CN117203325A - 糖苷产物生物合成和回收 - Google Patents

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Abstract

在各个方面和实施方案中，本公开提供了用于制备糖基化产物的方法，以及可用于其的细菌细胞和尿苷二磷酸(UDP)依赖性糖基转移酶(UGT)酶。在其他方面和实施方案中，本公开提供了从微生物培养物或无细胞反应中高产率和/或高纯度回收此类糖苷产物的方法。在各个方面和实施方案中，本公开提供了全细胞生物转化方法，涉及所需底物的糖基化，和/或以高产率和/或高纯度回收所述糖基化产物。

Description

糖苷产物生物合成和回收
背景技术
小分子的糖基转移酶由植物界中的大型多基因家族编码。这些酶将糖从核苷酸糖转移至广泛范围的次级代谢物，从而改变受体分子的物理和化学性质。例如，甜菊醇糖苷是在甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的叶子中发现的一类化合物，甜叶菊是一种原产于南美洲某些地区的菊科(Asteraceae(Compositae))多年生灌木。它们在结构上的特征在于核心萜类甜菊醇，不同之处在于位置C13和C19处存在碳水化合物残基。它们积聚在甜叶菊叶子中，占总干重的大约10％至20％。基于干重，在甜叶菊叶子中发现的四种主要糖苷通常包括甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和杜尔可苷A。其他甜菊醇糖苷以少量或痕量存在，包括莱鲍迪苷B、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M和O、杜尔可苷B、甜菊醇二糖苷和甜叶悬钩子苷。
据估计，次要糖基化产物莱鲍迪苷M(RebM)的效力是蔗糖的约200-350倍，并且被描述为具有清新甜味，并带有轻微苦味或甘草后味。Prakash I.等人,Development of Next Generation Stevia Sweetener:Rebaudioside M,Foods 3(1),162-175(2014)。尽管RebM在全球食品工业中引起极大的兴趣，但其在甜叶菊提取物中的低普及率必需创新的合成方法。
又如，罗汉果苷是在葫芦科植物罗汉果(也即monkfruit或Luo Han Guo)的果实中存在的三萜衍生的特化次级代谢物。它们在果实中的生物合成涉及糖苷配基罗汉果醇的多个连续糖基化。食品业正越来越多地使用罗汉果苷果实提取物作为天然的非糖食品甜味剂。例如，罗汉果苷V(mog.V)的增甜能力是蔗糖的约250倍(Kasai等人,Agric Biol Chem(1989))。此外，已经确定了罗汉果苷的其他健康益处(Li等人,ChinJNatMed(2014))。
纯化的Mog.V在日本已被批准为高强度甜味剂，并且该提取物在美国已获得GRAS地位，作为非营养性甜味剂和增味剂。从果实中提取罗汉果苷可以得到不同程度纯度的产物，常常伴有不合意的余味。另外，由于植物产量低和植物的特殊栽培要求，栽培果实中罗汉果苷的产量有限。罗汉果苷在新鲜水果中以约1％存在，并且在干果中以约4％存在。Mog.V是主要组分，在干果中的含量为0.5％至1.4％。而且，纯化困难限制了Mog.V的纯度，将来自植物提取物的商业产品标准化至约50％Mog.V。很可能纯Mog.V产品将获得比共混物更大的商业成功，因为它不太可能具有异味，将更容易配制成产品，并且具有良好的溶解潜力。因此，经由生物技术方法生产甜罗汉果苷化合物是有利的。
仍然需要用于生产高价值糖苷的经济方法，包括作为天然植物提取物的次要产物的那些。
发明内容
在各个方面和实施方案中，本公开提供了用于制备糖基化产物的方法，以及可用于其的细菌细胞和尿苷二磷酸(UDP)依赖性糖基转移酶(UGT)酶。在其他方面和实施方案中，本公开提供了从微生物培养物或无细胞反应中高产率和/或高纯度回收糖苷产物的方法。在各个方面和实施方案中，本公开提供了全细胞生物转化方法，涉及所需底物的糖基化，随后以高产率和/或高纯度回收糖基化产物。
在一方面，本发明提供了一种用于制备糖基化产物的细菌细胞和方法。具体地，本公开提供了一种表达一种或多种UGT酶的细菌细胞，用于根据全细胞生物转化方法糖基化所需底物。在一些实施方案中，细菌细胞表达一种或多种重组蔗糖合酶酶。蔗糖合酶表达可显著增强补给底物的全细胞糖基化。可替代性地或此外，细菌细胞包含增加UDP-糖利用度的一种或多种遗传修饰。细菌细胞在用于糖基化的底物存在下培养，并且糖基化产物任选地使用本文所述的回收方法回收。
全细胞生物转化系统优于无细胞系统，因为细胞提供UDP-葡萄糖辅因子再生。在本发明的实施方案中，催化(糖基化)是用活细菌细胞进行的，并且UDP-葡萄糖辅因子再循环使用细胞代谢进行，而不需要酶供给或供给昂贵的底物用于UDP-葡萄糖再生。根据本公开可以使用多种细菌物种，包括大肠埃希氏菌(E.coli)。
在一些实施方案中，细菌细胞表达重组蔗糖合酶酶，并且细菌细胞可以在蔗糖存在下培养。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与选自SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，微生物细胞具有增加UDP-葡萄糖利用度的一种或多种遗传修饰，诸如编码消耗UDP-葡萄糖的酶的基因的缺失、失活或活性或表达降低。其他可减少或消除的UDP-葡萄糖槽包括消除或降低负责脂质糖基化和LPS生物合成的基因以及负责使十一异戊烯二磷酸(UPP)糖基化的基因的活性或表达。在这些或其他实施方案中，细菌细胞具有编码消耗UDP-葡萄糖前体的酶的基因的缺失、失活或活性或表达降低。在这些或其他实施方案中，细胞具有一种或多种编码参与将葡萄糖-6-磷酸转化为UDP-葡萄糖的酶的基因的过表达或活性增加。可替代性地或此外，细菌细胞具有增加葡萄糖转运的一种或多种遗传修饰。可替代性地或此外，微生物细胞具有增加UTP产生和再循环的一种或多种遗传修饰。可替代性地或此外，微生物细胞具有增加UDP产生的一种或多种遗传修饰。可替代性地或此外，微生物细胞可具有一种或多种遗传修饰以除去或减少对葡萄糖摄取的调控。可替代性地或此外，微生物细胞可具有减少葡萄糖-1-磷酸的去磷酸化的一种或多种遗传修饰。可替代性地或此外，细菌细胞具有减少葡萄糖-1-磷酸向TDP-葡萄糖转化的一种或多种遗传修饰。可替代性地或此外，细菌细胞可具有减少葡萄糖-1-磷酸向ADP-葡萄糖转化的一种或多种遗传修饰。
在各个实施方案中，用于糖基化的底物作为植物提取物或其级分提供，或合成地或通过生物合成方法产生。示例性底物包括各种次级代谢物，诸如选自萜类或萜类糖苷、类黄酮或类黄酮糖苷、聚酮类或聚酮类糖苷、芪类或芪类糖苷，以及多酚或多酚糖苷的那些。可以对植物提取物进行分级以其他方式富集所需底物。在一些实施方案中，底物包含萜类糖苷，诸如甜菊醇或甜菊醇糖苷，或罗汉果醇或罗汉果醇糖苷。可以选择UGT酶以及相关底物(包括富含所需底物的级分)以产生所需糖基化产物。在一些实施方案中，糖基化产物包含一种或多种甜菊醇糖苷，诸如RebM、RebE、RebD、RebB和/或RebI，或罗汉果醇糖苷诸如mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI、isomog.V和/或赛门苷等。
在其他方面和实施方案中，本发明提供了一种工程化UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其对糖基化底物具有高生产率，包括萜类糖苷底物，并且包括与本文所述的细菌细胞和方法相关的。在一些实施方案中，工程化UGT酶包含与SEQ ID NO:13具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列，并且具有提高对萜类糖苷底物(例如，甜菊醇糖苷底物)的糖基化活性的一个或多个氨基酸修饰。在其他实施方案中，UGT酶包含与SEQ ID NO:14具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列，并且具有提高对萜类糖苷底物(例如，甜菊醇糖苷底物)的糖基化活性的一个或多个氨基酸修饰。在其他实施方案中，UGT酶包含与SEQ ID NO:15具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列，并且具有提高对萜类糖苷底物(例如，甜菊醇糖苷底物)的糖基化活性的一个或多个氨基酸取代。
在其他方面和实施方案中，本发明提供了用于糖基化罗汉果醇或罗汉果醇糖苷底物的UGT酶(包括表达其的微生物细胞)。在这些方面和实施方案中，该方法包括在UDP-糖存在下使底物与UGT酶接触。UGT酶可包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:79。在这些实施方案中，罗汉果醇或罗汉果醇糖苷底物可以作为植物提取物或其级分提供，诸如罗汉果提取物或其级分。例如，底物可以包含(或富集)选自以下的一种或多种底物：罗汉果醇、mog.I-A、mog.I-E、mog.II-A、mog.II-E、mog III、mog IVA、mog.IV和赛门苷。在一些实施方案中，糖基化产物可以包含以下中的一种或多种：mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog VI、isomog.V和赛门苷。在各个实施方案中，UGT酶可能能够在罗汉果醇核心的C3和C24羟基处进行伯糖基化，以及C3和/或C24伯糖基的1-2和1-6分支糖基化。
在一些关于生产罗汉果醇糖苷的实施方案中，将底物与表达UGT酶的微生物细胞一起培养。示例性微生物细胞包括用于如本文所述的全细胞生物转化方法的被工程化的细菌细胞。在其他实施方案中，微生物细胞是酵母细胞。然而，在其他实施方案中，根据已知技术将底物用包含UGT酶的细胞裂解物孵育，或用纯化的重组UGT酶孵育。
在一些方面，本发明提供了一种用于生产和回收糖苷产物的方法。在此类实施方案中，该方法包括通过在无细胞反应中或在微生物培养物中酶促转移一个或多个糖部分将用于糖基化的底物转化为目标糖苷产物，其可任选地采用本文所述的方法、UGT酶和/或微生物菌株。该方法还包括从该反应或培养物中回收这些糖苷产物，其中回收包括以下中的一种或多种：将反应或培养物的pH调节至低于约pH 5或高于约pH 10，将温度升高至至少约50℃，并添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
传统上，生物质去除是回收中的第一步，以去除大的细胞碎片，并避免破坏将使下游纯化复杂化的细胞。然而，根据本发明的实施方案，培养材料可以是高度粘稠的并且难以处理。通过在去除生物质或酶之前如本文所述处理培养材料，可以产生具有所需品质的产物，包括：糖苷产物的高纯度、有吸引力的颜色、容易溶解、无味和/或高回收率。例如，培养物的初始pH和温度调节可以改变发酵液的流体特性，并提高圆盘堆叠式分离器去除生物质的效率。此外，通过pH和/或温度调节和/或添加糖苷增溶剂，可以显著提高糖苷产物的溶解度并因此提高其产率。
根据以下详细的公开内容和实施例，本公开内容的其他方面和实施方案将是显而易见的。
附图说明
图1示出了表达UGT酶的工程化大肠埃希氏菌细胞的两种染色体修饰((1)ΔotsA-otsB；(2)ΔotsA-otsB，ugpA的插入)对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。
图2示出了表达UGT酶的工程化大肠埃希氏菌细胞中过表达基因对甜菊醇糖苷生物转化的提高。基因在质粒上互补。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。互补基因从左到右为：(1)对照(空质粒)，(2)pgm(SEQ ID NO:92)和galU(SEQ ID NO:93)，(3)pgm(SEQ ID NO:92)，(4)galU(SEQ ID NO:93)，(5)ugpA(SEQ ID NO:95)，(6)ycjU(SEQ ID NO:94)，(7)adk(SEQ ID NO:96)，(8)ndk(SEQ ID NO:97)，(9)pyrH，(10)cmk(SEQ ID NO:98)。
图3示出了表达UGT酶并具有过表达蔗糖合酶的工程化大肠埃希氏菌细胞对甜菊醇糖苷生物转化的提高。基因在质粒上互补。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。互补基因从左到右为：(1)对照(空质粒)，(2)StSus1(SEQ ID NO:1)，(3)StSus2(SEQ IDNO:2)，(4)StSus2_S11E(SEQ ID NO:3)，(5)AcSuSy(SEQ ID NO:4)，(6)AcSuSy_L637M-T640V(SEQ ID NO:5)，(7)AtSus1(SEQ ID NO:6)，(8)AtSus3(SEQ ID NO:7)，(9)VrSS1(SEQID NO:8)，(10)VrSS1_S11E(SEQ ID NO:9)，(11)GmSS(SEQ ID NO:10)，(12)GmSS_S11E(SEQID NO:11)，(13)AtSusA(SEQ ID NO:12)。
图4示出了表达UGT酶并具有各种基因敲除的工程化大肠埃希氏菌细胞对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。缺失(从左到右)是：(1)ΔotsA，(2)Δugd，(3)ΔrfaQPSBIJ，(4)ΔyfdGHI，(5)ΔwcaJ，以及(6)ΔglgC。
图5示出了表达由SEQ ID NO:14(MbUGT1,2.3)限定的UGT酶的工程化大肠埃希氏菌细胞对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于亲本UGT酶(SEQ ID NO:13)的甜菊醇糖苷转化％。
图6示出了表达由SEQ ID NO:15(MbUGT1,2.4)限定的UGT酶的工程化大肠埃希氏菌细胞对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于亲本UGT酶(SEQ ID NO:14)的％甜菊醇糖苷转化。
图7示出了表达由SEQ ID NO:16(MbUGT1,2.5)限定的UGT酶的工程化大肠埃希氏菌细胞对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于亲本UGT酶(SEQ ID NO:15)的％甜菊醇糖苷转化。
图8示出了通过SEQ ID NO:15(MbUGT1,2.4)的UGT酶的表达，甜叶菊叶子提取物的工程化大肠埃希氏菌生物转化菌株生物转化为莱鲍迪苷E和莱鲍迪苷D的混合物，以及通过SEQ ID NO:25(MbUGT1-3.3)的UGT酶的表达生物转化为莱鲍迪苷I。
图9示出了通过表达SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:99的UGT酶，甜叶菊叶子提取物的工程化大肠埃希氏菌生物转化菌株生物转化为莱鲍迪苷B和甜菊二糖苷的混合物。
图10是示出用于甜菊醇糖苷的回收的常规方法的流程图。通常，首先进行生物质去除以去除大的细胞碎片、酶和完整的细胞，从而促进所需产物的纯化。
图11是示出根据本发明的实施方案用于糖苷产物回收的示例性方法的流程图。在去除生物质之前采用pH和/或温度调节和/或添加增溶剂，以改善用于加工的培养材料的物理性质，这进而促进生物质去除同时增加糖苷产物的产量。
图12示出了各种处理对离心后从水性发酵液中分离生物质的影响。颗粒的紧密度和上清液的澄清度用作生物质去除容易度的指标。试管从左到右：(1)22℃(室温)，pH6.64；(2)22℃(室温)，乙醇；(3)22℃(室温)，pH 3.78，+乙醇；(4)22℃(室温)，pH 3.78；(5)70℃，pH 6.64；(6)乙醇70℃；(7)70℃，pH 3.78，+乙醇；以及(8)70℃，pH 3.78。
图13示出在重结晶之前过滤溶液会影响纯度，并且过滤材料的选择对最终产物的质量具有显著影响。图13比较了在重结晶之前使用聚丙烯(PP)(左)和聚醚砜(PES)(右)材料过滤溶液。将高纯度RebM最终产物(>98％)溶解在丙二醇中至10重量％的浓度。PP过滤器的使用产生非常混浊的溶液，而PES过滤器的使用产生澄清的溶液。
图14示出了溶解度(底部曲线)和亚稳极限曲线(顶部曲线)，其限定了亚稳区宽度，如对于水中的RebM所确定的，从而允许控制晶体生长。
图15A、图15B示出了溶解度(底部曲线)和亚稳极限曲线(顶部曲线)，其限定了亚稳区宽度，如在pH 7下对于67％水/33％乙醇中的RebM所确定的，从而允许控制该溶剂体系中的晶体生长。图15A是0％甘油，而图15B包括0.5％甘油。
图16A、图16B示出了溶解度(底部曲线)和亚稳极限曲线(顶部曲线)，其限定了亚稳区宽度，如在pH 11下对于67％水/33％乙醇中的RebM所确定的，从而允许控制该溶剂体系中的晶体生长。图16A是0％甘油，而图16B包括0.5％甘油。
图17A示出了使用表达酶1(SEQ ID NO:71)或酶2(SEQ IDNO:33)的工程化大肠埃希氏菌菌株将罗汉果醇生物转化为罗汉果苷化合物(mog IIE、mog-IE和mog-IA)。图17B示出了使用表达酶1(SEQ ID NO:71)、酶3(SEQ ID NO:81)、酶4(SEQ ID NO:82)和酶5(SEQ IDNO:83)的工程化大肠埃希氏菌菌株将罗汉果醇生物转化为罗汉果苷-IA。
图18A和图18B示出了使用表达酶1(SEQ ID NO:84)、酶2(SEQ ID NO:71)或酶3(SEQ ID NO:33)的工程化大肠埃希氏菌菌株将mog-IA(图18A)或mog-IE(图18B)生物转化为mog-IIE。
图19示出了通过表达酶1(SEQ ID NO:72)、酶2(SEQ ID NO:54)或酶3(SEQ ID NO:13)的工程化大肠埃希氏菌菌株从Mog II-E生产Mog-III或赛门苷。
图20示出了表达酶1(SEQ ID NO:73)的大肠埃希氏菌细胞体外生产MogII-A2。
图21示出了通过UGT酶对甜菊醇和甜菊醇糖苷中间体的作用产生的糖基化产物。
图22示出了Mog.V的糖基化途径。气泡结构代表不同的罗汉果苷。白色四环核代表罗汉果醇。每个结构下面的数字表示特定的糖基化罗汉果苷。黑色圆圈代表C3或C24糖基化。深灰色垂直圆圈代表1,6-糖基化。浅灰色水平圆圈代表1,2-糖基化。缩写：Mog，罗汉果醇；sia，赛门苷。
具体实施方式
在各个方面和实施方案中，本公开提供了用于制备糖基化产物的方法，以及可用于其的细菌细胞和尿苷二磷酸(UDP)依赖性糖基转移酶(UGT)酶。在其他方面和实施方案中，本公开提供了从微生物培养物或无细胞反应中高产率和/或高纯度回收糖苷产物的方法。在各个方面和实施方案中，本公开提供了全细胞生物转化方法，涉及所需底物的糖基化，随后以高产率和/或高纯度回收糖基化产物。
在一方面，本发明提供了一种用于制备糖基化产物的细菌细胞和方法。细菌细胞表达一种或多种用于糖基化所需底物的UGT酶。在一些实施方案中，细菌细胞还表达一种或多种重组蔗糖合酶酶。蔗糖合酶表达可显著增强补给底物的全细胞糖基化(参见图3)。可替代性地或此外，细菌细胞包含增加UDP-糖利用度的一种或多种遗传修饰。细菌细胞在用于糖基化的底物存在下培养，并且糖基化产物任选地使用本文所述的回收方法回收。
对于糖基化反应，全细胞生物转化系统优于无细胞系统，因为细胞提供UDP-葡萄糖辅因子再生。这与依赖于使用来自细胞外溶解或分泌的酶的过程相反，所述过程需要外源性UDP-葡萄糖供应或UDP-葡萄糖前体或UDP-葡萄糖再生机制或UDP-葡萄糖再生酶系统。在本发明的实施方案中，催化(糖基化)是用活细菌细胞进行的，并且U DP-葡萄糖辅因子再循环使用细胞代谢进行，而不需要酶供给或供给昂贵的底物用于UDP-葡萄糖再生。根据本公开可以使用多种细菌种类，包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红杆菌属(R hodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)的物种。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荚膜红杆菌(Rhodobacter cap sulatus)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、运动发酵单胞菌(Zy momonas mobilis)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在示例性实施方案中，细菌细胞是大肠埃希氏菌。
在一些实施方案中，细菌细胞表达重组蔗糖合酶酶。在一些实施方案中，将表达蔗糖合酶酶的细菌细胞在蔗糖存在下培养。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与选自SEQID NO:1至12的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列。如图3所示，细菌细胞中蔗糖合酶的表达显著增强了供给全细胞的底物的糖基化。在各个实施方案中，蔗糖合酶酶包含与选自SEQ ID NO:1至12的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:2具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的S11E或S11D取代。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶在L637(例如，L637M)和T640(例如，T640V、T640L、T640I或T640A)中的一个或多个处包含相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨基酸取代。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含相对于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的S11E或S11D取代。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含相对于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的S11E或S11D取代。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:9具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:10具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:10的氨基酸序列包含S11E或S11D取代。
在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
酶的三维结构和相关活性位点、底物结合位点和其他相互作用位点的位置的知识可有助于衍生物的合理设计，并提供对特定变化的表型的机械洞察力。当高度保守的S11和类似位置被磷酸化时，植物蔗糖合酶酶显示出增加的活性。在一些实施方案中，蔗糖合酶酶包含S11E或S11D突变，其通过在将发现带负电荷的磷酸根的位置放置负电荷来模拟磷酸化。对蔗糖合酶酶的其他修饰可以由可公开获得的结构来指导，诸如Stein O.和GranotD.,An Overview of Sucrose Synthases in Plants,Front Plant Sci.2019；10:95中描述或引用的那些。
可替代性地或此外，细菌细胞包含提高UDP-糖(例如，UDP-葡萄糖)利用度的一种或多种遗传修饰，其如图1、图2和图4中所示增强了用于糖基化所需底物的全细胞生物转化。指数生长的大肠埃希氏菌中的野生型UDP-葡萄糖水平是约2.5mM(Bennett BD,KimballEH,Gao M,Osterhout R,Van dien SJ,Rabinowitz JD.Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli.Nat Chem Biol.2009；5(8):593-9.)。在一些实施方案中，对宿主细胞的遗传修饰被工程化以在指数生长的细胞(例如，不具有UGT酶的重组表达的细胞)中将UDP-葡萄糖增加至例如至少约5mM或至少约10mM。
在一些实施方案中，微生物细胞具有编码消耗UDP-葡萄糖的酶的基因的缺失、失活或活性或表达降低。例如，细菌细胞可以具有ushA(UDP-糖水解酶)和/或galE、galT、galK和galM(其负责从UDP-葡萄糖生物合成UDP-半乳糖)中的一种或多种或其在细菌物种中的直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。在一些实施方案中，galETKM基因失活、缺失或表达或活性显著降低。可替代性地或此外，细菌细胞具有大肠埃希氏菌otsA(海藻糖-6-磷酸合酶)或其在细菌物种中的直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。可替代性地或此外，微生物细胞具有大肠埃希氏菌ugd(UDP-葡萄糖6-脱氢酶)或其在细菌物种中的直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。降低或消除otsA和ugd的活性可分别将UDP-葡萄糖槽除去或还原为海藻糖或UDP-葡萄糖醛酸。
其他可减少或消除的UDP-葡萄糖槽包括消除或降低负责脂质糖基化和LPS生物合成的基因以及负责使十一异戊烯二磷酸(UPP)糖基化的基因的活性或表达。参与使脂质糖基化或LPS生物合成的基因包括大肠埃希氏菌waaG(脂多糖葡糖基转移酶1)大肠埃希氏菌waaO(UDP-D-葡萄糖：(葡糖基)LPSα-1,3-葡糖基转移酶))和大肠埃希氏菌waaJ(UDP-葡萄糖：(葡糖基)LPSα-1,2-葡糖基转移酶))。负责使十一异戊烯二磷酸(UPP)糖基化的基因包括大肠埃希氏菌yfdG(推定的细菌萜醇连接的葡萄糖转位酶)、大肠埃希氏菌yfdH(细菌萜醇葡糖基转移酶)、大肠埃希氏菌yfdI(血清型特异性葡糖基转移酶)和大肠埃希氏菌wcaJ(十一异戊烯-磷酸葡萄糖磷酸转移酶)。一种或多种这些基因产物(或细菌细胞中的相应直系同源物)的缺失、失活或活性或表达的降低可以增加UDP-葡萄糖利用度。
在这些或其他实施方案中，细菌细胞具有编码消耗UDP-葡萄糖前体的酶的基因的缺失、失活或活性或表达降低。例如，在一些实施方案中，细菌细胞具有pgi(葡萄糖-6磷酸盐异构酶)或其在宿主细胞的细菌物种中的直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。
在这些或其他实施方案中，细胞具有一种或多种编码参与将葡萄糖-6-磷酸转化为UDP-葡萄糖的酶的基因的过表达或活性增加。例如，pgm(磷酸葡萄糖变位酶)和/或galU(UTP-葡萄糖-1-磷酸酯尿苷酰转移酶)(或其直系同源物或衍生物)可以被过表达，或被修饰成增加酶生产力。可替代性地或此外，将葡萄糖-6-磷酸盐转化为葡萄糖-1-磷酸盐的大肠埃希氏菌ycjU(β-磷酸葡萄糖变位酶)和将葡萄糖-1-磷酸盐转化为UDP-葡萄糖的两歧双歧杆菌ugpA或这些酶的直系同源物或衍生物可以被过表达或修饰以提高酶生产率。
可替代性地或此外，细菌细胞具有增加葡萄糖转运的一种或多种遗传修饰。此类修饰包括大肠埃希氏菌galP(半乳糖：H+同向转运体)和大肠埃希氏菌glk(葡萄糖激酶)的表达或活性、或替代性地运动发酵单胞菌glf和大肠埃希氏菌glk或这些基因的直系同源物或工程化衍生物的表达增加。
可替代性地或此外，微生物细胞具有增加UTP产生和再循环的一种或多种遗传修饰。此类修饰包括大肠埃希氏菌adk(腺苷酸激酶)或大肠埃希氏菌ndk(核苷二磷酸激酶)或这些酶的直系同源物或工程化衍生物的表达或活性增加。
可替代性地或此外，微生物细胞具有增加UDP产生的一种或多种遗传修饰。此类修饰包括大肠埃希氏菌upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)、大肠埃希氏菌dctA(C4二羧酸盐/乳清酸盐：H+同向转运体)、大肠埃希氏菌pyrE(乳清酸盐磷酸核糖基转移酶)、大肠埃希氏菌pyrF(乳清苷-5'-磷酸盐脱羧酶)、大肠埃希氏菌pyrH(UMP激酶)和大肠埃希氏菌cmk(胞苷酸激酶)(包括它们的直系同源物或工程化衍生物)中的一种或多种的过表达或活性增加。例如，在一些实施方案中，微生物细胞过表达upp、pyrH和cmk或它们的直系同源物或工程化衍生物或具有它们的增加的活性。替代性地，微生物细胞过表达dctA、pyre、pyrH和cmk或它们的直系同源物或工程化衍生物或具有它们的增加的活性。
可替代性地或此外，所述微生物细胞可具有一种或多种遗传修饰以除去或减少对葡萄糖摄取的调控。例如，所述微生物细胞可具有sgrS的缺失、失活或减少的表达，sgrS是大肠埃希氏菌中的小调控RNA。
可替代性地或此外，所述微生物细胞可具有减少葡萄糖-1-磷酸的去磷酸化的一种或多种遗传修饰。示例性修饰包括大肠埃希氏菌agp(葡萄糖-1-磷酸酶)、大肠埃希氏菌yihX(α-D-葡萄糖-1-磷酸盐磷酸酶)、大肠埃希氏菌ybiV(糖磷酸酶)、大肠埃希氏菌yidA(糖磷酸酶)、大肠埃希氏菌yigL(磷酸糖磷酸酶)和大肠埃希氏菌phoA(碱性磷酸酶)中的一种或多种或其在细菌细胞中的直系同源物的缺失、失活或表达或活性降低。
可替代性地或此外，细菌细胞可具有减少葡萄糖-1-磷酸向TDP-葡萄糖转化的一种或多种遗传修饰。示例性修饰包括大肠埃希氏菌rffH(dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶)和大肠埃希氏菌rfbA(dTDP葡萄糖焦磷酸化酶)中的一种或多种或其在细菌细胞中的直系同源物的缺失、失活或表达或活性降低。
可替代性地或此外，细菌细胞可具有减少葡萄糖-1-磷酸向ADP-葡萄糖转化的一种或多种遗传修饰。示例性修饰包括大肠埃希氏菌glgC(葡萄糖-1-磷酸盐腺苷酰转移酶)或其在细菌细胞中直系同源物的缺失、失活或表达或活性降低。
例如，在一些实施方案中，ushA(UDP-糖二磷酸酶)和galETKM或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；大肠埃希氏菌pgm(SEQ ID NO:92)和/或ycjU(SEQ ID NO:94)或直系同源物过表达或与野生型酶相比具有增加的活性的衍生物表达；并且大肠埃希氏菌galU(SEQ IDNO:93)和/或两歧双歧杆菌ugpA(SEQ ID NO:95)或直系同源物或表达与野生型酶相比具有增加的活性的其衍生物过表达。
在细菌菌株过表达大肠埃希氏菌pgm(SEQ ID NO:92)和/或ycjU(SEQ ID NO:94)或直系同源物或表达与野生型酶相比具有增加的活性的衍生物或过表达大肠埃希氏菌galU(SEQ ID NO:93)或表达两歧双歧杆菌ugpA(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物(例如，具有比野生型酶更高的活性)的各种实施方案中，互补基因可包含分别与SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:95至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％相同的氨基酸序列。
例如，在一些实施方案中，细菌细胞包含pgm或其直系同源物或衍生物(例如，具有比野生型酶更高活性的衍生物)，和任选地galU或其直系同源物或衍生物(例如，具有比野生型酶更高活性的衍生物)的过表达。在一些实施方案中，细菌细胞具有ushA或其直系同源物和/或galE、galT、galK和galM或其直系同源物中的一种或多种的缺失、失活或活性或表达降低。例如，galETKM基因或其直系同源物可失活、缺失或表达或活性降低。在一些实施方案中，pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低。
可替代性地或此外，细菌细胞具有otsA(海藻糖-6-磷酸合酶)或其直系同源物和/或otsB(海藻糖-磷酸磷酸酶)或其直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。
可替代性地或此外，细菌细胞具有以下一种或多种的缺失、失活或活性或表达降低：ugd(UDP-葡萄糖6-脱氢酶)或其直系同源物；rfaQ-G-P-S-B-I-J或其直系同源物；yfdG-H-I或其直系同源物；wcaJ或其直系同源物；以及glgC或其直系同源物。
在示例性实施方案中，细菌细胞具有大肠埃希氏菌ycjU(β-磷酸葡萄糖变位酶)(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物、两歧双歧杆菌ugpA(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物、大肠埃希氏菌adk(腺苷酸激酶)(SEQID NO:96)或其直系同源物或衍生物、大肠埃希氏菌ndk(核苷二磷酸激酶)(SEQ ID NO:97)或其直系同源物或衍生物和大肠埃希氏菌cmk(胞苷一磷酸激酶)(SEQ ID NO:98)或其直系同源物或衍生物中的一种或多种的过表达或活性或表达增加。在各个实施方案中，衍生酶可以被工程化以具有比野生型酶更高的酶活性。互补基因可包含分别与SEQ ID NO:94、SEQID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:98至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％相同的氨基酸序列。
US2020/0087692中描述了对细菌细胞进行其他修饰以提高UDP-糖利用度，该文献全文据此以引用方式并入。
在各个实施方案中，用于糖基化的底物作为植物提取物或其级分提供，或合成地或通过生物合成方法产生。示例性底物包括各种次级代谢物，诸如选自萜类或萜类糖苷、类黄酮或类黄酮糖苷、聚酮类或聚酮类糖苷、芪类或芪类糖苷，以及多酚或多酚糖苷的那些。可以对植物提取物进行分级以其他方式富集所需底物。
在一些实施方案中，底物包含萜类和/或萜类糖苷，诸如甜菊醇或甜菊醇糖苷，或罗汉果醇或罗汉果醇糖苷(“罗汉果苷”)。在一些实施方案中，底物主要具有0至约4个糖基，并且其可包括葡糖基、半乳糖基、甘露糖基、木糖基和/或鼠李糖基。在各个实施方案中，糖基主要是葡糖基。在全细胞生物转化之后，在各个实施方案中，糖基化产物将具有至少四个、至少五个、至少六个或至少七个糖基(例如，葡糖基)。在各个实施方案中，全细胞生物转化涉及细菌细胞对底物的至少两个糖基化反应。在一些实施方案中，全细胞生物转化导致底物的单一糖基化或去糖基化(在由UGT催化的逆反应的情况下)。
在各个实施方案中，底物以甜叶菊叶子提取物或其级分的形式提供，该甜叶菊叶子提取物或其级分可以富含目标底物。例如，甜叶菊叶子提取物可包含或富集甜菊醇、甜菊苷、甜菊醇二糖苷、莱鲍迪苷A、杜尔可苷A、杜尔可苷B、莱鲍迪苷C和莱鲍迪苷F中的一种或多种。在一些实施方案中，提取物或其级分中至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％的甜菊醇糖苷包括甜菊苷、甜菊醇二糖苷和莱鲍迪苷A中的一种或多种。
可以选择UGT酶以及相关底物(包括富含所需底物的植物提取物级分)以产生所需糖基化产物。在一些实施方案中，至少一种UGT酶包含与SEQ ID NO:13至84和99中的任一个具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列。在各个实施方案中，至少一种UGT酶包含与SEQID NO:13至84和99中的任一个具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。根据本公开的实施方案，UGT酶在没有分泌或转运信号的情况下表达，并且不包含膜锚定结构域。
酶的三维结构和相关活性位点、底物结合位点和其他相互作用位点的位置的知识可有助于衍生物的合理设计，并提供对特定变化的表型的机械洞察力。植物UGT具有高度保守的二级和三级结构，同时具有相对低的氨基酸序列同一性。Osmani等人，Substrate specificity of plant UDP-dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling,Phytochemistry 70(2009)325–347。UGT的糖受体和糖供体底物被容纳在N-和C-末端结构域之间形成的裂缝中。一级序列的几个区域有助于形成底物结合袋，其包括结构上保守的结构域以及在氨基酸序列和序列长度方面都不同的环区。
在一些实施方案中，底物是萜类糖苷，并且在一些实施方案中可以包含甜菊醇糖苷或罗汉果苷。本文描述了对萜类或萜类糖苷支架具有糖基转移酶活性的多种UGT酶，包括由SEQ ID NO:13至39、46、54、60、71至84和99定义的UGT酶。参见表1、表8和表9。
例如，在一些实施方案中，糖基化产物是莱鲍迪苷(甜菊醇糖苷)。在这些实施方案中，UGT酶能够在甜菊醇核心的C13和/或C19羟基处进行一个或多个伯糖基化；C13和/或C19伯糖基的1-2分支糖基化；以及C13和/或C19伯糖基的1-3分支糖基化。参见图21。在一些实施方案中，UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至32和84之一具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％序列同一性)的氨基酸序列的酶。
用于甜菊醇和甜菊醇糖苷糖基化(包括用于RebM的生物合成)的UGT酶在US2017/0332673和2020/0087692中进行了公开，该文献全文据此以引用方式并入。示例性UGT酶列于下表1中：
表1：用于甜菊醇糖苷产生的示例性UGT酶
在一些实施方案中，糖基化产物是罗汉果苷。在各个实施方案中，UGT酶能够在罗汉果醇核心的C3和/或C24羟基处进行一个或多个伯糖基化，C3和/或C24伯糖基的1-2分支糖基化；和/或C3和/或C24伯糖基的1-6分支糖基化。可用于这些实施方案的UGT酶如表8和表9所示。在一些实施方案中，UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至17、29、33至39、46、54、60、71至80和82至84之一具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％序列同一性)的氨基酸序列的酶。
对酶的氨基酸序列的变化可改变其活性或没有可测量的影响。没有可测量的影响的沉默变化通常是保守性取代以及远离活性位点和底物结合位点的溶剂暴露表面上的小插入或缺失。相比之下，酶活性更可能受到非保守取代、大的插入或缺失以及活性位点、底物结合位点以及对于蛋白质折叠或构象重要的掩埋位置处的变化的影响。改变酶促活性的变化可增加或减少反应速率或者增加或减少对特定底物的亲和力或特异性。例如，使底物结合位点尺寸增加的变化可允许酶作用于更大的底物，并且将催化氨基酸侧链定位成更靠近底物上的靶位点的变化可增加酶促速率。
在一些实施方案中，在构建酶中的特定突变时涉及“合理的设计”。合理设计是指将酶或相关酶的知识(诸如其反应热力学和动力学、其三维结构、其活性位点、其底物和/或酶与底物之间的相互作用)纳入特定突变的设计中。基于合理的设计方法，能在酶中产生突变，然后能针对相对于对照水平萜烯或萜类的产量提高进行筛选。在一些实施方案中，能基于同源建模合理地设计突变。如本文所用，“同源建模”是指根据一种蛋白质的氨基酸序列和相关同源蛋白质的三维结构来构建该蛋白质的原子分辨率模型的过程。
氨基酸序列的同一性，即序列同一性百分比，可经由序列比对来测定。此类比对可以用数种已知的算法，诸如Karlin及Altschul所描述的算法(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)，用hmmalign(HMMER包)，或者用CLUSTAL算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22,4673-80)进行。可以使用如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算序列同一性(序列匹配)等级。将相似算法并入到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST蛋白比对可用BLASTP程序，评分＝50，词长＝3进行。为了获得有空位的比对以进行比较，如Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402中所述的那样来利用GappedBLAST。在利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各个程序的默认参数。
UGT酶或其他表达的酶可以整合到微生物细胞的染色体中，或者替代性地在染色体外表达。例如，UGT酶可从细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)表达。
一种或多种UGT酶(或其他表达的酶)的氨基酸序列可任选地包括在位置2处插入或取代的丙氨酸以减少细胞中的更新。在各个实施方案中，一种或多种UGT酶包含在位置2插入或取代的丙氨酸氨基酸残基，以在体内提供额外的稳定性。
可以使用例如基因模块(例如，操纵子)或酶的独立表达来调节酶的表达以获得最佳活性。例如，基因或操纵子的表达可以通过选择具有不同强度(例如强、中或弱)的启动子诸如诱导型启动子或组成型启动子来调控。具有不同强度的启动子的几个非限制性示例包括Trc、T5和T7。另外，可以通过操纵细胞中基因或操纵子的拷贝数来调控基因或操纵子的表达。在一些实施方案中，所述细胞表达每种UGT酶的单个拷贝。在一些实施方案中，可以通过操纵模块内基因的顺序来调节基因或操纵子的表达，其中先转录的基因一般以更高的水平表达。在一些实施方案中，通过将一个或多个基因或操纵子整合到染色体中来调节基因或操纵子的表达。
通过选择合适的启动子和核糖体结合位点也可以实现表达的优化。在一些实施方案中，这可以包括选择高拷贝数的质粒，或单拷贝数、低拷贝数或中拷贝数的质粒。通过引入或消除诸如茎环之类的结构，也可以靶向转录终止的步骤进行基因表达的调控。
含有所有表达必需元件的表达载体可商购获得并且是本领域技术人员所知的。参见，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989。通过将异源DNA引入细胞中对细胞进行遗传工程改造。异源DNA置于转录元件的可操作控制下，以容许异源DNA在宿主细胞中表达。
在一些实施方案中，内源基因受到编辑，这与基因互补相反。编辑可以修饰内源启动子、核糖体结合序列或其他表达控制序列，且/或在一些实施方案中，修饰基因调控中的反式作用因子和/或顺式作用因子。基因组编辑可以使用CRISPR/Cas基因组编辑技术，或采用锌指核酸酶和TALEN的类似技术进行。在一些实施方案中，通过同源重组置换内源基因。
在一些实施方案中，至少部分地通过控制基因拷贝数使基因过表达。虽然可以使用具有不同拷贝数的质粒方便地控制基因拷贝数，但是也可以采用基因复制和染色体整合。例如，US2011/0236927中描述了遗传稳定性串联基因复制的方法，所述专利特此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，糖基化产物包含RebM。在这些实施方案中，UGT酶能够在甜菊醇核心的C13和C19羟基处进行伯糖基化；C13和C19伯糖基的1-2分支糖基化；和C13和C19伯糖基的1-3分支糖基化。参见图21。在一些实施方案中，UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至32和84之一具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％序列同一性)的氨基酸序列的酶。在此类实施方案中，根据本公开回收的糖基化产物相对于总甜菊醇糖苷组分为至少约50％RebM、或至少约75％RebM、或至少约85％RebM、或至少约90％RebM、或至少约95％RebM。
在一些实施方案中，糖基化产物包含RebE和/或RebD。在此类实施方案中，细菌细胞可以表达能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-2糖基化的一种或多种UGT酶。在一些实施方案中，用于糖基化的底物包含RebA和甜菊苷作为主要组分(例如，底物的甜菊醇糖苷组合物的至少约20％、或至少约30％、或至少约50％、或至少约70％)。在一些实施方案中，UGT酶选自与SEQ ID NO:13至16和26至29之一具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％序列同一性)的酶。在此类实施方案中，根据本公开回收的糖基化产物相对于总甜菊醇糖苷组分为至少约50％RebE和/或RebD、或至少约75％RebE和/或RebD、或至少约85％RebE和/或RebD、或至少约90％RebE和/或RebD、或至少约95％RebE和/或RebD。
在一些实施方案中，糖基化产物包含RebB。在此类实施方案中，细菌细胞表达能够使甜菊醇C19伯糖基去糖基化的一种或多种UGT酶。在一些实施方案中，用于糖基化的底物包含RebA作为主要组分(例如，底物的莱鲍迪苷组合物的至少约20％、或至少约30％、或至少约50％、或至少约70％)。在一些实施方案中，UGT酶选自与SEQ ID NO:18、30、31和99之一具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％序列同一性)的酶。在一些实施方案中，细菌细胞表达与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:99具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％序列同一性)的UGT酶。在此类实施方案中，根据本公开回收的糖基化产物相对于总甜菊醇糖苷组分为至少约50％RebB、或至少约75％RebB、或至少约85％RebB、或至少约90％RebB、或至少约95％RebB。
在一些实施方案中，糖基化产物包含RebI。在此类实施方案中，细菌细胞表达能够对甜菊醇C19伯糖基进行1-3糖基化的一种或多种UGT酶。在一些实施方案中，用于糖基化的底物包含RebA作为主要组分(例如，底物的甜菊醇糖苷组合物的至少约20％、或至少约30％、或至少约50％、或至少约70％、或至少约80％)。在一些实施方案中，UGT酶选自与SEQID NO:19至25之一具有至少约70％(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％)序列同一性的酶。在此类实施方案中，根据本公开回收的糖基化产物相对于总甜菊醇糖苷组分为至少约50％RebI、或至少约75％RebI、或至少约85％RebI、或至少约90％RebI、或至少约95％RebI。
在一些实施方案中，底物以罗汉果提取物或其级分，或生物合成产生的罗汉果醇或罗汉果醇糖苷的形式提供。例如，底物可以包含选自以下的一种或多种底物：罗汉果醇、mog.I-A、mog.I-E、mog.II-A、mog.II-E、mog III、mog IVA、mog.IV和赛门苷。糖基化产物可以包含例如以下中的一种或多种：mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI、isomog.V和赛门苷。参见图18。在各个实施方案中，UGT酶能够在罗汉果醇核心的C3和/或C24羟基处进行一个或多个伯糖基化，以及C3和/或C24伯糖基的1-2分支糖基化；和C3和/或C24伯糖基的1-6分支糖基化。在一些实施方案中，糖基化产物是mog.V或赛门苷。在各个实施方案中，UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至17、29、33至39、46、54、60、71至80和82至84之一具有至少约70％(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约97％)序列同一性的氨基酸序列的酶。参见表8和表9。在各个实施方案中，该方法导致至少约40％的底物转化为糖基化产物、或至少约50％的底物转化为糖基化产物、或至少约75％的底物转化为糖基化产物、或至少约90％的底物转化为糖基化产物、或至少约95％的底物转化为糖基化产物(相对于回收的组合物的总罗汉果醇糖苷组分)。
在各个实施方案中，细菌细胞生物质通过在复合或基本培养基中生长而产生。然后在用于糖基化的底物存在下用一种或多种碳源培养细菌细胞。在一些实施方案中，碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油中的一种或多种。在一些实施方案中，碳源包括蔗糖，以及甘油和葡萄糖中的一种或多种。通常，合适的碳源包括C1至C6碳源。培养条件可以选自需氧、微需氧和厌氧。培养可以分批、连续或半连续方法进行。例如，在一些实施方案中，该方法作为分批进料方法进行。
在一些实施方案中，将底物与细菌细胞一起孵育约72小时或更短时间、或约48小时或更短时间。在某些实施方案中，使用例如搅拌槽发酵罐将底物与细菌细胞一起孵育1至约3天。在各个实施方案中，如本文别处所述回收糖苷产物。例如，回收可以包括以下中的一个或多个：将培养物的pH降低至低于约pH 5或将pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，以及添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
在其他方面和实施方案中，本发明提供了一种工程化UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其对糖基化底物具有高生产率，包括萜类糖苷底物，并且包括与本文所述的细菌细胞和方法相关的。在一些实施方案中，工程化UGT酶包含与SEQ ID NO:13具有至少约70％序列同一性(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％序列同一性)并且具有提高对萜类糖苷底物(例如，甜菊醇糖苷底物)的糖基化活性的一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:13，氨基酸修饰包含选自以下的一个或多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸取代：V397S、V397C、G5N、S20E、S23D、R45Y、H59P、G94S、K97E、M150L、I185F、A206P、G210E、Q237R、M250K、A251E、C252L、G259E、Q263Y、I287M、C288F、V336I、F338L、D351E、F186I、F186M、F186T、L418F、A451T、A451L、T453K、T453R、V456S、V456W、V456T、V456M。参见表2。可替代性地或此外，氨基酸修饰包括用主要由甘氨酸和丝氨酸氨基酸组成的五至十五个氨基酸对SEQ ID NO:13的残基270至281的取代。可替代性地或此外，氨基酸修饰包括在相对于SEQ ID NO:13的位置3处插入一个或两个氨基酸，和/或在SEQ ID NO:13的C-末端添加一个氨基酸。
在一些实施方案中，UGT酶具有用序列GGSGGS(SEQ ID NO:85)对SEQ ID NO:13的氨基酸270至281的取代。在这些或其他实施方案中，UGT酶相对于SEQ ID NO:13在位置3处插入Arg，或在位置2和3之间插入Ile-Arg。在这些或其他实施方案中，UGT酶相对于SEQ IDNO:13包含选自G5N、F186T和V397S的一个或多个(或全部)取代。该方面的示例性UGT酶包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。参见图5。
在其他实施方案中，UGT酶包含与SEQ ID NO:14具有至少约70％(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％)序列同一性并且具有提高对萜类糖苷底物(例如，甜菊醇糖苷底物)的糖基化活性的一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。例如，相对于SEQ ID NO:14，氨基酸修饰可以包含选自以下的一个或多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸取代：V395A、Q263Y、D269R、K97E、Q262E、H59P、G259E、M150L、Y267H、T3R、V95Q、A238E、S308Q、Q237R、R45Y、E254D、L203I、S151R、S123D、D351E、T453M、G94T、T186M、V336I、L58S、F338L、F51W、C252L、M250D、A251E、C252V、A79P、W401F、S323A、A251E、A130D、S42E、H400Y、S266R、S23D、P56A、A206P、M250K、A143W、V456T、G94S、I427F、T186I、T453F、C252R、V38F、R45F、T37S、Q244K、L11I、I287M、V31P、T43D和P39T。参见表3。可替代性地或此外，氨基酸修饰包括缺失SEQ ID NO:14的残基270至281，接头具有五至十五个氨基酸并且主要由甘氨酸和丝氨酸氨基酸组成。可替代性地或此外，UGT酶包括在相对于SEQ ID NO:14的位置3处插入一个或两个氨基酸，和/或在SEQ ID NO:14的C-末端添加一个氨基酸。
在一些实施方案中，UGT酶具有用主要由Ser和Gly组成的6至12个氨基酸的接头序列对SEQ ID NO:14的氨基酸270至281的取代。在这些或其他实施方案中，相对于SEQ IDNO:14，UGT酶包含选自H59P、A238E和L417F的一个或多个取代(或全部取代)。在这些或其他实施方案中，UGT酶包含在SEQ ID NO:14的A2和T3之间的插入或Arg-Arg。根据这些实施方案的示例性UGT酶包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。参见图9。
在其他实施方案中，UGT酶包含与SEQ ID NO:15具有至少约70％(或至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％)序列同一性并且具有提高对萜类糖苷底物(例如，甜菊醇糖苷底物)的糖基化活性的一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。相对于SEQ ID NO:15，此类氨基酸取代可以在选自125、152、153和442的位置。在一些实施方案中，UGT酶相对于SEQ ID NO:15包含选自M152A、S153A、P442D和S125V的一个或多个(或全部)氨基酸取代。参见表4。根据这些实施方案的示例性UGT酶包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。参见图7。
在其他方面和实施方案中，本发明提供了用于糖基化罗汉果醇或罗汉果醇糖苷底物的UGT酶(包括表达其的细菌细胞)。在这些实施方案中，该方法包括在UDP-糖(例如，UDP-葡萄糖)存在下使底物与UGT酶接触。UGT酶可包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％(或至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％)序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:79。参见表8和表9。
在各个实施方案中，使底物与包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％(或至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％)序列同一性的氨基酸序列的UGT酶接触：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:13。
在这些实施方案中，罗汉果醇或罗汉果醇糖苷底物可以作为植物提取物或其级分提供，诸如罗汉果提取物或其级分。例如，底物可以包含(或富集)选自以下的一种或多种底物：罗汉果醇、mog.I-A、mog.I-E、mog.II-A、mog.II-E、mog III、mog IVA、mog.IV和赛门苷。在这些实施方案中，糖基化产物可以包含以下中的一种或多种：mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI、isomog V和赛门苷。例如，UGT酶可能能够在罗汉果醇核心的C3和/或C24羟基处进行一个或多个伯糖基化，和/或C3和/或C24伯糖基的1-2和/或1-6分支糖基化。根据这些实施方案的示例性产物是mog.V。可以制备其他罗汉果苷产物(包括mog.IV、mog.VI和赛门苷)，并且可以根据它们的糖基化活性选择UGT酶。
在一些关于生产罗汉果醇糖苷的实施方案中，将底物与表达UGT酶的微生物细胞一起培养。示例性微生物细胞包括细菌细胞，诸如埃希氏菌属、芽孢杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属或假单胞菌属的物种。示例性细菌细胞包括大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红杆菌、球形红杆菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠埃希氏菌。在各个实施方案中，细菌细胞被工程化用于如本文所述的全细胞生物转化方法，例如，具有如本文别处所述的增加UDP-糖利用度和/或表达蔗糖合酶的一种或多种遗传修饰。
在其他实施方案中，微生物细胞是酵母细胞，其可以选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或耶氏酵母属(Yarrowia)的物种，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
然而，在其他实施方案中，根据已知技术将底物用包含UGT酶的细胞裂解物孵育，或用纯化的重组UGT酶孵育。可以外源添加支持糖基化反应的UDP-糖。
在各个实施方案中，糖基化产物根据下述方法回收。此类方法可以包括以下中的一个或多个：将反应或培养物的pH降低至低于约pH5或将反应或培养物的pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，以及添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
在一些方面，本发明提供了一种用于产生和回收糖苷产物的方法。在此类实施方案中，该方法包括通过在无细胞反应中或在微生物培养物中酶促转移一个或多个糖部分将用于糖基化的底物转化为目标糖苷产物，其可任选地采用本文所述的方法、UGT酶和/或细菌细胞。该方法还包括从该反应或培养物中回收糖苷产物，其中回收包括以下中的一个或多个：将反应或培养物的pH降低至低于约pH 5，将反应或培养物的pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，以及添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
传统上，生物质去除是回收中的第一步，以去除大的细胞碎片，并避免进一步破坏将使下游纯化复杂化的细胞。然而，根据本发明的一些实施方案，培养材料将是高度粘稠的并且难以处理。例如，通过离心去除生物质的效率可能会受到收获的培养材料的物理性质的限制。通过在去除生物质或酶之前如本文所述处理培养材料，可以产生具有所需品质的产物，包括：糖苷产物的高纯度、白色、容易溶解、无味和高回收率。具体地，培养物的初始pH和温度调节可以改变发酵液的流体特性，并提高圆盘堆叠式分离器去除生物质的效率。此外，通过调节pH和温度可显著提高糖苷产物的溶解度和产率，这避免了固相中糖苷产物的显著损失。
在各个实施方案中，糖基化产物是萜类糖苷，诸如RebM、RebE、RebD、RebB和RebI中的一种或多种(例如，如本文所讨论的)。在一些实施方案中，糖基化产物是RebM。在其他实施方案中，糖基化产物包括以下中的一种或更多种：mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI、isomog.V和赛门苷(如本文所述)。示例性罗汉果苷产物是mog.V。
在一些实施方案中，酶促转移发生在微生物培养物中，其中微生物培养物包含表达一种或多种UGT酶的微生物菌株(例如，使用进料底物的全细胞生物转化)。在其他实施方案中，微生物菌株还表达产生用于糖基化的底物(例如，甜菊醇或罗汉果醇)的生物合成途径，并表达用于糖基化底物的一种或多种UGT酶。参见例如美国专利10,463,062和WO 2019/169027，这两篇文献全文据此以引用方式并入。在各个实施方案中，酶促转移通过酵母菌株的微生物培养进行，诸如选自酵母属、毕赤酵母属或耶氏酵母属的那些，包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和解脂耶氏酵母。在其他实施方案中，酶促转移通过如本文所述的细菌细胞的微生物培养进行，包括在一些实施方案中被工程化用于全细胞生物转化的大肠埃希氏菌细胞(例如，表达一种或多种蔗糖合酶酶，和/或包含一种或多种提高UDP-糖利用度的遗传修饰，如所述)。例如，细菌细胞可以包含遗传修饰，例如，其中：ushA和galETKM或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；pgi或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；大肠埃希氏菌pgm(SEQ ID NO:92)和/或ycjU(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物(例如，具有比野生型酶更高活性的衍生物)过表达；和/或大肠埃希氏菌galU(SEQ ID NO:93)和/或两歧双歧杆菌ugpA(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物(例如，具有比野生型酶更高活性的衍生物)过表达。
在一些实施方案中，酶促转移发生在具有至少约10,000L、或至少约50,000L、或至少约100,000L、或至少约150,000L、或至少约200,000L、或至少约500,000L的体积的生物反应器中。在各个实施方案中，可以分批、连续或半连续方式收获培养材料用于糖苷回收。
在一些实施方案中，将收获的培养材料的pH调节至例如约2至约5范围内的pH。在一些实施方案中，将pH调节至约2至约4范围内的pH、或约2至约3.5的pH、或约2.5至约4范围内的pH。在一些实施方案中，将pH调节至约2.5、约3.0或约3.5。在其他实施方案中，将pH调节至碱性pH范围，诸如在约9至约12的范围内、或在约9.5至约12或约10至约12(例如，约11、约11.5或约12)的范围内的pH。在各个实施方案中，pH调节提高了糖苷溶解度和/或提高了收获材料的物理性质，使得更容易除去生物质和/或酶而不会大量损失产物。根据已知方法，可以通过添加或滴定有机酸或无机酸或氢氧根离子来调节pH。
可替代性地或此外，将收获的培养材料的温度调节至介于约50℃和约90℃之间的温度，诸如约50℃至约80℃。例如，在一些实施方案中，将温度调节至约55℃至约75℃范围内的温度，或约65℃至约75℃范围内的温度。在一些实施方案中，将温度调节至约70℃。在各个实施方案中，温度调节提高了糖苷溶解度和/或提高了收获材料的物理性质，使得更容易除去生物质和/或酶而不会大量损失产物。在一些实施方案中，通过将反应介质或培养物转移至预热的收获罐来进行温度调节。在一些实施方案中，温度调节在线进行，例如，通过在到达下一个单元操作的途中通过保持回路。
在一些实施方案中，将收获的反应或培养基从反应罐转移至收获罐用于pH和/或温度调节，这可以在相同的收获罐中或在不同的收获罐中进行。在一些实施方案中，pH和/或温度调节作为连续单元操作在线进行。温度和pH调节可以以任何顺序或同时进行。在一些实施方案中，pH调节在温度调节之前进行。在其他实施方案中，温度调节在pH调节之前进行。在其他实施方案中，pH调节和温度调节基本上同时进行。
可替代性地或此外，该方法包括添加一种或多种糖苷增溶剂。示例性增溶剂包括具有醇官能团的化学试剂(包括有机酸和聚合物)和/或极性试剂(包括具有醚、酯、醛和酮官能团的那些)，并且包括但不限于甘油、1,3-丙二醇、聚乙烯醇、聚乙二醇等。其他示例性增溶剂包括有机酸、糖类和多糖。US2020/0268026中描述了其他增溶剂，该文献全文据此以引用方式并入。糖苷溶解度的提高有利于生物质和/或酶的去除而不会大量损失产物。通常，增溶剂可以以约0.1重量％至约2重量％的范围，诸如以约0.1重量％至约1重量％(例如，约0.5重量％)的范围添加到收获的培养材料中。
随后，通过离心除去生物质和/或酶，从而制备澄清的发酵液。用于生物质去除的示例性方法采用圆盘堆叠式离心机来分离液相和固相。回收澄清的发酵液(液相)用于进一步处理以纯化糖苷产物。分离的生物质(固相)可以被再处理用于进一步的糖苷产物回收，或者替代性地作为废物处理。
在一些实施方案中，糖苷从澄清的发酵液中结晶。在一些实施方案中，该方法包括1、2或3个结晶步骤。在一些实施方案中，使用选自过滤、离子交换、活性炭、膨润土、亲和色谱和消化的一种或多种方法从澄清的发酵液中纯化糖苷产物，该一种或多种方法可以任选地在结晶之前和/或在重结晶之前进行。可以选择这些方法以实现高产物纯度、有吸引力的颜色(在RebM的情况下是白色)、容易溶解、无味和高回收率。在一些实施方案中，该方法采用亲和色谱，诸如使用苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂和疏水相互作用树脂中的一种或多种。在其他实施方案中，该方法采用如美国专利10,213,707中所述的模拟移动床色谱法，该专利全文据此以引用方式并入。在其他实施方案中，回收方法是非色谱法的(即，没有色谱法步骤)，提供了显著的成本优势。例如，生物质去除后的回收方法可以基本上由过滤和结晶步骤组成，或由过滤和结晶步骤组成。在一些实施方案中，回收方法使用有机溶剂(例如，乙醇)，但在其他实施方案中，该方法完全使用水性溶剂。在一些实施方案中，采用两个结晶步骤。
在一些实施方案中，回收方法将包括一个或多个切向流过滤(TFF)步骤。例如，具有孔径为约5kD的过滤器的TFF可以除去内毒素、大蛋白质和其他细胞碎片，同时还提高最终粉末产品的溶解度。在一些实施方案中，在初始结晶之前，通过切向流过滤纯化糖苷产物，任选地具有约5kD的膜孔径。还可以在下游采用具有孔径为约0.5kD的过滤器的TFF以除去小分子杂质和盐，和/或浓缩母液以进行重结晶。在一些实施方案中，在重结晶之前使用孔径为约0.5kD的TFF。
在每种情况下，结晶步骤可以包括静态结晶、搅拌结晶和蒸发结晶的一个或多个阶段。例如，结晶步骤可以包括静态阶段，然后是搅拌阶段，以控制晶体形态。静态阶段可以生长具有高度晶畴的大晶体。结晶过程可以包括接种晶体，或者在一些实施方案中，不涉及接种晶体(即，晶体自发形成)。在各个实施方案中，结晶溶剂包含水或水/乙醇。示例性结晶溶剂包含水，任选地具有按体积计约5％至约50％的乙醇，或按体积计约25％至约50％的乙醇(例如，按体积计约30％至约40％的乙醇)。在一些实施方案中，在静止阶段期间接种晶体后，搅拌阶段将快速生长晶体，并增加非晶域的程度。使用该方法，所得晶体可以具有更好的最终溶解度和高纯度的糖苷产物，并且可以更容易回收和洗涤。
在各个实施方案中，在重结晶之前，将糖苷产物再溶解于溶剂(诸如但不限于水和/或乙醇)中，其可以采用以下中的一个或多个：将溶剂和糖苷产物溶液或悬浮液的pH降低至低于约pH 5或将溶液或悬浮液的pH升高至高于约pH 9，加热至至少约50℃，并添加一种或多种糖苷增溶剂。pH、温度、糖苷增溶剂浓度的目标值可以替代性地用于生物质去除。例如，可以将糖苷产物溶液或悬浮液的pH调节在约2至约5的范围内。在其他实施方案中，将pH调节至碱性pH范围，诸如在约9至约12范围内，或在约9.5或约10至约12范围内的pH。根据已知方法，可以通过添加或滴定有机酸或无机酸或氢氧根离子来调节pH。在其他实施方案中，重结晶在约4至约12的pH处进行。可替代性地或此外，将溶液或悬浮液的温度调节至介于约50℃和约90℃之间的温度，诸如约50℃至约80℃。示例性重结晶溶剂包含水，任选地具有按体积计约5％至约50％的乙醇，或按体积计约25％至约50％的乙醇(例如，按体积计约30％至约40％的乙醇)。可替代性地或此外，增溶剂可以以约0.1重量％至约2重量％的范围，诸如以约0.1重量％至约1重量％(例如，约0.5重量％)的范围添加到溶液/悬浮液中，如所述。示例性增溶剂包括甘油。
在一些实施方案中，在结晶之后，例如使用篮式离心机或带式过滤器分离所得晶体，从而分离出糖苷湿滤饼(例如，甜菊醇糖苷或罗汉果醇糖苷湿滤饼)。在篮式离心机步骤中的洗涤可以采用用水洗涤，或者可以替代性地采用其他冲洗(例如，冷水/乙醇)。在一些实施方案中，将滤饼溶解并重结晶。然后可以将来自重结晶的湿滤饼干燥，任选地使用带式干燥器、桨式干燥器或喷雾干燥器。可以将干燥的滤饼研磨并包装。
在重结晶之前，可以过滤糖苷溶液(例如，RebM和其他甜菊醇糖苷)以除去杂质。在一些实施方案中，过滤器可以是约0.2微米的过滤器。替代性地，可以采用其他孔径，诸如约0.45微米过滤器和约1.2微米过滤器。根据实施方案，可以选择过滤器的材料以进一步除去杂质，诸如通过吸附。例如，亲水性材料诸如聚醚砜(PES)与疏水性更强的材料诸如聚丙烯相比具有显著的优点。其他示例性亲水性填料材料包括尼龙、醋酸纤维素、硝酸纤维素以及通常被官能化以产生亲水性材料的疏水性材料(诸如涂覆有氟代烷基封端的聚乙二醇的PTFE或PVDF)。
在各个实施方案中，回收方法产生高纯度的目标糖苷组合物。例如，在一些实施方案中，目标糖苷产物为回收的组合物的至少约75重量％。在一些实施方案中，目标糖苷产物为回收的组合物的至少约80重量％、或至少约90重量％、或至少约95重量％。在示例性实施方案中，糖基化产物的产量为每升培养物或反应至少约25克产物(g/L)、或至少约50g/L、或至少约75g/L、或至少约100g/L、或至少约125g/L、或至少约150g/L、或至少约200g/L。
在一些方面，本发明提供了用于制备包含糖基化产物的产物的方法，该糖基化产物诸如甜菊醇糖苷或罗汉果醇糖苷(例如，RebM或mog.V)。该方法包括将糖苷产物(根据本公开内容产生的)掺入产品中，诸如食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂、调味剂或其他产品。根据本发明制备的纯化糖苷可用于多种产品，包括但不限于食品、饮料、质构化剂(例如，淀粉、纤维、树胶、脂肪和脂肪模拟物以及乳化剂)、药物组合物、烟草产品、营养食品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。可以组合使用糖苷的调味剂的非限制性示例包括酸橙、柠檬、橙子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、苦杏仁、可乐、肉桂、糖、棉花糖和香草调味剂。其他食品成分的非限制性示例包括风味剂、酸化剂和氨基酸、着色剂、增量剂、改性淀粉、树胶、调质剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂和胶凝剂。
在一些方面，本发明提供了用于制备包含多种高强度甜味剂的甜味剂产品的方法，所述多种甜味剂包括以下中的两种或更多种：甜菊醇糖苷(例如，RebM、RebE、RebD、RebI或RebB)、罗汉果苷(例如，mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI或isomog.V)、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜、爱德万甜、乙酰磺胺酸钾、糖精、糖醇(例如，赤藓糖醇或木糖醇)、塔格糖、环己氨基磺酸盐、新橙皮苷二氢查耳酮、gnetifolin E和/或白皮杉醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。该方法可进一步包括将甜味剂产品掺入到食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂、调味剂或包括上述那些产品在内的其他产品中。
靶糖苷，诸如RebM或mog.V，以及包含它们的甜味剂组合物，可以与各种生理活性物质或功能成分组合使用。功能成分通常分为以下几类诸如：类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养品、类黄酮、异硫氰酸酯、酚、植物固醇和甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)；多元醇；益生元、益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白质；维生素；和矿物质。功能成分也可以基于其健康益处(诸如心血管、降胆固醇和抗炎益处)进行分类。
此外，目标糖苷，诸如RebM和mog.V，以及根据本发明获得的甜味剂组合物，可以用作高强度甜味剂以生产具有改善味道特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病饮料和食品。它也可以用于其中不能使用糖的饮料、食料、药品和其他产品中。此外，甜味剂组合物不仅可以用作饮料、食品和其他专供人消费的产品的甜味剂，而且可以用于具有改进特性的动物饲料和草料中。
可以使用目标糖苷和甜味剂组合物的产品的示例包括但不限于酒精饮料诸如伏特加、葡萄酒、啤酒、白酒和清酒等；天然果汁；提神饮料；碳酸软饮料；减肥饮料；零卡路里饮料；低热量饮料和食品；酸奶饮料；速溶果汁；速溶咖啡；粉末状速溶饮料；罐装产品；糖浆；发酵豆酱；酱油；醋；敷料；蛋黄酱；番茄酱；咖喱；汤；即食肉汤；酱油粉；醋粉；各种类型的饼干；米饼；苏打饼；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；腌制水果和蔬菜；鲜奶油；果酱；柑橘酱；花糊；奶粉；冰淇淋；果汁冰糕；瓶装蔬菜和水果；罐装煮豆；肉类和用甜酱汁煮的食物；农业蔬菜食品；海鲜；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼酱；油炸鱼制品；干燥海鲜产品；冷冻食品；腌制海藻；腊肉；烟草；医药产品；以及许多其他。
在产品诸如食品、饮料、药品、化妆品、餐桌用品和口香糖的制造过程中，可以使用常规方法诸如混合、揉捏、溶解、腌制、渗透、渗滤、喷洒、雾化、浸泡和其他方法。
如本文所用，术语“约”意指相关数值的±10％。
本发明的其他方面和实施方案将从以下实施例中显而易见。
实施例
实施例1：生物转化基础菌株工程化
使用表达UGT酶的工程化大肠埃希氏菌菌株对甜菊醇糖苷中间体的生物转化(糖基化)在US2020/0087692中进行了描述，该文献据此以引用方式并入。US2020/0087692描述了细菌遗传修饰以增加UDP-葡萄糖(UGT酶的关键底物)的天然通量。通过增加可用于UGT的底物的量，大于UDP-葡萄糖的天然通量允许更大的UGT性能。遗传修饰导致细胞能够将进料底物转化为糖基化产物，诸如但不限于莱鲍迪苷和罗汉果苷。本文描述了用于糖基化的其他底物。遗传修饰包括：消耗UDP-葡萄糖的酶(ushA、galETKM)的缺失或失活；消耗UDP-葡萄糖的前体、葡萄糖-6-磷酸(G6P)的酶(例如，pgi)的缺失或失活；以及经由葡萄糖-1-磷酸(G1P)将G6P转化为UDP-葡萄糖的酶(例如，pgm、galU)的过表达。具有修饰ΔushA、ΔgalETKM、Δpgi以及pgm和galU的互补的大肠埃希氏菌菌株在下文中称为“基础菌株”。
测试了另外的染色体修饰，以获得与基础菌株相比提高的生物转化。图1示出了来自两种另外的染色体修饰对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。将甜叶菊叶子提取物、蔗糖和葡萄糖喂给表达SEQ ID NO:15和25的UGT酶以及SEQ ID NO:11的蔗糖合酶的生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LCDAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。otsA和otsB的缺失(如图1中的1所示)显示出与基础菌株相比甜菊醇糖苷生物转化的提高。此外，ugpA的过表达(图1中显示为2)提供了总甜菊醇糖苷生物转化的进一步提高。
与表达SEQ ID NO:14和24的UGT酶的基础菌株相比，其他细菌基因被过表达，并且进行生物转化测试。图2示出了来自在质粒上互补的一系列过表达基因对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。将甜叶菊叶子提取物和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。如所示，几种基因互补提高了总体糖基化，包括与大肠埃希氏菌pgm(SEQ IDNO:92)、galU(SEQ ID NO:93)、pgm-galU(SEQ ID NOS:92和93)、ugpA(SEQ ID NO:95)、ycjU(SEQ ID NO:94)、adk(SEQ ID NO:96)、ndk(SEQ ID NO:97)和cmk(SEQ ID NO:98)的互补。
产生了表达候选蔗糖合酶酶的菌株，其可以在饲喂蔗糖时提高UDP-葡萄糖利用度。蔗糖合酶的表达能够将蔗糖分解为果糖和葡萄糖。葡萄糖可以向UDP-葡萄糖生物合成集中。然而，当在作为碳源的甘油或葡萄糖上生长时，细胞表现出类似的生长和UDP-葡萄糖利用度。图3示出了在表达SEQ ID NO:15和25的UGT酶的生物转化基础菌株中来自互补蔗糖合酶的甜菊醇糖苷生物转化的提高。基因在质粒上互补。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。将甜叶菊叶子提取物、蔗糖和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。几种蔗糖合酶酶显著提高了糖基化，包括由SEQ ID NO:2、3、5、6、7、8、9、10和11表示的酶。
图4示出了表达SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:24的UGT酶的生物转化基础菌株在多种基因敲除情况下对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于总甜菊醇糖苷转化而言的。将甜叶菊叶子提取物和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。鉴定了几个基因敲除以提高生物转化。
实施例2：UGT工程化和靶甜菊醇糖苷产生
美国专利10,743,567中描述了称为MbUGT1,2的UGT酶，该美国专利据此通过引用并入。MbUGT1,2(SEQ ID NO:13)的工程化版本在US2020/0087692中进行了描述，该文献据此通过引用并入。SEQ ID NO:13的UGT酶被进一步工程化以提高甜菊醇糖苷生物转化的活性。图5示出了通过SEQ ID NO:14的工程化版本对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于亲本UGT酶(SEQ ID NO:13)的甜菊醇糖苷转化％。SEQ ID NO:14具有来自SEQ IDNO:13的以下突变：G5N、F186T、V397S。将甜叶菊叶子提取物和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。
表2示出了从单个突变到SEQ ID NO:13的UGT酶的甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高(FI)是相对于甜菊醇糖苷转化％而言的。
表2
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关键
名称 N-末端 C-末端
CTL MATKG IR
P5A8 MARTKG IR
P5A10 MARTKG IRTKG
P5B8 MARTKG I
P5B9 MAIRTKG -
P5E2 MATKG IRT
*l6具有GGSGGS接头(SEQ ID NO:85)。接头交换替代SEQ ID NO:13的残基270-281。
图6示出了通过进一步工程化版本SEQ ID NO:15对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于SEQ ID NO:14的亲本UGT酶的甜菊醇糖苷转化％。SEQ ID NO:15的UGT酶具有来自SEQ ID NO:14的以下突变：ins_A2_T3_RR、H59P、A238E、L417F。将甜叶菊叶子提取物和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。
表3示出了从单个突变到SEQ ID NO:14的UGT酶的甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高(FI)是相对于甜菊醇糖苷转化％而言的。
表3
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/>
关键
名称 接头
l6 GGSGGS(SEQ ID NO:85)
l7 GGSGGSG(SEQ ID NO:86)
l8 GGSGGSGG(SEQ ID NO:87)
l9 GGSGGSGGS(SEQ ID NO:88)
l10 GGSGGSGGSG(SEQ ID NO:89)
l11 GGSGGSGGSGG(SEQ ID NO:90)
l12 GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:91)
图7示出了通过进一步工程化版本SEQ ID NO:16对甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高是相对于SEQ ID NO:15的亲本UGT酶的甜菊醇糖苷转化％。SEQ ID NO:16具有来自SEQ ID NO:15的以下突变：M152A、S153A。将甜叶菊叶子提取物和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。
表4示出了从单个突变到SEQ ID NO:15的甜菊醇糖苷生物转化的提高。倍数提高(FI)是相对于甜菊醇糖苷转化％而言的。
表4
突变 FI％rebA->rebD FI％甜菊苷->rebE
M152A_S153A 1.26 1.32
P442D 1.19 1.18
S125V 1.13 1.16
G96M 1.10 1.10
H402W 1.09 1.07
K99F 1.08 1.08
S310T 1.04 1.04
A81K 1.04 1.02
L205Y 1.04 1.03
A81G 1.04 1.09
G189Y 1.04 1.04
K99E 1.03 1.02
M425S 1.02 1.03
A451R 1.02 0.99
A81K 1.02 1.01
P442G 1.01 1.01
G96M 1.01 1.03
L298F 0.97 1.01
除了通过四种UGT酶的共表达来产生RebM(参见图21)之外，在各个实施方案中，可以通过表达较少的UGT和/或通过利用某些莱鲍迪苷作为底物来产生其他目标甜菊醇糖苷。例如，某些甜叶菊叶子提取物可以含有大量的RebA和甜菊苷。1-2个分支UGT酶(如，SEQ IDNO:13-16之一)的表达将导致RebE和RebD混合物的产生，这取决于提取物的莱鲍迪苷含量。1-3个分支UGT酶(如，SEQ ID NO:19-25)的表达将基本上产生RebI。此外，UGTC19的表达有利于去糖基化为甜菊醇二糖苷和RebB。
图8展示了使用SEQ ID NO:15的UGT酶将甜叶菊叶子提取物生物转化为RebE和RebD的混合物，并使用SEQ ID NO:25的UGT酶将其转化为RebI。将甜叶菊叶子提取物(主要含有甜菊苷和RebA)、蔗糖和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。
图9示出了使用SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:99的UGT酶将甜叶菊叶子提取物生物转化为RebB和甜菊醇二糖苷的混合物。将甜叶菊叶子提取物、UDP和葡萄糖喂给生物转化菌株。生物转化在37℃下进行48小时。通过反相LC DAD定量数据以定量甜菊醇糖苷的转化。
实施例3：甜菊醇糖苷的回收
常规地，生物质(在发酵或全细胞/裂解物生物转化过程的情况下)或酶(在用经纯化的酶进行生物转化的情况下)将初始从培养物中去除以允许甜菊醇糖苷(或其他糖苷产物)回收和纯化。通常，优选在回收中作为初始步骤除去生物质以最小化微生物细胞的破坏，其中细胞碎片(大分子和小分子两者)否则将使纯化过程复杂化。图10总结了用于回收甜菊醇糖苷的常规方法。然而，根据本发明的实施方案，由生物转化菌株产生的培养液将具有非常高的粘度，这对去除生物质和回收甜菊醇糖苷提出了挑战。
在生物质除去之前，温度、pH调节和/或糖苷增溶剂的添加大大缓解了这一困难。例如，这些处理可以降低培养材料的粘度，允许蛋白质的沉淀，以及糖苷的溶解以促进它们随后从生物质中分离和回收。图11中概述的过程可以产生具有≥95％甜菊醇糖苷(如，RebM)的最终产物。例如，将pH(从约7的起始pH)降低至约2至4范围内的pH显著地提高了RebM的溶解度。可替代性地，增加pH(从约7的初始pH)至>pH 11也可以提高溶解度。通过pH调节和增溶剂，可以实现的根据本公开的具有高纯度的甜菊醇糖苷的浓度为>100g/L或>150g/L。示例性增溶剂包括甘油(如，约0.5重量％)和1,3-丙二醇(如，约0.5重量％)。除了本文所述的其他物质之外，其他增溶剂包括聚乙烯醇、聚乙二醇和聚丙二醇。
图12示出了各种处理对离心后从水性发酵液中分离生物质的影响。颗粒的紧密度和上清液的澄清度用作生物质去除容易度的指标。简而言之，将30ml发酵液单独或组合进行以下处理：在70℃下加热30分钟，酸化至pH 3.78，或添加15％v/v乙醇。然后将发酵液以3000rpm离心5分钟以确定分离效率。结果显示了加热和酸化对分离有正面影响。将显示最佳分离的8号管加热至70℃，并将pH调节至3.78。包括通过添加乙醇将pH调节至3.78的7号管也显示出良好的分离。
表5示出了加热(70℃，30分钟)和酸化(pH 3.6)对生物质去除所需的处理时间的影响。简而言之，使经处理和未经处理的发酵液通过GEA Westfalia SB7分离器以测试生物质的去除。未经处理的发酵液需要以0.44min/L的处理时间分三次通过SB7，随后以2.2min/L的处理时间进行切向流过滤(TFF)，以实现用于下游步骤的生物质的充分分离。通过加热和酸化进行的处理使得仅单次通过SB7就能够进行有效的生物质分离，从而导致处理时间缩短至八分之一以下。
表5
表6示出了加热和酸化对RebM的定量和回收的影响。简而言之，在通过加热(70℃，15min)和酸化(pH 2.5)进行处理之前和之后测量水性发酵液中的RebM浓度。与未经处理的条件相比，处理导致RebM回收率提高120％-173％(相对于七个独立样品平均提高140％)。
表6
表7示出了加热结合酸或碱添加和/或添加小分子增强剂对RebM溶解度的影响。将发酵液保持在70℃的恒温下并经受如表7中所述的不同处理。在恒定搅拌下缓慢添加RebM以确定RebM的最大溶解度。培养基的酸化显示了RebM溶解度增加，如添加小分子增强剂(甘油、1,3-丙二醇)一样。在一些情况下，增强剂的添加加上pH的变化(碱添加)导致RebM溶解度进一步增加。
表7
pH 温度(℃) 小分子 重量％增强剂 RebM溶解度(g/L)
7 70.8 (无) 0 29.9
3.5 70.8 (无) 0 68.9
7 70.8 甘油 0.5 119.0
11.6 70.8 甘油 0.5 151.3
11.6 70.8 1,3-丙二醇 0.5 151.3
在此描述的过程可以生产具有理想品质的产品，包括：≥95％糖苷(例如，RebM或mog.V)纯度、有吸引力的白色、容易溶解、无味和高回收率。具体地，培养物的初始pH和温度调节可以改变发酵液的流体特性，并提高用于生物质去除的圆盘堆叠式分离器的效率。此外，通过pH和温度调节，显著提高了糖苷的溶解度，并因此提高了产率(这避免了固相中产物的大量损失)。
该过程可以采用一个或多个结晶步骤。结晶过程可以包括静态阶段，随后是搅拌阶段，以及任选的蒸发阶段，以控制晶体形态。静态阶段可以生长具有高度晶畴的大晶体。结晶可以包括接种晶体的过程，或使用不涉及晶体接种的系统(即，晶体自发形成)。例如，使用晶体接种过程，在静止阶段期间接种晶体后，搅拌阶段将快速生长晶体，并增加非晶域的程度。使用该过程，所得晶体可具有良好的最终溶解度。所得晶体将具有高纯度的甜菊醇糖苷(如，RebM)，并且将更容易回收和洗涤。对于重结晶，示例性重结晶溶液体系可包含水，或在一些实施方案中包含乙醇(如，1:2EtOH:H2O)。在一些实施方案中，重结晶溶液还包含甘油(如，至多2％)。用于重结晶的溶液的pH可以变化，诸如约4.0至约12.0。
在重结晶之前，可以过滤溶液。此外，过滤材料的选择可能对最终产品的质量具有显著影响。例如，图13比较了使用疏水过滤材料诸如聚丙烯(PP)和相对亲水的材料诸如聚醚砜(PES)以在重结晶之前过滤溶液(均具有0.2微米孔径)。将RebM最终产物(>98％)溶解在丙二醇中至10重量％的浓度。如图13所示，PP过滤器的使用产生相当混浊的溶液(左侧)，而PES过滤器的使用产生澄清的溶液(右侧)。因此，PES过滤材料和类似的亲水材料可能通过吸附杂质而提供显著的优点。
理解结晶系统的热力学和动力学性质对于正确设计工业过程至关重要。例如，热力学溶解度表示溶质在给定温度下可以达到的最大浓度(饱和度或溶解度)。该溶解度曲线上方的区域(参见例如图14)是过饱和的，而其下方的区域是不饱和的。为了进行结晶，溶液必须是过饱和的。实现过饱和的一种方法是降低饱和溶液的温度。然而，在这种情况下不会立即开始结晶；相反，该系统进入过饱和空间的具有指定宽度的亚稳区。在该区域中没有自发成核，但是可以通过添加晶种来引发结晶。如果在冷却时不添加晶种，则系统将到达亚稳区的边缘，经过该点将发生自发成核。过饱和度越高，成核速率越快，这对粒度和晶体生长速率具有显著影响。因此，了解溶解度和亚稳区宽度使得能够设计具有所需晶体尺寸分布(CSD)并且还以实际速度进行的工业结晶过程。在未接种结晶的情况下，必须达到并稍微超过亚稳区的边缘以引发结晶而不会产生太多自发成核的负面影响(如，其产生非常小的晶体)。随着过程的进行，浓度将下降回到亚稳区，之后在整个结晶持续期间需要保持过饱和(通过冷却、蒸发等)。在接种结晶的情况下，重要的是不超过亚稳区以避免自发成核，并且必须在溶液饱和后添加晶种，使得种晶不溶解并引发成核。在接种和无接种的情况下，理解系统的热力学和动力学能够设计结晶过程的升温速率(或蒸发速率)以及成核点。
进行研究以理解RebM在不同溶剂系统中的溶解度，并探索溶解度增强的影响，以实现用于晶体形成和生长的接种和温度逐渐减少策略。对于这些研究，使用来自TechnobisCrystallization体系的Crystal16体系(Crystalline系列)在升温过程中产生澄清点(作为溶解度的替代指标)和在降温过程中产生浊点(作为亚稳区宽度的替代指标)。评价各种溶剂体系。
表8：重结晶步骤的实验设计
图14示出了溶解度(底部曲线)和亚稳极限曲线(顶部曲线)，其限定了亚稳区宽度，如对于水中的RebM(pH 7.0，0％甘油)所确定的，从而使得能够控制该溶剂体系中的晶体生长。
图15A、15B示出了溶解度(底部曲线)和亚稳极限曲线(顶部曲线)，其限定了亚稳区宽度，如在pH 7下对于67％水/33％乙醇中的RebM所确定的，从而使得能够控制该溶剂体系中的晶体生长。图15A是0％甘油，而图15B包括0.5％甘油。
图16A、16B示出了溶解度(底部曲线)和亚稳极限曲线(顶部曲线)，其限定了亚稳区宽度，如在pH 11下对于67％水/33％乙醇中的RebM所确定的，使得能够控制该溶剂体系中的晶体生长。图16A是0％甘油，而图16B包括0.5％甘油。
在一些实施方案中，回收方法将包括一个或多个切向流过滤(TFF)步骤。例如，具有孔径为约5kD的过滤器的TFF可以除去内毒素、大蛋白质和其他细胞碎片，同时还提高最终粉末产品的溶解度。还可以在下游采用具有孔径为约0.5kD的过滤器的TFF以除去小分子杂质和盐，和/或浓缩母液以进行重结晶。
在篮式离心机步骤的洗涤可以采用用水洗涤，或者可以替代性地采用其他冲洗。例如，冷水/乙醇(如，15％乙醇)可以提高滤饼的质量。母液可以用作洗涤水，或者可以再加工。
可以采用的其他方法包括活性炭处理、膨润土处理、离子交换色谱和蒸发浓缩。具体地，在将湿滤饼溶解在EtOH:H2O中后进行活性炭处理可以改善最终产品的颜色。
实施例4：罗汉果醇或罗汉果醇糖苷前体的生物转化
本文所述的工程化细菌菌株可用于多种底物的糖基化，包括但不限于萜类糖苷。在一些方面，本发明鉴定对罗汉果醇或罗汉果苷支架有活性的UGT酶。图22提供了用于产生各种罗汉果苷的糖基化途径。图17A和B示出了将罗汉果酚生物转化为罗汉果苷中间体。将表达UGT酶的工程化大肠埃希氏菌菌株(基础菌株)与罗汉果醇一起在96孔板中孵育。在48小时后检查产物形成。报告的值是那些超过空载体对照的值。在具有可靠标准品的LC-MS/MS上测量产物。如图17A所示，酶1(SEQ ID NO:71)和酶2(SEQ ID NO:33)UGT酶都主要从罗汉果醇产生Mog.IA，形成较少量的Mog.IE和/或Mog.IIE。图17B示出了使用表达酶1(SEQ IDNO:71)、酶3(SEQ ID NO:33)、酶4(SEQ ID NO:82)和酶5(SEQ ID NO:83)的工程化大肠埃希氏菌菌株将罗汉果醇生物转化为罗汉果苷-IA。
图18A和图18B示出了Mog.IA(图18A)或Mog.IE(图18B)到Mog.IIE的生物转化。在该实验中，将表达UGT酶、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:33的工程化大肠埃希氏菌基础菌株在37℃下在96孔板中的含有Mog.IA(图18A)或Mog.IE(图18B)的发酵培养基中孵育。在48小时后检查产物形成。在具有可靠标准品的LC-MS/MS上测量产物。计算超过空载体对照的Mog.IIE水平的值。如图18A所示，SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:71能够催化Mog.IA生物转化为Mog.IIE。类似地，如图18B所示，SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:71和SEQ IDNO:33能够催化Mog.IE生物转化为Mog.IIE。
图19示出了从Mog.II-E产生Mog.III或赛门苷。在该实验中，将表达UGT酶、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:13的工程化大肠埃希氏菌菌株在37℃下在含有Mog.II-E的发酵培养基中生长48小时。通过LCMS/MS用每种化合物的可靠标准品定量产物。如图19所示，所有菌株都能够催化Mog.IIE向Mog.III的生物转化。此外，SEQ ID NO:13的酶也显示大量赛门苷的产生。
图20示出了Mog.II-A2的产生。体外喂给Mog.I-E。在该实验中，将表达UGT酶SEQID NO:73的工程化大肠埃希氏菌菌株(基础菌株)在37℃下孵育48小时。通过LC-MS/MS用每种化合物的可靠标准品定量产物。如图20所示，SEQ ID NO:73能够催化Mog.IE向Mog.II-A2的生物转化。
在罗汉果醇的C3和C24羟基处观察到的伯糖基化反应的总结提供于表8中。具体地，将罗汉果醇喂给表达各种UGT酶的细胞。将反应物在37℃下孵育48小时。通过LCMS/MS用每种化合物的可靠标准品定量产物。
表8
UGT C3O-糖基化 C24O-糖基化
SEQ ID NO:84 是 是
SEQ ID NO:17 否 是
SEQ ID NO:80 否 是
SEQ ID NO:71 是 是
SEQ ID NO:46 是 否
SEQ ID NO:33 是 是
SEQ ID NO:83 否 是
SEQ ID NO:81 否 是
SEQ ID NO:82 否 是
分支糖基化反应的总结提供于表9中。Mog.IIE或Mog.IE被喂给表达各种UGT酶的细胞。将反应物在37℃下孵育48小时。通过LC-MS/MS用每种化合物的可靠标准品定量产物。“间接”证据意指观察到底物的消耗。
表9
现在将参考所附权利要求来限定本发明的实施方案。
序列
蔗糖合酶酶
SEQ ID NO:1：马铃薯(Solanum tuberosum)(StSus1)
SEQ ID NO:2：马铃薯(Solanum tuberosum)(StSus2)
SEQ ID NO:3：马铃薯(Solanum tuberosum)(StSus2_S11E)
SEQ ID NO:4：喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)(AcS uSy)
SEQ ID NO:5：喜温嗜酸硫杆菌(AcSuSy_L637M-T640V)
SEQ ID NO:6：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AtSus1)
SEQ ID NO:7：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AtSus3)
SEQ ID NO:8：绿豆(Vigna radiate)(VrSS1)
SEQ ID NO:9：绿豆(Vigna radiate)(VrSS1_S11E)
SEQ ID NO:10：大豆(Glycine Max)(GmSS)
SEQ ID NO:11：大豆(GmSS_S11E)
SEQ ID NO:12：鱼腥藻属某种(Anabaena sp.)(AsSusA)
尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)
SEQ ID NO:13：合成(MbUGT1,2.2)
SEQ ID NO:14：合成(MbUGT1,2.3)
SEQ ID NO:15：合成(MbUGT1,2.4)
SEQ ID NO:16：合成(MbUGT1,2.5)
SEQ ID NO:17：SrUGT85C2(甜叶菊)
SEQ ID NO:18：SrUGT74G1(甜叶菊)
SEQ ID NO:19：SrUGT76G1(甜叶菊)
SEQ ID NO:20：合成(MbUGT1-3)
SEQ ID NO:21：UGT76G1_L200A(甜叶菊，L200A)
SEQ ID NO:22：合成(MbUGT1-3_0)
SEQ ID NO:23：合成(MbUGT1-3_1)
SEQ ID NO:24：合成(MbUGT1-3_2)
SEQ ID NO:25：合成(MbUGT1-3_3)
SEQ ID NO:26：SrUGT91D1(甜叶菊)
SEQ ID NO:27：SrUGT91D2(甜叶菊)
SEQ ID NO:28：SrUGT91D2e(甜叶菊)
SEQ ID NO:29：OsUGT1-2(水稻(Oryzasativa))
SEQ ID NO:30：合成(MbUGTC19)
SEQ ID NO:31：合成(MbUGTC19-2)
SEQ ID NO:32：MbUGTC13(甜叶菊UGT85C2，P215T)
SEQ ID NO:33：SgUGT720-269-1(罗汉果)
SEQ ID NO:34：SgUGT94-289-3(罗汉果)
SEQ ID NO:35：SgUGT74-345-2(罗汉果)
SEQ ID NO:36：SgUGT75-281-2(罗汉果)
SEQ ID NO:37：SgUGT720-269-4(罗汉果)
SEQ ID NO:38：SgUGT94-289-2(罗汉果)
SEQ ID NO:39：SgUGT94-289-1(罗汉果)
SEQ ID NO:40：McUGT1(苦瓜(Momordica charantia))
SEQ ID NO:41：McUGT2(苦瓜(Momordica charantia))
SEQ ID NO:42：McUGT3(苦瓜(Momordica charantia))
SEQ ID NO:43：McUGT4(苦瓜(Momordica charantia))
SEQ ID NO:44：McUGT5(苦瓜(Momordica charantia))
SEQ ID NO:45(黄瓜(Cucumis sativus))
SEQ ID NO:46：CmaUGT1(笋瓜(Cucurbita maxima))
SEQ ID NO:47：(桃(Prunus persica))
SEQ ID NO:48：(可可树(Theobroma cacao))
SEQ ID NO:49：CmaUGT2(笋瓜(Cucurbita maxima))
SEQ ID NO:50：CmoUGT2(中国南瓜(Cucurbita moschata))
SEQ ID NO:51：CmaUGT3(笋瓜(Cucurbita maxima))
SEQ ID NO:52：CmoUGT3(中国南瓜(Cucurbita moschata))
SEQ ID NO:53：(白黄麻(Corchorus capsularis))
SEQ ID NO:54：(枣(Ziziphus jujube))
SEQ ID NO:55：(葡萄(Vitis vinifera))
SEQ ID NO:56：(普通胡桃(Juglans regia))
SEQ ID NO:57：(巴西橡胶树(Hevea brasiliensis))
SEQ ID NO:58：(木薯(Manihot esculenta))
SEQ ID NO:59：(土瓶草(Cephalotus follicularis))
SEQ ID NO:60：UGT_1,6(小果咖啡(Coffea Arabica))
SEQ ID NO:61：CmoUGT1(中国南瓜)
SEQ ID NO:62：(拟南芥)
SEQ ID NO:63：(拟南芥)
SEQ ID NO:64：ClUGT1(原鸽(Columbalivia))
SEQ ID NO:65：(杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi))
SEQ ID NO:66：(淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae))
SEQ ID NO:67：(苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)，菌株1021)
SEQ ID NO:68：(放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter))
SEQ ID NO:69：(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))
SEQ ID NO:70(肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia))
SEQ ID NO:71：AtUGT73C3(拟南芥)
SEQ ID NO:72：HvUGTB1(四棱大麦(Hordeum vulgare subsp.Vulgare))
SEQ ID NO:73：HvUGT_B3(四棱大麦)
/>
SEQ ID NO:74：CcUGT_1,6(中果咖啡(Coffea canephora))
SEQ ID NO:75：CeUGT_1,6(欧基尼奥伊德斯种咖啡(Coffea eugenioides))
SEQ ID NO:76：CeUGT_1,6.2(欧基尼奥伊德斯种咖啡)
SEQ ID NO:77：SgUGT94-289-3.2(罗汉果)
SEQ ID NO:78：OsJUGT_1,6(水稻)(OsJUGT_1,6)
SEQ ID NO:79：PgUGT94_B1(高丽参(Panaxginseng))
SEQ ID NO:80：SrUGT73E1，具有任选的His标签(甜叶菊)
SEQ ID NO:81：(亚麻荠(Camelina sativa))
SEQ ID NO:82：UGT73F24(甘草(Glycyrrhizauralensis))(UGT73F24)
SEQ ID NO:83：UGT73C33(甘草)
SEQ ID NO:84：UGT85C1(甜叶菊)
SEQ ID NO:99：At75D1(拟南芥)
接头
SEQ ID NO:85：GGSGGS(L6)
SEQ ID NO:86：GGSGGSG(L7)
SEQ ID NO:87：GGSGGSGG(L8)
SEQ ID NO:88：GGSGGSGGS(L9)
SEQ ID NO:89：GGSGGSGGSG(L10)
SEQ ID NO:90：GGSGGSGGSGG(L11)
SEQ ID NO:91：GGSGGSGGSGGS(L12)互补酶
SEQ ID NO:92：大肠埃希氏菌pgm
SEQ ID NO:93：大肠埃希氏菌galU
SEQ ID NO:94：大肠埃希氏菌ycjU
SEQ ID NO:95：两歧双歧杆菌ugpA
SEQ ID NO:96：大肠埃希氏菌adk
SEQ ID NO:97：大肠埃希氏菌ndk
SEQ ID NO:98：大肠埃希氏菌cmk
/>

Claims (229)

1.一种用于制备糖基化产物的方法，所述方法包括：
提供表达一种或多种重组UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶的细菌细胞，所述细菌细胞具有以下中的一种或多种：
重组蔗糖合酶酶表达，和增加UDP-糖利用度的一种或多种遗传修饰；
在用于糖基化的底物存在下培养所述细菌细胞；和
回收所述糖基化产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属某些种、芽孢杆菌属某些种、红杆菌属某些种、发酵单胞菌属某些种或假单胞菌属某些种。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红杆菌、球形红杆菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。
4.如权利要求3所述的方法，其中细菌菌株是大肠埃希氏菌。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞表达重组蔗糖合酶酶，所述重组蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:1至12中的一种具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:1至12中的一种具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:2具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:2任选地具有S11E取代。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:3任选地具有L637M和T640V取代。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:7任选地具有S11E取代。
12.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:8任选地具有S11E取代。
13.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:9具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:10具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:10任选地具有S11E取代。
15.如权利要求5所述的方法，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞在蔗糖存在下培养。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞包含所述遗传修饰：ushA和galETKM或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；pgi或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；大肠埃希氏菌pgm(SEQ ID NO:92)和/或ycjU(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物过表达或活性增加；以及大肠埃希氏菌galU(SEQ ID NO:93)和/或两歧双歧杆菌ugpA(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物过表达或活性增加。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞包含pgm或其直系同源物或衍生物以及任选的galU或其直系同源物或衍生物的过表达或活性增加。
19.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中微生物细胞具有ushA或其直系同源物和/或galE、galT、galK和galM或其直系同源物中的一种或多种的缺失、失活或活性或表达降低。
20.如权利要求19所述的方法，其中galETKM基因或其直系同源物失活、缺失或表达或活性降低。
21.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞具有otsA(海藻糖-6-磷酸合酶)或其直系同源物和/或otsB(海藻糖-磷酸磷酸酶)或其直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。
23.如权利要求1至22所述的方法，其中所述微生物细胞具有以下中的一种或多种的缺失、失活或活性或表达降低：ugd(UDP-葡萄糖6-脱氢酶)或其直系同源物；rfaQ-G-P-S-B-I-J或其直系同源物；yfdG-H-I或其直系同源物；wcaJ或其直系同源物；以及glgC或其直系同源物。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞具有大肠埃希氏菌ycjU(β-磷酸葡萄糖变位酶)(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物、两歧双歧杆菌ugpA(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物、大肠埃希氏菌adk(腺苷酸激酶)(SEQ ID NO:96)或其直系同源物或衍生物、大肠埃希氏菌ndk(核苷二磷酸激酶)(SEQ ID NO:97)或其直系同源物或衍生物和大肠埃希氏菌cmk(胞苷一磷酸激酶)(SEQ ID NO:98)或其直系同源物或衍生物中的一种或多种的过表达或活性或表达增加。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述用于糖基化的底物作为植物提取物或其级分提供，或合成地或通过生物合成方法产生。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述底物是选自以下的次级代谢物：萜类或萜类糖苷、类黄酮或类黄酮糖苷、聚酮类或聚酮类糖苷、芪类或芪类糖苷，以及多酚或多酚糖苷。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述底物包含萜类糖苷。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述萜类糖苷包括甜菊醇糖苷或罗汉果醇糖苷。
29.如权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述底物具有零、一、二、三或四个糖基。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述糖基独立地选自葡糖基、半乳糖基、甘露糖基、木糖基和鼠李糖基。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述糖基是葡糖基。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述糖基化产物具有至少四个、至少五个、至少六个或至少七个糖基。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述产物的生物合成涉及所述细菌细胞对所述底物的至少两个糖基化反应。
34.如权利要求28所述的方法，其中所述底物以甜叶菊叶子提取物或其级分的形式提供。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述甜叶菊叶子提取物包含甜菊醇、甜菊苷、甜菊醇二糖苷、莱鲍迪苷A、杜尔可苷A、杜尔可苷B、莱鲍迪苷C和莱鲍迪苷F中的一种或多种。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述提取物或其级分中至少约30％的所述甜菊醇糖苷选自甜菊苷、甜菊醇二糖苷和莱鲍迪苷A。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebM。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述UGT酶能够在甜菊醇核心的C13和C19羟基处进行伯糖基化，以及C13和C19伯糖基的1-2和1-3分支糖基化。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至32和84中的一种具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列的酶。
40.如权利要求36所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebE和/或RebD。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细菌细胞表达能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-2糖基化的一种或多种UGT酶。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述UGT酶选自与SEQ ID NO:13至16和26至29中的一种具有至少约70％序列同一性的酶。
43.如权利要求35或36所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebB。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述细菌细胞表达能够使甜菊醇C19伯糖基去糖基化的一种或多种UGT酶。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述UGT酶选自与SEQ ID NO:18、30、31和99中的一种具有至少约70％序列同一性的酶。
46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞表达与SEQ ID NO:31或99具有至少约70％序列同一性的UGT酶。
47.如43至46中任一项所述的方法，其中所述用于糖基化的底物包含RebA。
48.如权利要求36所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebI。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述细菌细胞表达能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-3糖基化的一种或多种UGT酶。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述UGT酶选自与SEQ ID NO:19至25中的一种具有至少约70％序列同一性的酶。
51.如权利要求28所述的方法，其中所述底物以罗汉果提取物或其级分，或生物合成产生的罗汉果醇或罗汉果醇糖苷的形式提供。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述底物包含选自以下的一种或多种底物：罗汉果醇、mog.I-A、mog.I-E、mog.II-A、mog.II-E、mog III、mog IVA、mog.IV和赛门苷。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述糖基化产物包含mog.IV、mog.IVA、mog.V、mogVI、isomog V或赛门苷。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述UGT酶能够在罗汉果醇核心的C3和C24羟基处进行伯糖基化，以及C3和/或C24伯糖基的1-2和1-6分支糖基化。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至17、29、33至39、46、54、60、71至80和82至84中的一种具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列的酶。
56.如权利要求1至55中任一项所述的方法，其中编码所述UGT酶的基因整合到所述微生物细胞的染色体中或在染色体外表达。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述方法导致至少40％的所述底物转化为所述糖基化产物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述方法导致至少75％的所述底物转化为所述糖基化产物。
59.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞生物质通过在复合或基本培养基中生长而产生。
60.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中在用于糖基化的底物存在下用一种或多种碳源培养所述细菌细胞。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油中的一种或多种。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述培养条件选自需氧、微需氧和厌氧。
63.如权利要求56至62中任一项所述的方法，其中所述培养以分批进料方法进行。
64.如权利要求63所述的方法，其中将所述底物与所述细菌细胞一起孵育约72小时或更短时间。
65.如权利要求57至64中任一项所述的方法，其中回收包括以下中的一个或多个：将培养物的pH降低至低于约pH 5或将培养物的pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，以及添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
66.一种用于制备糖基化产物的细菌细胞，所述细菌细胞表达一种或多种重组UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶并且具有以下中的一种或多种：表达重组蔗糖合酶酶，以及增加UDP-糖利用度的一种或多种遗传修饰。
67.如权利要求66所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属某些种、芽孢杆菌属某些种、红杆菌属某些种、发酵单胞菌属某些种或假单胞菌属某些种。
68.如权利要求67所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红杆菌、球形红杆菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。
69.如权利要求67所述的细菌细胞，其中所述细菌菌株是大肠埃希氏菌。
70.如权利要求66至69中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达重组蔗糖合酶酶，所述重组蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:1至12中的一种具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列。
71.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶包含与SEQ ID NO:1至12中的一种具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
72.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:2具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:2任选地具有S11E取代。
73.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:3任选地具有L637M和T640V取代。
74.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
75.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
76.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:7任选地具有S11E取代。
77.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:8任选地具有S11E取代。
78.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:9具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
79.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:10具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蔗糖合酶酶相对于SEQ ID NO:10任选地具有S11E取代。
80.如权利要求70所述的细菌细胞，其中所述蔗糖合酶酶包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
81.如权利要求66至80中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞包含所述遗传修饰：ushA和galETKM或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；pgi或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；大肠埃希氏菌pgm(SEQ ID NO:92)和/或ycjU(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物过表达或活性增加；以及大肠埃希氏菌galU(SEQ ID NO:93)和/或两歧双歧杆菌ugpA(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物过表达或活性增加。
82.如权利要求66至81中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞包含pgm或其直系同源物或衍生物以及任选的galU或其直系同源物或衍生物的过表达或活性增加。
83.如权利要求66至81中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞具有ushA或其直系同源物和/或galE、galT、galK和galM或其直系同源物中的一种或多种的缺失、失活或活性或表达降低。
84.如权利要求83所述的细菌细胞，其中galETKM基因或其直系同源物失活、缺失或表达或活性降低。
85.如权利要求66至81中任一项所述的细菌细胞，其中pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低。
86.如权利要求66至85中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞具有otsA(海藻糖-6-磷酸合酶)或其直系同源物和/或otsB(海藻糖-磷酸磷酸酶)或其直系同源物的缺失、失活或活性或表达降低。
87.如权利要求66至86中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞具有以下中的一种或多种的缺失、失活或活性或表达降低：ugd(UDP-葡萄糖6-脱氢酶)或其直系同源物；rfaQ-G-P-S-B-I-J或其直系同源物；yfdG-H-I或其直系同源物；wcaJ或其直系同源物；以及glgC或其直系同源物。
88.如权利要求66至87中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞具有大肠埃希氏菌ycjU(β-磷酸葡萄糖变位酶)(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物、两歧双歧杆菌ugpA(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物、大肠埃希氏菌adk(腺苷酸激酶)(SEQ ID NO:96)或其直系同源物或衍生物、大肠埃希氏菌ndk(核苷二磷酸激酶)(SEQ ID NO:97)或其直系同源物或衍生物和大肠埃希氏菌cmk(胞苷一磷酸激酶)(SEQ ID NO:98)或其直系同源物或衍生物中的一种或多种的过表达或活性或表达增加。
89.如权利要求66至88中任一项所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达一种或多种UGT酶，所述一种或多种UGT酶包含与选自SEQ ID NO:13至84的氨基酸序列至少约70％同一的氨基酸序列。
90.如权利要求89所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞使萜类糖苷底物糖基化。
91.如权利要求90所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞使甜菊醇糖苷或罗汉果醇糖苷底物糖基化。
92.如权利要求91所述的细菌细胞，其中所述UGT酶能够在甜菊醇核心的C13和C19羟基处进行伯糖基化，以及C13和C19伯糖基的1-2和1-3分支糖基化。
93.如权利要求92所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞从甜叶菊叶子提取物或其级分产生RebM。
94.如权利要求92或93所述的细菌细胞，其中所述UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至32和84中的一种具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列的酶。
95.如权利要求91所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞从甜叶菊叶子提取物或其级分产生RebE和/或RebD。
96.如权利要求95所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-2糖基化的一种或多种UGT酶。
97.如权利要求96所述的细菌细胞，其中所述UGT酶选自与SEQ ID NO:13至16和26至29中的一种具有至少约70％序列同一性的酶。
98.如权利要求91所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞从甜叶菊叶子提取物或其级分产生RebB。
99.如权利要求98所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达能够使甜菊醇C19伯糖基去糖基化的一种或多种UGT酶。
100.如权利要求99所述的细菌细胞，其中所述UGT酶选自与SEQ ID NO:18、30、31和99中的一种具有至少约70％序列同一性的酶。
101.如权利要求100所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达与SEQ ID NO:31或99具有至少70％同一性的UGT酶。
102.如权利要求91所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞从甜叶菊叶子提取物或其级分产生RebI。
103.如权利要求102所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-3糖基化的一种或多种UGT酶。
104.如权利要求103所述的细菌细胞，其中所述UGT酶选自与SEQ ID NO:19至25中的一种具有至少约70％序列同一性的酶。
105.如权利要求91所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞从罗汉果提取物产生mog.V、mog VI、isomog.V或赛门苷。
106.如权利要求105所述的细菌细胞，其中所述UGT酶能够在罗汉果醇核心的C3和C24羟基处进行伯糖基化，以及C3和/或C24伯糖基的1-2和1-6分支糖基化。
107.如权利要求106所述的细菌细胞，其中所述UGT酶选自包含与SEQ ID NO:13至17、29、33至39、46、54、60、71至80和82至84中的一种具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列的酶。
108.如权利要求66至107中任一项所述的细菌细胞，其中编码所述UGT酶的基因整合到所述微生物细胞的染色体中或在染色体外表达。
109.一种用于糖基化底物的方法，所述方法包括在用于糖基化的底物存在下培养如权利要求66至108中任一项所述的细胞，和回收所述糖基化产物。
110.如权利要求109所述的方法，其中通过以下中的一个或多个回收糖基化产物：将反应或培养物的pH降低至低于约pH 5或将反应或培养物的pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，以及添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
111.一种UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶，所述UGT酶包含与SEQ ID NO:13具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列，并且具有选自以下的一个或多个修饰：
选自以下的一个或多个氨基酸取代：V397S、V397C、G5N、S20E、S23D、R45Y、H59P、G94S、K97E、M150L、I185F、A206P、G210E、Q237R、M250K、A251E、C252L、G259E、Q263Y、I287M、C288F、V336I、F338L、D351E、F186I、F186M、F186T、L418F、A451T、A451L、T453K、T453R、V456S、V456W、V456T、V456M；
用主要由甘氨酸和丝氨酸氨基酸组成的五至十五个氨基酸对SEQ ID NO:13的残基270至281的取代；
在相对于SEQ ID NO:13的位置3处插入一个或两个氨基酸，和/或在SEQ ID NO:13的C-末端添加一个氨基酸。
112.如权利要求111所述的UGT酶，其中所述UGT酶具有用序列GGSGGS(SEQ ID NO:85)对SEQ ID NO:13的氨基酸270至281的取代。
113.如权利要求111或112所述的UGT酶，其中所述UGT酶在SEQ ID NO:13的位置3处插入Arg，或在位置2和3之间插入Ile-Arg。
114.如权利要求111所述的UGT酶，其中所述酶相对于SEQ ID NO:13包含选自G5N、F186T和V397S的一个或多个取代。
115.如权利要求114所述的UGT酶，其中所述酶相对于SEQ ID NO:13包含氨基酸取代G5N、F186T和V397S。
116.如权利要求111所述的UGT酶，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
117.一种UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其包含与SEQ ID NO:14具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列，并且具有选自以下的一个或多个修饰：
选自以下的一个或多个氨基酸取代：V395A、Q263Y、D269R、K97E、Q262E、H59P、G259E、M150L、Y267H、T3R、V95Q、A238E、S308Q、Q237R、R45Y、E254D、L203I、S151R、S123D、D351E、T453M、G94T、T186M、V336I、L58S、F338L、F51W、C252L、M250D、A251E、C252V、A79P、W401F、S323A、A251E、A130D、S42E、H400Y、S266R、S23D、P56A、A206P、M250K、A143W、V456T、G94S、I427F、T186I、T453F、C252R、V38F、R45F、T37S、Q244K、L11I、I287M、V31P、T43D和P39T；
缺失SEQ ID NO:2的残基270至281，接头具有五至十五个氨基酸并且主要由甘氨酸和丝氨酸氨基酸组成；
在相对于SEQ ID NO:14的位置3处插入一个或两个氨基酸，和/或在SEQ ID NO:14的C-末端添加一个氨基酸。
118.如权利要求117所述的UGT酶，其中所述UGT酶具有用主要由Ser和Gly组成的6至12个氨基酸的接头序列对SEQ ID NO:14的氨基酸270至281的取代。
119.如权利要求117或118所述的UGT酶，其中所述酶相对于SEQ ID NO:14包含选自H59P、A238E和L417F的一个或多个取代。
120.如权利要求119所述的UGT酶，其中所述酶相对于SEQ ID NO:14包含氨基酸取代H59P、A238E和L417F。
121.如权利要求120所述的UGT酶，其中所述酶包含在SEQ ID NO:14的A2和T3之间的插入或Arg-Arg。
122.如权利要求120所述的UGT酶，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
123.一种UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其包含与SEQ ID NO:15具有至少约70％序列同一性的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:15在选自125、152、153和442的位置处具有一个或多个氨基酸取代。
124.如权利要求123所述的UGT酶，并且相对于SEQ ID NO:15包含选自M152A、S153A、P442D和S125V的氨基酸取代。
125.如权利要求124所述的UGT酶，并且包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
126.一种用于使罗汉果醇或罗汉果醇糖苷底物糖基化的方法，所述方法包括在UDP-糖存在下使所述底物与UDP依赖性糖基转移酶(UGT)酶接触，所述UGT酶包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:79。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述底物与UGT酶接触，所述UGT酶包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:79。
128.如权利要求126所述的方法，其中所述底物与UGT酶接触，所述UGT酶包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:13。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述底物与UGT酶接触，所述UGT酶包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:13。
130.如权利要求126至129中任一项所述的方法，其中所述底物以植物提取物或其级分的形式提供。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述植物提取物是罗汉果提取物或其级分。
132.如权利要求130或131所述的方法，其中所述植物提取物包含选自以下的一种或多种底物：罗汉果醇、mog.I-A、mog.I-E、mog.II-A、mog.II-E、mog III、mog IVA、mog.IV和赛门苷。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述糖基化产物包含mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI或赛门苷。
134.如权利要求126至133中任一项所述的方法，其中所述UGT酶能够在罗汉果醇核心的C3和C24羟基处进行伯糖基化，以及C3和/或C24伯糖基的1-2和1-6分支糖基化。
135.如权利要求126至134中任一项所述的方法，其中将所述底物与表达所述UGT酶的微生物细胞一起培养。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述微生物细胞是细菌细胞。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属某些种、芽孢杆菌属某些种、红杆菌属某些种、发酵单胞菌属某些种或假单胞菌属某些种。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红杆菌、球形红杆菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。
139.如权利要求138所述的方法，其中细菌菌株是大肠埃希氏菌。
140.如权利要求136至139中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞具有增加UDP-糖利用度的一种或多种遗传修饰。
141.如权利要求139或140所述的方法，其中所述细菌细胞表达蔗糖合酶，并且所述蔗糖合酶任选地包含与SEQ ID NO:1至12中的一种具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
142.如权利要求135所述的方法，其中所述微生物细胞是酵母细胞，所述酵母细胞任选地选自酵母属、毕赤酵母属或耶氏酵母属，包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和解脂耶氏酵母。
143.如权利要求126至134中任一项所述的方法，其中所述底物用包含所述UGT酶的细胞裂解物孵育，或用纯化的重组UGT酶孵育。
144.如权利要求126至143中任一项所述的方法，其中通过以下中的一个或多个回收所述糖基化产物：将反应或培养物的pH降低至低于约pH 5或将反应或培养物的pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，和添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
145.一种用于产生糖苷产物的方法，所述方法包括：
通过在无细胞反应中或在微生物培养物中酶促转移一个或多个糖部分，将用于糖基化的底物转化为目标糖苷产物，和
从所述反应或培养物中回收所述糖苷产物，所述回收包括以下中的一个或多个：将所述反应或培养物的pH降低至低于约pH 5或将所述反应或培养物的pH升高至高于约pH 9，将温度升高至至少约50℃，和添加一种或多种糖苷增溶剂；然后除去酶或生物质。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述用于糖基化的底物以植物提取物或其级分的形式提供。
147.如权利要求145或146所述的方法，其中所述底物是选自以下的次级代谢物：萜类或萜类糖苷、类黄酮或类黄酮糖苷、聚酮类或聚酮类糖苷、芪类或芪类糖苷，以及多酚或多酚糖苷。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述底物包含萜类糖苷。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述萜类糖苷包括甜菊醇糖苷或罗汉果醇糖苷。
150.如权利要求147至149中任一项所述的方法，其中所述底物具有一、二、三或四个糖基。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述糖基独立地选自葡糖基、半乳糖基、甘露糖基、木糖基和鼠李糖基。
152.如权利要求151所述的方法，其中所述糖基化产物具有至少五个糖基、或至少六个、或至少七个糖基。
153.如权利要求145至152中任一项所述的方法，其中所述产物的生物合成涉及所述底物的至少两个糖基化反应。
154.如权利要求145至153中任一项所述的方法，其中所述植物提取物是甜叶菊叶子提取物或其级分。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述甜叶菊叶子提取物包含甜菊苷、甜菊醇二糖苷、莱鲍迪苷A、杜尔可苷A、杜尔可苷B、莱鲍迪苷C和莱鲍迪苷F中的一种或多种。
156.如权利要求155所述的方法，其中所述提取物或其级分中至少约30％的所述甜菊醇糖苷选自甜菊苷、甜菊醇二糖苷和莱鲍迪苷A。
157.如权利要求154至156中任一项所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebM。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述UGT酶能够在甜菊醇核心的C13和C19羟基处进行伯糖基化，以及C13和C19伯糖基的1-2和1-3分支糖基化。
159.如权利要求154至156中任一项所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebE和/或RebD。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述微生物细胞表达能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-2糖基化的一种或多种UGT酶。
161.如权利要求154至156中任一项所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebB。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述UGT酶能够使甜菊醇C19伯糖基去糖基化。
163.如权利要求154至156中任一项所述的方法，其中所述糖基化产物包含RebI。
164.如权利要求163所述的方法，其中一种或多种UGT酶能够对甜菊醇C13和C19伯糖基进行1-3糖基化。
165.如权利要求145至153中任一项所述的方法，其中所述植物提取物是罗汉果提取物或其级分。
166.如权利要求165所述的方法，其中所述罗汉果提取物包含选自以下的一种或多种底物：罗汉果醇、mog.I-A、mog.I-E、mog.II-A、mog.II-E、mog III、mog IVA、mog.IV和赛门苷。
167.如权利要求165或166所述的方法，其中所述糖基化产物包含mog.IV、mog.IVA、mog.V、mog.VI或赛门苷。
168.如权利要求165至167中任一项所述的方法，其中所述UGT酶能够在罗汉果醇核心的C3和C24羟基处进行伯糖基化，以及C3和/或C24伯糖基的一个或多个1-2和/或1-6分支糖基化。
169.如权利要求145至168中任一项所述的方法，其中所述酶促转移发生在微生物培养物中，所述微生物培养物包含表达一种或多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)酶的微生物菌株。
170.如权利要求169所述的方法，其中所述微生物菌株表达产生用于糖基化的底物的生物合成途径，并表达所述一种或多种UGT酶。
171.如权利要求169所述的方法，其中所述微生物菌株表达所述一种或多种UGT酶，并且所述菌株与进料底物一起培养。
172.如权利要求169至171中任一项所述的方法，其中所述酶促转移通过酵母菌株的微生物培养进行，所述酵母菌株任选地选自酵母属、毕赤酵母属或耶氏酵母属，包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和解脂耶氏酵母。
173.如权利要求169至171中任一项所述的方法，其中所述酶促转移通过细菌菌株的微生物培养进行。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述细菌菌株是埃希氏菌属某些种、芽孢杆菌属某些种、红杆菌属某些种、发酵单胞菌属某些种或假单胞菌属某些种。
175.如权利要求174所述的方法，其中所述细菌菌株是大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、荚膜红杆菌、球形红杆菌、运动发酵单胞菌或恶臭假单胞菌。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述细菌菌株是大肠埃希氏菌。
177.如权利要求173至176中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞具有增加UDP-糖利用度的一种或多种遗传修饰。
178.如权利要求173至177中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞表达蔗糖合酶，并且所述蔗糖合酶任选地包含与SEQ ID NO:1至12中的一种具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
179.如权利要求177或178所述的方法，其中所述细菌细胞包含所述遗传修饰：ushA和galETKM或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；pgi或其直系同源物缺失、失活或表达或活性降低；大肠埃希氏菌pgm(SEQ ID NO:92)和/或ycjU(SEQ ID NO:94)或其直系同源物或衍生物过表达或活性增加；以及大肠埃希氏菌galU(SEQ ID NO:93)和/或两歧双歧杆菌ugpA(SEQ ID NO:95)或其直系同源物或衍生物过表达或活性增加。
180.如权利要求145至179中任一项所述的方法，其中所述方法以分批、连续或半连续方式进行。
181.如权利要求180所述的方法，其中所述方法通过分批进料连续或半连续方式进行。
182.如权利要求180或181所述的方法，其中所述酶促转移发生在具有至少10,000L、或至少50,000L、或至少100,000L、或至少150,000L、或至少200,000L、或至少500,000L的体积的生物反应器中。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述糖苷中间体与所述微生物菌株一起孵育至少约24小时、或至少约48小时、或至少约72小时。
184.如权利要求182或183所述的方法，其中所述糖苷中间体与所述微生物菌株一起孵育约72小时或更短时间。
185.如权利要求145至184中任一项所述的方法，其中将所述pH调节至约2至约4范围内并且任选地约3.5的pH。
186.如权利要求145至184中任一项所述的方法，其中将所述pH调节至约9至约12范围内的pH。
187.如权利要求145至186中任一项所述的方法，其中将所述温度调节至介于约50℃和约90℃之间、并且任选地约70℃或约80℃的温度。
188.如权利要求185至187中任一项所述的方法，其中将反应或培养基从反应罐转移至收获罐用于pH和/或温度调节，并且其中所述反应罐和收获罐任选地串联。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述pH调节和温度调节在相同的收获罐中进行。
190.如权利要求188所述的方法，其中所述pH调节和温度调节在不同的收获罐中进行。
191.如权利要求189或190所述的方法，其中pH调节在温度调节之前进行。
192.如权利要求189或190所述的方法，其中温度调节在pH调节之前进行。
193.如权利要求189所述的方法，其中pH调节和温度调节基本上同时进行。
194.如权利要求185至193中任一项所述的方法，其中pH调节通过添加有机酸或无机酸进行。
195.如权利要求145至194中任一项所述的方法，其包括添加一种或多种糖苷增溶剂。
196.如权利要求187至195中任一项所述的方法，其中温度调节通过将反应介质或培养物转移至预热的收获槽进行。
197.如权利要求145至196中任一项所述的方法，其中通过离心除去生物质和/或酶，从而制备澄清的发酵液。
198.如权利要求197所述的方法，其中所述方法包括用圆盘堆叠式分离器除去生物质。
199.如权利要求198所述的方法，其中所分离的生物质被再处理用于糖苷产物回收。
200.如权利要求198所述的方法，其中所述生物质作为废物处理。
201.如权利要求197至200中任一项所述的方法，其中将所述澄清的发酵液直接或间接转移至一个或多个结晶容器中。
202.如权利要求201所述的方法，其中在结晶之前，使用选自过滤、离子交换、活性炭、膨润土、亲和色谱和消化中的一种或多种方法从所述澄清的发酵液中纯化糖苷产物。
203.如权利要求202所述的方法，其中所述亲和色谱采用苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂和疏水相互作用树脂中的一种或多种。
204.如权利要求202或203所述的方法，其中所述方法采用模拟移动床色谱法。
205.如权利要求203所述的方法，其中在结晶之前，通过任选地具有约5kD的膜孔径的切向流过滤(TFF)纯化糖苷产物。
206.如权利要求202至205中任一项所述的方法，其中回收不采用任何有机溶剂。
207.如权利要求202至206中任一项所述的方法，其中采用至少两个结晶步骤。
208.如权利要求207所述的方法，其中在重结晶步骤之前，通过将溶液或悬浮液的pH降低至低于约pH 5或将溶液或悬浮液的pH升高至高于约pH 9，将溶液或悬浮液的温度升高至至少约50℃，并添加一种或多种糖苷增溶剂来使糖苷产物重溶解。
209.如权利要求207所述的方法，其中重结晶在约4至约12的pH下进行。
210.如权利要求208或209所述的方法，其中重结晶溶剂为水，任选地具有约5体积％至约50体积％的乙醇，或约25体积％至约50体积％的乙醇，或约30体积％至约40体积％的乙醇。
211.如权利要求210所述的方法，其中重结晶在约0.1重量％至约2重量％范围内的一种或多种增溶剂存在下进行。
212.如权利要求211所述的方法，其中所述增溶剂是甘油。
213.如权利要求202至212中任一项所述的方法，其中结晶步骤包括静态结晶、搅拌结晶和蒸发结晶的一个或多个阶段。
214.如权利要求213所述的方法，其中结晶步骤包括静态阶段，随后是搅拌阶段。
215.如权利要求207至214中任一项所述的方法，其中使用篮式离心机或带式过滤器分离晶体，从而分离出糖苷湿滤饼。
216.如权利要求215所述的方法，其中洗涤甜菊醇糖苷湿滤饼。
217.如权利要求216所述的方法，其中所述湿滤饼在任选地包含乙醇的水溶液中洗涤。
218.如权利要求217所述的方法，其中将所述滤饼溶解并重结晶。
219.如权利要求218所述的方法，其中在重结晶之前，通过过滤和/或活性炭纯化所述产物。
220.如权利要求219所述的方法，其中所述过滤器材料是亲水性的，并且任选地是聚醚砜、尼龙、醋酸纤维素、硝酸纤维素和涂覆有氟代烷基封端的聚乙二醇的PTFE或PVDF。
221.如权利要求219或220所述的方法，其中所述过滤器的孔径为约0.2微米。
222.如权利要求219所述的方法，其中过滤包括热过滤和/或切向流过滤。
223.如权利要求222所述的方法，其中过滤包括使用孔径为约0.5kD的膜的切向流过滤。
224.如权利要求145至223中任一项所述的方法，其中从澄清的发酵液中的回收方法是非色谱的，并且任选地基本上由过滤和结晶组成。
225.如权利要求211至224中任一项所述的方法，其中将来自重结晶的所述湿滤饼干燥，任选地使用带式干燥器、桨式干燥器或喷雾干燥器。
226.如权利要求225所述的方法，其中将所干燥的滤饼研磨并任选地包装。
227.如权利要求145至226中任一项所述的方法，其中所述目标糖苷产物为回收的组合物的至少约75重量％。
228.如权利要求227所述的方法，其中所述目标糖苷产物为所述回收的组合物的至少约80重量％、或至少约90重量％、或至少约95重量％。
229.如权利要求145至228中任一项所述的方法，其中相对于所述培养物或反应的体积，所述糖基化产物的产量为至少约25g/L、或至少约50g/L、或至少约75g/L、或至少约100g/L、或至少约125g/L、或至少约150g/L、或至少约200g/L。
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US7989677B2 (en) * 2005-08-17 2011-08-02 Nestec S. A. Nucleic acids and proteins associated with sucrose accumulation in coffee
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EP3860364A1 (en) * 2018-11-07 2021-08-11 Firmenich Incorporated Methods for making high intensity sweeteners
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