, e, dessa forma, espécies como o A. niger são geralmente adequadas para a produção de glicosídeos de esteviol.
Yarrowia lipolytica
[0240]Yarrowia lipolytica é uma levedura dimórfica (ver Arxula adeninivorans) e pertence à família Hemiascomycetes. Todo o genoma da Yarrowia lipolytica é conhecido. A espécie Yarrowia é aeróbia e considerada não-patogênica. A Yarrowia é eficiente na utilização de substratos hidrofóbicos (por exemplo, alcanos, ácidos graxos e óleos) e pode crescer em açúcares. Ela tem um elevado potencial para aplicações industriais e é um microrganismo oleaginoso. A Yarrowia lipolyptica pode acumular teor lipídico até cerca de 40% do seu peso celular seco e é um organismo modelo para acúmulo de lipídios e remobilização.
Ver por exemplo, Nicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18; Beopoulos et al., 2009, Biochimie 91(6):692-6; Banker et al., 2009, AppI Microbiol Biotechnol. 84(5):847-65.
Rhodosporidium toruloides
[0241]Rhodosporidium toruloides é uma levedura oleaginosa e útil para manipular vias de produção de lipídio (Ver por exemplo Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112; Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4): 1219-27).
Candida boldinll
[0242]Candida boidinii é uma levedura metilotrófica (pode crescer em metanol). Assim como outras espécies metilotróficas, como Hansenula polymorphe e PIchla pastorls, ela fornece uma excelente plataforma para a produção de proteínas heterólogas. Rendimentos em um intervalo de multigrama de uma proteína estranha secretada foram relatados. Um método computacional, IPRO, previu recentemente mutações que trocaram experimentalmente a especificidade de cofator de xilose redutase de Candida boidinii de NADPH para NADH. Ver, por exemplo, Mattanovich et al., 2012, Methods Mol Biol. 824:329-58; Khoury et al., 2009, Protein Scl. 18(10):2125-38.
Hansenula polymorphe (PIchla angusta)
[0243]Hansenula polymorphe é uma levedura metilotrófica (ver Candida boldinll). Além disso, esta pode crescer em uma larga gama de outros substratos; é termotolerante e pode assimilar nitrato (ver também Kluyveromyces lactis). Ela foi aplicada na produção de vacinas de hepatite B, insulina e interferon alfa-2a para o tratamento da hepatite C, além de uma gama de enzimas técnicas. Ver, por exemplo, Xu et al., 2014, Virol Sin. 29(6):403-9.
Candida krusel (Issatchenkla orlentalls)
[0244]Candida krusel, nome científico Issatchenkla orlentalls, é amplamente utilizada na produção de chocolate. C. krusel é usada para remover o sabor amargo e quebrar os grãos de cacau. Além do envolvimento dessa espécie na produção de chocolate, a C. krusel é comumente encontrada nos imunocomprometidos como patógeno nosocomial fúngico (ver Mastromarino et al., New MIcroblolgIca, 36:229-238; 2013) Kluyveromyces lactls
[0245]Kluyveromyces lactls é uma levedura regularmente aplicada na produção de kefir. Pode crescer em diversos açúcares, sobretudo na lactose presente no leite e no soro de leite. Foi aplicada com êxito, entre outros, na produção de quimosina (uma enzima que é normalmente presente no estômago de bezerros) para a produção de queijo. A produção ocorre em fermentadores em uma escala de 40.000 L. Ver, por exemplo, van Ooyen et al., 2006, FEMS Yeast Res.
6(3):381-92.
PIchla pastorls
[0246]Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica (ver Candida boidinii e Hansenula polymorpha). Também é comumente referida como Komagataella pastoris. Ela fornece uma plataforma eficiente para a produção de proteínas estranhas. Os elementos da plataforma estão disponíveis como um kit e são usados mundialmente na academia para produzir proteínas. Cepas foram manipuladas para produzir N-glicanos humanos complexos (os glicanos de levedura são semelhantes, mas não idênticos, aos encontrados em humanos). Ver, por exemplo, Piirainen et al., 2014, N Biotechnoi. 31(6):532-7.
Scheffersomyces stipitis
[0247]Scheffersomyces stipitis, também conhecida como Pichia stipitis, é uma levedura homotálica encontrada na forma haploide. Comumente usada no lugar de S. cerevisiae devido à sua capacidade respiratória aprimorada resultante de um sistema respiratório alternativo (ver Papini et al., Microbial Cell Factories, 11:136 (2012)).
[0248]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser uma célula de inseto, como Drosophilia, especificamente Drosophiiia meianogaster.
[0249]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser uma célula de alga, como por exemplo, mas não se limitando a, Biakesiea trispora, Dunaiieiia saiina, Haematococcus piuviaiis. Chioreiia sp.,
[0250]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser uma célula de cianobactéria como, por exemplo, mas não se limitando a, Biakesiea trispora, Dunaiieiia saiina, Haematococcus piuviaiis, Chioreiia sp., Undaria pinnatifida, Sargassum, Laminaria Japonica, and Scenedesmus aimeriensis.
[0251]Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser uma célula bacteriana. Exemplos de bactérias incluem, mas não se limitam a, os gêneros Bacillus (por exemplo, B. subtiiis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus), Acinetobacter, Nocardia, Xanthobacter, Escherichia (por exemplo, E. coli), Streptomyces, Erwinia, Kiebsieiia, Serratia (por exemplo, S. marcessans). Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonelia (por exemplo, S. typhimurium, e S. typhi). Células bacterianas também podem incluir, mas não se limitam a, bactérias fotossintéticas (por exemplo, bactérias verdes não sulfurosas (por exemplo, bactérias Chorofiexus (por exemplo, C.
aurantiacus), Chloronema (por exemplo, C. gigateum), bactérias verdes sulfurosas (por exemplo, bactérias Chlorobium (por exemplo, C. iimicola), Peiodictyon (por exemplo, P. luteolum), bactérias púrpuras sulfurosas (por exemplo, Chromatium (por exemplo, C. okenii)) e bactérias púrpuras não sulfurosas (por exemplo, Rhode-spirillum (por exemplo, R. rubrum), Rhodobacter (por exemplo, R.
sphaeroides, R. capsuiatus) e bactérias Rhodomicrobium (por exemplo, R.
vanellii)).
E. coli
[0252]E. coli é outro organismo de plataforma amplamente utilizado em biologia sintética que também pode ser usado como a plataforma de microrganismo recombinante. Semelhante a Saccharomyces, existem bibliotecas de mutantes,
plasmídeos, modelos de computador de metabolismo detalhados e outras informações disponíveis para E. coli, permitindo o projeto racional de vários módulos para melhorar o rendimento de produto. Métodos semelhantes àqueles descritos acima para Saccharomyces podem ser usados para criar microrganismos E. coli recombinantes.
[0253]Pode ser apreciado que a célula hospedeira recombinante divulgada neste documento pode compreender uma célula vegetal, compreendendo uma célula vegetal que é cultivada em uma planta, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de fungo do gênero Aspergillus; uma célula de levedura de Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae. S. bayanus, S. pastorianus, e S.
carlsbergensis), Schizosaccharomyces (por exemplo, S. pom be). Yarrowia (por exemplo, Y. lipolytica), Candida (por exemplo, C. glabrata, C. albicans, C. krusei, C.
revkaufi, C. pulcherrima, Candida tropicalis, C. utilis, e C. boidinii), Ashbya (por exemplo, A. gossypii), Cyberlindnera (por exemplo, C. jadinii), Pichia (por exemplo, P. pastoris e P. kudriavzevii), Kluyveromyces (por exemplo, K. lactis), Hansenual (por exemplo, H. polymorphe), Arxula (por exemplo, A. adeninivorans), Xanthophyllomyces (por exemplo, X. dendrorhous), Issatchenkia (por exemplo, I.
oriental!). Torulaspora (por exemplo, T. franciscae e T. globose), Geotrichum (por exemplo, G. candidum e G. klebahni), Zygosaccharomyces (por exemplo, Z.
bisporus and Z. cidri), Yamadazyma (por exemplo, Y. philogaea), Lanchancea (por exemplo, L. kluyveri), Kodamaea (por exemplo, K. ohmeri), Brettanomyces (por exemplo, B. anomalus), Trichosporon (por exemplo, T. aquatile, T. beigelii, e T.
dermatis), Debaromyces (por exemplo, D. hansenuis e D. hansenii), Scheffersomyces (por exemplo, S. sfipis'), Rhodosporidium (por exemplo, R.
toruloides), Pachysolen (por exemplo, P. tannophilus), e gêneros Physcomitrella, Rhodotorula, Kazachstania, Gibberella, Agaricus, e Phanerochaete; um célula de inseto incluindo, mas não se limitando a, Drosophilia melanogaster, uma célula de alga incluindo, mas não se limitando a, Blakeslee trispora, Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis, Chlorella sp., Undaria pinnatifida, Sargassum, Laminaria Japonica, e espécie Scenedesmus almeriensis; ou uma célula de bactéria dos gêneros Bacillus (por exemplo, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B.
puntis, B. megaterium, B. halodurans, e B. pumilus) Acinetobacter, Nocardia, Xanthobacter, Escherichia (por exemplo, E. coli), Streptomyces, Erwinia, Klebsiella, Serratia (por exemplo, S. marcessans). Pseudomonas (por exemplo, P.
aeruginosa). Salmonella (por exemplo, S. typhimurium e S. typhi) e, inclusive, bactérias Choroflexus (por exemplo, B. aurantiacus), Cloronema (por exemplo, C.
gigateum), bactérias verdes de enxofre (por exemplo, bactérias Chlorobium (por exemplo, C. limicola), Pelodictyon (por exemplo, P. lutecium)), bactérias roxas com enxofre (por exemplo, Chromatium (por exemplo, C. okenii)) e bactérias roxas sem enxofre (por exemplo, Rhode-spirillum (por exemplo, R. rubrum), Rhodobacter (por exemplo, R. sphaeroides e R. capsulatus) e bactérias Rhodomicrobium (por exemplo, R. vanellii).
Composições de Glicosídeo de Esteviol
[0254]Os glicosídeos de esteviol não têm necessariamente desempenho equivalente em diferentes sistemas alimentares. Por conseguinte, é desejável possuir a capacidade de direcionar a síntese para as composições de glicosídeos de esteviol escolhidas. Os hospedeiros recombinantes descritos neste documento podem produzir composições que são enriquecidas seletivamente para glicosídeos de esteviol específicos (por exemplo, RebD ou RebM) e têm um perfil de sabor consistente. Conforme usado neste documento, o termo “enriquecido” é usado para descrever uma composição glicosídica de esteviol com uma proporção aumentada de um determinado glicosídeo de esteviol, em comparação com uma composição de glicosídeo de esteviol (extrato) de uma planta de estévia. Assim, os hospedeiros recombinantes descritos neste documento podem facilitar a produção de composições que são adaptadas para satisfazer o perfil de adoçante desejado para um determinado produto alimentar e que têm uma proporção de cada glicosídeo de esteviol que é consistente de lote para lote. Em algumas modalidades, os hospedeiros descritos neste documento não produzem ou produzem uma quantidade reduzida de derivados de plantas indesejáveis encontrados em extratos de estévia. Assim, as composições de glicosídeo de esteviol produzidas pelos hospedeiros recombinantes descritos neste documento são distinguíveis das composições derivadas de plantas de estévia.
[0255]A quantidade de um glicosídeo de esteviol individual (por exemplo, RebA, RebB, RebD ou RebM) acumulado pode ser de cerca de 1 a aproximadamente 7.000 mg/L, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 10 mg/L, de cerca de 3 a cerca de 10 mg/L, de cerca de 5 a cerca de 20 mg/L, de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L, de cerca de 10 a cerca de 100 mg/L, de 25 a cerca de 500 mg/L, de cerca de 100 a cerca de 1.500 mg/L, ou de cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/L, pelo menos 1.000 mg/L, pelo menos 1.200 mg/L, pelo menos 1.400 mg/L, pelo menos 1.600 mg/L, pelo menos 1.800 mg/L, pelo menos 2.800 mg/L ou pelo menos
7.000 mg/L. Em alguns aspectos, a quantidade de um glicosídeo de esteviol individual pode exceder 7.000 mg/L. A quantidade de uma combinação de glicosídeos de esteviol (por exemplo, RebA, RebB, RebD ou RebM) acumulado pode ser de cerca de 1 mg/L a cerca de 7.000 mg/L, por exemplo, de cerca de 200 a cerca de 1.500, pelo menos 2.000 mg/L, pelo menos 3.000 mg/L, pelo menos
4.000 mg/L, pelo menos 5.000 mg/L, pelo menos 6.000 mg/L ou pelo menos 7.000 mg/L. Em alguns aspectos, a quantidade de uma combinação de glicosídeos de esteviol pode exceder 7.000 mg/L. Em geral, os tempos de cultura mais longos vão levar a uma quantidade maior do produto. Assim, o micro-organismo recombinante pode ser cultivado por de 1 dia a 7 dias, de 1 dia a 5 dias, de 3 dias a 5 dias, por cerca de 3 dias, por cerca de 4 dias ou por cerca de 5 dias.
[0256]A quantidade de compostos acumulados pelo hospedeiro recombinante pode ser relatada como um "fluxo". Por exemplo, o "fluxo total" pode ser calculado como uma soma (em equivalentes de g/L de RebD) dos níveis de RebA, RebB, RebD, RebE, RebM, 13-SMG, rubusosídeo, esteviol-1,2-biosídeo, esteviol diglicosilado, esteviol triglicosilado, esteviol tetraglicosilado, esteviol pentaglicosilado, esteviol hexaglicosilado, esteviol heptaglicosilado, copalol, ácido ent-caurenoico, ácido ent-caurenoico glicosilado, ent-caurenol glicosilado, ent-caurenal, geranilgeraniol, ent-caurenal e ent-caureno. Compostos individuais, tais como glicosídeos de esteviol individuais, ou grupos de compostos, como o grupo de glicosídeos de esteviol, podem ser relatados como uma fração do fluxo total. Por exemplo, "glicosídeo de esteviol/fluxo" pode ser calculado como (("fluxo total" - (geranilgeraniol + copalol + ent-caureno + ent-caurenol glicosilado + ent-caurenol + ent-caurenal + ácido ent-caurenoico + ácido ent-caurenoico glicosilado) / “fluxo total”).
[0257]Será apreciado que os vários genes e módulos discutidos neste documento podem estar presentes em dois ou mais micro-organismos recombinantes em vez de um único micro-organismo. Quando é utilizada uma pluralidade de micro-organismos recombinantes, eles podem ser cultivados em uma cultura mista para produzir esteviol e/ou glicosídeos de esteviol. Por exemplo, um primeiro micro-organismo pode compreender um ou mais genes de biossíntese para produzir um precursor de glicosídeo de esteviol, enquanto um segundo micro-organismo compreende genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol. O produto produzido pelo segundo, ou micro-organismo final, é então recuperado.
Também será apreciado que, em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante é cultivado usando fontes de nutrientes diferentes de um meio de cultura e utilizando um sistema diferente de um fermentador.
[0258]Alternativamente, os dois ou mais micro-organismos podem ser individualmente cultivados em um meio de cultura separado e o produto do primeiro meio de cultura, por exemplo, o esteviol, pode ser introduzido no segundo meio de cultura para ser convertido em um intermediário subsequente, ou em um produto final, tal como RebA. O produto produzido pelo segundo, ou micro-organismo final, é então recuperado. Também será apreciado que, em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante é cultivado usando fontes de nutrientes diferentes de um meio de cultura e utilizando um sistema diferente de um fermentador.
[0259]Os glicosídeos de esteviol e as composições obtidas pelos métodos descritos neste documento podem ser utilizados para produzir produtos alimentares, suplementos dietéticos e composições adoçantes. Ver, por exemplo, WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227 e WO 2014/122328.
[0260]Por exemplo, o esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro, como RebM ou RebD, pode ser incluído em produtos alimentares, como sorvetes, bebidas gaseificadas, sucos de frutas, iogurtes, pastelaria, gomas de mascar, balas duras e macias, e molhos. O esteviol ou o glicosídeo de esteviol substancialmente puro também pode ser incluído em produtos não alimentares, tais como produtos farmacêuticos, medicamentos, suplementos dietéticos e suplementos nutricionais. O esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro também pode ser incluído em produtos para alimentação animal, tanto para a indústria agrícola como para a indústria de animais de companhia.
Alternativamente, uma mistura de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol pode ser feita cultivando-se micro-organismos recombinantes separadamente, cada um produzindo um glicosídeo de esteviol específico, recuperando-se o esteviol ou glicosídeo de esteviol em forma substancialmente pura de cada micro-organismo e depois combinando os compostos para obter um mistura compreendendo cada composto na proporção desejada. Os micro-organismos recombinantes descritos neste documento permitem que misturas mais precisas e consistentes sejam obtidas em comparação com os produtos de estévia atuais.
[0261]Em outra alternativa, um esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro pode ser incorporado em um produto alimentar juntamente com outros adoçantes, por exemplo, sacarina, dextrose, sacarose, frutose, eritritol, aspartame, sucralose, monatina ou acessulfame de potássio. A razão em peso de esteviol ou glicosídeo de esteviol em relação a outros adoçantes pode variar conforme desejado para se obter um sabor satisfatório no produto alimentar final.
Vide, por exemplo, U.S. 2007/0128311. Em algumas modalidades, o esteviol ou glicosídeo de esteviol pode ser fornecido com um aromatizante (por exemplo, cítrico) como um modulador de sabor.
[0262]As composições produzidas por um micro-organismo recombinante descrito neste documento podem ser incorporadas em produtos alimentares. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante pode ser incorporada em um produto alimentar em uma quantidade que varia de cerca de 20 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto alimentar a cerca de 1800 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto alimentar em uma base de peso seco, dependendo do tipo de glicosídeo de esteviol e de produto alimentar. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante pode ser incorporada em uma sobremesa, confeitaria fria (por exemplo, sorvete), laticínio (por exemplo, iogurte) ou bebida (por exemplo, uma bebida gaseificada) de modo que o produto alimentar tenha um máximo de 500 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante pode ser incorporada em pastelaria (por exemplo, um biscoito) de modo que o produto alimentar tenha um máximo de 300 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante pode ser incorporada em um molho (por exemplo, calda de chocolate) ou produto vegetal (por exemplo, picles) de modo que o produto alimentar tenha um máximo de 1000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante pode ser incorporada em pão de modo que o produto alimentar tenha um máximo de 160 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante, planta ou célula vegetal pode ser incorporada em uma bala dura ou macia, de modo que o produto alimentar tenha um máximo de 1600 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante, planta ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto frutícola processado (por exemplo, sucos de frutas, recheios de frutas, geleias e gelatinas), de modo que o produto alimentar tenha um máximo de 1000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Em algumas modalidades, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida neste documento é um componente de uma composição farmacêutica. Ver, por exemplo, Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, preparado por Harriet Wallin, Food Agric. Org.; EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS), “Scientific Opinion on the safety of steviol glycosides for the proposed uses as a food additive,” 2010, EFSA Journal 8(4):1537; U.S. Food and Drug Administration GRAS Notice 323; U.S Food and Drug Administration GRAS Notice 329; WO 2011/037959; WO 2010/146463; WO 2011/046423; e WO 2011/056834.
[0263]Por exemplo, tal composição de glicosídeo de esteviol pode ter de 90-99% em peso de RebA e uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia e ser incorporada em um produto alimentar a partir de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em uma base de peso seco.
[0264]Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com RebB com mais de 3% em peso de RebB e ser incorporada no produto alimentar de modo que a quantidade de RebB no produto seja de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com RebB possui uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[0265]Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com RebD com RebD superior a 3% em peso e ser incorporada no produto alimentar, de modo que a quantidade de RebD no produto seja de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com RebD possui uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[0266]Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com RebE com mais de 3% em peso de RebE e ser incorporada no produto alimentar de modo que a quantidade de RebE no produto seja de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com RebE possui uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[0267]Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com RebM com RebM superior a 3% em peso e ser incorporada no produto alimentar, de modo que a quantidade de RebM no produto seja de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com RebM possui uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[0268]Em algumas modalidades, um esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro é incorporado em um adoçante de mesa ou produto "cup for cup". Tais produtos tipicamente são diluídos até o nível de doçura apropriado com um ou mais agentes de volume, por exemplo, maltodextrinas, conhecidas pelos versados na técnica. As composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas para RebA, RebB, RebD, RebE ou RebM, podem ser embaladas num sachê, por exemplo, a partir de 10.000 a 30.000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto numa base de peso seco, para uso à mesa. Em algumas modalidades, um glicosídeo de esteviol é produzido in vitro, in vivo, ou por bioconversão de células inteiras.
[0269]A invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa capaz de desagregar glicogênio compreendendo um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157 ou um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato compreendendo um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo com pelo menos 55% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159.
[0270]Num aspecto dos ácidos nucleicos isolados divulgados neste documento, o ácido nucleico é cDNA.
[0271]A invenção também fornece um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa capaz de desagregar glicogênio compreendendo um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 157 ou um polipeptídeo ou um porção cataliticamente ativa do mesmo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato compreendendo um polipeptídeo ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 159.
[0272]Em um aspecto dos polipeptídeos ou a sua porção cataliticamente ativa divulgada neste documento, o polipeptídeo ou a sua porção cataliticamente ativa é um polipeptídeo purificado ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo.
[0273]A invenção será descrita adicionalmente nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.
EXEMPLOS
[0274]Os exemplos que se seguem são ilustrativos de modalidades específicas da invenção, e suas várias utilizações. Eles são estabelecidos apenas para fins explicativos, e não devem ser considerados como limitativos da invenção.
Exemplo 1: Manipulação de Cepas
[0275]Cepas de S. cerevisiae produtoras de glicosídeos de esteviol foram construídas conforme descrito em WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227 e WO 2014/122328, cada uma dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Por exemplo, cepas de leveduras que compreendem e expressam um gene nativo que codifica um polipeptídeo YNK1 (SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123), um gene nativo que codifica um polipeptídeo PGM1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2), um gene nativo que codifica um polipeptídeo PGM2 (SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119), um gene nativo que codifica um polipeptídeo UGP1 (SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121), um gene nativo que codifica um polipeptídeo GDB1 (SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157), um gene nativo que codifica um polipeptídeo GPH1 (SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo GGPPS (SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CDPS truncado (SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KS (SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KO (SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KO (SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo ATR2 (SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KAHe1 (SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CPR8 (SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CPR1 (SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C2 (SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT74G1 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT91d2e-b (SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo EUGT11 (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KAH (SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97), um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KQ (SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 64) e cópias adicionais do gene que codifica um polipeptídeo YNK1 (SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123), o gene que codifica um polipeptídeo PGM1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2), o gene que codifica um polipeptídeo PGM2 (SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119), o gene que codifica um polipeptídeo UGP1 (SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121) e o gene que codifica um polipeptídeo transportador ERC1 (por exemplo, da família MATE) (SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161) foram manipuladas para acumular glicosídeos de esteviol.
Exemplo 2: Superexpressão de GDB1 e GPH1
[0276]Uma cepa de S. cerevisiae produtora de glicosídeo esteviol, conforme descrito no Exemplo 1, foi transformada com vetores compreendendo cópias adicionais do gene que codifica um polipeptídeo GDB1 (SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157), operacionalmente ligado a um promotor de TPI1 (SEQ ID NO: 152) e um terminador ADH1 (SEQ ID NO: 155) e o gene que codifica um polipeptídeo GPH1 (SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159), operacionalmente ligado a um promotor de pPDC1 (SEQ ID NO: 153) e um terminador tCYC1 (SEQ ID NO: 154).
[0277]Fermentação por lotes descontínuos alimentados com culturas de uma cepa de S. cerevisiae e uma cepa de S. cerevisiae de controle (uma cepa de S.
cerevisiae produtora de glicosídeos de esteviol conforme descrito no Exemplo 1) foi realizada aerobiamente em fermentadores de 2L a 30 °C com uma fase de cultivo aproximada de 16 h em meio mínimo compreendendo glicose, sulfato de amônio, traços de metais, vitaminas, sais e tampão seguido por uma fase de alimentação aproximada de 100 h um meio de alimentação definido compreendendo glicose.
Um pH próximo de 6,0 e condições limitantes de glicose foram mantidas. Extrações de amostras de cultura inteiras (sem remoção de células) foram realizadas e os extratos foram analisados por LC-UV para determinar os níveis de glicosídeos de esteviol.
[0278]A LC-UV foi conduzida com um instrumento Agilent 1290 compreendendo um detector de comprimento de onda variável (VWD), um compartimento de coluna termostatizado (TCC), um amostrador automático, uma unidade de resfriamento com amostrador automático e uma bomba binária, usando colunas analíticas de 2,1 mm x 300 mm, 1,8 μm de alta definição e rápida resolução (RRHD) SB-C18 (duas colunas de 150 mm em série; temperatura da coluna de 65 °C). Os glicosídeos de esteviol foram separados por uma coluna C18 de fase reversa, seguida por detecção por absorvência de UV a 210 mm. A quantificação de glicosídeos de esteviol foi feita comparando-se a área de pico de cada analito com os padrões de RebA e aplicando-se um fator de correção para espécies com diferentes absorções molares. Para LC-UV, 0,5 mL de culturas foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido e o peso úmido dos sedimentos foi calculado. Os resultados de LC-UV foram normalizados por peso úmido de grânulo.
Os valores totais de glicosídeo de esteviol da fermentação descontínua alimentada foram calculados com base nos níveis medidos de glicosídeos de esteviol calculados como uma soma (em equivalentes de g/L de RebD) de RebA, RebB, RebD, RebE, RebM, 13-SMG, rubusosídeo, esteviol-1,2-biosídeo, esteviol diglicosilado, esteviol triglicosilado, esteviol tetraglicosilado, esteviol pentaglicosilado, esteviol hexaglicosilado e esteviol heptaglicosilado. O fluxo total foi calculado como uma soma (em equivalentes de g/L de RebD) dos níveis de RebA, RebB, RebD, RebE, RebM, 13-SMG, rubusosídeo, esteviol-1,2-biosídeo, esteviol diglicosilado, esteviol triglicosilado, esteviol tetraglicosilado, esteviol pentaglicosilado, esteviol hexaglicosilado, esteviol heptaglicosilado, copalol, ácido ent-caurenoico, ácido ent-caurenoico glicosilado, ent-caurenol glicosilado, ent-caurenal, geranilgeraniol, ent-caurenal e ent-caureno. Os resultados são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1: Acúmulo de glicosídeos de esteviol por cepa de S. cerevisiae e cepa de S. cerevisiae de controle. Cepas 13-SM RebA RebD RebM RebD SGs Fluxo G (g/L) (g/L) (g/L) + Totais Total (g/L) RebM (g/L) (g/L) (g/L) Controle 1,59 0,49 1,26 5,91 7,2 11,53 23,08 +GDB1 1,13 0,53 1,63 6,60 8,2 11,60 26,29 +GPH1 Alteraçã -29% 8% 29% 12% 14% 1% 14% o Título de fermentação do ponto final (120 h) g/L como no equivalente de RebD
[0279]A variação percentual na produção de glicosídeo de esteviol (% de aumento ou % de redução) foi calculada da seguinte maneira. A quantidade de um glicosídeo de esteviol específico (por exemplo, RebM) produzido pela cepa de controle (em g/L) foi subtraída da quantidade do glicosídeo de esteviol específico produzido pela cepa experimental que superexpressa GPH1 e GDB1 (em g/L).
Esse valor resultante foi então dividido pela quantidade do glicosídeo de esteviol específico produzido pela cepa de controle (em g/L) e multiplicado por 100. Um número positivo usando essa equação significa um aumento percentual em um glicosídeo de esteviol específico produzido pela cepa que superexpressa GPH1 e GDB1 (em g/L), enquanto um número negativo usando essa equação significa uma diminuição percentual em um glicosídeo de esteviol específico (por exemplo, 13-SMG) produzido pela cepa que superexpressa GPH1 e GDB1 (em g/L).
[0280]A superexpressão de GPH1 e GDB1 resultou em uma diminuição de 29% na acumulação de 13-SMG e um aumento de 8%, 29% e 12% na acumulação de RebA, RebD e RebM, respectivamente, em comparação com a cepa de controle. Também houve um aumento de 14% na acumulação de RebD + RebM.
Além disso, houve um aumento de 14% no fluxo total acumulado pela cepa que superexpressa os genes GPH1 e GDB1, em comparação à cepa de controle. A quantidade total de glicosídeos de esteviol acumulados se alterou de forma insignificante. Sem estar limitado pela teoria, a falta de uma mudança significativa no acúmulo total de glicosídeo de esteviol e a diminuição no acúmulo de 13-SMG sugerem que a superexpressão de GPH1 e GDB1 em um hospedeiro recombinante produtor de glicosídeo de esteviol aumenta o fluxo de vias de glicosilação em direção a glicosídeos de esteviol de maior peso molecular, por exemplo, RebD e RebM, alterando o perfil de produção, em vez de simplesmente aumentar a produção de glicosídeo de esteviol, em geral.
[0281]Que possui-se descrito a invenção detalhadamente e em referência a modalidades específicas da mesma, será evidente que variações e modificações são possíveis sem que se incorra em afastamento do escopo da invenção definido nas reivindicações anexas. Mais especificamente, embora alguns aspectos da presente invenção sejam identificados neste documento como particularmente vantajosos, é contemplado que a presente invenção não é necessariamente limitada a estes aspectos particulares da invenção.
Tabela 3. Sequências divulgadas neste documento.
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Claims (50)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula hospedeira recombinante capaz de produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol em uma cultura de células, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio; e/ou (b) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato.
2. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio é capaz de atividade de 4-α-glucanotransferase e atividade de α-1,6-amiloglucosidase.
3. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente: (c) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina-5'- trifosfato (UTP) a partir da uridina difosfato (UDP); (d) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato; e/ou (e) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina difosfato glicose (UDP-glicose) a partir de UTP e glicose-1-fosfato.
4. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que: (a) o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; (b) o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159;
(c) o polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; (d) o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 119 ou 143 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 141, 145 ou 147; e/ou o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1- fosfato compreende um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 121 ou 127, um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139 ou um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 131.
5. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente: (a) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 deste; (b) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose, ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O- glicose do glicosídeo de esteviol; (c) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 deste;
(d) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol; (e) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar pirofosfato de geranilgeranil (GGPP) a partir de farnesil difosfato (FPP) e isopentenil difosfato (IPP); (f) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar difosfato de ent- copalil a partir de GGPP; (g) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno a partir de ent-copalil difosfato; (h) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar ácido ent- caurenoico a partir de ent-caureno; (i) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450; e/ou (j) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar esteviol a partir de ácido ent-caurenoico; em que pelo menos um dos genes é um gene recombinante.
6. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que: (a) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo hidroxila C-13 deste compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; (b) o polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose, ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; (c) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19 deste compreende um polipeptídeo com pelo menos 55%
de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4;
(d) o polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2' da 13-O-glicose, da
19-O-glicose ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos
65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 16;
(e) o polipeptídeo capaz de sintetizar GGPP compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, ou 116;
(f) o polipeptídeo capaz de sintetizar difosfato de ent-copalil compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 34, 36,
38, 40, 42 ou 120;
(g) o polipeptídeo capaz de sintetizar ent-caureno compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 50 ou 52;
(h) o polipeptídeo capaz de sintetizar o ácido ent-caurenoico compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 60, 62, 66, 68, 70, 72,
74, 76, ou 117;
(i) o polipeptídeo capaz de reduzir o complexo do citocromo P450 compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 78, 80, 82, 84, 86,
88, 90, 92; e/ou
(j) o polipeptídeo capaz de sintetizar esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 94, 97, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112 ou 114.
7. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; (b) o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; (c) o gene que codifica um polipeptídeo capaz de sintetizar uridina-5'-trifosfato (UTP) a partir de uridina difosfato (UDP) com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123; (d) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato com pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 2 ou 119; e (e) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-1-fosfato que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 121; e um ou mais dentre: (f) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 deste com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7;
(g) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 de C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose, ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O- glicose de um glicosídeo de esteviol com pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; (h) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 deste com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; (i) o gene que codifica o polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2' da 13-O-glicose, 19-O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende o polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; o polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou o polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; em que pelo menos um dos genes é um gene recombinante.
8. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou (b) o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; em que o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio e/ou o gene recombinante que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato são superexpressos em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
9. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene que codifica o polipeptídeo capaz de desagregar o glicogênio e/ou o gene que codifica o polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato são superexpressos em pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
10. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem o um ou mais genes recombinantes.
11. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em pelo menos 10%, ou pelo menos 25%, ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, ou pelo menos 250% em relação a um hospedeiro correspondente sem um ou mais genes recombinantes.
12. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade dos um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem o um ou mais genes recombinantes.
13. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade dos um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
14. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade de RebA, RebD e/ou RebM produzida pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
15. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta uma quantidade dos um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
16. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade dos um ou mais glicosídeos de esteviol acumulados pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50% em relação a uma célula hospedeira correspondente sem os um ou mais genes recombinantes em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
17. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes diminui a quantidade de 13-SMG acumulada pela célula em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
18. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
19. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão dos um ou mais genes recombinantes aumenta ou diminui a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula em menos de 10%, menos de 5%, ou menos de 2,5% em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
20. Célula hospedeira recombinante, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADA pelo fato de que os um ou mais glicosídeos de esteviol são, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13- O-glucosídeo (13-SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O- glucosídeo (19-SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B (RebB), rebaudiosídeo C (RebC),
rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero destes.
21. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica do gênero Aspergillus ou uma célula de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendnorhous ou Candida albicans, uma célula de algas ou uma célula bacteriana da espécie Escherichia coli ou do gênero Bacillus.
22. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.
23. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de Yarrowia lipolytica.
24. Método para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol numa cultura de células, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira recombinante de qualquer uma das reivindicações 1-21 na cultura de células, sob condições em que os genes são expressos e em que os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol são produzidos pela célula hospedeira recombinante.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que os genes são expressos constitutivamente.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão dos genes é induzida.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de RebA, RebD e/ou RebM produzida pela célula é aumentada em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de 13-SMG acumulada pela célula é diminuída em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de glicosídeos de esteviol totais produzidos pela célula é aumentada em pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 15%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 125%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 175%, ou pelo menos 200% em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade total de glicosídeos de esteviol produzidos pela célula diminui em menos de 10%, ou menos de 5%, ou menos de 2,5% em relação a um hospedeiro correspondente sem os ou mais genes recombinantes.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30,
CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é cultivada num fermentador a uma temperatura durante um período de tempo, em que a temperatura e o período de tempo facilitam a produção dos um ou mais glicosídeos de esteviol ou da composição de glicosídeo de esteviol.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade de UDP-glicose acumulada pela célula em pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, em pelo menos 200% ou pelo menos 250% em relação a um hospedeiro correspondente sem os um ou mais genes recombinantes.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente isolar os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol da cultura de células.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de isolamento compreende separar uma fase líquida da cultura de células de uma fase sólida da cultura de células para obter um sobrenadante compreendendo os um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol, e: (a) colocar em contato o sobrenadante com uma ou mais resinas adsorventes para obter pelo menos uma porção dos um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou da composição de glicosídeo de esteviol; ou (b) colocar em contato com o sobrenadante uma ou mais colunas de cromatografia de permuta iônica ou de fase reversa, a fim de obter pelo menos uma porção dos um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou da composição de glicosídeo de esteviol; ou (c) cristalizar ou extrair os um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol;
isolando assim os um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos ou a composição de glicosídeo de esteviol.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol da cultura de células.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais glicosídeos de esteviol recuperados ou a composição de glicosídeo de esteviol são enriquecidos para os um ou mais glicosídeos de esteviol em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol da planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados da planta de estévia em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol obtida a partir de um extrato de estévia derivado de plantas.
37. Método para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a bioconversão de célula inteira de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol derivados de plantas ou sintéticos em uma cultura celular de uma célula hospedeira recombinante usando: (a) um polipeptídeo capaz de desagregar glicogênio, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 157; e/ou (b) um polipeptídeo capaz de sintetizar glicose-1-fosfato, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 159; e opcionalmente, um ou mais dentre: (c) um polipeptídeo capaz de sintetizar UTP a partir de UDP, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 123;
(d) um polipeptídeo capaz de converter glicose-6-fosfato em glicose-1-fosfato,
compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2,
119 ou 143; ou pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 141, 145 ou 147; e/ou
(e) um polipeptídeo capaz de sintetizar UDP-glicose a partir de UTP e glicose-
1-fosfato, compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ
ID NO: 121 ou 127; pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 125, 129, 133, 135, 137 ou 139; ou pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 131, e um ou mais dentre:
(f) um polipeptídeo capaz de glicosilar um esteviol ou um glicosídeo de esteviol no seu grupo hidroxila C-13 deste;
(g) um gene que codifica um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do
C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose, ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O-
glicose do glicosídeo de esteviol;
(h) um polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo carboxila C-19 deste; e/ou
(i) um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2' da 13-O-glicose, 19-
O-glicose, ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol;
em que pelo menos um dentre os polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante expresso na célula hospedeira recombinante; e produzindo assim os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que: (f) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol em seu grupo hidroxila C-13 deste compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; (g) o polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3' da 13-O-glicose, da 19-O-glicose, ou tanto da 13-O-glicose quanto da 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; (h) o polipeptídeo capaz de glicosilar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila C-19 deste compreende um polipeptídeo com pelo menos 55% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; (i) o polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2' da 13-O-glicose, 19- O-glicose ou 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11; um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; ou um polipeptídeo com pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica do gênero Aspergillus ou uma célula de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendnorhous ou Candida albicans, uma célula de algas ou uma célula bacteriana da espécie Escherichia coli ou do gênero Bacillus.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma célula de Yarrowia lipolytica.
42. Método, de acordo qualquer uma das reivindicações 24 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais glicosídeos de esteviol são, ou a composição de glicosídeo de esteviol compreende, esteviol-13-O-glucosídeo (13- SMG), esteviol-1,2-Biosídeo, esteviol-1,3-Biosídeo, esteviol-19-O-glucosídeo (19- SMG), 1,2-esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, rebaudiosídeo A (RebA), rebaudiosídeo B (RebB), rebaudiosídeo C (RebC), rebaudiosídeo D (RebD), rebaudiosídeo E (RebE), rebaudiosídeo F (RebF), rebaudiosídeo M (RebM), rebaudiosídeo Q (RebQ), rebaudiosídeo I (RebI), dulcosídeo A e/ou um isômero destes.
43. Cultura de células, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a célula hospedeira recombinante de qualquer uma das reivindicações 1-23, a cultura de células compreendendo ainda: (a) os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira recombinante; (b) glicose, frutose, sacarose, xilose, ramnose, UDP-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glucosamina; e (c) nutrientes suplementares compreendendo metais vestigiais, vitaminas, sais, YNB e/ou aminoácidos; em que os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol estão presentes a uma concentração de pelo menos 1 mg/litro de cultura de células; em que a cultura de células é enriquecida para um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia em relação a um extrato de estévia derivado de plantas.
44. Cultura de células, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a célula hospedeira recombinante de qualquer uma das reivindicações 1-23, a cultura de células compreendendo ainda: (a) os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira recombinante; (b) glicose, frutose, sacarose, xilose, ramnose, UDP-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glucosamina; e (c) nutrientes suplementares compreendendo metais vestigiais, vitaminas, sais, YNB e/ou aminoácidos; em que UDP-glicose está presente na cultura celular a uma concentração de pelo menos 100 µM; em que o meio de cultura de células é enriquecido para a UGP-glicose em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol da planta de estévia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia relativamente a um extrato de estévia derivado de plantas.
45. Lisado celular da célula hospedeira recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23 cultivado na cultura de células, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira recombinante;
(b) glicose, frutose, sacarose, xilose, ramnose, UDP-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil-glucosamina; e/ou (c) nutrientes suplementares compreendendo metais vestigiais, vitaminas, sais, base nitrogenada de fermento, YNB e/ou aminoácidos; em que os um ou mais glicosídeos de esteviol ou a composição de glicosídeo de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante estão presentes a uma concentração de pelo menos 1 mg/litro da cultura de células.
46. Um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23; CARACTERIZADOs pelo fato de que os um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante estão presentes em quantidades relativas que são diferentes de uma composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia e têm um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia em relação a um extrato de estévia derivado de plantas.
47. Um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pelo método de qualquer uma das reivindicações 24-42; CARACTERIZADOs pelo fato de que os um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos pela célula hospedeira recombinante estão presentes em quantidades relativas que são diferentes de uma composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia e têm um nível reduzido de componentes derivados de plantas de estévia em relação a um extrato de estévia derivado de plantas.
48. Composição adoçante, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende os um ou mais glicosídeos de esteviol de acordo com a reivindicação 46 ou 47.
49. Produto alimentar, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição adoçante de acordo com a reivindicação 48.
50. Bebida ou um concentrado de bebida, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição adoçante de acordo com a reivindicação 48.
Petição 870200060734, de 15/05/2020, pág. 243/249 1/3 ent-Copalil-PP ent-Caureno Ácido Esteviol ent-caurenoico
Figura 1
Petição 870200060734, de 15/05/2020, pág. 244/249 Glicose Glicose Glicose Glicose O-Glicose-Glicose Glicose O-Glicose O-Glicose-Glicose O-Glicose O-Glicose-Glicose Glicose Glicose Glicose COO-Glicose-Glicose COO-Glicose COO-Glicose Esteviol-1,3- biosídeo
Glicose Glicose Glicose O-Glicose O-Glicose-Glicose O-Glicose O-Glicose-Glicose O-Glicose-Glicose
COO-Glicose COO-Glicose COO-Glicose-Glicose Esteviol-13-O- Esteviol-1,2- 1,3-Esteviosídeo 2/3
Glicosídeo biosídeo
O-Glicose O-Glicose-Glicose O-Glicose-Glicose Esteviol
COO-Glicose COO-Glicose COO-Glicose COO-Glicose-Glicose Esteviol-19-O- Rubusosídeo Esteviosídeo Glicosídeo
Figura 2
Petição 870200060734, de 15/05/2020, pág. 245/249 Glicose Glicogênio 3/3
Orotidina-5P
Esteviol Ácido orótico
Glutamina
Figura 3
BR112020009838-8A 2017-12-05 2018-12-05 produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes BR112020009838A2 (pt)

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