JP2023550496A - グリコシド生成物の生合成及び回収 - Google Patents

グリコシド生成物の生合成及び回収 Download PDF

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Abstract

様々な態様及び実施形態では、本開示は、グリコシル化生成物を作製するための方法、ならびにそれに有用な細菌細胞及びウリジン二リン酸（ＵＤＰ）依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供する。他の態様及び実施形態では、本開示は、微生物培養または無細胞反応によるそのようなグリコシド生成物の高収率及び／または高純度回収のための方法を提供する。様々な態様及び実施形態では、本開示は、所望の基質のグリコシル化、及び／または、グリコシル化生成物の高収率及び／または高純度での回収を含む全細胞生物変換プロセスを提供する。

Description

小分子のグリコシルトランスフェラーゼは、植物界の大きな多重遺伝子ファミリーにコードされている。これらの酵素は、ヌクレオチド糖から広範囲の二次代謝生成物に糖を転移し、それにより、アクセプター分子の物理的及び化学的特性が変化する。例えば、ステビオールグリコシドは、南米の特定の地域原産のＡｓｔｅｒａｃｅａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）科の多年生低木であるＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉの葉に見出される化合物の一部類である。これらは、コアのテルペノイドであるステビオールを構造的に特徴とし、Ｃ１３及びＣ１９位に炭水化物残基が存在する点で異なる。それらは、ステビアの葉に蓄積し、総乾燥重量の約１０％～２０％を占める。乾燥重量基準で、ステビアの葉に見出される４つの主要なグリコシドには、通常、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、及びズルコシドＡが含まれる。レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＯ、ズルコシドＢ、ステビオールビオシド、ならびにルブソシドを含む他のステビオールグリコシドが、少量または微量で存在する。
微量グリコシル化生成物であるレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）は、スクロースよりも約２００～３５０倍強力であると推定されており、わずかに苦いまたはカンゾウの後味を伴うすっきりとした甘い味を有すると記載されている。Ｐｒａｋａｓｈ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｔｅｖｉａ Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ：Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｍ，Ｆｏｏｄｓ ３（１），１６２－１７５（２０１４）。ＲｅｂＭは、世界の食品産業の大きな関心を集めているが、ステビア抽出物の中で普及率が低いので、合成に革新的なプロセスを必要とする。
別の例として、モグロシドは、ウリ科植物Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ（別名モンクフルーツまたはラカンカ）の果実に見出されるトリテルペン由来の特殊な二次代謝生成物である。果実における生合成には、アグリコンモグロールの多数の連続的なグリコシル化が含まれる。食品業界では、天然の非糖食品甘味料としてモグロシド果実抽出物の使用が増加している。例えば、モグロシドＶ（ｍｏｇ．Ｖ）は、スクロースの約２５０倍の甘味能力を有する（Ｋａｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８９））。さらに、モグロシドの追加の健康上の利点が確認されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎ Ｊ Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１４））。
精製Ｍｏｇ．Ｖは、日本で高甘味度甘味料として承認されており、抽出物は、米国で非栄養甘味料及び風味増強剤としてＧＲＡＳステータスを取得している。果実からモグロシドを抽出すると、様々な純度の製品が得られ得るが、多くの場合、望ましくない後味が伴う。加えて、植物の収量が低く、植物の栽培要件が特殊であるので、栽培された果実からのモグロシドの収量は乏しい。モグロシドは、生の果物には、約１％、ドライフルーツには、約４％存在する。Ｍｏｇ．Ｖが主成分であり、ドライフルーツ中に０．５％～１．４％含まれる。さらに、精製の難しさにより、Ｍｏｇ．Ｖの純度が制限され、植物抽出物からの市販品は、約５０％のＭｏｇ．Ｖに標準化されている。純粋なＭｏｇ．Ｖ生成物は、異臭が発生する可能性が低く、製品への配合が容易となり、溶解可能性も良好であるので、混合物よりも商業的な成功を収める可能性が高い。それ故、バイオテクノロジープロセスを介して甘いモグロシド化合物を製造することは有利である。
天然植物抽出物の少量生成物であるものを含む、高価値のグリコシドを製造するための経済的な方法に対するニーズが依然としてある。
様々な態様及び実施形態では、本開示は、グリコシル化生成物を作製するための方法、ならびにそれに有用な細菌細胞及びウリジン二リン酸（ＵＤＰ）依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供する。他の態様及び実施形態では、本開示は、微生物培養または無細胞反応によるグリコシド生成物の高収率及び／または高純度回収のための方法を提供する。様々な態様及び実施形態では、本開示は、所望の基質のグリコシル化とそれに続く、グリコシル化生成物の高収率及び／または高純度での回収を含む全細胞生物変換プロセスを提供する。
一態様では、本発明は、細菌細胞及びグリコシル化生成物の製造方法を提供する。特に、本開示は、全細胞生物変換プロセスに従って、所望の基質をグリコシル化するための１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上の組み換えスクロースシンターゼ酵素を発現する。スクロースシンターゼの発現は、供給された基質の全細胞グリコシル化を劇的に増強し得る。代替的または追加的に、細菌細胞は、ＵＤＰ－糖の利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子改変を含む。細菌細胞は、グリコシル化のための基質の存在下で培養され、任意に、本明細書に記載の回収プロセスを使用して、グリコシル化生成物が回収される。
細胞がＵＤＰ－グルコース補因子の再生をもたらすので、全細胞生物変換系には、無細胞系に優る利点がある。本発明の実施形態では、触媒反応（グリコシル化）は、生きた細菌細胞を用いて実行され、ＵＤＰ－グルコース補因子のリサイクルは、酵素の供給またはＵＤＰ－グルコース再生のための高価な基質の供給を必要とせずに、細胞代謝を使用して行われる。Ｅ．ｃｏｌｉを含む様々な細菌種は、本開示に従って使用され得る。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、組み換えスクロースシンターゼ酵素を発現し、細菌細胞は、スクロースの存在下で培養され得る。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号１～１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、ＵＤＰ－グルコースの利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子改変、例えば、ＵＤＰ－グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減、を有する。低減または除去することができる他のＵＤＰ－グルコースシンクには、脂質のグリコシル化及びＬＰＳ生合成を担う遺伝子、ならびにウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）のグリコシル化に関与している遺伝子の活性または発現の除去または低減が含まれる。これらまたは他の実施形態では、細菌細胞は、ＵＤＰ－グルコースの前駆体を消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。これらまたは他の実施形態では、細胞は、グルコース－６－リン酸をＵＤＰ－グルコースに変換することに関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現または活性の増加を有する。代替的または追加的に、細菌細胞は、グルコース輸送を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する。代替的または追加的に、微生物細胞は、ＵＴＰの生成及びリサイクルを増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する。代替的または追加的に、微生物細胞は、ＵＤＰ産生を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する。代替的または追加的に、微生物細胞は、グルコース取り込みの調節を除去または低減させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。代替的または追加的に、微生物細胞は、グルコース－１－リン酸の脱リン酸化を低減させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。代替的または追加的に、細菌細胞は、グルコース－１－リン酸のＴＤＰ－グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子改変を有する。代替的または追加的に、細菌細胞は、グルコース－１－リン酸のＡＤＰ－グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。
様々な実施形態では、グリコシル化のための基質は、植物抽出物もしくはその画分として提供されるか、または、合成的にもしくは生合成プロセスにより生成される。例示的な基質としては、テルペノイドまたはテルペノイドグリコシド、フラボノイドまたはフラボノイドグリコシド、カンナビノイドまたはカンナビノイドグリコシド、ポリケチドまたはポリケチドグリコシド、スチルベノイドまたはスチルベノイドグリコシド、及びポリフェノールまたはポリフェノールグリコシドから選択されるような様々な二次代謝生成物が挙げられる。植物抽出物は、分画するか、または、別の方法で所望の基質を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、基質には、ステビオールもしくはステビオールグリコシド、またはモグロールもしくはモグロールグリコシドなどのテルペノイドグリコシドが含まれる。ＵＧＴ酵素、及び関連基質（所望の基質が濃縮された画分を含む）は、所望のグリコシル化生成物を生成するように選択することができる。いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、とりわけ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＢ、及び／またはＲｅｂＩなどの１つ以上のステビオールグリコシド、またはｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ．ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ．Ｖ、及び／またはシアメノシドなどのモグロールグリコシドを含む。
他の態様及び実施形態では、本発明は、テルペノイドグリコシド基質を含み、且つ本明細書に記載の細菌細胞及び方法と関連したものを含む、基質をグリコシル化するための高い生産性を有する改変ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供する。いくつかの実施形態では、改変ＵＧＴ酵素は、配列番号１３と少なくとも約７０％の配列同一性を有し且つテルペノイドグリコシド基質（例えば、ステビオールグリコシド基質）に対するグリコシル化活性を向上させる１つ以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１４と少なくとも約７０％の配列同一性を有し且つテルペノイドグリコシド基質（例えば、ステビオールグリコシド基質）に対するグリコシル化活性を向上させる１つ以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１５と少なくとも約７０％の配列同一性を有し且つテルペノイドグリコシド基質（例えば、ステビオールグリコシド基質）に対するグリコシル化活性を向上させる１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
他の態様及び実施形態では、本発明は、モグロールまたはモグロールグリコシド基質をグリコシル化するためのＵＧＴ酵素（それを発現する微生物細胞を含む）を提供する。これらの態様及び実施形態では、方法は、ＵＤＰ－糖の存在下で基質をＵＧＴ酵素と接触させることを含む。ＵＧＴ酵素は、配列番号８４、配列番号８０、配列番号４６、配列番号８３、配列番号８２、配列番号７３、配列番号７２、配列番号７８、配列番号５４、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２９、及び配列番号７９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。これらの実施形態では、モグロールまたはモグロールグリコシド基質は、モンクフルーツ抽出物またはその画分などの植物抽出物またはその画分として提供され得る。例えば、基質は、モグロール、ｍｏｇ．Ｉ－Ａ、ｍｏｇ．Ｉ－Ｅ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅ、ｍｏｇ ＩＩＩ、ｍｏｇ ＩＶＡ、ｍｏｇ．ＩＶ、及びシアメノシドから選択される１つ以上の基質を含んでもよい（または濃縮されていてもよい）。いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ．Ｖ、及びシアメノシドのうちの１つ以上を含んでもよい。様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、モグロールコアのＣ３及びＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびにＣ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２及び１－６分岐グリコシル化が可能であることがある。
モグロールグリコシドの生成に関するいくつかの実施形態では、基質は、ＵＧＴ酵素を発現する微生物細胞と共に培養される。例示的な微生物細胞としては、本明細書に記載の全細胞生物変換プロセスのために改変された細菌細胞が挙げられる。さらに他の実施形態では、微生物細胞は、酵母細胞である。しかし、さらに他の実施形態では、基質は、ＵＧＴ酵素を含む細胞溶解物と共にインキュベートされるか、または既知の手法に従って精製組み換えＵＧＴ酵素と共にインキュベートされる。
いくつかの態様では、本発明は、グリコシド生成物を製造及び回収する方法を提供する。そのような実施形態では、本方法は、無細胞反応または微生物培養中での１つ以上の糖部分の酵素的転移により、グリコシル化のための基質を標的グリコシド生成物に変換することを含み、これは、任意に、ＵＧＴ酵素、及び／または本明細書に記載の微生物株などの方法を用いてもよい。本方法は、さらに、反応物または培養物からグリコシド生成物を回収すること（回収することは、反応物または培養物のｐＨを約ｐＨ５未満または約１０超に調整すること、温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド可溶化剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去することを含む）を含む。
従来、バイオマス除去は、大きな細胞破片を除去し且つ下流の精製を複雑にする細胞の破壊を回避する回収の最初のステップである。しかし、本発明の実施形態によれば、培養材料は、粘度が高く、処理困難である可能性がある。バイオマスまたは酵素の除去前に、本明細書に記載の培養材料を処理することにより、高純度のグリコシド生成物、魅力的な色、容易な可溶化、無臭、及び／または高回収率を含む望ましい品質を備えた生成物を生成することが可能である。例えば、培養物の初期のｐＨ及び温度の調整により、ブロスの流体特性が変化し、バイオマス除去用のディスクスタック分離機の効率が向上し得る。さらに、ｐＨ及び／または温度の調整、及び／またはグリコシド可溶化剤の添加により、グリコシド生成物の溶解度とそれによる生産量が実質的に増加し得る。
本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な開示及び実施例から明らかになるであろう。
ＵＧＴ酵素を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の２つの染色体改変（（１）ΔｏｔｓＡ－ｏｔｓＢ；（２）ΔｏｔｓＡ－ｏｔｓＢ、ｕｇｐＡの挿入）によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。 ＵＧＴ酵素を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における過剰発現遺伝子からのステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。遺伝子は、プラスミド上で補完された。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。補完された遺伝子は、左から右に：（１）対照（空のプラスミド）、（２）ｐｇｍ（配列番号９２）及びｇａｌＵ（配列番号９３）、（３）ｐｇｍ（配列番号９２）、（４）ｇａｌＵ（配列番号９３）、（５）ｕｇｐＡ（配列番号９５）、（６）ｙｃｊＵ（配列番号９４）、（７）ａｄｋ（配列番号９６）、（８）ｎｄｋ（配列番号９７）、（９）ｐｙｒＨ、（１０）ｃｍｋ（配列番号９８）である。 ＵＧＴ酵素を発現し、過剰発現されたスクロースシンターゼを有する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。遺伝子は、プラスミド上で補完された。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。補完された遺伝子は、左から右に：（１）対照（空のプラスミド）、（２）ＳｔＳｕｓ１（配列番号１）、（３）ＳｔＳｕｓ２（配列番号２）、（４）ＳｔＳｕｓ２＿Ｓ１１Ｅ（配列番号３）、（５）ＡｃＳｕＳｙ（配列番号４）、（６）ＡｃＳｕＳｙ＿Ｌ６３７Ｍ－Ｔ６４０Ｖ（配列番号５）、（７）ＡｔＳｕｓ１（配列番号６）、（８）ＡｔＳｕｓ３（配列番号７）、（９）ＶｒＳＳ１（配列番号８）、（１０）ＶｒＳＳ１＿Ｓ１１Ｅ（配列番号９）、（１１）ＧｍＳＳ（配列番号１０）、（１２）ＧｍＳＳ＿Ｓ１１Ｅ（配列番号１１）、（１３）ＡｔＳｕｓＡ（配列番号１２）である。 ＵＧＴ酵素を発現し且つ様々な遺伝子ノックアウトを有する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。欠失は、（左から右に）：（１）ΔｏｔｓＡ、（２）Δｕｇｄ、（３）ΔｒｆａＱＰＳＢＩＪ、（４）ΔｙｆｄＧＨＩ、（５）ΔｗｃａＪ、及び（６）ΔｇｌｇＣである。 配列番号１４で定義されるＵＧＴ酵素（ＭｂＵＧＴ１，２．３）を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。向上倍数は、親ＵＧＴ酵素（配列番号１３）のステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。 配列番号１５で定義されるＵＧＴ酵素（ＭｂＵＧＴ１，２．４）を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。向上倍数は、親ＵＧＴ酵素（配列番号１４）のステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。 配列番号１６で定義されるＵＧＴ酵素（ＭｂＵＧＴ１，２．５）を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。向上倍数は、親ＵＧＴ酵素（配列番号１５）のステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。 ステビア葉抽出物の、配列番号１５のＵＧＴ酵素（ＭｂＵＧＴ１，２．４）の発現による、レバウジオシドＥ及びレバウジオシドＤの混合物への、ならびに配列番号２５のＵＧＴ酵素（ＭｂＵＧＴ１－３．３）の発現による、レバウジオシドＩへの、改変Ｅ．ｃｏｌｉ生物変換株による生物変換を示す。 配列番号３１及び配列番号９９のＵＧＴ酵素の発現による、ステビア葉抽出物のレバウジオシドＢ及びステビオールビオシドの混合物への、改変Ｅ．ｃｏｌｉ変換株による生物変換を示す。 ステビオールグリコシドを回収するための従来のプロセスを示すフローチャートである。通常、所望の生成物の精製を容易にするために、最初に大きな細胞破片、酵素、及びインタクトな細胞全体を除去するバイオマス除去が実行される。 本発明の実施形態による、グリコシド生成物の回収の例示的なプロセスを示すフローチャートである。バイオマスの除去前に、ｐＨ及び／または温度の調整及び／または可溶化剤の添加は、加工用の培養材料の物理的特性を向上させるために用いられ、これにより、グリコシド生成物の生産量が増加させながらバイオマスの除去が促進される。 遠心分離後の水性ブロスからのバイオマスの分離に対する様々な処理の効果を示す。ペレットの緻密さ及び上澄みの透明度は、バイオマス除去の容易さの指標として機能する。チューブは、左から右に：（１）２２℃（室温）、ｐＨ６．６４；（２）２２℃（室温）、エタノール；（３）２２℃（室温）、ｐＨ３．７８、＋エタノール；（４）２２℃（室温）、ｐＨ３．７８；（５）７０℃、ｐＨ６．６４；（６）７０℃、エタノール；（７）７０℃、ｐＨ３．７８、＋エタノール；及び（８）７０℃、ｐＨ３．７８、である。 再結晶化前の溶液の濾過が、純度に影響を及ぼし、フィルター材料の選択が、最終生成物の品質に重大な影響を与えることを示す。図１３は、再結晶化前の溶液を濾過するポリプロピレン（ＰＰ）（左）及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（右）材料の使用を比較する。高純度のＲｅｂＭの最終生成物（＞９８％）をプロピレングリコールに溶解させ、１０重量％の濃度にする。ＰＰフィルターを使用すると、非常に濁っている溶液がもたらされるが、ＰＥＳフィルターを使用すると、透明な溶液が得られる。 結晶成長の制御を可能にする、水中のＲｅｂＭについて決定された準安定領域幅を定義する溶解度（下の曲線）及び準安定限界曲線（上の曲線）を示す。 Ａ、Ｂは、ｐＨ７の６７％の水／３３％のエタノール中のＲｅｂＭについて決定された、準安定領域幅を定義する溶解度（下の曲線）及び準安定限界曲線（上の曲線）を示し、この溶媒系中での結晶成長の制御を可能にする。Ａは、０％のグリセロールであるが、Ｂには、０．５％のグリセロールが含まれる。 Ａ、Ｂは、ｐＨ１１の６７％の水／３３％のエタノール中のＲｅｂＭについて決定された、準安定領域幅を定義する溶解度（下の曲線）及び準安定限界曲線（上の曲線）を示し、この溶媒系中での結晶成長の制御を可能にする。Ａは、０％のグリセロールであるが、Ｂには、０．５％のグリセロールが含まれる。 酵素１（配列番号７１）または酵素２（配列番号３３）のいずれかを発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を使用した、モグロールのモグロシド化合物（ｍｏｇＩＩＥ、ｍｏｇ－ＩＥ、及びｍｏｇ－ＩＡ）への生物変換を示す。 酵素１（配列番号７１）、酵素３（配列番号８１）、酵素４（配列番号８２）、及び酵素５（配列番号８３）を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を使用した、モグロールのモグロシド－ＩＡへの生物変換を示す。 Ａ及びＢは、酵素１（配列番号８４）、酵素２（配列番号７１）、または酵素３（配列番号３３）のいずれかを発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を使用した、ｍｏｇ－ＩＡ（図１８Ａ）またはｍｏｇ－ＩＥ（図１８Ｂ）のｍｏｇ－ＩＩＥへの生物変換を示す。 酵素１（配列番号７２）、酵素２（配列番号５４）、または酵素３（配列番号１３）を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株による、ＭｏｇＩＩ－ＥからのＭｏｇ－ＩＩＩまたはシアメノシドの生成を示す。 酵素１（配列番号７３）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞によるＭｏｇＩＩ－Ａ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を示す。 ステビオール及びステビオールグリコシド中間体に対するＵＧＴ酵素の作用により生成されたグリコシル化生成物を示す。 Ｍｏｇ．Ｖへのグリコシル化経路を示す。バブル構造は、様々なモグロシドを表す。白い四環式コアは、モグロールを表す。各構造の下の数字は、特定のグリコシル化モグロシドを示す。黒丸は、Ｃ３またはＣ２４のグルコシル化を表す。濃灰色の縦の円は、１，６－グルコシル化を表す。薄灰色の水平の円は、１，２－グルコシル化を表す。略称：Ｍｏｇ、モグロール；シア、シアメノシド。
様々な態様及び実施形態では、本開示は、グリコシル化生成物を作製するための方法、ならびにそれに有用な細菌細胞及びウリジン二リン酸（ＵＤＰ）依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供する。他の態様及び実施形態では、本開示は、微生物培養または無細胞反応によるグリコシド生成物の高収率及び／または高純度回収のための方法を提供する。様々な態様及び実施形態では、本開示は、所望の基質のグリコシル化とそれに続く、グリコシル化生成物の高収率及び／または高純度での回収を含む全細胞生物変換プロセスを提供する。
一態様では、本発明は、細菌細胞及びグリコシル化生成物の製造方法を提供する。細菌細胞は、所望の基質をグリコシル化するために１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、さらに、１つ以上の組み換えスクロースシンターゼ酵素を発現する。スクロースシンターゼの発現は、供給された基質の全細胞グリコシル化を劇的に増強し得る（図３を参照）。代替的または追加的に、細菌細胞は、ＵＤＰ－糖の利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子改変を含む。細菌細胞は、グリコシル化のための基質の存在下で培養され、任意に、本明細書に記載の回収プロセスを使用して、グリコシル化生成物が回収される。
細胞がＵＤＰ－グルコース補因子の再生をもたらすので、全細胞生物変換系には、グリコシル化反応について無細胞系に優る利点がある。これは、細胞溶解からの酵素または細胞外の分泌物を使用するプロセスと対照的であり、これは、外因性のＵＤＰ－グルコース供給またはＵＤＰ－グルコース前駆体またはＵＤＰ－グルコース再生機構またはＵＤＰ－グルコース再生酵素系を必要とする。本発明の実施形態では、触媒反応（グリコシル化）は、生きた細菌細胞を用いて実行され、ＵＤＰ－グルコース補因子のリサイクルは、酵素の供給またはＵＤＰ－グルコース再生のための高価な基質の供給を必要とせずに、細胞代謝を使用して行われる。本開示に従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種を含む様々な細菌種が使用され得る。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａである。例示的な実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、組み換えスクロースシンターゼ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素を発現する細菌細胞は、スクロースの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号１～１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。図３に示されるように、細菌細胞におけるスクロースシンターゼの発現により、細胞全体に供給される基質のグリコシル化の劇的な増強がもたらされる。様々な実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号１～１２から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号２と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号２のアミノ酸配列についてＳ１１ＥまたはＳ１１Ｄ置換を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号３と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号３のアミノ酸配列について、Ｌ６３７（例えば、（Ｌ６３７Ｍ））及びＴ６４０（例えば、Ｔ６４０Ｖ、Ｔ６４０Ｌ、Ｔ６４０Ｉ、またはＴ６４０Ａ）の１つ以上にアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号５と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号６と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号７と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号７のアミノ酸配列についてＳ１１ＥまたはＳ１１Ｄ置換を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号８と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号８のアミノ酸配列についてＳ１１ＥまたはＳ１１Ｄ置換を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号９と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号１０と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号１０のアミノ酸配列についてＳ１１ＥまたはＳ１１Ｄ置換を含む。
いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、配列番号１１と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
酵素の三次元構造及び関連活性部位、基質結合部位、及び他の相互作用部位の位置を知ることにより、誘導体の合理的な設計が容易になり、特定の変化の表現型に対する機構的な洞察が得られ得る。植物のスクロースシンターゼ酵素は、高度に保存されたＳ１１及びアナログの位置がリン酸化されると、活性の増加を示している。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼ酵素は、Ｓ１１ＥまたはＳ１１Ｄ変異を含み、これは、負荷電リン酸塩が見出される場所に負電荷を配置することによりリン酸化を模倣する。Ｓｔｅｉｎ Ｏ．ａｎｄ Ｇｒａｎｏｔ Ｄ．，Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０１９；１０：９５に記載または参照されているような一般公開されている構造により、スクロースシンターゼ酵素に対する他の改変を誘導することができる。
代替的または追加的に、細菌細胞は、ＵＤＰ－糖（例えば、ＵＤＰ－グルコース）の利用可能性を向上させる１つ以上の遺伝子改変を含み、これは、図１、２、及び４に示されるように、所望の基質をグリコシル化するための全細胞生物変換を増強する。指数関数的に成長するＥ．ｃｏｌｉにおける野生型ＵＤＰ－グルコースレベルは、約２．５ｍＭである（Ｂｅｎｎｅｔｔ ＢＤ，Ｋｉｍｂａｌｌ ＥＨ，Ｇａｏ Ｍ，Ｏｓｔｅｒｈｏｕｔ Ｒ，Ｖａｎ ｄｉｅｎ ＳＪ，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＤ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９；５（８）：５９３－９．）。いくつかの実施形態では、宿主細胞に対する遺伝子改変は、指数関数的に成長する細胞（例えば、ＵＧＴ酵素の組み換え発現を有さない）において、例えば、少なくとも約５ｍＭ、または少なくとも約１０ｍＭまで、ＵＤＰ－グルコースを増加させるように改変される。
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、ＵＤＰ－グルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。例えば、細菌細胞は、細菌種において、ｕｓｈＡ（ＵＤＰ－糖加水分解酵素）及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭ（ＵＤＰ－グルコースからＵＤＰ－ガラクトース生合成に関与する）またはそのオルソログのうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子は、不活性化されているか、欠失しているか、または発現もしくは活性が実質的に減少している。代替的または追加的に、細菌細胞は、細菌種において、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｔｓＡ（トレハロース－６－リン酸シンターゼ）またはそのオルソログの欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。代替的または追加的に、微生物細胞は、細菌種において、Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｇｄ（ＵＤＰ－グルコース６－デヒドロゲナーゼ）またはそのオルソログの欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。ｏｔｓＡ及びｕｇｄの活性を低減または排除すると、それぞれ、ＵＤＰ－グルコースシンクをトレハロースまたはＵＤＰ－グルクロニデートに除去または低減し得る。
低減または除去することができる他のＵＤＰ－グルコースシンクには、脂質のグリコシル化及びＬＰＳ生合成を担う遺伝子、ならびにウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）のグリコシル化に関与している遺伝子の活性または発現の除去または低減が含まれる。脂質のグリコシル化またはＬＰＳ生合成に関与する遺伝子には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｗａａＧ（リポ多糖グルコシルトランスフェラーゼ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｗａａＯ（ＵＤＰ－Ｄ－グルコース：（グルコシル）ＬＰＳα－１，３－グルコシルトランスフェラーゼ））、及びＥ．ｃｏｌｉ ｗａａＪ（ＵＤＰ－グルコース：（グリコシル）ＬＰＳα－１，２－グルコシルトランスフェラーゼ））が含まれる。ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）のグリコシル化に関与する遺伝子には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｆｄＧ（推定上のバクトプレノール結合グルコーストランスロカーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｆｄＨ（バクトプレノールグルコシルトランスフェラーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｆｄＩ（血清型特異的グルコシルトランスフェラーゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ ｗｃａＪ（ウンデカプレニルリン酸グルコースホスホトランスフェラーゼ）が含まれる。これらの遺伝子生成物（または細菌細胞の対応するオルソログ）の１つ以上の欠失、不活化、または活性または発現の低減により、ＵＤＰ－グルコースの利用可能性が増加し得る。
これらまたは他の実施形態では、細菌細胞は、ＵＤＰ－グルコースの前駆体を消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、宿主細胞の細菌種において、ｐｇｉ（グルコース－６リン酸イソメラーゼ）またはそのオルソログの欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。
これらまたは他の実施形態では、細胞は、グルコース－６－リン酸をＵＤＰ－グルコースに変換することに関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現または活性の増加を有する。例えば、ｐｇｍ（ホスホグルコムターゼ）及び／またはｇａｌＵ（ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）（またはそのオルソログもしくは誘導体）を過剰発現するか、または酵素生産性を増加させるように改変することができる。代替的または追加的に、グルコース－６－リン酸をグルコース－１－リン酸に変換するＥ．ｃｏｌｉ ｙｃｊＵ（β－ホスホグルコムターゼ）、及びグルコース－１－リン酸をＵＤＰ－グルコースに変換するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ、またはこれらの酵素のオルソログもしくは誘導体を過剰発現するか、または酵素の生産性を増加させるように改変することができる。
代替的または追加的に、細菌細胞は、グルコース輸送を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する。そのような改変には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＰ（ガラクトース：Ｈ＋共輸送体）及びＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｋ（グルコキナーゼ）の発現または活性の増加、あるいは、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ｇｌｆ及びＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｋ、またはこれらの遺伝子のオルソログもしくは改変誘導体の発現が含まれる。
代替的または追加的に、微生物細胞は、ＵＴＰの生成及びリサイクルを増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する。そのような改変には、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）もしくはＥ．ｃｏｌｉ ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）、またはこれらの酵素のオルソログもしくは改変誘導体の発現または活性の増加が含まれる。
代替的または追加的に、微生物細胞は、ＵＤＰ産生を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する。そのような改変には、それらのオルソログまたは改変誘導体を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｃｔＡ（Ｃ４ジカルボン酸／オロチン酸：Ｈ＋シンポーター）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｙｒＥ（オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｙｒＦ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｙｒＨ（ＵＭＰキナーゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ ｃｍｋ（シチジル酸キナーゼ）のうちの１つ以上の過剰発現または活性の増加が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、微生物細胞は、ｕｐｐ、ｐｙｒＨ、及びｃｍｋ、あるいはそれらのオルソログもしくは改変誘導体を過剰発現するか、またはそれらの活性が増加している。あるいは、微生物細胞は、ｄｃｔＡ、ｐｙｒｅ、ｐｙｒＨ、及びｃｍｋ、あるいはそれらのオルソログもしくは改変誘導体を過剰発現するか、またはそれらの活性が増加している。
代替的または追加的に、微生物細胞は、グルコース取り込みの調節を除去または低減させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。例えば、微生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける小さな調節ＲＮＡであるｓｇｒＳの欠失、不活化、または発現の低減を有し得る。
代替的または追加的に、微生物細胞は、グルコース－１－リン酸の脱リン酸化を低減させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。例示的な改変としては、細菌細胞における、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｇｐ（グルコース－１－ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｉｈＸ（α－Ｄ－グルコース－１－リン酸ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｂｉＶ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｉｄＡ（糖ホスファターゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｉｇＬ（リン酸糖ホスファターゼ）、及びＥ．ｃｏｌｉ ｐｈｏＡ（アルカリホスファターゼ）、またはそれらのオルソログのうちの１つ以上の欠失、不活性化、または発現もしくは活性の低減が挙げられる。
代替的または追加的に、細菌細胞は、グルコース－１－リン酸のＴＤＰ－グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。例示的な改変としては、細菌細胞における、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｆｆＨ（ｄＴＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ）及びＥ．ｃｏｌｉ ｒｆｂＡ（ｄＴＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）またはそのオルソログのうちの１つ以上の欠失、不活化、または発現もしくは活性の低減が挙げられる。
代替的または追加的に、細菌細胞は、グルコース－１－リン酸のＡＤＰ－グルコースへの変換を減少させる１つ以上の遺伝子改変を有してもよい。例示的な改変としては、細菌細胞における、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｇＣ（グルコース－１－リン酸アデニリルトランスフェラーゼ）またはそのオルソログの欠失、不活化、または発現もしくは活性の低減が挙げられる。
例えば、いくつかの実施形態では、ｕｓｈＡ（ＵＤＰ－糖ジホスファターゼ）及びｇａｌＥＴＫＭまたはそのオルソログは、欠失しているか、不活性化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；ｐｇｉ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）またはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現または活性が低減しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）及び／またはｙｃｊＵ（配列番号９４）もしくはオルソログが、過剰発現されているか、または野生型酵素と比較して活性が増加している誘導体が発現されており；ならびに、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ（配列番号９３）及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（配列番号９５）またはオルソログが、過剰発現されているか、または野生型酵素と比較して活性が増加しているその誘導体が発現されている。
細菌株がＥ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）及び／またはｙｃｊＵ（配列番号９４）もしくはオルソログを過剰発現するか、または野生型酵素と比較して増加した活性を有する誘導体を発現するか；あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ（配列番号９３）を過剰発現するか、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（配列番号９５）もしくはそのオルソログもしくは誘導体（例えば、野生型酵素よりも活性が高い）を発現する様々な実施形態では、補完遺伝子は、それぞれ、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９３、または配列番号９５と、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％と同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｐｇｍまたはそのオルソログもしくは誘導体（例えば、野生型酵素よりも活性が高い誘導体）、及び、任意に、ｇａｌＵまたはそのオルソログもしくは誘導体（例えば、野生型酵素よりも活性が高い誘導体）の過剰発現を含む。さらにいくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｕｓｈＡもしくはそのオルソログ、及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭ、もしくはそのオルソログ（複数可）のうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。例えば、ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子またはそのオルソログは、不活性化されているか、欠失しているか、または発現もしくは活性が低減していることがある。いくつかの実施形態では、ｐｇｉ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）またはそのオルソログは、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減している。
代替的または追加的に、細菌細胞は、ｏｔｓＡ（トレハロース－６－リン酸シンターゼ）もしくはそのオルソログ、及び／またはｏｔｓＢ（トレハロース－リン酸ホスファターゼ）もしくはそのオルソログの欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。
代替的または追加的に、細菌細胞は、ｕｇｄ（ＵＤＰ－グルコース６－デヒドロゲナーゼ）またはそのオルソログ；ｒｆａＱ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｂ－Ｉ－Ｊまたはそのオルソログ（複数可）；ｙｆｄＧ－Ｈ－Ｉまたはそのオルソログ（複数可）；ｗｃａＪまたはそのオルソログ；及びｇｌｇＣまたはそのオルソログのうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する。
例示的な実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｃｊＵ（β－ホスホグルコムターゼ）（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）（配列番号９６）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）（配列番号９７）またはそのオルソログもしくは誘導体、及びＥ．ｃｏｌｉ ｃｍｋ（シチジン一リン酸キナーゼ）（配列番号９８）またはそのオルソログもしくは誘導体のうちの１つ以上の過剰発現または活性もしくは発現の増加を有する。様々な実施形態では、誘導体酵素は、野生型酵素よりも酵素活性が高くなるように改変され得る。補完遺伝子は、それぞれ、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、または配列番号９８と、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。
ＵＤＰ－糖の利用可能性を向上させる、細菌細胞への他の改変は、ＵＳ２０２０／００８７６９２に記載されており、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、グリコシル化のための基質は、植物抽出物もしくはその画分として提供されるか、または、合成的にもしくは生合成プロセスにより生成される。例示的な基質としては、テルペノイドまたはテルペノイドグリコシド、フラボノイドまたはフラボノイドグリコシド、カンナビノイドまたはカンナビノイドグリコシド、ポリケチドまたはポリケチドグリコシド、スチルベノイドまたはスチルベノイドグリコシド、及びポリフェノールまたはポリフェノールグリコシドから選択されるような様々な二次代謝生成物が挙げられる。植物抽出物は、分画するか、または、別の方法で所望の基質を濃縮することができる。
いくつかの実施形態では、基質は、テルペノイド及び／またはテルペノイドグリコシド、例えば、ステビオールもしくはステビオールグリコシド、またはモグロールもしくはモグロールグリコシド（「モグロシド」）を含む。いくつかの実施形態では、基質は、主に０～約４つのグリコシル基を有し、これには、グルコシル、ガラクトシル、マンノシル、キシロシル、及び／またはラムノシル基が含まれ得る。様々な実施形態では、グリコシル基は、主にグルコシルである。全細胞生物変換後、様々な実施形態では、グリコシル化生成物は、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのグリコシル基（例えば、グルコシル）を有するであろう。様々な実施形態では、全細胞生物変換は、細菌細胞による基質の少なくとも２つのグリコシル化反応を含む。いくつかの実施形態では、全細胞生物変換により、基質の単一のグリコシル化または脱グリコシル化がもたらされる（ＵＧＴにより触媒される逆反応の場合）。
様々な実施形態では、基質は、標的基質が濃縮され得るステビア葉抽出物またはその画分として提供される。例えば、ステビア葉抽出物は、ステビオール、ステビオシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、ズルコシドＡ、ズルコシドＢ、レバウジオシドＣ、及びレバウジオシドＦのうちの１つ以上を含むか、またはそれらが濃縮されていてもよい。いくつかの実施形態では、抽出物またはその画分中のステビオールグリコシドの少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％には、ステビオシド、ステビオールビオシド、及びレバウジオシドＡのうちの１つ以上が含まれる。
ＵＧＴ酵素、及び関連基質（所望の基質が濃縮された植物抽出物画分を含む）は、所望のグリコシル化生成物を生成するために選択することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＵＧＴ酵素は、配列番号１３～８４、及び９９のいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、少なくとも１つのＵＧＴ酵素は、配列番号１３～８４及び９９のいずれか１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本開示の実施形態によれば、ＵＧＴ酵素は、分泌または輸送シグナルなしで発現され、膜アンカードメインを含有しない。
酵素の三次元構造及び関連活性部位、基質結合部位、及び他の相互作用部位の位置を知ることにより、誘導体の合理的な設計が容易になり、特定の変化の表現型に対する機構的な洞察が得られ得る。植物ＵＧＴは、アミノ酸配列の同一性が比較的低いが、高度に保存された二次及び三次構造を共有する。Ｏｓｍａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＵＤＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０（２００９）３２５－３４７。ＵＧＴの糖受容体及び糖供与体基質は、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメイン間に形成される裂け目に収容されている。一次配列のいくつかの領域は、構造的に保存されたドメインならびにアミノ酸配列及び配列長の両方に関して異なるループ領域を含む基質結合ポケットの形成に寄与する。
いくつかの実施形態では、基質は、テルペノイドグリコシドであり、いくつかの実施形態では、ステビオールグリコシドまたはモグロシドを含んでもよい。配列番号１３～３９、４６、５４、６０、７１～８４、及び９９で定義されるＵＧＴ酵素を含む、テルペノイドまたはテルペノイドグリコシド足場に対するグリコシルトランスファーゼ活性を有する多数のＵＧＴ酵素が本明細書に記載されている。表１、８、及び９を参照のこと。
例えば、いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、レバウジオシド（ステビオールグリコシド）である。これらの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、ステビオールコアのＣ１３及び／またはＣ１９ヒドロキシルにおける一次グリコシル化；Ｃ１３及び／またはＣ１９の一次グリコシル基の１－２分岐グリコシル化；ならびにＣ１３及び／またはＣ１９の一次グリコシル基の１－３分岐グリコシル化の１つ以上が可能である。図２１を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３～３２、及び８４の１つと、少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される。
ステビオール及びステビオールグリコシドのグリコシル化のためのＵＧＴ酵素（ＲｅｂＭの生合成用のものを含む）は、ＵＳ２０１７／０３３２６７３及び２０２０／００８７６９２に開示されており、これらは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＵＧＴ酵素が、以下の表１に記載されている。
Figure 2023550496000001
いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、モグロシドである。様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、モグロールコアのＣ３及び／またはＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、Ｃ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２分岐グリコシル化；及び／またはＣ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－６分岐グリコシル化のうちの１つ以上が可能である。これらの実施形態に有用なＵＧＴ酵素が、表８及び表９に示される。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３～１７、２９、３３～３９、４６、５４、６０、７１～８０、及び８２～８４のうちの１つと、少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される。
酵素のアミノ酸配列が変化すると、活性が変化するか、または測定可能な効果がなくなる可能性がある。測定可能な効果を伴わないサイレントな変化は、多くの場合、活性部位及び基質結合部位から離れた位置にある、溶媒に曝露された表面上の保存的置換及び小さな挿入または欠失である。対照的に、酵素活性は、非保存的置換、大きな挿入または欠失、ならびに活性部位、基質結合部位内、及びタンパク質のフォールディングまたは立体配座に重要な埋没位置内の変化に影響を受ける可能性が高い。酵素活性を変える変化により、反応速度が増加もしくは減少するか、または特定の基質に対する親和性もしくは特異性が増加もしくは減少し得る。例えば、基質結合部位のサイズを増加させる変化は、酵素がより大きな基質に作用することを可能にすることがあり、触媒アミノ酸側鎖を基質上の標的部位の近くに配置する変化は、酵素速度を増加させ得る。
いくつかの実施形態では、「合理的設計」は、酵素における特定の変異の構築に関与する。合理的設計は、酵素または関連酵素に関する知識、例えば、反応熱力学及び反応速度論、三次元構造、活性部位（複数可）、その基質（複数可）、及び／または酵素及び基質間の相互作用を、特定の変異の設計に組み込むことを指す。合理的設計アプローチに基づいて、酵素に、変異を作成することができ、次に、これを、対照レベルと比較してテルペンまたはテルペノイドの生成の増加についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、相同性モデリングに基づいて変異を合理的に設計することができる。本明細書で使用される場合、「相同モデリング」は、アミノ酸配列由来のタンパク質の原子分解能モデル及び関連相同タンパク質の三次元構造から構築するプロセスを指す。
アミノ酸配列の同一性、すなわち、配列同一性の割合を、配列アラインメントで決定することができる。いくつかの既知のアルゴリズム、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７）に記載のもの、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ）、またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３－８０）を用いて、そのようなアラインメントを実施することができる。配列同一性（配列マッチング）の程度は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、またはＢｌａｓｔＺ（もしくはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算され得る。同様のアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質のアライメントは、ＢＬＡＳＴＰプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で実施され得る。比較目的でギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーターが使用される。
ＵＧＴ酵素または他の発現酵素は、微生物細胞の染色体に組み込まれても、染色体外で発現されてもよい。例えば、ＵＧＴ酵素は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現され得る。
ＵＧＴ酵素（または他の発現酵素）のうちの１つ以上のアミノ酸配列には、任意に、細胞内のターンオーバーを減少させる、２位に挿入または置換されたアラニンが含まれ得る。様々な実施形態では、１つ以上のＵＧＴ酵素は、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる安定性を提供するために、２位に挿入または置換されたアラニンアミノ酸残基を含む。
酵素の発現は、例えば、遺伝子モジュール（例えば、オペロン）または酵素の独立した発現を使用して、最適な活性になるように調整することができる。例えば、遺伝子またはオペロンの発現は、異なる強度（例えば、強い、中間、または弱い）を有する誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターなどのプロモーターの選択を通して調節することができる。異なる強度のプロモーターのいくつかの非限定例としては、Ｔｒｃ、Ｔ５、及びＴ７が挙げられる。さらに、遺伝子またはオペロンの発現は、細胞内の遺伝子またはオペロンのコピー数を操作することにより制御することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、各ＵＧＴ酵素の単一コピーを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現は、モジュール内の遺伝子の順序を操作することにより調節することができ、最初に転写される遺伝子は、一般に、より高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現は、１つ以上の遺伝子またはオペロンの染色体への組み込みにより調節される。
発現の最適化は、適切なプロモーター及びリボソーム結合部位の選択により達成することもできる。いくつかの実施形態では、これには、高コピー数プラスミド、または単一、低コピー数、もしくは中コピー数のプラスミドの選択が含まれ得る。転写終結のステップは、ステムループなどの構造の導入または除去により、遺伝子発現の調節の標的とすることもできる。
発現に必要なエレメントを全て含有する発現ベクターは、市販されており、当業者らに既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。細胞は、異種ＤＮＡを細胞に導入することにより遺伝子改変されている。宿主細胞内での異種ＤＮＡの発現を可能にするために、異種ＤＮＡが、転写エレメントの作動可能な制御下に置かれる。
いくつかの実施形態では、遺伝子補完とは対照的に、内因性遺伝子が編集されている。編集は、内因性プロモーター、リボソーム結合配列、または他の発現制御配列を改変し得、及び／または、いくつかの実施形態では、遺伝子調節におけるトランス作用因子及び／またはシス作用因子を改変する。ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集手法、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮを用いる同様の手法を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子は、相同組み換えで置換されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、遺伝子コピー数を制御することにより少なくとも部分的に過剰発現されている。遺伝子のコピー数は、コピー数が異なるプラスミドを使用して都合よく制御することができるが、遺伝子重複及び染色体への組み込みを用いることもできる。例えば、遺伝的に安定なタンデム遺伝子複製のプロセスは、ＵＳ２０１１／０２３６９２７に記載されており、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ＲｅｂＭを含む。これらの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、ステビオールコアのＣ１３及びＣ１９ヒドロキシルにおける一次グリコシル化；Ｃ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１－２分岐グリコシル化；ならびにＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１－３分岐グリコシル化が可能である。図２１を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３～３２、及び８４の１つと、少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される。そのような実施形態では、本開示に従って回収されるグリコシル化生成物は、総ステビオールグリコシド成分に対して、少なくとも約５０％のＲｅｂＭ、または少なくとも約７５％のＲｅｂＭ、または少なくとも約８５％のＲｅｂＭ、または少なくとも約９０％のＲｅｂＭ、または少なくとも約９５％のＲｅｂＭである。
いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤを含む。そのような実施形態では、細菌細胞は、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～２グリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現し得る。いくつかの実施形態では、グリコシル化のための基質は、ＲｅｂＡ及びステビオシドを主成分として（例えば、基質のステビオールグリコシド組成物の少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％）含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３～１６及び２６～２９の１つと、少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有する酵素から選択される。そのような実施形態では、本開示に従って回収されるグリコシル化生成物は、総ステビオールグリコシド成分に対して、少なくとも約５０％のＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤ、または少なくとも約７５％のＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤ、または少なくとも約８５％のＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤ、または少なくとも約９０％のＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤ、または少なくとも約９５％のＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤである。
いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ＲｅｂＢを含む。そのような実施形態では、細菌細胞は、ステビオールＣ１９の一次グリコシル基の脱グリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、グリコシル化のための基質は、ＲｅｂＡを主成分として（例えば、基質のレバウジオシド組成物の少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％）含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１８、３０、３１、及び９９の１つと、少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有する酵素から選択される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、配列番号３１または配列番号９９と、少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有するＵＧＴ酵素を発現する。このような実施形態では、本開示に従って回収されるグリコシル化生成物は、総ステビオールグリコシド成分に対して、少なくとも約５０％のＲｅｂＢ、または少なくとも約７５％のＲｅｂＢ、または少なくとも約８５％のＲｅｂＢ、または少なくとも約９０％のＲｅｂＢ、または少なくとも約９５％のＲｅｂＢである。
いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ＲｅｂＩを含む。そのような実施形態では、細菌細胞は、ステビオールＣ１９の一次グリコシル基の１～３つのグリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する。いくつかの実施形態では、グリコシル化のための基質は、ＲｅｂＡを主成分として（例えば、基質のステビオールグリコシドの組成物の少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％）含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１９～２５の１つと、少なくとも約７０％（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％）の配列同一性を有する酵素から選択される。このような実施形態では、本開示に従って回収されるグリコシル化生成物は、総ステビオールグリコシド成分に対して、少なくとも約５０％のＲｅｂＩ、または少なくとも約７５％のＲｅｂＩ、または少なくとも約８５％のＲｅｂＩ、または少なくとも約９０％のＲｅｂＩ、または少なくとも約９５％のＲｅｂＩである。
いくつかの実施形態では、基質は、モンクフルーツ抽出物もしくはその画分、または生合成的に生成されたモグロールもしくはモグロールグリコシドとして提供される。例えば、基質は、モグロール、ｍｏｇ．Ｉ－Ａ、ｍｏｇ．Ｉ－Ｅ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅ、ｍｏｇ ＩＩＩ、ｍｏｇ ＩＶＡ、ｍｏｇ．ＩＶ、及びシアメノシドから選択される１つ以上の基質を含んでもよい。グリコシル化生成物は、例えば、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ．Ｖ、及びシアメノシドのうちの１つ以上を含んでもよい。図１８を参照のこと。様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、モグロールコアのＣ３及び／またはＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびにＣ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２分岐グリコシル化；ならびにＣ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－６分岐グリコシル化のうちの１つ以上が可能である。いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ｍｏｇ．Ｖまたはシアメノシドである。様々な実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３～１７、２９、３３～３９、４６、５４、６０、７１～８０、及び８２～８４のうちの１つと、少なくとも約７０％（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される。表８及び９を参照のこと。様々な実施形態では、本方法は、（回収された組成物の総モグロールグリコシド成分に対して）基質のグリコシル化生成物への少なくとも約４０％の変換、または基質のグリコシル化生成物への少なくとも約５０％の変換、または基質のグリコシル化生成物への少なくとも約７５％の変換、または基質のグリコシル化生成物への少なくとも約９０％の変換、または基質のグリコシル化生成物への少なくとも約９５％の変換をもたらす。
様々な実施形態では、細菌細胞バイオマスは、複合または最小培地中での成長により生成される。次に、細菌細胞は、１つ以上の炭素源によるグリコシル化のための基質の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、炭素源は、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、及びグリセロールのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、炭素源には、スクロース、ならびにグリセロール及びグルコースのうちの１つ以上が含まれる。一般に、好適な炭素源には、Ｃ１～Ｃ６炭素源が含まれる。培養条件を、好気、微好気、及び嫌気から選択することができる。培養は、バッチ式、連続式、または半連続式プロセスで実施され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、流加プロセスとして実施される。
いくつかの実施形態では、基質は、細菌細胞と共に約７２時間以下、または約４８時間以下でインキュベートされる。特定の実施形態では、基質は、例えば、撹拌タンク発酵槽を使用して、細菌細胞と共に１～約３日間インキュベートされる。様々な実施形態では、グリコシド生成物は、本明細書の他の箇所に記載されているように回収される。例えば、回収は、培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、またはｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去すること、を含んでもよい。
他の態様及び実施形態では、本発明は、テルペノイドグリコシド基質を含み、且つ本明細書に記載の細菌細胞及び方法と関連したものを含む、基質をグリコシル化するための高い生産性を有する改変ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供する。いくつかの実施形態では、改変ＵＧＴ酵素は、配列番号１３と少なくとも約７０％の配列同一性（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の配列同一性）を有し、且つテルペノイドグリコシド基質（例えば、ステビオールグリコシド基質）に対するグリコシル化活性を向上させる１つ以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、配列番号１３に関して、Ｖ３９７Ｓ、Ｖ３９７Ｃ、Ｇ５Ｎ、Ｓ２０Ｅ、Ｓ２３Ｄ、Ｒ４５Ｙ、Ｈ５９Ｐ、Ｇ９４Ｓ、Ｋ９７Ｅ、Ｍ１５０Ｌ、Ｉ１８５Ｆ、Ａ２０６Ｐ、Ｇ２１０Ｅ、Ｑ２３７Ｒ、Ｍ２５０Ｋ、Ａ２５１Ｅ、Ｃ２５２Ｌ、Ｇ２５９Ｅ、Ｑ２６３Ｙ、Ｉ２８７Ｍ、Ｃ２８８Ｆ、Ｖ３３６Ｉ、Ｆ３３８Ｌ、Ｄ３５１Ｅ、Ｆ１８６Ｉ、Ｆ１８６Ｍ、Ｆ１８６Ｔ、Ｌ４１８Ｆ、Ａ４５１Ｔ、Ａ４５１Ｌ、Ｔ４５３Ｋ、Ｔ４５３Ｒ、Ｖ４５６Ｓ、Ｖ４５６Ｗ、Ｖ４５６Ｔ、Ｖ４５６Ｍから選択される１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のアミノ酸置換を含む。表２を参照のこと。代替的または追加的に、アミノ酸改変は、配列番号１３の残基２７０～２８１の、主にグリシン及びセリンアミノ酸から構成される５～１５アミノ酸との置換を含む。代替的または追加的に、アミノ酸改変は、配列番号１３に関して、３位での１つもしくは２つのアミノ酸の挿入、及び／または配列番号１３のＣ末端へのアミノ酸の付加を含む。
いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号８５）による配列番号１３のアミノ酸２７０～２８１の置換を有する。これらまたは他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３に関して、３位にＡｒｇの挿入、または２位及び３位間にＩｌｅ－Ａｒｇの挿入を有する。これらまたは他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１３に関して、Ｇ５Ｎ、Ｆ１８６Ｔ、及びＶ３９７Ｓから選択される１つ以上（または全て）の置換を含む。この態様の例示的なＵＧＴ酵素は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。図５を参照のこと。
さらに他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１４と少なくとも約７０％（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％）の配列同一性を有し、且つテルペノイドグリコシド基質（例えば、ステビオールグリコシド基質）に対するグリコシル化活性を向上させる１つ以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を含む。例えば、アミノ酸改変は、配列番号１４に関して、Ｖ３９５Ａ、Ｑ２６３Ｙ、Ｄ２６９Ｒ、Ｋ９７Ｅ、Ｑ２６２Ｅ、Ｈ５９Ｐ、Ｇ２５９Ｅ、Ｍ１５０Ｌ、Ｙ２６７Ｈ、Ｔ３Ｒ、Ｖ９５Ｑ、Ａ２３８Ｅ、Ｓ３０８Ｑ、Ｑ２３７Ｒ、Ｒ４５Ｙ、Ｅ２５４Ｄ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ１５１Ｒ、Ｓ１２３Ｄ、Ｄ３５１Ｅ、Ｔ４５３Ｍ、Ｇ９４Ｔ、Ｔ１８６Ｍ、Ｖ３３６Ｉ、Ｌ５８Ｓ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ５１Ｗ、Ｃ２５２Ｌ、Ｍ２５０Ｄ、Ａ２５１Ｅ、Ｃ２５２Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｗ４０１Ｆ、Ｓ３２３Ａ、Ａ２５１Ｅ、Ａ１３０Ｄ、Ｓ４２Ｅ、Ｈ４００Ｙ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２３Ｄ、Ｐ５６Ａ、Ａ２０６Ｐ、Ｍ２５０Ｋ、Ａ１４３Ｗ、Ｖ４５６Ｔ、Ｇ９４Ｓ、Ｉ４２７Ｆ、Ｔ１８６Ｉ、Ｔ４５３Ｆ、Ｃ２５２Ｒ、Ｖ３８Ｆ、Ｒ４５Ｆ、Ｔ３７Ｓ、Ｑ２４４Ｋ、Ｌ１１Ｉ、Ｉ２８７Ｍ、Ｖ３１Ｐ、Ｔ４３Ｄ、及びＰ３９Ｔから選択される、１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のアミノ酸置換を含んでもよい。表３を参照のこと。代替的または追加的に、アミノ酸改変は、主にグリシン及びセリンアミノ酸からなる５～１５アミノ酸のリンカーを用いる、配列番号１４の残基２７０～２８１の欠失を含む。代替的または追加的に、ＵＧＴ酵素は、配列番号１４に関して、３位での１つもしくは２つのアミノ酸の挿入、及び／または配列番号１４のＣ末端へのアミノ酸の付加を含む。
いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、主にＳｅｒ及びＧｌｙから構成される６～１２アミノ酸のリンカー配列による配列番号１４のアミノ酸２７０～２８１の置換を有する。これらまたは他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１４に関して、Ｈ５９Ｐ、Ａ２３８Ｅ、及びＬ４１７Ｆから選択される１つ以上の置換（または全ての置換）を含む。これらまたは他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１４のＡ２及びＴ３間に挿入またはＡｒｇ－Ａｒｇを含む。これらの実施形態による例示的なＵＧＴ酵素は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。図９を参照のこと。
さらに他の実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１５と少なくとも約７０％（または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％）の配列同一性を有し、且つテルペノイドグリコシド基質（例えば、ステビオールグリコシド基質）に対するグリコシル化活性を向上させる１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。このようなアミノ酸置換は、配列番号１５に関して、１２５、１５２、１５３、及び４４２から選択される位置にあってよい。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号１５に関して、Ｍ１５２Ａ、Ｓ１５３Ａ、Ｐ４４２Ｄ、及びＳ１２５Ｖから選択される１つ以上（または全て）のアミノ酸置換を含む。表４を参照のこと。これらの実施形態による例示的なＵＧＴ酵素は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。図７を参照のこと。
他の態様及び実施形態では、本発明は、モグロールまたはモグロールグリコシド基質をグリコシル化するためのＵＧＴ酵素（それを発現する細菌細胞を含む）を提供する。これらの実施形態では、本方法は、ＵＤＰ－糖（例えば、ＵＤＰ－グルコース）の存在下で基質をＵＧＴ酵素と接触させることを含む。ＵＧＴ酵素は、配列番号８４、配列番号８０、配列番号４６、配列番号８３、配列番号８２、配列番号７３、配列番号７２、配列番号７８、配列番号５４、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２９、及び配列番号７９から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。表８及び９を参照のこと。
様々な実施形態では、基質は、配列番号８４、配列番号８０、配列番号８３、配列番号７３、配列番号７２、配列番号５４、及び配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＧＴ酵素と接触させる。
これらの実施形態では、モグロールまたはモグロールグリコシド基質は、モンクフルーツ抽出物またはその画分などの植物抽出物またはその画分として提供され得る。例えば、基質は、モグロール、ｍｏｇ．Ｉ－Ａ、ｍｏｇ．Ｉ－Ｅ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅ、ｍｏｇ ＩＩＩ、ｍｏｇ ＩＶＡ、ｍｏｇ．ＩＶ、及びシアメノシドから選択される１つ以上の基質を含んでもよい（または濃縮されていてもよい）。これらの実施形態では、グリコシル化生成物は、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ．ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ Ｖ、及びシアメノシドのうちの１つ以上を含んでもよい。例えば、ＵＧＴ酵素は、モグロールコアのＣ３及び／またはＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、及び／またはＣ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２及び／または１－６分岐グリコシル化のうちの１つ以上が可能であることがある。これらの実施形態による例示的な生成物は、ｍｏｇ．Ｖである。他のモグロシド生成物（ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＶＩ、及びシアメノシドを含む）を調製することができ、ＵＧＴ酵素は、グリコシル化活性により選択される。
モグロールグリコシドの生成に関するいくつかの実施形態では、基質は、ＵＧＴ酵素を発現する微生物細胞と共に培養される。例示的な微生物細胞としては、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種が挙げられる。例示的な細菌細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａが挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。様々な実施形態では、細菌細胞は、本明細書に記載される全細胞生物変換プロセスについて改変され、これは、例えば、本明細書の他の場所に記載されるように、ＵＤＰ－糖の利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有し、及び／またはスクロースシンターゼを発現する。
さらに他の実施形態では、微生物細胞は、酵母細胞であり、これは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、またはＹａｒｒｏｗｉａの種から選択され得る。
しかし、さらに他の実施形態では、基質は、ＵＧＴ酵素を含む細胞溶解物と共にインキュベートされるか、または既知の手法に従って精製組み換えＵＧＴ酵素と共にインキュベートされる。グリコシル化反応をサポートするＵＤＰ－糖を外部から添加することができる。
様々な実施形態では、グリコシル化生成物は、以下に記載される方法に従って回収される。そのような方法は、反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去すること、を含み得る。
いくつかの態様では、本発明は、グリコシド生成物を製造及び回収する方法を提供する。そのような実施形態では、本方法は、無細胞反応または微生物培養中での１つ以上の糖部分の酵素的転移により、グリコシル化のための基質を標的グリコシド生成物に変換することを含み、これは、任意に、ＵＧＴ酵素、及び／または本明細書に記載の細菌細胞などの方法を用いてもよい。本方法は、さらに、反応物または培養物からグリコシド生成物を回収することを含み、回収することは、反応物または培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させること、反応物または培養物のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド可溶化剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去することを含む。
従来、大きな細胞破片を除去し、下流の精製を複雑にする細胞のさらなる破壊を回避するバイオマス除去は、回収の最初のステップである。しかし、本発明のいくつかの実施形態によれば、培養材料は、粘度が高く、処理が困難である。例えば、遠心分離によるバイオマス除去の効率を、採取された培養材料の物理的特性により制限することができる。バイオマスまたは酵素の除去前に、本明細書に記載の培養材料を処理することにより、高純度のグリコシド生成物、白色、容易な可溶化、無臭、及び高い回収率を含む望ましい品質を備えた生成物を生成することが可能である。特に、培養物の初期のｐＨ及び温度の調整により、ブロスの流体特性が変化し、バイオマス除去のためのディスクスタック分離機の効率が向上し得る。さらに、ｐＨ及び温度の調整により、グリコシド生成物の溶解度とそれによる生産量が実質的に増加し、これにより、固相でのグリコシド生成物の大幅な損失が回避される。
様々な実施形態では、グリコシル化生成物は、テルペノイドグリコシド、例えば、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＢ、及びＲｅｂＩ（例えば、本明細書で説明）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、グリコシル化生成物は、ＲｅｂＭである。他の実施形態では、グリコシル化生成物には、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ．ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ．Ｖ、及びシアメノシド（本明細書に記載）のうちの１つ以上が含まれる。例示的なモグロシド生成物は、ｍｏｇ．Ｖである。
いくつかの実施形態では、酵素的転移は、微生物培養物中に生じ、微生物培養物は、１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する微生物株を含む（例えば、供給された基質を使用する全細胞生物変換）。他の実施形態では、微生物株は、さらに、グリコシル化のための基質（例えば、ステビオールまたはモグロール）を生成する生合成経路を発現し、基質をグリコシル化するための１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する。例えば、米国特許第１０，４６３，０６２号及びＷＯ２０１９／１６９０２７（これらは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。様々な実施形態では、酵素的転移は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、またはＹａｒｒｏｗｉａから選択されるような酵母株の微生物培養によるものである。他の実施形態では、酵素的転移は、（例えば、本明細書に記載されるように、１つ以上のスクロースシンターゼ酵素を発現し、及び／または、ＵＤＰ－糖の利用可能性を向上させる１つ以上の遺伝子改変を含む）いくつかの実施形態で、全細胞生物変換のために改変されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む、本明細書に記載の細菌細胞の微生物培養によるものである。例えば、細菌細胞は、遺伝子改変を含んでもよく、例えば、ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭまたはそのオルソログが欠失しているか、不活性化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；ｐｇｉまたはそのオルソログが欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）及び／またはｙｃｊＵ（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体（例えば、野生型酵素よりも活性が高い誘導体）が過剰発現されており；ならびに／またはＥ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ（配列番号９３）及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体（例えば、野生型酵素よりも活性が高い誘導体）が過剰発現されている。
いくつかの実施形態では、酵素的転移は、少なくとも約１０，０００Ｌ、または少なくとも約５０，０００Ｌ、または少なくとも約１００，０００Ｌ、または少なくとも約１５０，０００Ｌ、または少なくとも約２００，０００Ｌ、または少なくとも約５００，０００Ｌの容積を有するバイオリアクター内で行われる。様々な実施形態では、培養材料は、バッチ式、連続式、または半連続式でグリコシドを回収するために採取され得る。
いくつかの実施形態では、採取された培養材料は、例えば、約２～約５の範囲内のｐＨにｐＨ調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約２～約４の範囲のｐＨ、または約２～約３．５のｐＨ、または約２．５～約４の範囲内のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約２．５、約３．０、または約３．５に調整される。さらに他の実施形態では、ｐＨは、塩基性ｐＨ範囲、例えば、約９～約１２の範囲内、または約９．５～約１２の範囲内、または約１０～約１２の範囲内（例えば、約１１、約１１．５、または約１２）のｐＨに調整される。様々な実施形態では、ｐＨ調整により、グリコシドの溶解度が向上し、及び／または採取された材料の物理的特性が向上し、その結果、バイオマス及び／または酵素は、生成物に大きな損失を与えることなく、より容易に除去される。ｐＨ調整は、既知の方法に従って、有機酸または無機酸または水酸化物イオンの添加または滴定によるものであってよい。
代替的または追加的に、採取された培養材料の温度は、約５０℃～約９０℃、例えば、約５０℃～約８０℃、の温度に調整される。例えば、いくつかの実施形態では、温度は、約５５℃～約７５℃の範囲の温度、または約６５℃～約７５℃の範囲の温度に調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約７０℃に調整される。様々な実施形態では、温度調整により、グリコシドの溶解度が向上し、及び／または採取された材料の物理的特性が向上し、その結果、生成物に大きな損失を与えることなく、バイオマス及び／または酵素がより容易に除去される。いくつかの実施形態では、温度調整は、反応培地または培養物を予熱した採取タンクに移すことにより行われる。いくつかの実施形態では、温度調整は、例えば、次の単位動作に向かう途中で保持ループを通過することにより、インラインで行われる。
いくつかの実施形態では、採取された反応物または培養物は、ｐＨ及び／または温度調整のために反応タンクから採取タンクに移され、これは、同じ採取タンク内で、または異なる採取タンク内で行われ得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ及び／または温度の調整は、連続的な単位操作としてインラインで行われる。温度及びｐＨの調整は、任意の順序で、または同時に行われ得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ調整は、温度調整前に行われる。他の実施形態では、温度調整は、ｐＨ調整前に行われる。さらに他の実施形態では、ｐＨ調整及び温度調整は、実質的に同時に行われる。
代替的または追加的に、本方法は、１つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することを含む。例示的な溶解促進剤としては、アルコール官能基を有する化学試薬（有機酸及びポリマーを含む）及び／または極性試薬（エーテル、エステル、アルデヒド、及びケトン官能基を有するものを含む）が挙げられ、限定されないが、とりわけ、グリセロール、１，３－プロパンジオール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールを含む。他の例示的な溶解促進剤としては、有機酸、糖類、及び多糖類が挙げられる。他の溶解性促進剤は、ＵＳ２０２０／０２６８０２６に記載されており、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。グリコシドの溶解度が向上すると、生成物を大幅に損失することなくバイオマス及び／または酵素の除去が容易になる。一般に、溶解促進剤を、約０．１重量％～約２重量％の範囲、例えば、約０．１重量％～約１重量％の範囲（例えば、約０．５重量％）で、採取された培養材料に添加することができる。
その後、バイオマス及び／または酵素が、遠心分離で除去され、それにより、清澄化ブロスが調製される。バイオマス除去の例示的なプロセスは、液相及び固相を分離するディスクスタック遠心分離機を用いる。清澄化ブロス（液相）は、グリコシド生成物を精製するさらなる処理のために回収される。分離されたバイオマス（固相）は、さらに、グリコシド生成物を回収するために再処理することも、廃棄物として処理することもできる。
いくつかの実施形態では、グリコシドは、清澄化ブロスから結晶化される。いくつかの実施形態では、プロセスには、１、２、または３つの結晶化ステップが含まれる。いくつかの実施形態では、グリコシド生成物は、濾過、イオン交換、活性炭、ベントナイト、アフィニティークロマトグラフィー、及び消化から選択される１つ以上のプロセスを使用して、清澄化ブロスから精製され、これらは、任意に、結晶化前及び／または再結晶化前に行うことができる。これらのプロセスは、高い生成物純度、魅力的な色（ＲｅｂＭの場合は白色）、容易な可溶化、無臭、及び高い回収率を達成するために選択することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、スチレン－ジビニルベンゼン吸着樹脂、強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂、及び疎水性相互作用樹脂のうちの１つ以上を備えるアフィニティークロマトグラフィーを用いる。さらに他の実施形態では、このプロセスは、米国特許第１０，２１３，７０７号（これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の模擬移動床クロマトグラフィーを用いる。さらに他の実施形態では、回収プロセスは、実質的なコスト上の利点を提供する非クロマトグラフィー（すなわち、クロマトグラフィーステップがない）である。例えば、バイオマス除去後の回収プロセスは、濾過及び結晶化ステップから本質的に構成されるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、回収プロセスは、有機溶媒（例えば、エタノール）を用いるが、他の実施形態では、プロセスは、完全に水性溶媒を用いるものである。いくつかの実施形態では、２つの結晶化ステップが用いられる。
いくつかの実施形態では、回収プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の１つ以上のステップが含まれるであろう。例えば、孔径が約５ｋＤのフィルターを備えたＴＦＦは、最終粉末生成物の溶解性も高めながら、エンドトキシン、大きなタンパク質、及び他の細胞破片を除去し得る。いくつかの実施形態では、最初の結晶化前に、グリコシド生成物は、任意に、膜孔径が約５ｋＤのタンジェンシャルフロー濾過で精製される。小分子の不純物及び塩を除去し、及び／または再結晶のために母液を濃縮するために、孔径が約０．５ｋＤのフィルターを備えたＴＦＦを下流で使用することもできる。いくつかの実施形態では、再結晶化前に、孔径が約０．５ｋＤのＴＦＦが用いられる。
いずれの場合も、結晶化ステップには、静的結晶化、撹拌結晶化、及び蒸発結晶化のうちの１つ以上の段階が含まれ得る。例えば、結晶化ステップは、結晶形態を制御するために、静止相とそれに続く撹拌相を含んでもよい。静止相は、結晶ドメインの程度が高い大きな結晶を成長し得る。結晶化プロセスには、結晶の種付けを含み得るか、または、いくつかの実施形態では、結晶の種付けを含まない（すなわち、結晶が自発的に形成される）。様々な実施形態では、結晶化溶媒は、水または水／エタノールを含む。例示的な結晶化溶媒としては、水（任意に、約５体積％～約５０体積％のエタノール、または約２５体積％～約５０体積％のエタノール（例えば、約３０体積％～約４０体積％のエタノール）を含む）が挙げられる。いくつかの実施形態では、静止相中に結晶を種付けした後、撹拌相により、結晶が急速に成長し、非晶質ドメインの程度が増加するであろう。このプロセスを使用すると、得られる結晶は、グリコシド生成物の最終溶解度が良好で純度が高いことがあり、回収及び洗浄が容易になり得る。
様々な実施形態では、再結晶化前に、グリコシド生成物は、溶媒（限定されないが、水及び／またはエタノールなど）中で再可溶化され、これは、溶媒及びグリコシド生成物の溶液もしくは懸濁液のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または溶液もしくは懸濁液のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、少なくとも約５０℃に加熱すること、ならびに、１つ以上のグリコシド可溶化剤を添加することのうちの１つ以上を用いてもよい。あるいは、ｐＨ、温度、グリコシド可溶化剤濃度の目標値を、バイオマス除去に用いることができる。例えば、グリコシド生成物の溶液または懸濁液は、約２～約５の範囲内にｐＨ調整され得る。他の実施形態では、ｐＨは、塩基性ｐＨ範囲、例えば、約９～約１２の範囲内のｐＨ、または約９．５もしくは約１０～約１２の範囲内のｐＨに調整される。ｐＨ調整は、既知の方法に従って、有機または無機の酸または水酸化物イオンの添加または滴定によるものであってよい。さらに他の実施形態では、再結晶化は、約４～約１２のｐＨで実施される。代替的または追加的に、溶液または懸濁液の温度は、約５０℃～約９０℃、例えば、約５０℃～約８０℃の温度に調整される。例示的な再結晶化溶媒としては、水（任意に、約５体積％～約５０体積％のエタノール、または約２５体積％～約５０体積％のエタノール（例えば、約３０体積％～約４０体積％のエタノール）を含む）が挙げられる。代替的または追加的に、溶解促進剤を、記載されているように、約０．１重量％～約２重量％の範囲、例えば、約０．１重量％～約１重量％の範囲（例えば、約０．５重量％）で溶液／懸濁液に添加することができる。溶解促進剤の例としては、グリセロールが挙げられる。
いくつかの実施形態では、結晶化後に、得られる結晶が、例えば、バスケット型遠心分離機またはベルトフィルターを使用して単離され、それにより、グリコシドのウェットケーキ（例えば、ステビオールグリコシドまたはモグロールグリコシドのウェットケーキ）が単離される。バスケット型遠心分離ステップでの洗浄は、水を用いる洗浄を用い得るか、または代わりに他のすすぎ（例えば、冷水／エタノール）を用いることができる。いくつかの実施形態では、ケーキは、溶解され、再結晶化される。次に、再結晶化によるウェットケーキを、任意に、ベルト乾燥機、パドル乾燥機、または噴霧乾燥機を使用して乾燥させ得る。ドライケーキを粉砕して包装することができる。
再結晶化前に、不純物を除去するために、グリコシド溶液（例えば、ＲｅｂＭ及び他のステビオールグリコシド）を濾過することができる。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．２ミクロンのフィルターであり得る。あるいは、約０．４５ミクロンのフィルター及び約１．２ミクロンのフィルターなどの他の孔径を用いることができる。実施形態によれば、例えば、吸着により、さらに不純物を除去するために、フィルターの材料を選択することができる。例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）などの親水性材料には、ポリプロピレンなどの疎水性材料に優る利点がある。他の例示的な親水性フィルター材料としては、ナイロン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、及び、通常、親水性材料がもたらされるように官能化されている疎水性材料（例えば、フルオロアルキル末端ポリエチレングリコールでコーティングされたＰＴＦＥまたはＰＶＤＦ）が挙げられる。
様々な実施形態では、回収プロセスにより、標的グリコシドの高純度組成物が得られる。例えば、いくつかの実施形態では、標的グリコシド生成物は、回収された組成物の少なくとも約７５重量％である。いくつかの実施形態では、標的グリコシド生成物は、回収された組成物の少なくとも約８０重量％、または少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９５重量％である。例示的な実施形態では、グリコシル化生成物の生産量は、培養物または反応物１リットル当たりの少なくとも約２５グラムの生成物（ｇ／Ｌ）、または少なくとも約５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約７５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｇ／Ｌ、または少なくとも約１２５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｇ／Ｌである。
いくつかの態様では、本発明は、ステビオールグリコシドまたはモグロールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭまたはｍｏｇ．Ｖ）などのグリコシル化生成物を含む生成物を作製する方法を提供する。本方法は、グリコシド生成物（本開示に従って製造）を、製品、例えば、食品、飲料、オーラルケア製品、甘味料、香味料、または他の製品に組み込むことを含む。本発明に従って調製された精製グリコシドは、限定されないが、食品、飲料、テクスチャラント（例えば、デンプン、繊維、ガム、脂肪及び脂肪模倣物、ならびに乳化剤）、医薬組成物、タバコ製品、栄養補助食品組成物、口腔衛生組成物、ならびに化粧組成物を含む様々な製品に使用され得る。グリコシドを組み合わせて使用することができるフレーバーの非限定例としては、ライム、レモン、オレンジ、フルーツ、バナナ、グレープ、ナシ、パイナップル、マンゴー、ビターアーモンド、コーラ、シナモン、砂糖、綿菓子、及びバニラフレーバーが挙げられる。他の食品成分の非限定例としては、香味料、酸味料、及びアミノ酸、着色剤、増量剤、加工デンプン、ガム、テクスチャライザー、防腐剤、酸化防止剤、乳化剤、安定剤、増粘剤、及びゲル化剤が挙げられる。
いくつかの態様では、本発明は、複数の高甘味度甘味料を含む甘味料製品を作製する方法を提供し、該複数は、以下のうちの２つ以上を含む：ステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＩ、もしくはＲｅｂＢ）、モグロシド（例えば、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ．ＶＩ、もしくはｉｓｏｍｏｇ．Ｖ）、スクラロース、アスパルテーム、ネオテーム、アドバンテーム、アセスルファムカリウム、サッカリン、糖アルコール（例えば、エリスリトールもしくはキシリトール）、タガトース、シクラメート、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、グネチフォリンＥ、及び／またはピセアタンノール４’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド。本方法は、さらに、甘味料製品を食品、飲料、オーラルケア製品、甘味料、香味料、または上記のものを含む他の製品に組み込むことを含んでもよい。
標的グリコシド（複数可）、例えば、ＲｅｂＭまたはｍｏｇ．Ｖと、それを含む甘味料組成物は、様々な生理活性物質または機能性成分と組み合わせて使用することができる。機能性成分は、一般に、カテゴリー、例えば、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化物質、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、植物ステロール及びスタノール（フィトステロール及びフィトスタノール）；ポリオール；プレバイオティクス、プロバイオティクス；植物エストロゲン；大豆タンパク質；スルフィド／チオール；アミノ酸；タンパク質；ビタミン；及びミネラルに分類される。機能性成分は、また、健康上の利点、例えば、心血管、コレステロール低下、抗炎症性、に基づいて分類されてもよい。
さらに、ＲｅｂＭ及びｍｏｇ．Ｖなどの標的グリコシド（複数可）、ならびに本発明に従って得られた甘味料組成物は、ゼロカロリー、低カロリー、または糖尿病飲料、及び味覚特性が向上した食品を製造するために、高甘味度甘味料として適用され得る。それは、また、飲料、食品、医薬品、及び砂糖を使用することができない他の製品に使用され得る。加えて、飲料、食品、及びヒトの摂取専用の他の製品用甘味料だけでなく、特性が向上した動物飼料及び飼料中甘味料としても、甘味料組成物を使用することができる。
標的グリコシド（複数可）及び甘味料組成物が使用され得る生成物の例としては、アルコール飲料、例えば、ウォッカ、ワイン、ビール、洋酒、及び日本酒など；天然ジュース；清涼飲料水；炭酸ソフトドリンク；ダイエットドリンク；ゼロカロリードリンク；カロリーを抑えたドリンク及び食品；ヨーグルトドリンク；インスタントジュース；インスタントコーヒー；粉末タイプのインスタント飲料；缶詰製品；シロップ；味噌；醤油；酢；ドレッシング；マヨネーズ；ケチャップ；カレー；スープ；インスタントブイヨン；粉末醤油；粉末酢；ビスケットの種類；ライスビスケット；クラッカー；パン；チョコレート；カラメル；キャンディー；チューインガム；ゼリー；プリン；保存された果物及び野菜；新鮮なクリーム；ジャム；マーマレード；フラワーペースト；粉ミルク；アイスクリーム；シャーベット；瓶詰め野菜及び果物；缶詰及び煮豆；甘露煮の肉及び食品；農産野菜食品；シーフード；ハム；ソーセージ；魚肉ハム；魚肉ソーセージ；魚のすり身；魚のフライ製品；乾燥シーフード製品；冷凍食品；保存海苔；保存肉；タバコ；医薬品；ならびに他の多くのものが挙げられるが、これらに限定されない。
製品、例えば、食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、及びチューインガムの製造中に、従来の方法、例えば、混合、混練、溶解、酸洗、浸透、濾過、散布、噴霧、注入、及び他の方法が使用され得る。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、関連数値の±１０％を意味する。
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の実施例から明らかになるであろう。
実施例１：生物変換シャーシ株の改変
ＵＧＴ酵素を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を使用したステビオールグリコシド中間体の生物変換（グリコシル化）は、ＵＳ２０２０／００８７６９２に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＵＳ２０２０／００８７６９２は、ＵＧＴ酵素の重要な基質であるＵＤＰ－グルコースへの自然流束を増加させるための細菌の遺伝子改変について記載している。ＵＤＰ－グルコースへの自然流束よりも大きいと、ＵＧＴに対する利用できる基質の量を増加させることにより、ＵＧＴ性能の向上が可能になる。遺伝子改変により、細胞は、供給された基質をグリコシル化生成物（限定されないが、レバウジオシド及びモグロシドなど）に変換する能力が生じる。グリコシル化のための他の基質が、本明細書に記載されている。遺伝子改変には、ＵＤＰ－グルコースを消費する酵素（ｕｓｈＡ、ｇａｌＥＴＫＭ）の欠失または不活化；ＵＤＰ－グルコースの前駆体であるグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を消費する酵素（例えば、ｐｇｉ）の欠失または不活化；及びグルコース－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を介してＧ６ＰをＵＤＰ－グルコースに変換する酵素（例えば、ｐｇｍ、ｇａｌＵ）の過剰発現、が含まれる。改変ΔｕｓｈＡ、ΔｇａｌＥＴＫＭ、Δｐｇｉ、ならびにｐｇｍ及びｇａｌＵの補完を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、以下では「シャーシ株」と呼ばれる。
シャーシ株と比較して、生物変換の向上について、追加の染色体改変を試験した。図１は、２つの追加の染色体改変によるステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。ステビア葉抽出物、スクロース、及びグルコースを、配列番号１５及び２５のＵＧＴ酵素、ならびに配列番号１１のスクロースシンターゼを発現する生物変換株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。ｏｔｓＡ及びｏｔｓＢの欠失（図１の１として示される）は、シャーシ株と比較して、ステビオールグリコシドの生物変換の向上を示した。さらに、ｕｇｐＡの過剰発現（図１の２として示される）は、総ステビオールグリコシドの生物変換のさらなる向上を提供した。
他の細菌遺伝子を過剰発現させ、配列番号１４及び２４のＵＧＴ酵素を発現するシャーシ株と比較して、生物変換を試験した。図２は、プラスミド上で補完された一連の過剰発現遺伝子からのステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。ステビア葉抽出物及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。示されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）、ｇａｌＵ（配列番号９３）、ｐｇｍ－ｇａｌＵ（配列番号９２及び９３）、ｕｇｐＡ（配列番号９５）、ｙｃｊＵ（配列番号９４）、ａｄｋ（配列番号９６）、ｎｄｋ（配列番号９７）、及びｃｍｋ（配列番号９８）での補完を含む、いくつかの遺伝子補完により全体のグリコシル化が向上した。
候補スクロースシンターゼ酵素を発現する株を作成した。これにより、スクロースを供給した場合、ＵＤＰ－グルコースの利用可能性が向上し得る。スクロースシンターゼの発現により、スクロースをフルクトース及びグルコースに分割することが可能になる。グルコースを、ＵＤＰ－グルコース生合成に集めることができる。しかし、炭素源としてグリセロールまたはグルコースのいずれかで成長させた場合、細胞は、同様の成長及びＵＤＰ－グルコース利用可能性を示す。図３は、配列番号１５及び２５のＵＧＴ酵素を発現する生物変換シャーシ株における、補完されたスクロースシンターゼからのステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。遺伝子は、プラスミド上で補完された。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。ステビア葉抽出物、スクロース、及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。配列番号２、３、５、６、７、８、９、１０、及び１１で表される酵素を含む、いくつかのスクロースシンターゼ酵素により、グリコシル化の劇的な向上がもたらされた。
図４は、様々な遺伝子ノックアウトを有する、配列番号１４及び配列番号２４のＵＧＴ酵素を発現する生物変換シャーシ株によるステビオールグリコシド生物変換の向上を示す。向上倍数は、総ステビオールグリコシド変換に関するものである。ステビア葉抽出物及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。いくつかの遺伝子ノックアウトは、生物変換を向上させることが確認された。
実施例２：ＵＧＴ改変及び標的ステビオールグリコシドの生成
ＭｂＵＧＴ１，２と呼ばれるＵＧＴ酵素は、米国特許第１０，７４３，５６７号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＭｂＵＧＴ１，２（配列番号１３）の改変バージョンは、ＵＳ２０２０／００８７６９２に記載されており、これは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ステビオールグリコシド生物変換の活性を向上させるように、配列番号１３のＵＧＴ酵素を改変した。図５は、配列番号１４の改変バージョンによるステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数は、親ＵＧＴ酵素（配列番号１３）のステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。配列番号１４は、配列番号１３からの以下の変異を有する：Ｇ５Ｎ、Ｆ１８６Ｔ、Ｖ３９７Ｓ。ステビア葉抽出物及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。
表２は、個々の変異から配列番号１３のＵＧＴ酵素へのステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数（ＦＩ）は、ステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。
Figure 2023550496000002
Figure 2023550496000003
図６は、さらなる改変バージョン、配列番号１５によるステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数は、配列番号１４の親ＵＧＴ酵素のステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。配列番号１５のＵＧＴ酵素は、配列番号１４からの以下の変異を有する：ｉｎｓ＿Ａ２＿Ｔ３＿ＲＲ、Ｈ５９Ｐ、Ａ２３８Ｅ、Ｌ４１７Ｆ。ステビア葉抽出物及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。
表３は、個々の変異から配列番号１４のＵＧＴ酵素へのステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数（ＦＩ）は、ステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。
Figure 2023550496000004
Figure 2023550496000005
Figure 2023550496000006
Figure 2023550496000007
図７は、さらなる改変バージョン、配列番号１６によるステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数は、配列番号１５の親ＵＧＴ酵素のステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。配列番号１６は、配列番号１５からの以下の変異を有する：Ｍ１５２Ａ、Ｓ１５３Ａ。ステビア葉抽出物及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。
表４は、配列番号１５への個々の変異からのステビオールグリコシドの生物変換の向上を示す。向上倍数（ＦＩ）は、ステビオールグリコシド変換率（％）に関するものである。
Figure 2023550496000008
４つのＵＧＴ酵素の共発現を伴うＲｅｂＭの生成（図２１を参照）に加えて、様々な実施形態では、より少ないＵＧＴの発現により、及び／または基質として特定のレバウジオシドを利用することにより、他の標的ステビオールグリコシドを生成することができる。例えば、特定のステビア葉抽出物は、大量のＲｅｂＡ及びステビオシドを含有し得る。１－２分岐ＵＧＴ酵素（例えば、配列番号１３～１６のうちの１つ）の発現により、抽出物のレバウジオシド含有量に応じて、ＲｅｂＥ及びＲｅｂＤ混合物の生成がもたらされるであろう。１－３分岐ＵＧＴ酵素（例えば、配列番号１９～２５）の発現により、実質的にＲｅｂＩが生成されるであろう。さらに、ＵＧＴＣ１９の発現により、ステビオールビオシド及びＲｅｂＢへの脱グリコシル化が有利に働く。
図８は、配列番号１５のＵＧＴ酵素を使用するＲｅｂＥ及びＲｅｂＤの混合物へのステビア葉抽出物の生物変換、ならびに配列番号２５のＵＧＴ酵素を使用するＲｅｂＩへの変換を示す。ステビア葉抽出物（主に、ステビオシド及びＲｅｂＡを含有する）、スクロース、及びグルコースを生物変換株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。
図９は、配列番号３１及び配列番号９９のＵＧＴ酵素を使用する、ＲｅｂＢ及びステビオールビオシドの混合物へのステビア葉抽出物の生物変換を示す。ステビア葉抽出物、ＵＤＰ、及びグルコースを生物変換菌株に供給した。生物変換を、３７℃で４８時間行った。データを逆相ＬＣ ＤＡＤで定量して、ステビオールグリコシドの変換を定量した。
実施例３：ステビオールグリコシドの回収
従来、ステビオールグリコシド（または他のグリコシド生成物）の回収及び精製を可能にするために、バイオマス（発酵または全細胞／溶解物生物変換プロセスの場合）または酵素（精製酵素による生物変換の場合）が、最初に培養物から除去されるであろう。従来、微生物細胞の破壊を最小限に抑えるために、回収の最初のステップとしてバイオマスを除去することが好まれており、細胞破片（大きな分子及び小さな分子の両方）が、他の点では、精製プロセスを複雑にするであろう。ステビオールグリコシドを回収するための従来のプロセスを図１０に要約する。しかし、本発明の実施形態によれば、生物変換菌株により生成された培養ブロスは、非常に高い粘度を有し、これにより、バイオマスの除去及びステビオールグリコシドの回収に課題が示される。
バイオマス除去前の温度、ｐＨ調整、及び／またはグリコシド溶解促進剤の添加により、この問題は大幅に軽減される。例えば、これらの処理により、培養材料の粘度が低下し得、タンパク質の沈殿及びグリコシドの可溶化が可能になり、その後のバイオマスからの分離及び回収が容易になる。図１１に概説されたプロセスにより、ステビオールグリコシドを９５％以上含む最終生成物（例えば、ＲｅｂＭ）がもたらされ得る。例えば、ｐＨを（開始ｐＨ約７から）約２～４の範囲のｐＨまで低下させると、ＲｅｂＭの溶解度がかなり高まる。あるいは、ｐＨを（初期ｐＨ約７から）ｐＨ１１超に増加させることにより、溶解度が高まり得る。ｐＨ調整及び溶解促進剤を用いると、本開示に従って、高純度のステビオールグリコシドの１００ｇ／Ｌ超または１５０ｇ／Ｌ超の濃度を達成することが可能である。例示的な溶解促進剤としては、グリセロール（例えば、約０．５重量％）及び１，３－プロパンジオール（例えば、約０．５重量％）が含まれる。本明細書に記載のものに加えて、他の溶解促進剤としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールが挙げられる。
図１２は、遠心分離後の水性ブロスからのバイオマスの分離に対する様々な処理の効果を示す。ペレットの緻密さ及び上澄みの透明度は、バイオマス除去の容易さの指標として機能する。要約すると、発酵ブロス３０ｍｌを、単独でまたは組み合わせて以下の処理にかけた：７０℃で３０分間の加熱、ｐＨ３．７８への酸性化、または１５％ｖ／ｖのエタノールの添加。次に、ブロスを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、分離効率を測定した。結果は、加熱及び酸性化が分離にプラスの影響を与えることを示す。最も良好な分離を示したチューブＮｏ．８を、７０℃に加熱し、ｐＨを３．７８に調整した。エタノールの添加を伴う３．７８へのｐＨ調整が含まれるチューブＮｏ．７も良好な分離を示した。
表５は、バイオマス除去に必要な処理時間に対する加熱（７０℃、３０分）及び酸性化（ｐＨ３．６）の影響を示す。要約すると、処理済み及び未処理の発酵ブロスを、ＧＥＡ Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＳＢ７分離機に通し、バイオマスの除去を試験した。未処理ブロスは、下流のステップでバイオマスを十分な分離を行うために、それぞれ、処理時間０．４４分／Ｌで３回別々にＳＢ７に通過させ、続いて、処理時間２．２分／Ｌでタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を行う必要があった。加熱及び酸性化による処理で、ＳＢ７に１回通過させるだけで効率的なバイオマス分離が可能になり、処理時間が８倍以上速くなった。
Figure 2023550496000009
表６は、ＲｅｂＭの定量及び回収に対する加熱及び酸性化の影響を示す。要約すると、加熱（７０℃、１５分）及び酸性化（ｐＨ２．５）の両方を用いる処理の前後で、水性ブロス中のＲｅｂＭ濃度を測定した。処理により、未処理の状態と比較して、ＲｅｂＭの回復が１２０～１７３％向上した（７つの独立したサンプルの平均で１４０％の向上）。
Figure 2023550496000010
表７は、ＲｅｂＭの溶解度に対する、酸もしくは塩基の添加及び／または小分子増強剤の添加と組み合わせた加熱の効果を示す。発酵ブロスを７０℃の一定温度に保持し、表７に記載されている種々の処理にかけた。ＲｅｂＭを一定に撹拌しながら徐々に添加して、ＲｅｂＭの最大溶解度を測定した。培地の酸性化は、小分子増強剤（グリセロール、１，３－プロパンジオール）の添加と同様に、ＲｅｂＭの溶解度の増加を示した。いくつかの場合では、増強剤の添加とｐＨの変化（塩基の添加）により、ＲｅｂＭの溶解度がさらに増加した。
Figure 2023550496000011
本明細書に記載のプロセスは、９５％以上のグリコシド（例えば、ＲｅｂＭまたはｍｏｇ．Ｖ）純度、魅力的な白色、容易な可溶化、無臭、及び高回収率を含む望ましい品質を備えた製品を生成し得る。特に、培養物の初期のｐＨ及び温度の調整により、ブロスの流体特性が変化し、バイオマス除去のためのディスクスタック分離機の効率が向上し得る。さらに、ｐＨ及び温度の調整により、グリコシドの溶解度とそれによる生産量が実質的に増加する（これにより、固相での生成物の実質的な損失が回避される）。
プロセスは、１つ以上の結晶化ステップを用いてもよい。結晶化プロセスには、結晶形態を制御するために、静止相とその後の撹拌相、及び任意に、蒸発相が含まれ得る。静止相は、結晶ドメインの程度が高い大きな結晶を成長し得る。結晶化は、結晶を種付けするプロセスを含むか、または、結晶の種付けを含まない系（すなわち、結晶が自発的に形成される）を使用し得る。例えば、結晶種付けプロセスを使用すると、静止段階で結晶を種付けした後、撹拌段階で結晶が急速に成長し、非晶質ドメインの程度が増加するであろう。本プロセスを使用すると、得られる結晶は、最終的に良好な溶解度を有し得る。得られる結晶は、高純度のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭ）を有することになり、回収及び洗浄が容易になる。再結晶の場合、例示的な再結晶溶液系は、水を含み得るか、または、いくつかの実施形態では、エタノール（例えば、１：２のＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ）を含む。いくつかの実施形態では、再結晶溶液は、さらに、グリセロール（例えば、最大２％）を含む。再結晶化のための溶液のｐＨは、例えば、約４．０から約１２．０まで変化し得る。
再結晶化前に、溶液を濾過することができる。さらに、フィルター材料の選択は、最終生成物の品質に大きな影響を与え得る。例えば、図１３は、再結晶化前に溶液を濾過する、疎水性フィルター材料、例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）と、相対的親水性材料、例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の使用を比較する（両方とも孔径０．２ミクロン）。ＲｅｂＭ最終生成物（９８％超）を、プロピレングリコールに１０重量％の濃度で溶解させる。図１３に示されるように、ＰＰフィルターを使用すると、かなり濁っている溶液（左側）が生じるが、ＰＥＳフィルターを使用すると、透明な溶液（右側）が生じる。それに応じて、ＰＥＳフィルター材料及び同様の親水性材料は、おそらく不純物の吸着により大きな利点を提供する。
結晶化系の熱力学的及び速度論的特性を理解することは、工業プロセスを適切に設計するために重要である。例えば、熱力学的溶解度は、所定温度で溶質が到達し得る最大濃度（飽和または溶解度）を表す。この溶解度曲線より上の領域（例えば、図１４を参照）は、過飽和であり、下の領域は、不飽和である。結晶化が進行するには、溶液が過飽和でなければならない。過飽和を達成する１つの方法は、飽和溶液の温度を低減することである。しかし、この状況では結晶化がすぐに開始されず、むしろ、系は、所定の幅を有する過飽和空間の準安定ゾーンに入る。このゾーンでは、自発核生成はないが、種結晶を添加することにより、結晶化を開始させることができる。冷却中に種を添加しない場合、系は、準安定領域の端に到達することになり、この点以降、自発核生成が生じることになる。過飽和度が高いほど、核生成速度が速いであろう。これは、粒径及び結晶成長速度に大きな影響を与える。そのようなものであるから、溶解度及び準安定領域幅を知ることにより、望ましい結晶サイズ分布（ＣＳＤ）を有し、さらには実用的な速度で進行する工業的な結晶化プロセスの設計が可能になる。種なしの結晶化の場合、過剰な自発核生成による悪影響（例えば、これにより、非常に小さな結晶が生成する）なしに結晶化を開始するために、準安定ゾーンの端に到達し、わずかに超えなければならない。プロセスが進行するにつれて、濃度は、準安定領域に戻ることになるが、その後は、結晶化の間中（冷却、蒸発などにより）過飽和が維持される必要がある。種付け結晶化の場合、自発核生成を回避するために、準安定領域を超えないことが重要であり、溶液が飽和した後に、種結晶が溶解せずに核生成を開始するように、種が添加されなければならない。種付けする場合及び種付けなしの場合の両方で、系の熱力学及び速度論を理解することにより、結晶化プロセスの上昇速度（または蒸発速度）及び核生成点の設計が可能になる。
種々の溶媒系におけるＲｅｂＭの溶解度を理解し、溶解度促進の効果を調査するための研究を行い、結晶形成及び成長のための種付け及び温度降下方策を可能にした。これらの研究では、Ｔｅｃｈｎｏｂｉｓ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ製のＣｒｙｓｔａｌ １６系（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｓｅｒｉｅｓ）を使用して、温度上昇中に透明点（溶解度の代用として）、温度下降中に曇点（準安定領域幅の代用として）を生じさせた。様々な溶媒系を評価した。
Figure 2023550496000012
図１４は、水（ｐＨ７．０、０％のグリセロール）中のＲｅｂＭについて決定された、準安定領域幅を定義する溶解度（下の曲線）及び準安定限界曲線（上の曲線）を示し、この溶媒系における結晶成長の制御を可能にする。
図１５Ａ、１５Ｂは、ｐＨ７の６７％の水／３３％のエタノール中のＲｅｂＭについて決定された、準安定ゾーン幅を定義する溶解度（下の曲線）及び準安定限界曲線（上の曲線）を示し、この溶媒系中での結晶成長の制御を可能にする。図１５Ａは、０％のグリセロールであるが、図１５Ｂには、０．５％のグリセロールが含まれる。
図１６Ａ、１６Ｂは、ｐＨ１１の６７％の水／３３％のエタノール中のＲｅｂＭについて決定された、準安定ゾーン幅を定義する溶解度（下の曲線）及び準安定限界曲線（上の曲線）を示し、この溶媒系中での結晶成長の制御を可能にする。図１６Ａは、０％のグリセロールであるが、図１６Ｂには、０．５％のグリセロールが含まれる。
いくつかの実施形態では、回収プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の１つ以上のステップが含まれるであろう。例えば、孔径が約５ｋＤのフィルターを備えたＴＦＦは、最終粉末生成物の溶解性も高めながら、エンドトキシン、大きなタンパク質、及び他の細胞破片を除去し得る。小分子の不純物及び塩を除去し、及び／または再結晶のために母液を濃縮するために、孔径が約０．５ｋＤのフィルターを備えたＴＦＦを下流で使用することもできる。
バスケット型遠心分離ステップでの洗浄は、水を用いる洗浄を用い得るか、または代わりに他のすすぎを用いることができる。例えば、冷水／エタノール（例えば、１５％のエタノール）は、ケーキの品質を向上させ得る。母液を、洗浄水として用いることも、再処理することもできる。
用いることができる他のプロセスには、活性炭処理、ベントナイト処理、イオン交換クロマトグラフィー、及び蒸発による濃縮が含まれる。特に、ウェットケーキをＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏに溶解させた後の活性炭処理により、最終生成物の色が向上し得る。
実施例４：モグロールまたはモグロールグリコシド前駆体の生物変換
限定されないが、テルペノイドグリコシドを含む様々な基質のグリコシル化に、本明細書に記載の改変細菌株を使用することができる。いくつかの態様では、本発明は、モグロールまたはモグロシド足場上で活性なＵＧＴ酵素を同定する。様々なモグロシドを生成するためのグリコシル化経路が図２２に提示される。図１７Ａ及びＢは、モグロールのモグロシド中間体への生物変換を示す。ＵＧＴ酵素を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株（シャーシ株）を、９６ウェルプレート中でモグロールと共にインキュベートした。４８時間後に、生成物の形成を試験した。報告値は、空ベクター対照を超える値である。標準物質を用いて、生成物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。図１７Ａに示されるように、酵素１（配列番号７１）及び酵素２（配列番号３３）ＵＧＴ酵素は双方ともに、主にモグロールからＭｏｇ．ＩＡを生成し、より少量のＭｏｇ．ＩＥ及び／またはＭｏｇ．ＩＩＥが形成した。図１７Ｂは、酵素１（配列番号７１）、酵素３（配列番号３３）、酵素４（配列番号８２）、及び酵素５（配列番号８３）を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を使用した、モグロールのモグロシド－ＩＡへの生物変換を示す。
図１８Ａ及び図１８Ｂは、Ｍｏｇ．ＩＡ（図１８Ａ）またはＭｏｇ．ＩＥ（図１８Ｂ）のＭｏｇ．ＩＩＥへの生体変換を示す。実験では、ＵＧＴ酵素、配列番号８４、配列番号７１、または配列番号３３を発現する遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉシャーシ株を、９６ウェルプレート内のＭｏｇ．ＩＡ（図１８Ａ）またはＭｏｇ．ＩＥ（図１８Ｂ）を含有する発酵培地中、３７℃でインキュベートした。４８時間後に、生成物の形成を試験した。標準物質を用いて、生成物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。空ベクター対照を超えるＭｏｇ．ＩＩＥレベルの値を計算した。図１８Ａに示されるように、配列番号８４及び配列番号７１は、Ｍｏｇ．ＩＡからＭｏｇ．ＩＩＥへの生物変換を触媒することができた。同様に、図１８Ｂ、配列番号８４、配列番号７１、及び配列番号３３に示されるように、Ｍｏｇ．ＩＥのＭｏｇ．ＩＩＥへの生物変換を触媒することができた。
図１９は、Ｍｏｇ．ＩＩ－ＥからのＭｏｇ．ＩＩＩまたはシアメノシドの生成を示す。実験では、ＵＧＴ酵素である配列番号７２、配列番号５４、または配列番号１３を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株を、Ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅを含有する発酵培地中、３７℃で４８時間成長させた。各化合物の標準物質を用いて、生成物をＬＣＭＳ／ＭＳで定量した。図１９に示されるように、全ての株は、Ｍｏｇ．ＩＩＥのＭｏｇ．ＩＩＩへの生物変換を触媒することが可能である。加えて、配列番号１３の酵素は、相当量のシアメノシドの生成も示した。
図２０は、Ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ２の生成を示す。Ｍｏｇ．Ｉ－Ｅをｉｎ ｖｉｔｒｏで供給した。実験では、ＵＧＴ酵素である配列番号７３を発現する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株（シャーシ株）を３７℃で４８時間インキュベートした。各化合物の標準物質を用いて、生成物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで定量した。図２０に示されるように、配列番号７３は、Ｍｏｇ．ＩＥのＭｏｇ．ＩＩ－Ａ２への生物変換を触媒することができる。
モグロールのＣ３及びＣ２４ヒドロキシルで観察された一次グリコシル化反応の概要は、表８に提示される。具体的には、モグロールを、様々なＵＧＴ酵素を発現する細胞に供給した。反応物を３７℃で４８時間インキュベートした。各化合物の標準物質を用いて、生成物をＬＣＭＳ／ＭＳで定量した。
Figure 2023550496000013
分岐グリコシル化反応の概要は、表９に提示される。Ｍｏｇ．ＩＩＥまたはＭｏｇ．ＩＥを、様々なＵＧＴ酵素を発現する細胞に供給した。反応物を３７℃で４８時間インキュベートした。各化合物の標準物質を用いて、生成物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで定量した。「間接的な」証拠は、基質の消費が観察されたことを意味する。
Figure 2023550496000014
ここで、添付の特許請求の範囲を参照して、本発明の実施形態が定義されるであろう。

配列
スクロースシンターゼ酵素
配列番号１：Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳｔＳｕｓ１）
ＭＡＥＲＶＬＴＲＶＨＳＬＲＥＲＶＤＡＴＬＡＡＨＲＮＥＩＬＬＦＬＳＲＩＥＳＨＧＫＧＩＬＫＰＨＥＬＬＡＥＦＤＡＩＲＱＤＤＫＮＫＬＮＥＨＡＦＥＥＬＬＫＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＩＲＬＲＰＧＶＷＥＹＩＲＶＮＶＮＡＬＶＶＥＥＬＳＶＰＥＹＬＱＦＫＥＥＬＶＤＧＡＳＮＧＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＴＡＳＦＰＫＰＴＬＴＫＳＩＧＮＧＶＥＦＬＮＲＨＬＳＡＫＭＦＨＤＫＥＳＭＴＰＬＬＥＦＬＲＡＨＨＹＫＧＫＴＭＭＬＮＤＲＩＱＮＳＮＴＬＱＮＶＬＲＫＡＥＥＹＬＩＭＬＰＰＥＴＰＹＦＥＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＫＧＷＧＤＴＡＥＲＶＬＥＭＶＣＭＬＬＤＬＬＥＡＰＤＳＣＴＬＥＫＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＥＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＰＡＬＥＲＥＭＬＫＲＩＫＥＱＧＬＤＩＩＰＲＩＬＩＶＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＩＥＫＶＹＧＡＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＫＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＭＥＴＦＩＥＤＶＡＫＥＩＳＡＥＬＱＡＫＰＤＬＩＩＧＮＹＳＥＧＮＬＡＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＤＳＤＩＹＷＫＫＦＤＥＫＹＨＦＳＳＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＭＡＦＴＭＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＮＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＩＮＬＹＦＳＹＳＥＴＥＫＲＬＴＡＦＨＰＥＩＤＥＬＬＹＳＤＶＥＮＤＥＨＬＣＶＬＫＤＲＴＫＰＩＬＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＬＴＧＬＶＥＷＹＡＫＮＰＲＬＲＧＬＶＮＬＶＶＶＧＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＱＡＥＭＫＫＭＹＥＬＩＥＴＨＮＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＹＩＡＤＴＫＧＡＦＶＱＰＡＦＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＮＨＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＨＩＤＰＹＨＧＥＱＡＡＤＬＬＡＤＦＦＥＫＣＫＫＤＰＳＨＷＥＴＩＳＭＧＧＬＫＲＩＥＥＫＹＴＷＱＩＹＳＥＳＬＬＴＬＡＡＶＹＧＦＷＫＨＶＳＫＬＤＲＬＥＩＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＹＲＫＭＡＥＡＶＰＬＡＡＥ

配列番号２：Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳｔＳｕｓ２）
ＭＡＥＲＶＬＴＲＶＨＳＬＲＥＲＬＤＡＴＬＡＡＨＲＮＥＩＬＬＦＬＳＲＩＥＳＨＧＫＧＩＬＫＰＨＱＬＬＡＥＦＥＳＩＨＫＥＤＫＤＫＬＮＤＨＡＦＥＥＶＬＫＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＩＲＬＲＰＧＶＷＥＹＶＲＶＮＶＮＡＬＩＶＥＥＬＴＶＰＥＦＬＱＦＫＥＥＬＶＮＧＴＳＮＤＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＴＡＳＦＰＫＰＴＬＴＫＳＩＧＮＧＶＥＦＬＮＲＨＬＳＡＫＭＦＨＤＫＥＳＭＴＰＬＬＥＦＬＲＶＨＨＹＫＧＫＴＭＭＬＮＤＲＩＱＮＬＹＴＬＱＫＶＬＲＫＡＥＥＹＬＴＴＬＳＰＥＴＳＹＳＡＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＴＡＥＲＶＬＥＭＩＣＭＬＬＤＬＬＥＡＰＤＳＣＴＬＥＫＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＥＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＰＡＬＥＲＥＭＬＫＲＩＫＥＱＧＬＤＩＫＰＲＩＬＩＶＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＬＥＫＶＦＧＴＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＫＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＭＥＴＦＩＥＤＶＧＫＥＩＴＡＥＬＱＡＫＰＤＬＩＩＧＮＹＳＥＧＮＬＡＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＤＳＤＩＹＬＮＫＦＤＥＫＹＨＦＳＡＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＭＡＦＴＭＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＶＮＬＹＦＰＹＳＥＫＥＫＲＬＴＴＦＨＰＥＩＥＤＬＬＦＳＤＶＥＮＥＥＨＬＣＶＬＫＤＲＮＫＰＩＩＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＬＴＧＬＶＥＷＹＡＫＮＰＲＬＲＥＬＶＮＬＶＶＶＧＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＱＡＥＭＫＫＭＹＥＬＩＫＴＨＮＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＹＩＡＤＴＲＧＡＦＶＱＰＡＦＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＳＣＧＬＰＴＦＡＴＮＱＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＱＩＤＰＹＨＧＥＱＡＡＤＬＬＡＤＦＦＥＫＣＫＶＤＰＳＨＷＥＡＩＳＥＧＧＬＫＲＩＱＥＫＹＴＷＱＩＹＳＤＲＬＬＴＬＡＡＶＹＧＦＷＫＨＶＳＫＬＤＲＬＥＩＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＦＲＫＬＡＱＬＶＰＬＡＶＥ

配列番号３：Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳｔＳｕｓ２＿Ｓ１１Ｅ）
ＭＡＥＲＶＬＴＲＶＨＥＬＲＥＲＬＤＡＴＬＡＡＨＲＮＥＩＬＬＦＬＳＲＩＥＳＨＧＫＧＩＬＫＰＨＱＬＬＡＥＦＥＳＩＨＫＥＤＫＤＫＬＮＤＨＡＦＥＥＶＬＫＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＩＲＬＲＰＧＶＷＥＹＶＲＶＮＶＮＡＬＩＶＥＥＬＴＶＰＥＦＬＱＦＫＥＥＬＶＮＧＴＳＮＤＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＴＡＳＦＰＫＰＴＬＴＫＳＩＧＮＧＶＥＦＬＮＲＨＬＳＡＫＭＦＨＤＫＥＳＭＴＰＬＬＥＦＬＲＶＨＨＹＫＧＫＴＭＭＬＮＤＲＩＱＮＬＹＴＬＱＫＶＬＲＫＡＥＥＹＬＴＴＬＳＰＥＴＳＹＳＡＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＴＡＥＲＶＬＥＭＩＣＭＬＬＤＬＬＥＡＰＤＳＣＴＬＥＫＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＥＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＰＡＬＥＲＥＭＬＫＲＩＫＥＱＧＬＤＩＫＰＲＩＬＩＶＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＬＥＫＶＦＧＴＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＫＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＭＥＴＦＩＥＤＶＧＫＥＩＴＡＥＬＱＡＫＰＤＬＩＩＧＮＹＳＥＧＮＬＡＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＤＳＤＩＹＬＮＫＦＤＥＫＹＨＦＳＡＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＭＡＦＴＭＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＶＮＬＹＦＰＹＳＥＫＥＫＲＬＴＴＦＨＰＥＩＥＤＬＬＦＳＤＶＥＮＥＥＨＬＣＶＬＫＤＲＮＫＰＩＩＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＬＴＧＬＶＥＷＹＡＫＮＰＲＬＲＥＬＶＮＬＶＶＶＧＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＱＡＥＭＫＫＭＹＥＬＩＫＴＨＮＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＹＩＡＤＴＲＧＡＦＶＱＰＡＦＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＳＣＧＬＰＴＦＡＴＮＱＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＱＩＤＰＹＨＧＥＱＡＡＤＬＬＡＤＦＦＥＫＣＫＶＤＰＳＨＷＥＡＩＳＥＧＧＬＫＲＩＱＥＫＹＴＷＱＩＹＳＤＲＬＬＴＬＡＡＶＹＧＦＷＫＨＶＳＫＬＤＲＬＥＩＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＦＲＫＬＡＱＬＶＰＬＡＶＥ

配列番号４：Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ（ＡｃＳｕＳｙ）
ＭＡＩＥＡＬＲＱＱＬＬＤＤＰＲＳＷＹＡＦＬＲＨＬＶＡＳＱＲＤＳＷＬＹＴＤＬＱＲＡＣＡＤＦＲＥＱＬＰＥＧＹＡＥＧＩＧＰＬＥＤＦＶＡＨＴＱＥＶＩＦＲＤＰＷＭＶＦＡＷＲＰＲＰＧＲＷＩＹＶＲＩＨＲＥＱＬＡＬＥＥＬＳＴＤＡＹＬＱＡＫＥＧＩＶＧＬＧＡＥＧＥＡＶＬＴＶＤＦＲＤＦＲＰＶＳＲＲＬＲＤＥＳＴＩＧＤＧＬＴＨＬＮＲＲＬＡＧＲＩＦＳＤＬＡＡＧＲＳＱＩＬＥＦＬＳＬＨＲＬＤＧＱＮＬＭＬＳＮＧＮＴＤＦＤＳＬＲＱＴＶＱＹＬＧＴＬＰＲＥＴＰＷＡＥＩＲＥＤＭＲＲＲＧＦＡＰＧＷＧＮＴＡＧＲＶＲＥＴＭＲＬＬＭＤＬＬＤＳＰＳＰＡＡＬＥＳＦＬＤＲＩＰＭＩＳＲＩＬＩＶＳＩＨＧＷＦＡＱＤＫＶＬＧＲＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＡＲＡＬＥＲＥＭＲＮＲＬＲＱＱＧＶＤＶＥＰＲＩＬＩＡＴＲＬＩＰＥＳＤＧＴＴＣＤＱＲＬＥＰＶＶＧＡＥＮＶＱＩＬＲＶＰＦＲＹＰＤＧＲＩＨＰＨＷＩＳＲＦＫＩＷＰＷＬＥＲＹＡＱＤＬＥＲＥＶＬＡＥＬＧＳＲＰＤＬＩＩＧＮＹＳＤＧＮＬＶＡＴＬＬＳＥＲＬＧＶＴＱＣＮＩＡＨＡＬＥＫＳＫＹＬＹＳＤＬＨＷＲＤＨＥＱＤＨＨＦＡＣＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＡＡＤＩＩＶＴＳＴＹＱＥＩＡＧＮＤＲＥＩＧＱＹＥＧＨＱＤＹＴＬＰＧＬＹＲＶＥＮＧＩＤＶＦＤＳＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＰＲＦＹＦＳＹＡＲＴＥＥＲＰＳＦＬＥＰＥＩＥＳＬＬＦＧＲＥＰＧＡＤＲＲＧＶＬＥＤＲＱＫＰＬＬＬＳＭＡＲＭＤＲＩＫＮＬＳＧＬＡＥＬＹＧＲＳＳＲＬＲＧＬＡＮＬＶＩＩＧＧＨＶＤＶＧＮＳＲＤＡＥＥＲＥＥＩＲＲＭＨＥＩＭＤＨＹＱＬＤＧＱＬＲＷＶＧＡＬＬＤＫＴＶＡＧＥＬＹＲＶＶＡＤＧＲＧＶＦＶＱＰＡＬＦＥＡＦＧＬＴＶＩＥＡＭＳＳＧＬＰＶＦＡＴＲＦＧＧＰＬＥＩＩＥＤＧＶＳＧＦＨＩＤＰＮＤＨＥＡＴＡＥＲＬＡＤＦＬＥＡＡＲＥＲＰＫＹＷＬＥＩＳＤＡＡＬＡＲＶＡＥＲＹＴＷＥＲＹＡＥＲＬＭＴＩＡＲＩＦＧＦＷＲＦＶＬＤＲＥＳＱＶＭＥＲＹＬＱＭＦＲＨＬＱＷＲＰＬＡＨＡＶＰＭＥ

配列番号５：Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ（ＡｃＳｕＳｙ＿Ｌ６３７Ｍ－Ｔ６４０Ｖ）
ＭＡＩＥＡＬＲＱＱＬＬＤＤＰＲＳＷＹＡＦＬＲＨＬＶＡＳＱＲＤＳＷＬＹＴＤＬＱＲＡＣＡＤＦＲＥＱＬＰＥＧＹＡＥＧＩＧＰＬＥＤＦＶＡＨＴＱＥＶＩＦＲＤＰＷＭＶＦＡＷＲＰＲＰＧＲＷＩＹＶＲＩＨＲＥＱＬＡＬＥＥＬＳＴＤＡＹＬＱＡＫＥＧＩＶＧＬＧＡＥＧＥＡＶＬＴＶＤＦＲＤＦＲＰＶＳＲＲＬＲＤＥＳＴＩＧＤＧＬＴＨＬＮＲＲＬＡＧＲＩＦＳＤＬＡＡＧＲＳＱＩＬＥＦＬＳＬＨＲＬＤＧＱＮＬＭＬＳＮＧＮＴＤＦＤＳＬＲＱＴＶＱＹＬＧＴＬＰＲＥＴＰＷＡＥＩＲＥＤＭＲＲＲＧＦＡＰＧＷＧＮＴＡＧＲＶＲＥＴＭＲＬＬＭＤＬＬＤＳＰＳＰＡＡＬＥＳＦＬＤＲＩＰＭＩＳＲＩＬＩＶＳＩＨＧＷＦＡＱＤＫＶＬＧＲＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＡＲＡＬＥＲＥＭＲＮＲＬＲＱＱＧＶＤＶＥＰＲＩＬＩＡＴＲＬＩＰＥＳＤＧＴＴＣＤＱＲＬＥＰＶＶＧＡＥＮＶＱＩＬＲＶＰＦＲＹＰＤＧＲＩＨＰＨＷＩＳＲＦＫＩＷＰＷＬＥＲＹＡＱＤＬＥＲＥＶＬＡＥＬＧＳＲＰＤＬＩＩＧＮＹＳＤＧＮＬＶＡＴＬＬＳＥＲＬＧＶＴＱＣＮＩＡＨＡＬＥＫＳＫＹＬＹＳＤＬＨＷＲＤＨＥＱＤＨＨＦＡＣＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＡＡＤＩＩＶＴＳＴＹＱＥＩＡＧＮＤＲＥＩＧＱＹＥＧＨＱＤＹＴＬＰＧＬＹＲＶＥＮＧＩＤＶＦＤＳＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＰＲＦＹＦＳＹＡＲＴＥＥＲＰＳＦＬＥＰＥＩＥＳＬＬＦＧＲＥＰＧＡＤＲＲＧＶＬＥＤＲＱＫＰＬＬＬＳＭＡＲＭＤＲＩＫＮＬＳＧＬＡＥＬＹＧＲＳＳＲＬＲＧＬＡＮＬＶＩＩＧＧＨＶＤＶＧＮＳＲＤＡＥＥＲＥＥＩＲＲＭＨＥＩＭＤＨＹＱＬＤＧＱＬＲＷＶＧＡＬＭＤＫＶＶＡＧＥＬＹＲＶＶＡＤＧＲＧＶＦＶＱＰＡＬＦＥＡＦＧＬＴＶＩＥＡＭＳＳＧＬＰＶＦＡＴＲＦＧＧＰＬＥＩＩＥＤＧＶＳＧＦＨＩＤＰＮＤＨＥＡＴＡＥＲＬＡＤＦＬＥＡＡＲＥＲＰＫＹＷＬＥＩＳＤＡＡＬＡＲＶＡＥＲＹＴＷＥＲＹＡＥＲＬＭＴＩＡＲＩＦＧＦＷＲＦＶＬＤＲＥＳＱＶＭＥＲＹＬＱＭＦＲＨＬＱＷＲＰＬＡＨＡＶＰＭＥ

配列番号６：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＳｕｓ１）
ＭＡＮＡＥＲＭＩＴＲＶＨＳＱＲＥＲＬＮＥＴＬＶＳＥＲＮＥＶＬＡＬＬＳＲＶＥＡＫＧＫＧＩＬＱＱＮＱＩＩＡＥＦＥＡＬＰＥＱＴＲＫＫＬＥＧＧＰＦＦＤＬＬＫＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＶＲＰＲＰＧＶＷＥＹＬＲＶＮＬＨＡＬＶＶＥＥＬＱＰＡＥＦＬＨＦＫＥＥＬＶＤＧＶＫＮＧＮＦＴＬＥＬＤＦＥＰＦＮＡＳＩＰＲＰＴＬＨＫＹＩＧＮＧＶＤＦＬＮＲＨＬＳＡＫＬＦＨＤＫＥＳＬＬＰＬＬＫＦＬＲＬＨＳＨＱＧＫＮＬＭＬＳＥＫＩＱＮＬＮＴＬＱＨＴＬＲＫＡＥＥＹＬＡＥＬＫＳＥＴＬＹＥＥＦＥＡＫＦＥＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＮＡＥＲＶＬＤＭＩＲＬＬＬＤＬＬＥＡＰＤＰＣＴＬＥＴＦＬＧＲＶＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＤＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＲＡＬＥＩＥＭＬＱＲＩＫＱＱＧＬＮＩＫＰＲＩＬＩＬＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＥＲＬＥＲＶＹＤＳＥＹＣＤＩＬＲＶＰＦＲＴＥＫＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＬＥＴＹＴＥＤＡＡＶＥＬＳＫＥＬＮＧＫＰＤＬＩＩＧＮＹＳＤＧＮＬＶＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＤＳＤＩＹＷＫＫＬＤＤＫＹＨＦＳＣＱＦＴＡＤＩＦＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＥＴＶＧＱＹＥＳＨＴＡＦＴＬＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＭＳＩＹＦＰＹＴＥＥＫＲＲＬＴＫＦＨＳＥＩＥＥＬＬＹＳＤＶＥＮＫＥＨＬＣＶＬＫＤＫＫＫＰＩＬＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＬＳＧＬＶＥＷＹＧＫＮＴＲＬＲＥＬＡＮＬＶＶＶＧＧＤＲＲＫＥＳＫＤＮＥＥＫＡＥＭＫＫＭＹＤＬＩＥＥＹＫＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＤＲＶＲＮＧＥＬＹＲＹＩＣＤＴＫＧＡＦＶＱＰＡＬＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＣＫＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＨＩＤＰＹＨＧＤＱＡＡＤＴＬＡＤＦＦＴＫＣＫＥＤＰＳＨＷＤＥＩＳＫＧＧＬＱＲＩＥＥＫＹＴＷＱＩＹＳＱＲＬＬＴＬＴＧＶＹＧＦＷＫＨＶＳＮＬＤＲＬＥＡＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＹＲＰＬＡＱＡＶＰＬＡＱＤＤ

配列番号７：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＳｕｓ３）
ＭＡＮＰＫＬＴＲＶＬＳＴＲＤＲＶＱＤＴＬＳＡＨＲＮＥＬＶＡＬＬＳＲＹＶＤＱＧＫＧＩＬＱＰＨＮＬＩＤＥＬＥＳＶＩＧＤＤＥＴＫＫＳＬＳＤＧＰＦＧＥＩＬＫＳＡＭＥＡＩＶＶＰＰＦＶＡＬＡＶＲＰＲＰＧＶＷＥＹＶＲＶＮＶＦＥＬＳＶＥＱＬＴＶＳＥＹＬＲＦＫＥＥＬＶＤＧＰＮＳＤＰＦＣＬＥＬＤＦＥＰＦＮＡＮＶＰＲＰＳＲＳＳＳＩＧＮＧＶＱＦＬＮＲＨＬＳＳＶＭＦＲＮＫＤＣＬＥＰＬＬＤＦＬＲＶＨＫＹＫＧＨＰＬＭＬＮＤＲＩＱＳＩＳＲＬＱＩＱＬＳＫＡＥＤＨＩＳＫＬＳＱＥＴＰＦＳＥＦＥＹＡＬＱＧＭＧＦＥＫＧＷＧＤＴＡＧＲＶＬＥＭＭＨＬＬＳＤＩＬＱＡＰＤＰＳＳＬＥＫＦＬＧＭＶＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＧＱＡＮＶＬＧＬＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＲＡＬＥＴＥＭＬＬＲＩＫＲＱＧＬＤＩＳＰＳＩＬＩＶＴＲＬＩＰＤＡＫＧＴＴＣＮＱＲＬＥＲＶＳＧＴＥＨＴＨＩＬＲＶＰＦＲＳＥＫＧＩＬＲＫＷＩＳＲＦＤＶＷＰＹＬＥＮＹＡＱＤＡＡＳＥＩＶＧＥＬＱＧＶＰＤＦＩＩＧＮＹＳＤＧＮＬＶＡＳＬＭＡＨＲＭＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＤＳＤＩＹＷＫＤＦＤＮＫＹＨＦＳＣＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＮＡＤＦＩＩＴＳＴＹＱＥＩＡＧＴＫＮＴＶＧＱＹＥＳＨＧＡＦＴＬＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＭＴＩＹＦＰＹＳＥＥＴＲＲＬＴＡＬＨＧＳＩＥＥＭＬＹＳＰＤＱＴＤＥＨＶＧＴＬＳＤＲＳＫＰＩＬＦＳＭＡＲＬＤＫＶＫＮＩＳＧＬＶＥＭＹＳＫＮＴＫＬＲＥＬＶＮＬＶＶＩＡＧＮＩＤＶＮＫＳＫＤＲＥＥＩＶＥＩＥＫＭＨＮＬＭＫＮＹＫＬＤＧＱＦＲＷＩＴＡＱＴＮＲＡＲＮＧＥＬＹＲＹＩＡＤＴＲＧＡＦＡＱＰＡＦＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＣＨＧＧＰＡＥＩＩＥＨＧＬＳＧＦＨＩＤＰＹＨＰＥＱＡＧＮＩＭＡＤＦＦＥＲＣＫＥＤＰＮＨＷＫＫＶＳＤＡＧＬＱＲＩＹＥＲＹＴＷＫＩＹＳＥＲＬＭＴＬＡＧＶＹＧＦＷＫＹＶＳＫＬＥＲＲＥＴＲＲＹＬＥＭＦＹＩＬＫＦＲＤＬＶＫＴＶＰＳＴＡＤＤ

配列番号８：Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ（ＶｒＳＳ１）
ＭＡＴＤＲＬＴＲＶＨＳＬＲＥＲＬＤＥＴＬＳＡＮＲＮＥＩＬＡＬＬＳＲＩＥＧＫＧＫＧＩＬＱＨＨＱＶＩＡＥＦＥＥＩＰＥＥＳＲＱＫＬＴＤＧＡＦＧＥＶＬＲＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＶＲＰＲＰＧＶＷＥＹＬＲＶＮＶＨＡＬＶＶＥＶＬＱＰＡＥＹＬＲＦＫＥＥＬＶＤＧＳＳＮＧＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＴＡＳＦＰＲＰＴＬＮＫＳＩＧＮＧＶＱＦＬＮＲＨＬＳＡＫＬＦＨＤＫＥＳＬＨＰＬＬＥＦＬＲＬＨＳＶＫＧＫＴＬＭＬＮＤＲＩＱＮＰＤＡＬＱＨＶＬＲＫＡＥＥＹＬＧＴＶＰＰＥＴＰＹＳＡＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＮＡＥＲＶＬＥＳＩＱＬＬＬＤＬＬＥＡＰＤＰＣＴＬＥＴＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＤＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＲＡＬＥＮＥＭＬＨＲＩＫＱＱＧＬＤＩＶＰＲＩＬＩＩＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＬＥＫＶＦＧＴＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＮＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＬＥＴＹＴＥＤＶＡＨＥＬＡＫＥＬＱＧＫＰＤＬＩＶＧＮＹＳＤＧＮＩＶＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＥＳＤＩＹＷＫＫＬＥＥＲＹＨＦＳＣＱＦＴＡＤＬＦＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＴＡＦＴＬＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＱＴＩＹＦＰＨＴＥＴＳＲＲＬＴＳＦＨＴＥＩＥＥＬＬＹＳＳＶＥＮＥＥＨＩＣＶＬＫＤＲＳＫＰＩＩＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＩＴＧＬＶＥＷＹＧＫＮＡＫＬＲＥＬＶＮＬＶＶＶＡＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＫＡＥＭＫＫＭＹＳＬＩＥＴＹＫＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＶＩＡＤＴＫＧＡＦＶＱＰＡＶＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＣＮＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＨＩＤＰＹＨＧＤＲＡＡＤＬＬＶＥＦＦＥＫＶＫＶＤＰＳＨＷＤＫＩＳＱＡＧＬＱＲＩＥＥＫＹＴＷＱＩＹＳＱＲＬＬＴＬＴＧＶＹＧＦＷＫＨＶＳＮＬＤＲＲＥＳＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＹＲＫＬＡＥＳＶＰＬＡＶＥ

配列番号９：Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ（ＶｒＳＳ１＿Ｓ１１Ｅ）
ＭＡＴＤＲＬＴＲＶＨＥＬＲＥＲＬＤＥＴＬＳＡＮＲＮＥＩＬＡＬＬＳＲＩＥＧＫＧＫＧＩＬＱＨＨＱＶＩＡＥＦＥＥＩＰＥＥＳＲＱＫＬＴＤＧＡＦＧＥＶＬＲＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＶＲＰＲＰＧＶＷＥＹＬＲＶＮＶＨＡＬＶＶＥＶＬＱＰＡＥＹＬＲＦＫＥＥＬＶＤＧＳＳＮＧＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＴＡＳＦＰＲＰＴＬＮＫＳＩＧＮＧＶＱＦＬＮＲＨＬＳＡＫＬＦＨＤＫＥＳＬＨＰＬＬＥＦＬＲＬＨＳＶＫＧＫＴＬＭＬＮＤＲＩＱＮＰＤＡＬＱＨＶＬＲＫＡＥＥＹＬＧＴＶＰＰＥＴＰＹＳＡＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＮＡＥＲＶＬＥＳＩＱＬＬＬＤＬＬＥＡＰＤＰＣＴＬＥＴＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＤＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＲＡＬＥＮＥＭＬＨＲＩＫＱＱＧＬＤＩＶＰＲＩＬＩＩＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＬＥＫＶＦＧＴＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＮＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＬＥＴＹＴＥＤＶＡＨＥＬＡＫＥＬＱＧＫＰＤＬＩＶＧＮＹＳＤＧＮＩＶＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＥＳＤＩＹＷＫＫＬＥＥＲＹＨＦＳＣＱＦＴＡＤＬＦＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＴＡＦＴＬＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＱＴＩＹＦＰＨＴＥＴＳＲＲＬＴＳＦＨＴＥＩＥＥＬＬＹＳＳＶＥＮＥＥＨＩＣＶＬＫＤＲＳＫＰＩＩＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＩＴＧＬＶＥＷＹＧＫＮＡＫＬＲＥＬＶＮＬＶＶＶＡＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＫＡＥＭＫＫＭＹＳＬＩＥＴＹＫＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＶＩＡＤＴＫＧＡＦＶＱＰＡＶＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＣＮＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＨＩＤＰＹＨＧＤＲＡＡＤＬＬＶＥＦＦＥＫＶＫＶＤＰＳＨＷＤＫＩＳＱＡＧＬＱＲＩＥＥＫＹＴＷＱＩＹＳＱＲＬＬＴＬＴＧＶＹＧＦＷＫＨＶＳＮＬＤＲＲＥＳＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＹＲＫＬＡＥＳＶＰＬＡＶＥ

配列番号１０：Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｍａｘ（ＧｍＳＳ）
ＭＡＴＤＲＬＴＲＶＨＳＬＲＥＲＬＤＥＴＬＴＡＮＲＮＥＩＬＡＬＬＳＲＩＥＡＫＧＫＧＩＬＱＨＨＱＶＩＡＥＦＥＥＩＰＥＥＮＲＱＫＬＴＤＧＡＦＧＥＶＬＲＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＶＲＰＲＰＧＶＷＥＹＬＲＶＮＶＨＡＬＶＶＥＥＬＱＰＡＥＹＬＨＦＫＥＥＬＶＤＧＳＳＮＧＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＮＡＡＦＰＲＰＴＬＮＫＳＩＧＮＧＶＱＦＬＮＲＨＬＳＡＫＬＦＨＤＫＥＳＬＨＰＬＬＥＦＬＲＬＨＳＶＫＧＫＴＬＭＬＮＤＲＩＱＮＰＤＡＬＱＨＶＬＲＫＡＥＥＹＬＧＴＶＰＰＥＴＰＹＳＥＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＮＡＥＲＶＬＥＳＩＱＬＬＬＤＬＬＥＡＰＤＰＣＴＬＥＴＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＤＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＲＡＬＥＮＥＭＬＨＲＩＫＱＱＧＬＤＩＶＰＲＩＬＩＩＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＬＥＫＶＦＧＴＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＫＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＬＥＴＹＴＥＤＶＡＨＥＬＡＫＥＬＱＧＫＰＤＬＩＶＧＮＹＳＤＧＮＩＶＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＥＳＤＩＹＷＫＫＬＥＥＲＹＨＦＳＣＱＦＴＡＤＬＦＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＴＡＦＴＬＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＱＴＩＹＦＰＨＴＥＴＳＲＲＬＴＳＦＨＰＥＩＥＥＬＬＹＳＳＶＥＮＥＥＨＩＣＶＬＫＤＲＳＫＰＩＩＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＩＴＧＬＶＥＷＹＧＫＮＡＫＬＲＥＬＶＮＬＶＶＶＡＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＫＡＥＭＫＫＭＹＧＬＩＥＴＹＫＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＶＩＣＤＴＲＧＡＦＶＱＰＡＶＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＣＮＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＨＩＤＰＹＨＧＤＲＡＡＤＬＬＶＤＦＦＥＫＣＫＬＤＰＴＨＷＤＫＩＳＫＡＧＬＱＲＩＥＥＫＹＴＷＱＩＹＳＱＲＬＬＴＬＴＧＶＹＧＦＷＫＨＶＳＮＬＤＲＲＥＳＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＹＲＫＬＡＥＳＶＰＬＡＡＥ

配列番号１１：Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｍａｘ（ＧｍＳＳ＿Ｓ１１Ｅ）
ＭＡＴＤＲＬＴＲＶＨＥＬＲＥＲＬＤＥＴＬＴＡＮＲＮＥＩＬＡＬＬＳＲＩＥＡＫＧＫＧＩＬＱＨＨＱＶＩＡＥＦＥＥＩＰＥＥＮＲＱＫＬＴＤＧＡＦＧＥＶＬＲＳＴＱＥＡＩＶＬＰＰＷＶＡＬＡＶＲＰＲＰＧＶＷＥＹＬＲＶＮＶＨＡＬＶＶＥＥＬＱＰＡＥＹＬＨＦＫＥＥＬＶＤＧＳＳＮＧＮＦＶＬＥＬＤＦＥＰＦＮＡＡＦＰＲＰＴＬＮＫＳＩＧＮＧＶＱＦＬＮＲＨＬＳＡＫＬＦＨＤＫＥＳＬＨＰＬＬＥＦＬＲＬＨＳＶＫＧＫＴＬＭＬＮＤＲＩＱＮＰＤＡＬＱＨＶＬＲＫＡＥＥＹＬＧＴＶＰＰＥＴＰＹＳＥＦＥＨＫＦＱＥＩＧＬＥＲＧＷＧＤＮＡＥＲＶＬＥＳＩＱＬＬＬＤＬＬＥＡＰＤＰＣＴＬＥＴＦＬＧＲＩＰＭＶＦＮＶＶＩＬＳＰＨＧＹＦＡＱＤＮＶＬＧＹＰＤＴＧＧＱＶＶＹＩＬＤＱＶＲＡＬＥＮＥＭＬＨＲＩＫＱＱＧＬＤＩＶＰＲＩＬＩＩＴＲＬＬＰＤＡＶＧＴＴＣＧＱＲＬＥＫＶＦＧＴＥＨＳＨＩＬＲＶＰＦＲＴＥＫＧＩＶＲＫＷＩＳＲＦＥＶＷＰＹＬＥＴＹＴＥＤＶＡＨＥＬＡＫＥＬＱＧＫＰＤＬＩＶＧＮＹＳＤＧＮＩＶＡＳＬＬＡＨＫＬＧＶＴＱＣＴＩＡＨＡＬＥＫＴＫＹＰＥＳＤＩＹＷＫＫＬＥＥＲＹＨＦＳＣＱＦＴＡＤＬＦＡＭＮＨＴＤＦＩＩＴＳＴＦＱＥＩＡＧＳＫＤＴＶＧＱＹＥＳＨＴＡＦＴＬＰＧＬＹＲＶＶＨＧＩＤＶＦＤＰＫＦＮＩＶＳＰＧＡＤＱＴＩＹＦＰＨＴＥＴＳＲＲＬＴＳＦＨＰＥＩＥＥＬＬＹＳＳＶＥＮＥＥＨＩＣＶＬＫＤＲＳＫＰＩＩＦＴＭＡＲＬＤＲＶＫＮＩＴＧＬＶＥＷＹＧＫＮＡＫＬＲＥＬＶＮＬＶＶＶＡＧＤＲＲＫＥＳＫＤＬＥＥＫＡＥＭＫＫＭＹＧＬＩＥＴＹＫＬＮＧＱＦＲＷＩＳＳＱＭＮＲＶＲＮＧＥＬＹＲＶＩＣＤＴＲＧＡＦＶＱＰＡＶＹＥＡＦＧＬＴＶＶＥＡＭＴＣＧＬＰＴＦＡＴＣＮＧＧＰＡＥＩＩＶＨＧＫＳＧＦＨＩＤＰＹＨＧＤＲＡＡＤＬＬＶＤＦＦＥＫＣＫＬＤＰＴＨＷＤＫＩＳＫＡＧＬＱＲＩＥＥＫＹＴＷＱＩＹＳＱＲＬＬＴＬＴＧＶＹＧＦＷＫＨＶＳＮＬＤＲＲＥＳＲＲＹＬＥＭＦＹＡＬＫＹＲＫＬＡＥＳＶＰＬＡＡＥ

配列番号１２：Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．（ＡｓＳｕｓＡ）
ＭＡＳＥＬＭＱＡＩＬＤＳＥＥＫＨＤＬＲＧＦＩＳＥＬＲＱＱＤＫＮＹＬＬＲＮＤＩＬＮＶＹＡＥＹＣＳＫＣＱＫＰＥＴＳＹＫＦＳＮＬＳＫＬＩＹＹＴＱＥＩＩＰＥＤＳＮＦＣＦＩＩＲＰＫＩＡＡＱＥＶＹＲＬＴＡＤＬＤＶＥＰＭＴＶＱＥＬＬＤＬＲＤＲＬＶＮＫＦＨＰＹＥＧＤＩＬＥＬＤＦＧＰＦＹＤＹＴＰＴＩＲＤＰＫＮＩＧＫＧＶＱＹＬＮＲＹＬＳＳＫＬＦＱＤＳＱＱＷＬＥＳＬＦＮＦＬＲＬＨＮＹＮＧＩＱＬＬＩＮＨＱＩＱＳＱＱＱＬＳＱＱＶＫＮＡＬＮＦＶＳＤＲＰＮＤＥＰＹＥＱＦＲＬＱＬＱＴＭＧＦＥＰＧＷＧＮＴＡＳＲＶＲＤＴＬＮＩＬＤＥＬＩＤＳＰＤＰＱＴＬＥＡＦＩＳＲＩＰＭＩＦＲＩＶＬＶＳＡＨＧＷＦＧＱＥＧＶＬＧＲＰＤＴＧＧＱＶＶＹＶＬＤＱＡＫＮＬＥＫＱＬＱＥＤＡＩＬＡＧＬＥＶＬＮＶＱＰＫＶＩＩＬＴＲＬＩＰＮＳＤＧＴＬＣＮＱＲＬＥＫＶＹＧＴＥＮＡＷＩＬＲＶＰＬＲＥＦＮＰＫＭＴＱＮＷＩＳＲＦＥＦＷＰＹＬＥＴＦＡＩＤＳＥＲＥＬＬＡＥＦＱＧＲＰＤＬＩＶＧＮＹＴＤＧＮＬＶＡＦＬＬＴＲＲＭＫＶＴＱＣＮＩＡＨＡＬＥＫＳＫＹＬＦＳＮＬＹＷＱＤＬＥＥＫＹＨＦＳＬＱＦＴＡＤＬＩＡＭＮＡＡＮＦＶＩＳＳＴＹＱＥＩＶＧＴＰＤＳＩＧＱＹＥＳＹＫＣＦＴＭＰＥＬＹＨＶＶＮＧＩＥＬＦＳＰＫＦＮＶＶＰＰＧＶＮＥＮＳＹＦＰＹＴＱＴＱＮＲＩＥＳＤＲＤＲＬＥＥＭＬＦＴＬＥＤＳＳＱＩＦＧＫＬＤＤＰＮＫＲＰＩＦＳＭＡＲＬＤＲＩＫＮＬＴＧＬＡＥＣＦＧＱＳＱＥＬＱＥＲＣＮＬＩＬＶＡＧＫＬＲＩＥＥＳＥＤＮＥＥＫＤＥＩＶＫＬＹＲＩＩＤＥＹＮＬＨＧＫＩＲＷＬＧＶＲＬＳＫＮＤＳＧＥＩＹＲＶＩＣＤＲＱＧＩＦＶＱＰＡＬＦＥＡＦＧＬＴＩＬＥＳＭＩＳＧＬＰＴＦＡＴＱＦＧＧＰＬＥＩＩＱＤＫＩＮＧＦＹＩＮＰＴＨＬＥＥＴＡＴＫＩＬＤＦＶＴＫＣＥＱＮＰＮＹＷＮＩＩＳＥＫＡＩＤＲＶＹＳＴＹＴＷＫＩＨＴＴＫＬＬＴＬＡＲＩＹＧＦＷＮＦＴＳＫＥＫＲＥＤＬＬＲＹＬＥＳＬＦＹＬＩＹＫＰＲＡＱＱＬＬＥＱＨＫＹＲ

ウリジン二リン酸依存性糖転移酵素（ＵＧＴ）
配列番号１３：合成（ＭｂＵＧＴ１，２．２）
ＭＡＴＫＧＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＷＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＥＭＩＡＳＩＡＤＥＲＬＥＨＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲ

配列番号１４：合成（ＭｂＵＧＴ１，２．３）
ＭＡＴＫＮＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＷＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＴＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＳＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＥＭＩＡＳＩＡＤＥＲＬＥＨＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲ

配列番号１５：合成（ＭｂＵＧＴ１，２．４）
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配列番号１６：合成（ＭｂＵＧＴ１，２．５）
ＭＡＲＲＴＫＮＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＷＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＰＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＡＡＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＴＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＥＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＳＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＦＬＧＳＡＥＭＩＡＳＩＡＤＥＲＬＥＨＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲ

配列番号１７：ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
ＭＤＡＭＡＴＴＥＫＫＰＨＶＩＦＩＰＦＰＡＱＳＨＩＫＡＭＬＫＬＡＱＬＬＨＨＫＧＬＱＩＴＦＶＮＴＤＦＩＨＮＱＦＬＥＳＳＧＰＨＣＬＤＧＡＰＧＦＲＦＥＴＩＰＤＧＶＳＨＳＰＥＡＳＩＰＩＲＥＳＬＬＲＳＩＥＴＮＦＬＤＲＦＩＤＬＶＴＫＬＰＤＰＰＴＣＩＩＳＤＧＦＬＳＶＦＴＩＤＡＡＫＫＬＧＩＰＶＭＭＹＷＴＬＡＡＣＧＦＭＧＦＹＨＩＨＳＬＩＥＫＧＦＡＰＬＫＤＡＳＹＬＴＮＧＹＬＤＴＶＩＤＷＶＰＧＭＥＧＩＲＬＫＤＦＰＬＤＷＳＴＤＬＮＤＫＶＬＭＦＴＴＥＡＰＱＲＳＨＫＶＳＨＨＩＦＨＴＦＤＥＬＥＰＳＩＩＫＴＬＳＬＲＹＮＨＩＹＴＩＧＰＬＱＬＬＬＤＱＩＰＥＥＫＫＱＴＧＩＴＳＬＨＧＹＳＬＶＫＥＥＰＥＣＦＱＷＬＱＳＫＥＰＮＳＶＶＹＶＮＦＧＳＴＴＶＭＳＬＥＤＭＴＥＦＧＷＧＬＡＮＳＮＨＹＦＬＷＩＩＲＳＮＬＶＩＧＥＮＡＶＬＰＰＥＬＥＥＨＩＫＫＲＧＦＩＡＳＷＣＳＱＥＫＶＬＫＨＰＳＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＧＳＴＩＥＳＬＳＡＧＶＰＭＩＣＷＰＹＳＷＤＱＬＴＮＣＲＹＩＣＫＥＷＥＶＧＬＥＭＧＴＫＶＫＲＤＥＶＫＲＬＶＱＥＬＭＧＥＧＧＨＫＭＲＮＫＡＫＤＷＫＥＫＡＲＩＡＩＡＰＮＧＳＳＳＬＮＩＤＫＭＶＫＥＩＴＶＬＡＲＮ

配列番号１８：ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
ＭＡＥＱＱＫＩＫＫＳＰＨＶＬＬＩＰＦＰＬＱＧＨＩＮＰＦＩＱＦＧＫＲＬＩＳＫＧＶＫＴＴＬＶＴＴＩＨＴＬＮＳＴＬＮＨＳＮＴＴＴＴＳＩＥＩＱＡＩＳＤＧＣＤＥＧＧＦＭＳＡＧＥＳＹＬＥＴＦＫＱＶＧＳＫＳＬＡＤＬＩＫＫＬＱＳＥＧＴＴＩＤＡＩＩＹＤＳＭＴＥＷＶＬＤＶＡＩＥＦＧＩＤＧＧＳＦＦＴＱＡＣＶＶＮＳＬＹＹＨＶＨＫＧＬＩＳＬＰＬＧＥＴＶＳＶＰＧＦＰＶＬＱＲＷＥＴＰＬＩＬＱＮＨＥＱＩＱＳＰＷＳＱＭＬＦＧＱＦＡＮＩＤＱＡＲＷＶＦＴＮＳＦＹＫＬＥＥＥＶＩＥＷＴＲＫＩＷＮＬＫＶＩＧＰＴＬＰＳＭＹＬＤＫＲＬＤＤＤＫＤＮＧＦＮＬＹＫＡＮＨＨＥＣＭＮＷＬＤＤＫＰＫＥＳＶＶＹＶＡＦＧＳＬＶＫＨＧＰＥＱＶＥＥＩＴＲＡＬＩＤＳＤＶＮＦＬＷＶＩＫＨＫＥＥＧＫＬＰＥＮＬＳＥＶＩＫＴＧＫＧＬＩＶＡＷＣＫＱＬＤＶＬＡＨＥＳＶＧＣＦＶＴＨＣＧＦＮＳＴＬＥＡＩＳＬＧＶＰＶＶＡＭＰＱＦＳＤＱＴＴＮＡＫＬＬＤＥＩＬＧＶＧＶＲＶＫＡＤＥＮＧＩＶＲＲＧＮＬＡＳＣＩＫＭＩＭＥＥＥＲＧＶＩＩＲＫＮＡＶＫＷＫＤＬＡＫＶＡＶＨＥＧＧＳＳＤＮＤＩＶＥＦＶＳＥＬＩＫＡ

配列番号１９：ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
ＭＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＬＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬ

配列番号２０：合成（ＭｂＵＧＴ１－３）
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配列番号２１：ＵＧＴ７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｌ２００Ａ）
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配列番号２２：合成（ＭｂＵＧＴ１－３＿０）
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配列番号２３：合成（ＭｂＵＧＴ１－３＿１）
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配列番号２４：合成（ＭｂＵＧＴ１－３＿２）
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配列番号２５：合成（ＭｂＵＧＴ１－３＿３）
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配列番号２６：ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
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配列番号２７：ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
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配列番号２８：ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
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配列番号２９：ＯｓＵＧＴ１－２（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）
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配列番号３０：合成（ＭｂＵＧＴＣ１９）
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配列番号３１：合成（ＭｂＵＧＴＣ１９－２）
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配列番号３２：ＭｂＵＧＴＣ１３（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ８５Ｃ２、Ｐ２１５Ｔ）
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配列番号３３：ＳｇＵＧＴ７２０－２６９－１（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号３４：ＳｇＵＧＴ９４－２８９－３（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号３５：ＳｇＵＧＴ７４－３４５－２（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号３６：ＳｇＵＧＴ７５－２８１－２（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号３７：ＳｇＵＧＴ７２０－２６９－４（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号３８：ＳｇＵＧＴ９４－２８９－２（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号３９：ＳｇＵＧＴ９４－２８９－１（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号４０：ＭｃＵＧＴ１（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）
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配列番号４１：ＭｃＵＧＴ２（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）
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配列番号４２：ＭｃＵＧＴ３（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）
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配列番号４３：ＭｃＵＧＴ４（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）
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配列番号４４：ＭｃＵＧＴ５（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）
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配列番号４５（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）
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配列番号４６：ＣｍａＵＧＴ１（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）
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配列番号４７：（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）
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配列番号４８：（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）
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配列番号４９：ＣｍａＵＧＴ２（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）
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配列番号５０：ＣｍｏＵＧＴ２（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）
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配列番号５１：ＣｍａＵＧＴ３（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）
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配列番号５２：ＣｍｏＵＧＴ３（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）
ＭＤＡＱＱＡＡＮＫＳＰＴＡＳＴＩＦＭＬＰＷＶＧＹＧＨＬＳＡＹＬＥＬＡＫＡＬＳＴＲＮＦＨＶＹＦＣＳＴＰＶＳＬＡＳＩＫＰＲＬＩＰＳＣＳＳＩＱＦＶＥＬＨＬＰＳＳＤＥＦＰＰＨＬＨＴＴＮＧＬＰＡＨＬＶＰＴＩＨＱＡＦＡＡＡＡＱＴＦＥＡＦＬＱＴＬＲＰＨＬＬＩＹＤＳＬＱＰＷＡＰＲＩＡＳＳＬＮＩＰＡＩＮＦＦＴＡＧＡＦＡＶＳＨＶＬＲＡＦＨＹＰＤＳＱＦＰＳＳＤＦＶＬＨＳＲＷＫＩＫＮＴＴＡＥＳＰＴＱＶＫＩＰＫＩＧＥＡＩＧＹＣＬＮＡＳＲＧＶＩＬＴＮＳＦＲＥＬＥＧＫＹＩＤＹＬＳＶＩＬＫＫＲＶＬＰＩＧＰＬＶＹＱＰＮＱＤＥＥＤＥＤＹＳＲＩＫＮＷＬＤＲＫＥＡＳＳＴＶＬＶＳＦＧＳＥＦＦＬＳＫＥＥＴＥＡＩＡＨＧＬＥＱＳＥＡＮＦＩＷＧＩＲＦＰＫＧＡＫＫＮＡＩＥＥＡＬＰＥＧＦＬＥＲＶＧＧＲＡＭＶＶＥＥＷＶＰＱＧＫＩＬＫＨＧＮＩＧＧＦＶＳＨＣＧＷＮＳＡＭＥＳＩＭＣＧＶＰＶＩＧＩＰＭＱＶＤＱＰＦＮＡＧＩＬＥＥＡＧＶＧＶＥＡＫＲＤＳＤＧＫＩＱＲＤＥＶＡＫＬＩＫＥＶＶＶＥＲＴＲＥＤＩＲＮＫＬＥＥＩＮＥＩＬＲＴＲＲＥＥＫＬＤＥＬＡＴＥＩＳＬＬＣＫＮ

配列番号５３：（Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ）
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配列番号５４：（Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂｅ）
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配列番号５５：（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）
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配列番号５６：（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）
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配列番号５７：（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）
ＭＥＴＬＱＲＲＫＩＳＶＬＭＦＰＷＬＡＨＧＨＬＳＰＦＬＥＬＳＫＫＬＮＫＲＮＦＨＶＹＦＣＳＴＰＶＮＬＤＳＩＫＰＫＬＳＡＥＹＳＦＳＩＱＬＶＥＬＨＬＰＳＳＰＥＬＰＬＨＹＨＴＴＮＧＬＰＰＨＬＭＫＮＬＫＮＡＦＤＭＡＳＳＳＦＦＮＩＬＫＴＬＫＰＤＬＬＩＹＤＦＩＱＰＷＡＰＡＬＡＳＳＬＮＩＰＡＶＮＦＬＣＴＳＭＡＭＳＣＦＧＬＨＬＮＮＱＥＡＫＦＰＦＰＧＩＹＰＲＤＹＭＲＭＫＶＦＧＡＬＥＳＳＳＮＤＩＫＤＧＥＲＡＧＲＣＭＤＱＳＦＨＬＩＬＡＫＴＦＲＥＬＥＧＫＹＩＤＹＬＳＶＫＬＭＫＫＩＶＰＶＧＰＬＶＱＤＰＩＦＥＤＤＥＫＩＭＤＨＨＱＶＩＫＷＬＥＫＫＥＲＬＳＴＶＦＶＳＦＧＴＥＹＦＬＳＴＥＥＭＥＥＩＡＹＧＬＥＬＳＫＡＨＦＩＷＶＶＲＦＰＴＧＥＫＩＮＬＥＥＳＬＰＫＲＹＬＥＲＶＱＥＲＧＫＩＶＥＧＷＡＰＱＱＫＩＬＲＨＳＳＩＧＧＦＶＳＨＣＧＷＳＳＩＭＥＳＭＫＦＧＶＰＩＩＡＭＰＭＮＬＤＱＰＶＮＳＲＩＶＥＤＡＧＶＧＩＥＶＲＲＮＫＳＧＥＬＥＲＥＥＩＡＫＴＩＲＫＶＶＶＥＫＤＧＫＮＶＳＲＫＡＲＥＭＳＤＴＩＲＫＫＧＥＥＥＩＤＧＶＶＤＥＬＬＱＬＣＤＶＫＴＮＹＬＱ

配列番号５８：（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）
ＭＡＴＡＱＴＲＫＩＳＶＬＭＦＰＷＬＡＨＧＨＬＳＰＦＬＥＬＳＫＫＬＡＮＲＮＦＨＶＹＦＣＳＴＰＶＮＬＤＳＩＫＰＫＬＳＰＥＹＨＦＳＩＱＦＶＥＬＨＬＰＳＳＰＥＬＰＳＨＹＨＴＴＮＧＬＰＰＨＬＭＫＴＬＫＫＡＦＤＭＡＳＳＳＦＦＮＩＬＫＴＬＮＰＤＬＬＩＹＤＦＬＱＰＷＡＰＡＬＡＳＳＬＮＩＰＡＶＮＦＬＣＳＳＭＡＭＳＣＦＧＬＮＬＮＫＮＫＥＩＫＦＬＦＰＥＩＹＰＲＤＹＭＥＭＫＬＦＲＶＦＥＳＳＳＮＱＩＫＤＧＥＲＡＧＲＣＩＤＱＳＦＨＶＩＬＡＫＴＦＲＥＬＥＧＫＹＩＤＹＶＳＶＫＣＮＫＫＩＶＰＶＧＰＬＶＥＤＴＩＨＥＤＤＥＫＴＭＤＨＨＨＨＨＨＤＥＶＩＫＷＬＥＫＫＥＲＳＴＴＶＦＶＳＦＧＳＥＹＦＬＳＫＥＥＭＥＥＩＡＨＧＬＥＬＳＫＶＮＦＩＷＶＶＲＦＰＫＧＥＫＩＮＬＥＥＳＬＰＥＧＹＬＥＲＩＱＥＲＧＫＩＶＥＧＷＡＰＱＲＫＩＬＧＨＳＳＩＧＧＦＶＳＨＣＧＷＳＳＩＭＥＳＭＫＬＧＶＰＩＩＡＭＰＭＮＬＤＱＰＩＮＳＲＩＶＥＡＡＧＶＧＩＥＶＳＲＮＱＳＧＥＬＥＲＥＥＭＡＫＴＩＲＫＶＶＶＥＲＥＧＶＹＶＲＲＫＡＲＥＭＳＤＶＬＲＫＫＧＥＥＥＩＤＧＶＶＤＥＬＶＱＬＣＤＭＫＴＮＹＬ

配列番号５９：（Ｃｅｐｈａｌｏｔｕｓ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ）
ＭＤＬＫＲＲＳＩＲＶＬＭＬＰＷＬＡＨＧＨＩＳＰＦＬＥＬＡＫＫＬＴＮＲＮＦＬＩＹＦＣＳＴＰＩＮＬＮＳＩＫＰＫＬＳＳＫＹＳＦＳＩＱＬＶＥＬＨＬＰＳＬＰＥＬＰＰＨＹＨＴＴＮＧＬＰＬＨＬＭＮＴＬＫＴＡＦＤＭＡＳＰＳＦＬＮＩＬＫＴＬＫＰＤＬＬＩＣＤＨＬＱＰＷＡＰＳＬＡＳＳＬＮＩＰＡＩＩＦＰＴＮＳＡＩＭＭＡＦＳＬＨＨＡＫＮＰＧＥＥＦＰＦＰＳＩＮＩＮＤＤＭＶＫＳＩＮＦＬＨＳＡＳＮＧＬＴＤＭＤＲＶＬＱＣＬＥＲＳＳＮＴＭＬＬＫＴＦＲＱＬＥＡＫＹＶＤＹＳＳＡＬＬＫＫＫＩＶＬＡＧＰＬＶＱＶＰＤＮＥＤＥＫＩＥＩＩＫＷＬＤＳＲＧＱＳＳＴＶＦＶＳＦＧＳＥＹＦＬＳＫＥＥＲＥＤＩＡＨＧＬＥＬＳＫＶＮＦＩＷＶＶＲＦＰＶＧＥＫＶＫＬＥＥＡＬＰＮＧＦＡＥＲＩＧＥＲＧＬＶＶＥＧＷＡＰＱＡＭＩＬＳＨＳＳＩＧＧＦＶＳＨＣＧＷＳＳＭＭＥＳＭＫＦＧＶＰＩＩＡＭＰＭＨＩＤＱＰＬＮＡＲＬＶＥＤＶＧＶＧＬＥＩＫＲＮＫＤＧＲＦＥＲＥＥＬＡＲＶＩＫＥＶＬＶＹＫＮＧＤＡＶＲＳＫＡＲＥＭＳＥＨＩＫＫＮＧＤＱＥＩＤＧＶＡＤＡＬＶＫＬＣＥＭＫＴＮＳＬＮＱＤ

配列番号６０：ＵＧＴ＿１，６（Ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ）
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配列番号６１：ＣｍｏＵＧＴ１（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）
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配列番号６２：（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
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配列番号６３：（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
ＭＧＳＨＶＡＱＫＱＨＶＶＣＶＰＹＰＡＱＧＨＩＮＰＭＭＫＶＡＫＬＬＹＡＫＧＦＨＩＴＦＶＮＴＶＹＮＨＮＲＬＬＲＳＲＧＰＮＡＶＤＧＬＰＳＦＲＦＥＳＩＰＤＧＬＰＥＴＤＶＤＶＴＱＤＩＰＴＬＣＥＳＴＭＫＨＣＬＡＰＦＫＥＬＬＲＱＩＮＡＲＤＤＶＰＰＶＳＣＩＶＳＤＧＣＭＳＦＴＬＤＡＡＥＥＬＧＶＰＥＶＬＦＷＴＴＳＡＣＧＦＬＡＹＬＹＹＹＲＦＩＥＫＧＬＳＰＩＫＤＥＳＹＬＴＫＥＨＬＤＴＫＩＤＷＩＰＳＭＫＮＬＲＬＫＤＩＰＳＦＩＲＴＴＮＰＤＤＩＭＬＮＦＩＩＲＥＡＤＲＡＫＲＡＳＡＩＩＬＮＴＦＤＤＬＥＨＤＶＩＱＳＭＫＳＩＶＰＰＶＹＳＩＧＰＬＨＬＬＥＫＱＥＳＧＥＹＳＥＩＧＲＴＧＳＮＬＷＲＥＥＴＥＣＬＤＷＬＮＴＫＡＲＮＳＶＶＹＶＮＦＧＳＩＴＶＬＳＡＫＱＬＶＥＦＡＷＧＬＡＡＴＧＫＥＦＬＷＶＩＲＰＤＬＶＡＧＤＥＡＭＶＰＰＥＦＬＴＡＴＡＤＲＲＭＬＡＳＷＣＰＱＥＫＶＬＳＨＰＡＩＧＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＬＥＳＬＣＧＧＶＰＭＶＣＷＰＦＦＡＥＱＱＴＮＣＫＦＳＲＤＥＷＥＶＧＩＥＩＧＧＤＶＫＲＥＥＶＥＡＶＶＲＥＬＭＤＥＥＫＧＫＮＭＲＥＫＡＥＥＷＲＲＬＡＮＥＡＴＥＨＫＨＧＳＳＫＬＮＦＥＭＬＶＮＫＶＬＬＧＥ

配列番号６４：ＣｌＵＧＴ１（Ｃｏｌｕｍｂａ ｌｉｖｉａ）
ＭＩＨＣＧＫＫＨＩＣＡＦＶＴＣＩＬＩＳＡＳＩＬＭＹＳＷＫＤＰＱＬＱＮＮＩＴＲＫＩＦＱＡＴＳＡＬＰＡＳＱＬＣＲＧＫＰＡＱＮＶＩＴＡＬＥＤＮＲＴＦＩＩＳＰＹＦＤＤＲＥＳＫＶＴＲＶＩＧＩＶＨＨＥＤＶＫＱＬＹＣＷＦＣＣＱＰＤＧＫＩＹＶＡＲＡＫＩＤＶＨＳＤＲＦＧＦＰＹＧＡＡＤＩＶＣＬＥＰＥＮＣＮＰＴＨＶＳＩＨＱＳＰＨＡＮＩＤＱＬＰＳＦＫＩＫＮＲＫＳＥＴＦＳＶＤＦＴＶＣＩＳＡＭＦＧＮＹＮＮＶＬＱＦＩＱＳＶＥＭＹＫＩＬＧＶＱＫＶＶＩＹＫＮＮＣＳＱＬＭＥＫＶＬＫＦＹＭＥＥＧＴＶＥＩＩＰＷＰＩＮＳＨＬＫＶＳＴＫＷＨＦＳＭＤＡＫＤＩＧＹＹＧＱＩＴＡＬＮＤＣＩＹＲＮＭＱＲＳＫＦＶＶＬＮＤＡＤＥＩＩＬＰＬＫＨＬＤＷＫＡＭＭＳＳＬＱＥＱＮＰＧＡＧＩＦＬＦＥＮＨＩＦＰＫＴＶＳＴＰＶＦＮＩＳＳＷＮＲＶＰＧＶＮＩＬＱＨＶＨＲＥＰＤＲＫＥＶＦＮＰＫＫＭＩＩＤＰＲＱＶＶＱＴＳＶＨＳＶＬＲＡＹＧＮＳＶＮＶＰＡＤＶＡＬＶＹＨＣＲＶＰＬＱＥＥＬＰＲＥＳＬＩＲＤＴＡＬＷＲＹＮＳＳＬＩＴＮＶＮＫＶＬＨＱＴＶＬ

配列番号６５：（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）
ＭＰＴＬＴＶＡＭＩＶＫＮＥＡＱＤＬＡＥＣＬＫＴＶＤＧＷＶＤＥＩＶＩＶＤＳＧＳＴＤＤＴＬＫＩＡＴＱＦＮＡＫＶＹＶＮＳＤＷＱＧＦＧＰＱＲＱＦＡＱＱＹＶＴＳＤＹＶＬＷＬＤＡＤＥＲＶＴＰＥＬＫＡＳＩＬＱＡＶＱＨＮＱＫＮＴＶＹＫＶＳＲＬＳＥＩＦＧＫＥＩＲＹＳＧＷＹＰＤＹＶＶＲＬＹＰＴＹＬＡＫＹＧＤＥＬＶＨＥＫＶＨＹＰＡＤＳＲＶＥＫＬＱＧＤＬＬＨＦＴＹＫＮＩＨＨＹＬＶＫＳＡＳＹＡＫＡＷＡＭＱＲＡＫＡＧＫＫＡＳＬＬＤＧＶＴＨＡＩＡＣＦＬＫＭＹＬＦＫＡＧＦＬＤＧＫＱＧＦＬＬＡＶＬＳＡＨＳＴＦＶＫＹＡＤＬＷＤＲＴＲＳ

配列番号６６：（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）
ＭＫＫＶＳＶＬＩＶＡＫＮＥＡＮＨＩＲＥＣＩＥＳＣＲＦＤＫＥＶＩＶＩＤＤＨＳＡＤＮＴＡＥＩＡＥＧＬＧＡＫＶＦＲＲＨＬＮＧＤＦＧＡＱＫＴＦＡＩＥＱＡＧＧＥＷＶＦＬＩＤＡＤＥＲＣＴＰＥＬＳＤＥＩＳＫＩＶＲＴＧＤＹＡＡＹＦＶＥＲＲＮＬＦＰＮＨＰＡＴＨＧＡＭＲＰＤＳＶＣＲＬＭＰＫＫＧＧＳＶＱＧＫＶＨＥＴＶＱＴＰＹＰＥＲＲＬＫＨＦＭＹＨＹＴＹＤＮＷＥＱＹＦＮＫＦＮＫＹＴＳＩＳＡＥＫＹＲＥＱＧＫＰＶＳＦＶＲＤＩＩＬＲＰＩＷＧＦＦＫＩＹＩＬＮＫＧＦＬＤＧＫＭＧＷＩＭＳＶＮＨＳＹＹＴＭＩＫＹＶＫＬＹＹＬＹＫＳＧＧＫＦ

配列番号６７：（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、株１０２１）
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配列番号６８：（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）
ＭＣＲＣＧＲＡＶＲＳＲＰＶＣＲＰＧＱＬＶＶＲＲＳＰＲＰＲＳＲＮＨＳＲＣＲＰＬＲＬＳＶＦＰＲＰＨＲＲＶＲＨＨＣＱＲＤＬＲＷＥＰＧＲＷＩＡＶＲＷＫＡＡＲＳＨＲＲＦＲＲＣＰＦＰＲＱＬＶＷＰＶＲＥＲＨＲＤＡＧＤＲＲＮＱＲＥＲＲＲＲＤＡＹＨＥＩＳＥＰＫＦＲＴＲＫＲＴＥＳＦＷＭＮＫＡＩＴＶＩＶＷＬＬＶＳＬＣＶＬＡＩＩＴＭＰＶＳＬＱＴＨＬＶＡＴＡＩＳＬＩＬＬＡＴＩＫＳＦＮＧＱＧＡＷＲＬＶＡＬＧＦＧＴＡＩＶＬＲＹＶＹＷＲＴＴＳＴＬＰＰＶＮＱＬＥＮＦＩＰＧＦＬＬＹＬＡＥＭＹＳＶＶＭＬＧＬＳＬＶＩＶＳＭＰＬＰＳＲＫＴＲＰＧＳＰＤＹＲＰＴＶＤＶＦＶＰＳＹＮＥＤＡＥＬＬＡＮＴＬＡＡＡＫＮＭＤＹＰＡＤＲＦＴＶＷＬＬＤＤＧＧＳＶＱＫＲＮＡＡＮＩＶＥＡＱＡＡＱＲＲＨＥＥＬＫＫＬＣＥＤＬＤＶＲＹＬＴＲＥＲＮＶＨＡＫＡＧＮＬＮＮＧＬＡＨＳＴＧＥＬＶＴＶＦＤＡＤＨＡＰＡＲＤＦＬＬＥＴＶＧＹＦＤＥＤＰＲＬＦＬＶＱＴＰＨＦＦＶＮＰＤＰＩＥＲＮＬＲＴＦＥＴＭＰＳＥＮＥＭＦＹＧＩＩＱＲＧＬＤＫＷＮＧＡＦＦＣＧＳＡＡＶＬＲＲＥＡＬＱＤＳＤＧＦＳＧＶＳＩＴＥＤＣＥＴＡＬＡＬＨＳＲＧＷＮＳＶＹＶＤＫＰＬＩＡＧＬＱＰＡＴＦＡＳＦＩＧＱＲＳＲＷＡＱＧＭＭＱＩＬＩＦＲＱＰＬＦＫＲＧＬＳＦＴＱＲＬＣＹＭＳＳＴＬＦＷＬＦＰＦＰＲＴＩＦＬＦＡＰＬＦＹＬＦＦＤＬＱＩＦＶＡＳＧＧＥＦＬＡＹＴＡＡＹＭＬＶＮＬＭＭＱＮＹＬＹＧＳＦＲＷＰＷＩＳＥＬＹＥＹＶＱＴＶＨＬＬＰＡＶＶＳＶＩＦＮＰＧＫＰＴＦＫＶＴＡＫＤＥＳＩＡＥＡＲＬＳＥＩＳＲＰＦＦＶＩＦＡＬＬＬＶＡＭＡＦＡＶＷＲＩＹＳＥＰＹＫＡＤＶＴＬＶＶＧＧＷＮＬＬＮＬＩＦＡＧＣＡＬＧＶＶＳＥＲＧＤＫＳＡＳＲＲＩＴＶＫＲＲＣＥＶＱＬＧＧＳＤＴＷＶＰＡＳＩＤＮＶＳＶＨＧＬＬＩＮＩＦＤＳＡＴＮＩＥＫＧＡＴＡＩＶＫＶＫＰＨＳＥＧＶＰＥＴＭＰＬＮＶＶＲＴＶＲＧＥＧＦＶＳＩＧＣＴＦＳＰＱＲＡＶＤＨＲＬＩＡＤＬＩＦＡＮＳＥＱＷＳＥＦＱＲＶＲＲＫＫＰＧＬＩＲＧＴＡＩＦＬＡＩＡＬＦＱＴＱＲＧＬＹＹＬＶＲＡＲＲＰＡＰＫＳＡＫＰＶＧＡＶＫ

配列番号６９：（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）
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配列番号７０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）
ＭＹＴＦＩＬＭＬＬＤＦＦＱＮＨＤＦＨＦＦＭＬＦＦＶＦＩＬＩＲＷＡＶＩＹＦＨＡＶＲＹＫＳＹＳＣＳＶＳＤＥＫＬＦＳＳＶＩＩＰＶＶＤＥＰＬＮＬＦＥＳＶＬＮＲＩＳＲＨＫＰＳＥＩＩＶＶＩＮＧＰＫＮＥＲＬＶＫＬＣＨＤＦＮＥＫＬＥＮＮＭＴＰＩＱＣＹＹＴＰＶＰＧＫＲＮＡＩＲＶＧＬＥＨＶＤＳＱＳＤＩＴＶＬＶＤＳＤＴＶＷＴＰＲＴＬＳＥＬＬＫＰＦＶＣＤＫＫＩＧＧＶＴＴＲＱＫＩＬＤＰＥＲＮＬＶＴＭＦＡＮＬＬＥＥＩＲＡＥＧＴＭＫＡＭＳＶＴＧＫＶＧＣＬＰＧＲＴＩＡＦＲＮＩＶＥＲＶＹＴＫＦＩＥＥＴＦＭＧＦＨＫＥＶＳＤＤＲＳＬＴＮＬＴＬＫＫＧＹＫＴＶＭＱＤＴＳＶＶＹＴＤＡＰＴＳＷＫＫＦＩＲＱＱＬＲＷＡＥＧＳＱＹＮＮＬＫＭＴＰＷＭＩＲＮＡＰＬＭＦＦＩＹＦＴＤＭＩＬＰＭＬＬＩＳＦＧＶＮＩＦＬＬＫＩＬＮＩＴＴＩＶＹＴＡＳＷＷＥＩＩＬＹＶＬＬＧＭＩＦＳＦＧＧＲＮＦＫＡＭＳＲＭＫＷＹＹＶＦＬＩＰＶＦＩＩＶＬＳＩＩＭＣＰＩＲＬＬＧＬＭＲＣＳＤＤＬＧＷＧＴＲＮＬＴＥ

配列番号７１：ＡｔＵＧＴ７３Ｃ３（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
ＭＡＴＥＫＴＨＱＦＨＰＳＬＨＦＶＬＦＰＦＭＡＱＧＨＭＩＰＭＩＤＩＡＲＬＬＡＱＲＧＶＴＩＴＩＶＴＴＰＨＮＡＡＲＦＫＮＶＬＮＲＡＩＥＳＧＬＡＩＮＩＬＨＶＫＦＰＹＱＥＦＧＬＰＥＧＫＥＮＩＤＳＬＤＳＴＥＬＭＶＰＦＦＫＡＶＮＬＬＥＤＰＶＭＫＬＭＥＥＭＫＰＲＰＳＣＬＩＳＤＷＣＬＰＹＴＳＩＩＡＫＮＦＮＩＰＫＩＶＦＨＧＭＧＣＦＮＬＬＣＭＨＶＬＲＲＮＬＥＩＬＥＮＶＫＳＤＥＥＹＦＬＶＰＳＦＰＤＲＶＥＦＴＫＬＱＬＰＶＫＡＮＡＳＧＤＷＫＥＩＭＤＥＭＶＫＡＥＹＴＳＹＧＶＩＶＮＴＦＱＥＬＥＰＰＹＶＫＤＹＫＥＡＭＤＧＫＶＷＳＩＧＰＶＳＬＣＮＫＡＧＡＤＫＡＥＲＧＳＫＡＡＩＤＱＤＥＣＬＱＷＬＤＳＫＥＥＧＳＶＬＹＶＣＬＧＳＩＣＮＬＰＬＳＱＬＫＥＬＧＬＧＬＥＥＳＲＲＳＦＩＷＶＩＲＧＳＥＫＹＫＥＬＦＥＷＭＬＥＳＧＦＥＥＲＩＫＥＲＧＬＬＩＫＧＷＡＰＱＶＬＩＬＳＨＰＳＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＬＥＧＩＴＳＧＩＰＬＩＴＷＰＬＦＧＤＱＦＣＮＱＫＬＶＶＱＶＬＫＡＧＶＳＡＧＶＥＥＶＭＫＷＧＥＥＤＫＩＧＶＬＶＤＫＥＧＶＫＫＡＶＥＥＬＭＧＤＳＤＤＡＫＥＲＲＲＲＶＫＥＬＧＥＬＡＨＫＡＶＥＫＧＧＳＳＨＳＮＩＴＬＬＬＱＤＩＭＱＬＡＱＦＫＮ

配列番号７２：ＨｖＵＧＴ Ｂ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ．Ｖｕｌｇａｒｅ）
ＭＡＱＡＥＳＥＲＭＲＶＶＭＦＰＷＬＡＨＧＨＩＮＰＹＬＥＬＡＫＲＬＩＡＳＡＳＧＤＨＨＬＤＶＶＶＨＬＶＳＴＰＡＮＬＡＰＬＡＨＨＱＴＤＲＬＲＬＶＥＬＨＬＰＳＬＰＤＬＰＰＡＬＨＴＴＫＧＬＰＡＲＬＭＰＶＬＫＲＡＣＤＬＡＡＰＲＦＧＡＬＬＤＥＬＣＰＤＩＬＶＹＤＦＩＱＰＷＡＰＬＥＡＥＡＲＧＶＰＡＦＨＦＡＴＣＧＡＡＡＴＡＦＦＩＨＣＬＫＴＤＲＰＰＳＡＦＰＦＥＳＩＳＬＧＧＶＤＥＤＡＫＹＴＡＬＶＴＶＲＥＤＳＴＡＬＶＡＥＲＤＲＬＰＬＳＬＥＲＳＳＧＦＶＡＶＫＳＳＡＤＩＥＲＫＹＭＥＹＬＳＱＬＬＧＫＥＩＩＰＴＧＰＬＬＶＤＳＧＧＳＥＥＱＲＤＧＧＲＩＭＲＷＬＤＧＥＥＰＧＳＶＶＦＶＳＦＧＳＥＹＦＭＳＥＨＱＭＡＱＭＡＲＧＬＥＬＳＧＶＰＦＬＷＶＶＲＦＰＮＡＥＤＤＡＲＧＡＡＲＳＭＰＰＧＦＥＰＥＬＧＬＶＶＥＧＷＡＰＱＲＲＩＬＳＨＰＳＣＧＡＦＬＴＨＣＧＷＳＳＶＬＥＳＭＡＡＧＶＰＭＶＡＬＰＬＨＩＤＱＰＬＮＡＮＬＡＶＥＬＧＡＡＡＡＲＶＫＱＥＲＦＧＥＦＴＡＥＥＶＡＲＡＶＲＡＡＶＫＧＫＥＧＥＡＡＲＲＲＡＲＥＬＱＥＶＶＡＲＮＮＧＮＤＧＱＩＡＴＬＬＱＲＭＡＲＬＣＧＫＤＱＡＶＰＮ

配列番号７３：ＨｖＵＧＴ＿Ｂ３（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ．Ｖｕｌｇａｒｅ）
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配列番号７４：ＣｃＵＧＴ＿１，６（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）
ＭＡＥＮＨＡＴＦＮＶＬＭＬＰＷＬＡＨＧＨＶＳＰＹＬＥＬＡＭＫＬＴＡＲＮＦＮＶＹＬＣＳＳＰＡＴＬＳＳＶＲＳＫＬＴＥＫＦＳＱＳＩＨＬＶＥＬＨＬＰＫＬＰＥＬＰＡＥＹＨＴＴＮＧＬＰＰＨＬＭＰＴＬＫＤＡＦＤＭＡＫＰＮＦＣＮＶＬＫＳＬＫＰＤＬＬＩＹＤＬＬＱＰＷＡＰＥＡＡＳＡＦＮＩＰＡＶＶＦＩＳＳＳＡＴＭＴＳＦＧＬＨＦＦＫＮＰＧＴＫＹＰＹＧＮＴＩＦＹＲＤＹＥＳＶＦＶＥＮＬＫＫＲＤＲＤＴＹＲＶＶＮＣＭＥＲＳＳＫＩＩＬＩＫＧＦＫＥＩＥＧＫＹＦＤＹＦＳＣＬＴＧＫＫＶＶＰＶＧＰＬＶＱＤＰＶＬＤＤＥＤＣＲＩＭＱＷＬＮＫＫＥＫＧＳＴＶＦＶＳＦＧＳＥＹＦＬＳＫＥＤＭＥＥＩＡＨＧＬＥＬＳＮＶＤＦＩＷＶＶＲＦＰＫＧＥＮＩＶＩＥＥＴＬＰＫＧＦＦＥＲＶＧＥＲＧＬＶＶＮＧＷＡＰＱＡＫＩＬＴＨＰＮＶＧＧＦＶＳＨＣＧＷＮＳＶＭＥＳＭＫＦＧＬＰＩＶＡＭＰＭＨＬＤＱＰＩＮＡＲＬＩＥＥＶＧＡＧＶＥＶＬＲＤＳＫＧＫＬＨＲＥＲＭＡＥＴＩＮＫＶＴＫＥＡＳＧＥＰＡＲＫＫＡＲＥＬＱＥＫＬＥＬＫＧＤＥＥＩＤＤＶＶＫＥＬＶＱＬＣＡＴＫＮＫＲＮＧＬＨＣＹＮ

配列番号７５：ＣｅＵＧＴ＿１，６（Ｃｏｆｆｅａ ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）
ＭＡＥＮＨＡＴＦＮＶＬＭＬＰＷＬＡＨＧＨＶＳＰＹＬＥＬＡＫＫＬＴＡＲＮＦＮＶＹＬＣＳＳＰＡＴＬＳＳＶＲＳＫＬＴＥＫＦＳＱＳＩＨＬＶＥＬＨＬＰＫＬＰＥＬＰＡＥＹＨＴＴＮＧＬＰＰＨＬＭＰＴＬＫＤＡＦＤＭＡＥＰＮＦＣＮＶＬＫＳＬＫＰＤＬＬＩＹＤＬＬＱＰＷＡＰＥＡＡＳＡＦＮＩＰＡＶＶＦＩＳＳＳＡＴＭＴＳＦＧＬＨＦＦＫＮＰＧＴＫＹＰＹＧＮＴＩＦＹＲＤＹＥＳＶＦＶＥＮＬＫＲＲＤＲＤＴＹＲＶＶＮＣＭＥＲＳＳＫＩＩＬＩＫＧＦＫＥＩＥＧＫＹＦＤＹＦＳＣＬＴＧＫＫＶＶＰＶＧＰＬＶＱＤＰＶＬＤＤＥＤＣＲＩＭＱＷＬＮＫＫＥＫＧＳＴＶＦＶＳＦＧＳＥＹＦＬＳＫＥＤＭＥＥＩＡＨＧＬＥＬＳＮＶＤＦＩＷＶＶＲＦＰＫＧＥＮＩＶＩＥＥＴＬＰＫＧＦＦＥＲＶＧＥＲＧＬＶＶＮＧＷＡＰＱＡＫＩＬＴＨＰＮＶＧＧＦＶＳＨＣＧＷＮＳＶＭＥＳＭＫＦＧＬＰＩＩＡＭＰＭＨＬＤＱＰＩＮＡＲＬＩＥＥＶＧＡＧＶＥＶＬＲＤＳＫＧＫＬＨＲＥＲＭＡＥＴＩＮＫＶＴＫＥＡＳＧＥＳＶＲＫＫＡＲＥＬＱＥＫＬＥＬＫＧＤＥＥＩＤＤＶＶＫＥＬＶＱＬＣＡＴＫＮＫＲＮＧＬＨＹＮ

配列番号７６：ＣｅＵＧＴ＿１，６．２（Ｃｏｆｆｅａ ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）
ＭＡＥＮＨＡＴＦＮＶＬＭＬＰＷＬＡＨＧＨＶＳＰＹＬＥＬＡＫＫＬＴＡＲＮＦＮＶＹＬＣＳＳＰＡＴＬＳＳＶＲＳＫＬＴＥＫＦＳＱＳＩＨＬＶＥＬＨＬＰＫＬＰＥＬＰＡＥＹＨＴＴＮＧＬＰＰＨＬＭＰＴＬＫＤＡＦＤＭＡＫＰＮＦＣＮＶＬＫＳＬＫＰＤＬＬＩＹＤＬＬＱＰＷＡＰＥＡＡＳＡＦＮＩＰＡＶＶＦＩＳＳＳＡＴＭＴＳＦＧＬＨＦＦＫＮＰＧＴＫＹＰＹＧＮＡＩＦＹＲＤＹＥＳＶＦＶＥＮＬＴＲＲＤＲＤＴＹＲＶＩＮＣＭＥＲＳＳＫＩＩＬＩＫＧＦＮＥＩＥＧＫＹＦＤＹＦＳＣＬＴＧＫＫＶＶＰＶＧＰＬＶＱＤＰＶＬＤＤＥＤＣＥＩＭＱＷＬＮＫＫＥＫＶＳＴＶＦＶＳＦＧＳＥＹＦＬＳＫＫＤＭＥＥＩＡＨＧＬＥＬＳＮＶＤＦＩＷＶＶＲＦＰＫＧＥＮＩＶＩＥＥＴＬＰＫＧＦＦＥＲＶＧＥＲＧＬＶＶＮＧＷＡＰＱＡＫＩＬＴＨＰＮＶＧＧＦＶＳＨＣＧＷＮＳＶＭＥＳＭＫＦＧＬＰＩＩＡＭＰＭＨＬＤＱＰＩＮＡＲＬＩＥＥＶＧＡＧＶＥＶＬＲＤＳＫＧＫＬＨＲＥＲＭＡＥＴＩＮＫＶＭＫＥＡＳＧＥＳＶＲＫＫＡＲＥＬＱＥＫＭＤＬＫＧＤＥＥＩＤＤＶＶＫＥＬＶＱＬＣＡＴＫＮＫＲＮＧＬＨＹＹ

配列番号７７：ＳｇＵＧＴ９４－２８９－３．２（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）
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配列番号７８：ＯｓＪＵＧＴ＿１，６（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（ＯｓＪＵＧＴ＿１，６）
ＭＡＱＡＥＲＥＲＬＲＶＬＭＦＰＷＬＡＨＧＨＩＮＰＹＬＥＬＡＴＲＬＴＴＴＳＳＳＱＩＤＶＶＶＨＬＶＳＴＰＶＮＬＡＡＶＡＨＲＲＴＤＲＩＳＬＶＥＬＨＬＰＥＬＰＧＬＰＰＡＬＨＴＴＫＨＬＰＰＲＬＭＰＡＬＫＲＡＣＤＬＡＡＰＡＦＧＡＬＬＤＥＬＳＰＤＶＶＬＹＤＦＩＱＰＷＡＰＬＥＡＡＡＲＧＶＰＡＶＨＦＳＴＣＳＡＡＡＴＡＦＦＬＨＦＬＤＧＧＧＧＧＧＧＲＧＡＦＰＦＥＡＩＳＬＧＧＡＥＥＤＡＲＹＴＭＬＴＣＲＤＤＧＴＡＬＬＰＫＧＥＲＬＰＬＳＦＡＲＳＳＥＦＶＡＶＫＴＣＶＥＩＥＳＫＹＭＤＹＬＳＫＬＶＧＫＥＩＩＰＣＧＰＬＬＶＤＳＧＤＶＳＡＧＳＥＡＤＧＶＭＲＷＬＤＧＱＥＰＧＳＶＶＬＶＳＦＧＳＥＹＦＭＴＥＫＱＬＡＥＭＡＲＧＬＥＬＳＧＡＡＦＶＷＶＶＲＦＰＱＱＳＰＤＧＤＥＤＤＨＧＡＡＡＡＲＡＭＰＰＧＦＡＰＡＲＧＬＶＶＥＧＷＡＰＱＲＲＶＬＳＨＲＳＣＧＡＦＬＴＨＣＧＷＳＳＶＭＥＳＭＳＡＧＶＰＭＶＡＬＰＬＨＩＤＱＰＶＧＡＮＬＡＡＥＬＧＶＡＡＲＶＲＱＥＲＦＧＥＦＥＡＥＥＶＡＲＡＶＲＡＶＭＲＧＧＥＡＬＲＲＲＡＴＥＬＲＥＶＶＡＲＲＤＡＥＣＤＥＱＩＧＡＬＬＨＲＭＡＲＬＣＧＫＧＴＧＲＡＡＱＬＧＨ

配列番号７９：ＰｇＵＧＴ９４＿Ｂ１（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）
ＭＡＤＮＱＮＧＲＩＳＩＡＬＬＰＦＬＡＨＧＨＩＳＰＦＦＥＬＡＫＱＬＡＫＲＮＣＮＶＦＬＣＳＴＰＩＮＬＳＳＩＫＤＫＤＳＳＡＳＩＫＬＶＥＬＨＬＰＳＳＰＤＬＰＰＨＹＨＴＴＮＧＬＰＳＨＬＭＬＰＬＲＮＡＦＥＴＡＧＰＴＦＳＥＩＬＫＴＬＮＰＤＬＬＩＹＤＦＮＰＳＷＡＰＥＩＡＳＳＨＮＩＰＡＶＹＦＬＴＴＡＡＡＳＳＳＩＧＬＨＡＦＫＮＰＧＥＫＹＰＦＰＤＦＹＤＮＳＮＩＴＰＥＰＰＳＡＤＮＭＫＬＬＨＤＦＩＡＣＦＥＲＳＣＤＩＩＬＩＫＳＦＲＥＬＥＧＫＹＩＤＬＬＳＴＬＳＤＫＴＬＶＰＶＧＰＬＶＱＤＰＭＧＨＮＥＤＰＫＴＥＱＩＩＮＷＬＤＫＲＡＥＳＴＶＶＦＶＣＦＧＳＥＹＦＬＳＮＥＥＬＥＥＶＡＩＧＬＥＩＳＴＶＮＦＩＷＡＶＲＬＩＥＧＥＫＫＧＩＬＰＥＧＦＶＱＲＶＧＤＲＧＬＶＶＥＧＷＡＰＱＡＲＩＬＧＨＳＳＴＧＧＦＶＳＨＣＧＷＳＳＩＡＥＳＭＫＦＧＶＰＶＩＡＭＡＲＨＬＤＱＰＬＮＧＫＬＡＡＥＶＧＶＧＭＥＶＶＲＤＥＮＧＫＹＫＲＥＧＩＡＥＶＩＲＫＶＶＶＥＫＳＧＥＶＩＲＲＫＡＲＥＬＳＥＫＭＫＥＫＧＥＱＥＩＤＲＡＬＥＥＬＶＱＩＣＫＫＫＫＤＥＱ

配列番号８０：ＳｒＵＧＴ７３Ｅ１、任意のＨｉｓタグを有する（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
ＭＡＨＨＨＨＨＨＶＧＴＧＳＮＤＤＤＤＫＳＰＤＰＮＷＡＳＴＳＥＬＶＦＩＰＳＰＧＡＧＨＬＰＰＴＶＥＬＡＫＬＬＬＨＲＤＱＲＬＳＶＴＩＩＶＭＮＬＷＬＧＰＫＨＮＴＥＡＲＰＣＶＰＳＬＲＦＶＤＩＰＣＤＥＳＴＭＡＬＩＳＰＮＴＦＩＳＡＦＶＥＨＨＫＰＲＶＲＤＩＶＲＧＩＩＥＳＤＳＶＲＬＡＧＦＶＬＤＭＦＣＭＰＭＳＤＶＡＮＥＦＧＶＰＳＹＮＹＦＴＳＧＡＡＴＬＧＬＭＦＨＬＱＷＫＲＤＨＥＧＹＤＡＴＥＬＫＮＳＤＴＥＬＳＶＰＳＹＶＮＰＶＰＡＫＶＬＰＥＶＶＬＤＫＥＧＧＳＫＭＦＬＤＬＡＥＲＩＲＥＳＫＧＩＩＶＮＳＣＱＡＩＥＲＨＡＬＥＹＬＳＳＮＮＮＧＩＰＰＶＦＰＶＧＰＩＬＮＬＥＮＫＫＤＤＡＫＴＤＥＩＭＲＷＬＮＥＱＰＥＳＳＶＶＦＬＣＦＧＳＭＧＳＦＮＥＫＱＶＫＥＩＡＶＡＩＥＲＳＧＨＲＦＬＷＳＬＲＲＰＴＰＫＥＫＩＥＦＰＫＥＹＥＮＬＥＥＶＬＰＥＧＦＬＫＲＴＳＳＩＧＫＶＩＧＷＡＰＱＭＡＶＬＳＨＰＳＶＧＧＦＶＳＨＣＧＷＮＳＴＬＥＳＭＷＣＧＶＰＭＡＡＷＰＬＹＡＥＱＴＬＮＡＦＬＬＶＶＥＬＧＬＡＡＥＩＲＭＤＹＲＴＤＴＫＡＧＹＤＧＧＭＥＶＴＶＥＥＩＥＤＧＩＲＫＬＭＳＤＧＥＩＲＮＫＶＫＤＶＫＥＫＳＲＡＡＶＶＥＧＧＳＳＹＡＳＩＧＫＦＩＥＨＶＳＮＶＴＩ

配列番号８１：（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）
ＭＡＳＥＫＴＬＱＶＨＰＰＬＨＦＶＬＦＰＦＭＡＱＧＨＭＩＰＭＶＤＩＡＲＬＬＡＱＲＧＡＴＶＴＩＶＴＴＲＹＮＡＧＲＦＥＮＶＬＳＲＡＶＥＳＧＬＰＩＮＩＶＨＶＫＦＰＹＥＥＶＧＬＰＫＧＫＥＮＩＤＳＬＤＳＭＥＬＭＶＰＦＦＫＡＶＮＭＬＱＤＰＶＶＫＬＭＥＥＭＥＳＲＰＳＣＩＩＳＤＬＬＬＰＹＴＳＫＩＡＫＫＦＮＩＰＫＩＶＦＨＧＩＳＣＦＣＬＬＣＶＨＶＬＲＲＮＬＥＩＬＴＮＬＫＳＤＫＥＹＦＬＶＰＳＦＰＤＲＶＥＦＴＫＰＱＶＴＶＥＴＮＡＳＧＤＷＫＥＦＬＤＥＭＶＥＡＥＤＴＳＹＧＶＩＩＮＴＦＥＥＬＥＰＡＹＶＫＤＹＫＤＡＲＡＧＮＶＷＳＩＧＰＶＳＬＣＮＫＡＧＶＤＫＡＥＲＧＮＫＡＴＩＤＱＤＥＣＬＫＷＬＤＳＫＥＥＧＳＶＬＹＶＣＬＧＳＩＣＮＬＰＬＶＱＬＫＥＬＧＬＧＬＥＥＳＱＲＰＦＩＷＶＩＲＧＷＥＫＹＮＥＬＳＥＷＭＶＥＳＧＦＥＥＲＩＲＥＲＧＬＬＩＲＧＷＡＰＱＶＬＩＬＳＨＰＳＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＶＥＧＩＴＳＧＶＰＬＩＴＷＰＬＦＧＤＱＦＣＮＱＴＬＶＶＱＶＬＫＡＧＶＳＶＧＶＥＥＶＭＫＷＧＥＥＥＫＩＧＶＬＶＤＫＥＧＶＫＫＡＶＥＤＬＭＧＥＳＤＤＡＫＥＲＴＫＲＶＫＥＬＧＧＬＡＨＫＡＶＥＥＧＧＳＳＨＳＮＩＴＬＦＬＱＤＩＲＱＶＱＳＶ

配列番号８２：ＵＧＴ７３Ｆ２４（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ（ＵＧＴ７３Ｆ２４）
ＭＡＤＶＡＥＥＱＰＬＫＩＹＦＩＰＹＬＡＡＧＨＭＩＰＬＣＤＩＡＴＬＦＡＳＲＧＨＨＶＴＩＩＴＴＰＳＮＡＱＴＬＲＥＳＨＨＦＲＶＱＴＩＱＦＰＳＱＥＶＧＬＰＡＧＶＱＮＬＴＡＶＴＮＬＤＤＳＹＫＩＹＨＡＴＭＬＬＲＫＨＩＥＤＦＶＥＲＤＰＰＤＣＩＶＡＤＦＬＦＰＷＶＤＤＶＡＴＫＬＨＩＰＲＬＶＦＮＧＦＴＬＦＴＩＣＡＭＥＳＨＫＡＨＰＬＰＶＤＡＡＳＧＳＦＶＩＰＤＦＰＨＨＶＴＩＮＳＴＰＰＫＲＴＫＥＦＶＤＰＬＬＴＥＡＦＫＳＨＧＦＬＩＮＳＦＶＥＬＤＧＥＥＣＶＥＨＹＥＲＩＴＧＧＨＫＡＷＨＬＧＰＡＦＬＶＨＲＴＡＱＤＲＧＥＫＳＶＶＳＴＱＥＣＬＳＷＬＤＳＫＲＤＮＳＶＬＹＩＣＦＧＴＩＣＹＦＰＤＫＱＬＹＥＩＡＳＡＩＥＡＳＧＨＥＦＩＷＶＶＰＥＫＲＧＮＡＤＥＳＥＥＥＫＥＫＷＬＰＫＧＦＥＥＲＮＮＧＫＫＧＭＩＩＲＧＷＡＰＱＶＡＩＬＧＨＰＡＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＶＥＡＶＳＡＧＶＰＭＩＴＷＰＶＨＳＤＱＹＦＮＥＫＬＩＴＱＶＲＧＩＧＶＥＶＧＡＥＥＷＩＶＴＡＦＲＥＴＥＫＬＶＧＲＤＲＩＥＲＡＶＲＲＶＭＤＧＧＤＥＡＶＱＩＲＲＲＡＲＥＬＧＥＭＡＲＱＡＶＱＥＧＧＳＳＨＴＮＬＴＡＬＩＮＤＬＫＲＷＲＤＳＫＱＬＮ

配列番号８３：ＵＧＴ７３Ｃ３３（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）
ＭＡＶＦＱＡＮＱＰＨＦＶＬＦＰＬＭＡＱＧＨＩＩＰＭＩＤＩＡＲＬＬＡＱＲＧＡＩＶＴＩＦＴＴＰＫＮＡＳＲＦＴＳＶＬＳＲＡＶＳＳＧＬＱＩＲＬＶＨＬＨＦＰＳＫＥＡＧＬＰＥＧＣＥＮＬＤＭＶＡＳＨＤＭＩＣＮＩＦＱＡＩＲＭＬＱＫＱＡＥＥＬＦＥＴＬＴＰＫＰＳＣＩＩＳＤＦＣＩＰＷＴＴＱＶＡＥＫＨＨＩＰＲＩＳＦＨＧＦＳＣＦＣＬＨＣＭＬＫＩＨＴＳＫＶＬＥＧＩＴＳＥＳＥＹＦＴＶＰＧＩＰＤＱＩＱＶＴＫＱＱＶＰＧＰＭＩＤＥＭＫＥＦＧＥＱＭＲＤＡＥＩＲＳＹＧＶＩＩＮＴＦＥＥＬＥＫＡＹＶＮＤＹＫＫＥＲＮＧＫＶＷＣＩＧＰＶＳＬＣＮＫＤＧＬＤＫＡＱＲＧＮＫＡＳＩＳＥＨＨＣＬＥＷＬＤＬＱＱＰＮＳＶＩＹＶＣＬＧＳＬＣＮＬＴＰＰＱＬＭＥＬＡＬＧＬＥＡＴＫＲＰＦＩＷＶＩＲＥＧＮＫＦＥＥＬＥＫＷＩＳＥＥＧＦＥＥＲＩＫＧＲＧＬＩＩＲＧＷＡＰＱＶＬＩＬＳＨＰＳＩＧＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＬＥＧＶＴＡＧＶＰＭＶＴＷＰＬＦＡＤＱＦＬＮＥＫＬＶＴＱＶＬＲＩＧＶＳＬＧＶＤＶＰＬＫＷＧＥＥＥＫＶＧＶＱＶＫＫＥＧＩＥＫＡＩＣＭＶＭＤＥＧＥＥＳＫＥＲＲＥＲＡＫＥＬＳＥＭＡＫＲＡＶＥＫＤＧＳＳＨＬＮＭＴＭＬＩＱＤＩＭＱＱＳＳＳＫＶＥＴ

配列番号８４：ＵＧＴ８５Ｃ１（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）
ＭＤＱＭＡＫＩＤＥＫＫＰＨＶＶＦＩＰＦＰＡＱＳＨＩＫＣＭＬＫＬＡＲＩＬＨＱＫＧＬＹＩＴＦＩＮＴＤＴＮＨＥＲＬＶＡＳＧＧＴＱＷＬＥＮＡＰＧＦＷＦＫＴＶＰＤＧＦＧＳＡＫＤＤＧＶＫＰＴＤＡＬＲＥＬＭＤＹＬＫＴＮＦＦＤＬＦＬＤＬＶＬＫＬＥＶＰＡＴＣＩＩＣＤＧＣＭＴＦＡＮＴＩＲＡＡＥＫＬＮＩＰＶＩＬＦＷＴＭＡＡＣＧＦＭＡＦＹＱＡＫＶＬＫＥＫＥＩＶＰＶＫＤＥＴＹＬＴＮＧＹＬＤＭＥＩＤＷＩＰＧＭＫＲＩＲＬＲＤＬＰＥＦＩＬＡＴＫＱＮＹＦＡＦＥＦＬＦＥＴＡＱＬＡＤＫＶＳＨＭＩＩＨＴＦＥＥＬＥＡＳＬＶＳＥＩＫＳＩＦＰＮＶＹＴＩＧＰＬＱＬＬＬＮＫＩＴＱＫＥＴＮＮＤＳＹＳＬＷＫＥＥＰＥＣＶＥＷＬＮＳＫＥＰＮＳＶＶＹＶＮＦＧＳＬＡＶＭＳＬＱＤＬＶＥＦＧＷＧＬＶＮＳＮＨＹＦＬＷＩＩＲＡＮＬＩＤＧＫＰＡＶＭＰＱＥＬＫＥＡＭＮＥＫＧＦＶＧＳＷＣＳＱＥＥＶＬＮＨＰＡＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＧＳＩＩＥＳＬＳＡＧＶＰＭＬＧＷＰＳＩＧＤＱＲＡＮＣＲＱＭＣＫＥＷＥＶＧＭＥＩＧＫＮＶＫＲＤＥＶＥＫＬＶＲＭＬＭＥＧＬＥＧＥＲＭＲＫＫＡＬＥＷＫＫＳＡＴＬＡＴＣＣＮＧＳＳＳＬＤＶＥＫＬＡＮＥＩＫＫＬＳＲＮ

配列番号９９：Ａｔ７５Ｄ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
ＭＡＮＮＮＳＮＳＰＴＧＰＨＦＬＦＶＴＦＰＡＱＧＨＩＮＰＳＬＥＬＡＫＲＬＡＧＴＩＳＧＡＲＶＴＦＡＡＳＩＳＡＹＮＲＲＭＦＳＴＥＮＶＰＥＴＬＩＦＡＴＹＳＤＧＨＤＤＧＦＫＳＳＡＹＳＤＫＳＲＱＤＡＴＧＮＦＭＳＥＭＲＲＲＧＫＥＴＬＴＥＬＩＥＤＮＲＫＱＮＲＰＦＴＣＶＶＹＴＩＬＬＴＷＶＡＥＬＡＲＥＦＨＬＰＳＡＬＬＷＶＱＰＶＴＶＦＳＩＦＹＨＹＦＮＧＹＥＤＡＩＳＥＭＡＮＴＰＳＳＳＩＫＬＰＳＬＰＬＬＴＶＲＤＩＰＳＦＩＶＳＳＮＶＹＡＦＬＬＰＡＦＲＥＱＩＤＳＬＫＥＥＩＮＰＫＩＬＩＮＴＦＱＥＬＥＰＥＡＭＳＳＶＰＤＮＦＫＩＶＰＶＧＰＬＬＴＬＲＴＤＦＳＳＲＧＥＹＩＥＷＬＤＴＫＡＤＳＳＶＬＹＶＳＦＧＴＬＡＶＬＳＫＫＱＬＶＥＬＣＫＡＬＩＱＳＲＲＰＦＬＷＶＩＴＤＫＳＹＲＮＫＥＤＥＱＥＫＥＥＤＣＩＳＳＦＲＥＥＬＤＥＩＧＭＶＶＳＷＣＤＱＦＲＶＬＮＨＲＳＩＧＣＦＶＴＨＣＧＷＮＳＴＬＥＳＬＶＳＧＶＰＶＶＡＦＰＱＷＮＤＱＭＭＮＡＫＬＬＥＤＣＷＫＴＧＶＲＶＭＥＫＫＥＥＥＧＶＶＶＶＤＳＥＥＩＲＲＣＩＥＥＶＭＥＤＫＡＥＥＦＲＧＮＡＴＲＷＫＤＬＡＡＥＡＶＲＥＧＧＳＳＦＮＨＬＫＡＦＶＤＥＨＭ

リンカー
配列番号８５：ＧＧＳＧＧＳ（Ｌ６）

配列番号８６：ＧＧＳＧＧＳＧ（Ｌ７）

配列番号８７：ＧＧＳＧＧＳＧＧ（Ｌ８）

配列番号８８：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（Ｌ９）

配列番号８９：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（Ｌ１０）

配列番号９０：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（Ｌ１１）

配列番号９１：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（Ｌ１２）

補完酵素
配列番号９２：Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ
ＭＡＩＨＮＲＡＧＱＰＡＱＱＳＤＬＩＮＶＡＱＬＴＡＱＹＹＶＬＫＰＥＡＧＮＡＥＨＡＶＫＦＧＴＳＧＨＲＧＳＡＡＲＨＳＦＮＥＰＨＩＬＡＩＡＱＡＩＡＥＥＲＡＫＮＧＩＴＧＰＣＹＶＧＫＤＴＨＡＬＳＥＰＡＦＩＳＶＬＥＶＬＡＡＮＧＶＤＶＩＶＱＥＮＮＧＦＴＰＴＰＡＶＳＮＡＩＬＶＨＮＫＫＧＧＰＬＡＤＧＩＶＩＴＰＳＨＮＰＰＥＤＧＧＩＫＹＮＰＰＮＧＧＰＡＤＴＮＶＴＫＶＶＥＤＲＡＮＡＬＬＡＤＧＬＫＧＶＫＲＩＳＬＤＥＡＭＡＳＧＨＶＫＥＱＤＬＶＱＰＦＶＥＧＬＡＤＩＶＤＭＡＡＩＱＫＡＧＬＴＬＧＶＤＰＬＧＧＳＧＩＥＹＷＫＲＩＧＥＹＹＮＬＮＬＴＩＶＮＤＱＶＤＱＴＦＲＦＭＨＬＤＫＤＧＡＩＲＭＤＣＳＳＥＣＡＭＡＧＬＬＡＬＲＤＫＦＤＬＡＦＡＮＤＰＤＹＤＲＨＧＩＶＴＰＡＧＬＭＮＰＮＨＹＬＡＶＡＩＮＹＬＦＱＨＲＰＱＷＧＫＤＶＡＶＧＫＴＬＶＳＳＡＭＩＤＲＶＶＮＤＬＧＲＫＬＶＥＶＰＶＧＦＫＷＦＶＤＧＬＦＤＧＳＦＧＦＧＧＥＥＳＡＧＡＳＦＬＲＦＤＧＴＰＷＳＴＤＫＤＧＩＩＭＣＬＬＡＡＥＩＴＡＶＴＧＫＮＰＱＥＨＹＮＥＬＡＫＲＦＧＡＰＳＹＮＲＬＱＡＡＡＴＳＡＱＫＡＡＬＳＫＬＳＰＥＭＶＳＡＳＴＬＡＧＤＰＩＴＡＲＬＴＡＡＰＧＮＧＡＳＩＧＧＬＫＶＭＴＤＮＧＷＦＡＡＲＰＳＧＴＥＤＡＹＫＩＹＣＥＳＦＬＧＥＥＨＲＫＱＩＥＫＥＡＶＥＩＶＳＥＶＬＫＮＡ

配列番号９３：Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ
ＭＡＡＩＮＴＫＶＫＫＡＶＩＰＶＡＧＬＧＴＲＭＬＰＡＴＫＡＩＰＫＥＭＬＰＬＶＤＫＰＬＩＱＹＶＶＮＥＣＩＡＡＧＩＴＥＩＶＬＶＴＨＳＳＫＮＳＩＥＮＨＦＤＴＳＦＥＬＥＡＭＬＥＫＲＶＫＲＱＬＬＤＥＶＱＳＩＣＰＰＨＶＴＩＭＱＶＲＱＧＬＡＫＧＬＧＨＡＶＬＣＡＨＰＶＶＧＤＥＰＶＡＶＩＬＰＤＶＩＬＤＥＹＥＳＤＬＳＱＤＮＬＡＥＭＩＲＲＦＤＥＴＧＨＳＱＩＭＶＥＰＶＡＤＶＴＡＹＧＶＶＤＣＫＧＶＥＬＡＰＧＥＳＶＰＭＶＧＶＶＥＫＰＫＡＤＶＡＰＳＮＬＡＩＶＧＲＹＶＬＳＡＤＩＷＰＬＬＡＫＴＰＰＧＡＧＤＥＩＱＬＴＤＡＩＤＭＬＩＥＫＥＴＶＥＡＹＨＭＫＧＫＳＨＤＣＧＮＫＬＧＹＭＱＡＦＶＥＹＧＩＲＨＮＴＬＧＴＥＦＫＡＷＬＥＥＥＭＧＩＫＫ

配列番号９４：Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｃｊＵ
ＭＫＬＱＧＶＩＦＤＬＤＧＶＩＴＤＴＡＨＬＨＦＱＡＷＱＱＩＡＡＥＩＧＩＳＩＤＡＱＦＮＥＳＬＫＧＩＳＲＤＥＳＬＲＲＩＬＱＨＧＧＫＥＧＤＦＮＳＱＥＲＡＱＬＡＹＲＫＮＬＬＹＶＨＳＬＲＥＬＴＶＮＡＶＬＰＧＩＲＳＬＬＡＤＬＲＡＱＱＩＳＶＧＬＡＳＶＳＬＮＡＰＴＩＬＡＡＬＥＬＲＥＦＦＴＦＣＡＤＡＳＱＬＫＮＳＫＰＤＰＥＩＦＬＡＡＣＡＧＬＧＶＰＰＱＡＣＩＧＩＥＤＡＱＡＧＩＤＡＩＮＡＳＧＭＲＳＶＧＩＧＡＧＬＴＧＡＱＬＬＬＰＳＴＥＳＬＴＷＰＲＬＳＡＦＷＱＮＶ

配列番号９５：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ
ＭＡＦＡＥＤＬＫＲＴＥＫＭＴＶＤＤＶＦＥＱＳＡＱＫＭＲＥＱＧＭＳＥＩＡＩＳＱＦＲＨＡＹＨＶＷＡＳＥＫＥＳＡＷＩＲＥＤＴＶＥＰＬＨＧＶＲＳＦＨＤＶＹＫＴＩＤＨＤＫＡＶＨＡＦＡＫＴＡＦＬＫＬＮＧＧＬＧＴＳＭＧＬＱＣＡＫＳＬＬＰＶＲＲＨＫＡＲＱＭＲＦＬＤＩＩＬＧＱＶＬＴＡＲＴＲＬＮＶＰＬＰＶＴＦＭＮＳＦＲＴＳＤＤＴＭＫＡＬＲＨＱＲＫＦＫＱＴＤＩＰＬＥＩＩＱＨＱＥＰＫＩＤＡＡＴＧＡＰＡＳＷＰＡＮＰＤＬＥＷＣＰＰＧＨＧＤＬＦＳＴＬＲＥＳＧＬＬＤＴＬＬＥＨＧＦＥＹＬＦＩＳＮＳＤＮＬＧＡＲＰＳＲＴＬＡＱＹＦＥＤＴＧＡＰＦＭＶＥＶＡＮＲＴＹＡＤＲＫＧＧＨＩＶＲＤＴＡＴＧＲＬＩＬＲＥＭＳＱＶＨＰＤＤＫＤＡＡＱＤＩＡＫＨＰＹＦＮＴＮＮＩＷＶＲＩＤＶＬＲＤＭＬＡＥＨＤＧＶＬＰＬＰＶＩＩＮＮＫＴＶＤＰＩＤＰＱＳＰＡＶＶＱＬＥＴＡＭＧＡＡＩＧＬＦＥＧＡＩＣＶＱＶＤＲＭＲＦＬＰＶＫＴＴＮＤＬＦＩＭＲＳＤＲＦＨＬＴＤＳＹＥＭＥＤＧＮＹＩＦＰＮＶＤＬＤＰＲＹＹＫＮＩＥＤＦＮＥＲＦＰＹＮＶＰＳＬＡＡＡＮＳＶＳＩＫＧＤＷＴＦＧＲＤＶＩＭＦＡＤＡＲＬＥＤＲＮＥＰＳＹＶＰＮＧＥＹＶＧＰＭＧＩＥＰＧＤＷＶ

配列番号９６：Ｅ．ｃｏｌｉ ａｄｋ
ＭＲＩＩＬＬＧＡＰＧＡＧＫＧＴＱＡＱＦＩＭＥＫＹＧＩＰＱＩＳＴＧＤＭＬＲＡＡＶＫＳＧＳＥＬＧＫＱＡＫＤＩＭＤＡＧＫＬＶＴＤＥＬＶＩＡＬＶＫＥＲＩＡＱＥＤＣＲＮＧＦＬＬＤＧＦＰＲＴＩＰＱＡＤＡＭＫＥＡＧＩＮＶＤＹＶＬＥＦＤＶＰＤＥＬＩＶＤＲＩＶＧＲＲＶＨＡＰＳＧＲＶＹＨＶＫＦＮＰＰＫＶＥＧＫＤＤＶＴＧＥＥＬＴＴＲＫＤＤＱＥＥＴＶＲＫＲＬＶＥＹＨＱＭＴＡＰＬＩＧＹＹＳＫＥＡＥＡＧＮＴＫＹＡＫＶＤＧＴＫＰＶＡＥＶＲＡＤＬＥＫＩＬＧ

配列番号９７：Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｄｋ
ＭＡＩＥＲＴＦＳＩＩＫＰＮＡＶＡＫＮＶＩＧＮＩＦＡＲＦＥＡＡＧＦＫＩＶＧＴＫＭＬＨＬＴＶＥＱＡＲＧＦＹＡＥＨＤＧＫＰＦＦＤＧＬＶＥＦＭＴＳＧＰＩＶＶＳＶＬＥＧＥＮＡＶＱＲＨＲＤＬＬＧＡＴＮＰＡＮＡＬＡＧＴＬＲＡＤＹＡＤＳＬＴＥＮＧＴＨＧＳＤＳＶＥＳＡＡＲＥＩＡＹＦＦＧＥＧＥＶＣＰＲＴＲ

配列番号９８：Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｍｋ
ＭＴＡＩＡＰＶＩＴＩＤＧＰＳＧＡＧＫＧＴＬＣＫＡＭＡＥＡＬＱＷＨＬＬＤＳＧＡＩＹＲＶＬＡＬＡＡＬＨＨＨＶＤＶＡＳＥＤＡＬＶＰＬＡＳＨＬＤＶＲＦＶＳＴＮＧＮＬＥＶＩＬＥＧＥＤＶＳＧＥＩＲＴＱＥＶＡＮＡＡＳＱＶＡＡＦＰＲＶＲＥＡＬＬＲＲＱＲＡＦＲＥＬＰＧＬＩＡＤＧＲＤＭＧＴＶＶＦＰＤＡＰＶＫＩＦＬＤＡＳＳＥＥＲＡＨＲＲＭＬＱＬＱＥＫＧＦＳＶＮＦＥＲＬＬＡＥＩＫＥＲＤＤＲＤＲＮＲＡＶＡＰＬＶＰＡＡＤＡＬＶＬＤＳＴＴＬＳＩＥＱＶＩＥＫＡＬＱＹＡＲＱＫＬＡＬＡ

Claims (229)

  1. グリコシル化生成物を調製するための方法であって、
    １つ以上の組み換えＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を発現する細菌細胞を提供すること、を含み、前記細菌細胞が、
    組み換えスクロースシンターゼ酵素の発現、及びＵＤＰ－糖の利用可能性を高める１つ以上の遺伝子改変のうちの１つ以上を有し、
    さらに、前記方法が、グリコシル化のための基質の存在下で前記細菌細胞を培養すること、及び
    前記グリコシル化生成物を回収すること、
    を含む、前記方法。
  2. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記細菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記細菌細胞が、配列番号１～１２の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えスクロースシンターゼ酵素を発現する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号１～１２の１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号２と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号２に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項５に記載の方法。
  8. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号３と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号３に関して、Ｌ６３７Ｍ及びＴ６４０Ｖ置換を有する、請求項５に記載の方法。
  9. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号５と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
  10. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号６と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
  11. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号７と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号７に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項５に記載の方法。
  12. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号８と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号８に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項５に記載の方法。
  13. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号９と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
  14. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号１０と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号１０に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項５に記載の方法。
  15. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号１１と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
  16. 前記細菌細胞を、スクロースの存在下で培養する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記細菌細胞が、前記遺伝子改変を含み、ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭまたはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；ｐｇｉまたはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）及び／またはｙｃｊＵ（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体が、過剰発現されているか、または活性が増加しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ（配列番号９３）及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体が、過剰発現されているか、または活性が増加している、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記細菌細胞が、ｐｇｍまたはそのオルソログもしくは誘導体、及び任意に、ｇａｌＵまたはそのオルソログもしくは誘導体の過剰発現または活性の増加を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記微生物細胞が、ｕｓｈＡもしくはそのオルソログ、及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭ、もしくはそのオルソログ（複数可）のうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子またはそのオルソログが、不活性化されているか、欠失しているか、または発現もしくは活性が低減している、請求項１９に記載の方法。
  21. ｐｇｉ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）またはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減している、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記微生物細胞が、ｏｔｓＡ（トレハロース－６－リン酸シンターゼ）もしくはそのオルソログ及び／またはｏｔｓＢ（トレハロース－リン酸ホスファターゼ）もしくはそのオルソログの欠失、不活化、もしくは活性もしくは発現の低減を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記微生物細胞が、ｕｇｄ（ＵＤＰ－グルコース６－デヒドロゲナーゼ）またはそのオルソログ；ｒｆａＱ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｂ－Ｉ－Ｊまたはそのオルソログ（複数可）；ｙｆｄＧ－Ｈ－Ｉまたはそのオルソログ（複数可）；ｗｃａＪまたはそのオルソログ；及びｇｌｇＣまたはそのオルソログのうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｃｊＵ（β－ホスホグルコムターゼ）（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）（配列番号９６）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）（配列番号９７）またはそのオルソログもしくは誘導体、及びＥ．ｃｏｌｉ ｃｍｋ（シチジン一リン酸キナーゼ）（配列番号９８）またはそのオルソログもしくは誘導体のうちの１つ以上の過剰発現または活性もしくは発現の増加を有する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. グリコシル化のための前記基質が、植物抽出物もしくはその画分として提供されるか、または合成的にもしくは生合成プロセスにより生成される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記基質が、テルペノイドまたはテルペノイドグリコシド、フラボノイドまたはフラボノイドグリコシド、カンナビノイドまたはカンナビノイドグリコシド、ポリケチドまたはポリケチドグリコシド、スチルベノイドまたはスチルベノイドグリコシド、及びポリフェノールまたはポリフェノールグリコシドから選択される二次代謝生成物である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記基質が、テルペノイドグリコシドを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記テルペノイドグリコシドが、ステビオールグリコシドまたはモグロールグリコシドを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記基質が、０、１、２、３、または４つのグリコシル基を有する、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記グリコシル基が、独立して、グルコシル、ガラクトシル、マンノシル、キシロシル、及びラムノシル基から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記グリコシル基が、グルコシルである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記グリコシル化生成物が、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのグリコシル基を有する、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記生成物の生合成が、前記細菌細胞による前記基質の少なくとも２つのグリコシル化反応物を含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記基質が、ステビア葉抽出物またはその画分として提供される、請求項２８に記載の方法。
  35. 前記ステビア葉抽出物が、ステビオール、ステビオシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、ズルコシドＡ、ズルコシドＢ、レバウジオシドＣ、及びレバウジオシドＦのうちの１つ以上を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記抽出物またはその画分中の前記ステビオールグリコシドの少なくとも約３０％が、ステビオシド、ステビオールビオシド、及びレバウジオシドＡから選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＭを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記ＵＧＴ酵素が、ステビオールコアのＣ１３及びＣ１９ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１－２及び１－３分岐グリコシル化が可能である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３～３２、及び８４のうちの１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤを含む、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記細菌細胞が、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～２つのグリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３～１６及び２６～２９の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する酵素から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＢを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
  44. 前記細菌細胞が、ステビオールＣ１９の一次グリコシル基の脱グリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１８、３０、３１、及び９９の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する酵素から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記細菌細胞が、配列番号３１または９９と少なくとも約７０％の配列同一性を有するＵＧＴ酵素を発現する、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. グリコシル化のための前記基質が、ＲｅｂＡを含む、４３～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＩを含む、請求項３６に記載の方法。
  49. 前記細菌細胞が、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～３つのグリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１９～２５の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する酵素から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記基質が、モンクフルーツ抽出物もしくはその画分、または生合成により生成されたモグロールもしくはモグロールグリコシドとして提供される、請求項２８に記載の方法。
  52. 前記基質が、モグロール、ｍｏｇ．Ｉ－Ａ、ｍｏｇ．Ｉ－Ｅ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅ、ｍｏｇ ＩＩＩ、ｍｏｇ ＩＶＡ、ｍｏｇ．ＩＶ、及びシアメノシドから選択される１つ以上の基質を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記グリコシル化生成物が、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ Ｖ、またはシアメノシドを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＵＧＴ酵素が、モグロールコアのＣ３及びＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２及び１－６分岐グリコシル化が可能である、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３～１７、２９、３３～３９、４６、５４、６０、７１～８０、及び８２～８４のうちの１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＵＧＴ酵素をコードする遺伝子が、前記微生物細胞の染色体に組み込まれるか、または染色体外で発現される、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記方法が、前記基質の前記グリコシル化生成物への少なくとも４０％の変換をもたらす、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記方法が、前記基質の前記グリコシル化生成物への少なくとも７５％の変換をもたらす、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記細菌細胞バイオマスが、複合または最少培地中での増殖により生成される、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記細菌細胞が、１つ以上の炭素源によるグリコシル化のための前記基質の存在下で培養される、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記炭素源が、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、及びグリセロールのうちの１つ以上を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記培養条件が、好気性、微好気性、及び嫌気性から選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記培養が、流加プロセスで実施される、請求項５６～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記基質が、前記細菌細胞と共に約７２時間以下でインキュベートされる、請求項６３に記載の方法。
  65. 回収が、前記培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または前記培養物のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、前記温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去することを含む、請求項５７～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. グリコシル化生成物を調製するための細菌細胞であって、前記細菌細胞が、１つ以上の組み換えＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を発現し、組み換えスクロースシンターゼ酵素の発現、及び、ＵＤＰ－糖の利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝的改変のうちの１つ以上を有する、前記細菌細胞。
  67. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．である、請求項６６に記載の細菌細胞。
  68. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａである、請求項６７に記載の細菌細胞。
  69. 前記細菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６７に記載の細菌細胞。
  70. 前記細菌細胞が、配列番号１～１２の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えスクロースシンターゼ酵素を発現する、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  71. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号１～１２の１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の細菌細胞。
  72. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号２と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号２に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項７０に記載の細菌細胞。
  73. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号３と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号３に関して、Ｌ６３７Ｍ及びＴ６４０Ｖ置換を有する、請求項７０に記載の細菌細胞。
  74. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号５と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の細菌細胞。
  75. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号６と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の細菌細胞。
  76. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号７と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号７に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項７０に記載の細菌細胞。
  77. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号８と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号８に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項７０に記載の細菌細胞。
  78. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号９と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の細菌細胞。
  79. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号１０と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記スクロースシンターゼ酵素が、任意に、配列番号１０に関して、Ｓ１１Ｅ置換を有する、請求項７０に記載の細菌細胞。
  80. 前記スクロースシンターゼ酵素が、配列番号１１と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の細菌細胞。
  81. 前記細菌細胞が、前記遺伝子改変を含み、ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭまたはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；ｐｇｉまたはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）及び／またはｙｃｊＵ（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体が、過剰発現されているか、または活性が増加しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ（配列番号９３）及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体が、過剰発現されているか、または活性が増加している、請求項６６～８０のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  82. 前記細菌細胞が、ｐｇｍまたはそのオルソログもしくは誘導体、及び任意に、ｇａｌＵまたはそのオルソログもしくは誘導体の過剰発現または活性の増加を含む、請求項６６～８１のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  83. 前記細菌細胞が、ｕｓｈＡもしくはそのオルソログ、及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭ、もしくはそのオルソログ（複数可）のうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する、請求項６６～８１のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  84. ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子またはそのオルソログが、不活性化されているか、欠失しているか、または発現もしくは活性が低減している、請求項８３に記載の細菌細胞。
  85. ｐｇｉ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）またはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減している、請求項６６～８１のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  86. 前記細菌細胞が、ｏｔｓＡ（トレハロース－６－リン酸シンターゼ）もしくはそのオルソログ及び／またはｏｔｓＢ（トレハロース－リン酸ホスファターゼ）もしくはそのオルソログの欠失、不活化、もしくは活性もしくは発現の低減を有する、請求項６６～８５のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  87. 前記細菌細胞が、ｕｇｄ（ＵＤＰ－グルコース６－デヒドロゲナーゼ）またはそのオルソログ；ｒｆａＱ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｂ－Ｉ－Ｊまたはそのオルソログ（複数可）；ｙｆｄＧ－Ｈ－Ｉまたはそのオルソログ（複数可）；ｗｃａＪまたはそのオルソログ；及びｇｌｇＣまたはそのオルソログのうちの１つ以上の欠失、不活化、または活性もしくは発現の低減を有する、請求項６６～８６のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  88. 前記細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ ｙｃｊＵ（β－ホスホグルコムターゼ）（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｄｋ（アデニル酸キナーゼ）（配列番号９６）またはそのオルソログもしくは誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｄｋ（ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）（配列番号９７）またはそのオルソログもしくは誘導体、及びＥ．ｃｏｌｉ ｃｍｋ（シチジン一リン酸キナーゼ）（配列番号９８）またはそのオルソログもしくは誘導体のうちの１つ以上の過剰発現または活性もしくは発現の増加を有する、請求項６６～８７のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  89. 前記細菌細胞が、配列番号１３～８４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項６６～８８のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  90. 前記細菌細胞が、テルペノイドグリコシド基質をグリコシル化する、請求項８９に記載の細菌細胞。
  91. 前記細菌細胞が、ステビオールグリコシド基質またはモグロールグリコシド基質をグリコシル化する、請求項９０に記載の細菌細胞。
  92. 前記ＵＧＴ酵素が、ステビオールコアのＣ１３及びＣ１９ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１－２及び１－３分岐グリコシル化が可能である、請求項９１に記載の細菌細胞。
  93. 前記細菌細胞が、ステビア葉抽出物またはその画分からＲｅｂＭを産生する、請求項９２に記載の細菌細胞。
  94. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３～３２、及び８４のうちの１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される、請求項９２または９３に記載の細菌細胞。
  95. 前記細菌細胞が、ステビア葉抽出物またはその画分からＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤを生成する、請求項９１に記載の細菌細胞。
  96. 前記細菌細胞が、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～２つのグリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項９５に記載の細菌細胞。
  97. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３～１６及び２６～２９の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する酵素から選択される、請求項９６に記載の細菌細胞。
  98. 前記細菌細胞が、ステビア葉抽出物またはその画分からＲｅｂＢを産生する、請求項９１に記載の細菌細胞。
  99. 前記細菌細胞が、ステビオールＣ１９の一次グリコシル基の脱グリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項９８に記載の細菌細胞。
  100. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１８、３０、３１、及び９９の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する酵素から選択される、請求項９９に記載の細菌細胞。
  101. 前記細菌細胞が、配列番号３１または９９と少なくとも７０％の同一性を有するＵＧＴ酵素を発現する、請求項１００に記載の細菌細胞。
  102. 前記細菌細胞が、ステビア葉抽出物またはその画分からＲｅｂＩを産生する、請求項９１に記載の細菌細胞。
  103. 前記細菌細胞が、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～３つのグリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項１０２に記載の細菌細胞。
  104. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１９～２５の１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有する酵素から選択される、請求項１０３に記載の細菌細胞。
  105. 前記細菌細胞が、モンクフルーツ抽出物からｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ ＶＩ、ｉｓｏｍｏｇ．Ｖ、またはシアメノシドを産生する、請求項９１に記載の細菌細胞。
  106. 前記ＵＧＴ酵素が、モグロールコアのＣ３及びＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２及び１－６分岐グリコシル化が可能である、請求項１０５に記載の細菌細胞。
  107. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３～１７、２９、３３～３９、４６、５４、６０、７１～８０、及び８２～８４のうちの１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素から選択される、請求項１０６に記載の細菌細胞。
  108. 前記ＵＧＴ酵素をコードする遺伝子が、前記微生物細胞の染色体に組み込まれるか、または染色体外で発現される、請求項６６～１０７のいずれか１項に記載の細菌細胞。
  109. 基質のグリコシル化のための方法であって、請求項６６～１０８のいずれか１項に記載の細胞をグリコシル化のための基質の存在下で培養すること、及び前記グリコシル化生成物を回収することを含む、前記方法。
  110. グリコシル化生成物が、前記反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または前記反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、前記温度を少なくとも約５０℃に増加させること、及び１つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去することにより回収される、請求項１０９に記載の方法。
  111. ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、配列番号１３と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｖ３９７Ｓ、Ｖ３９７Ｃ、Ｇ５Ｎ、Ｓ２０Ｅ、Ｓ２３Ｄ、Ｒ４５Ｙ、Ｈ５９Ｐ、Ｇ９４Ｓ、Ｋ９７Ｅ、Ｍ１５０Ｌ、Ｉ１８５Ｆ、Ａ２０６Ｐ、Ｇ２１０Ｅ、Ｑ２３７Ｒ、Ｍ２５０Ｋ、Ａ２５１Ｅ、Ｃ２５２Ｌ、Ｇ２５９Ｅ、Ｑ２６３Ｙ、Ｉ２８７Ｍ、Ｃ２８８Ｆ、Ｖ３３６Ｉ、Ｆ３３８Ｌ、Ｄ３５１Ｅ、Ｆ１８６Ｉ、Ｆ１８６Ｍ、Ｆ１８６Ｔ、Ｌ４１８Ｆ、Ａ４５１Ｔ、Ａ４５１Ｌ、Ｔ４５３Ｋ、Ｔ４５３Ｒ、Ｖ４５６Ｓ、Ｖ４５６Ｗ、Ｖ４５６Ｔ、Ｖ４５６Ｍから選択される１つ以上のアミノ酸置換、
    配列番号１３の残基２７０～２８１の、主にグリシン及びセリンアミノ酸から構成される５～１５アミノ酸との置換、
    配列番号１３に関して、３位での１つもしくは２つのアミノ酸の挿入、及び／または配列番号１３のＣ末端へのアミノ酸の付加
    から選択される１つ以上の改変を有する、前記ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素。
  112. 前記ＵＧＴ酵素が、配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号８５）との配列番号１３のアミノ酸２７０～２８１の置換を有する、請求項１１１に記載のＵＧＴ酵素。
  113. 前記ＵＧＴ酵素が、配列番号１３の３位にＡｒｇの挿入、または２位及び３位間にＩｌｅ－Ａｒｇの挿入を有する、請求項１１１または１１２に記載のＵＧＴ酵素。
  114. 前記酵素が、配列番号１３に関して、Ｇ５Ｎ、Ｆ１８６Ｔ、及びＶ３９７Ｓから選択される１つ以上の置換を含む、請求項１１１に記載のＵＧＴ酵素。
  115. 前記酵素が、配列番号１３に関して、前記アミノ酸置換Ｇ５Ｎ、Ｆ１８６Ｔ、及びＶ３９７Ｓを含む、請求項１１４に記載のＵＧＴ酵素。
  116. 配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１１１に記載のＵＧＴ酵素。
  117. ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、配列番号１４と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｖ３９５Ａ、Ｑ２６３Ｙ、Ｄ２６９Ｒ、Ｋ９７Ｅ、Ｑ２６２Ｅ、Ｈ５９Ｐ、Ｇ２５９Ｅ、Ｍ１５０Ｌ、Ｙ２６７Ｈ、Ｔ３Ｒ、Ｖ９５Ｑ、Ａ２３８Ｅ、Ｓ３０８Ｑ、Ｑ２３７Ｒ、Ｒ４５Ｙ、Ｅ２５４Ｄ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ１５１Ｒ、Ｓ１２３Ｄ、Ｄ３５１Ｅ、Ｔ４５３Ｍ、Ｇ９４Ｔ、Ｔ１８６Ｍ、Ｖ３３６Ｉ、Ｌ５８Ｓ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ５１Ｗ、Ｃ２５２Ｌ、Ｍ２５０Ｄ、Ａ２５１Ｅ、Ｃ２５２Ｖ、Ａ７９Ｐ、Ｗ４０１Ｆ、Ｓ３２３Ａ、Ａ２５１Ｅ、Ａ１３０Ｄ、Ｓ４２Ｅ、Ｈ４００Ｙ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２３Ｄ、Ｐ５６Ａ、Ａ２０６Ｐ、Ｍ２５０Ｋ、Ａ１４３Ｗ、Ｖ４５６Ｔ、Ｇ９４Ｓ、Ｉ４２７Ｆ、Ｔ１８６Ｉ、Ｔ４５３Ｆ、Ｃ２５２Ｒ、Ｖ３８Ｆ、Ｒ４５Ｆ、Ｔ３７Ｓ、Ｑ２４４Ｋ、Ｌ１１Ｉ、Ｉ２８７Ｍ、Ｖ３１Ｐ、Ｔ４３Ｄ、及びＰ３９Ｔから選択される１つ以上のアミノ酸置換、
    主にグリシン及びセリンアミノ酸から構成される５～１５アミノ酸のリンカーを用いる、配列番号２の残基２７０～２８１の欠失、
    配列番号１４に関して、３位での１つもしくは２つのアミノ酸の挿入、及び／または配列番号１４のＣ末端へのアミノ酸の付加
    から選択される１つ以上の改変を有する、前記ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素。
  118. 前記ＵＧＴ酵素が、主に、Ｓｅｒ及びＧｌｙから構成される６～１２アミノ酸のリンカー配列による配列番号１４のアミノ酸２７０～２８１の置換を有する、請求項１１７に記載のＵＧＴ酵素。
  119. 前記酵素が、配列番号１４に関して、Ｈ５９Ｐ、Ａ２３８Ｅ、及びＬ４１７Ｆから選択される１つ以上の置換を含む、請求項１１７または１１８に記載のＵＧＴ酵素。
  120. 前記酵素が、配列番号１４に関して、アミノ酸置換Ｈ５９Ｐ、Ａ２３８Ｅ、及びＬ４１７Ｆを含む、請求項１１９に記載のＵＧＴ酵素。
  121. 前記酵素が、配列番号１４のＡ２及びＴ３間に挿入またはＡｒｇ－Ａｒｇを含む、請求項１２０に記載のＵＧＴ酵素。
  122. 配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１２０に記載のＵＧＴ酵素。
  123. ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、配列番号１５と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５に関して、１２５、１５２、１５３、及び４４２から選択される位置において１つ以上のアミノ酸置換を有する、前記ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素。
  124. 配列番号１５に関して、Ｍ１５２Ａ、Ｓ１５３Ａ、Ｐ４４２Ｄ、及びＳ１２５Ｖから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１２３に記載のＵＧＴ酵素。
  125. 配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１２４に記載のＵＧＴ酵素。
  126. モグロールまたはモグロールグリコシド基質をグリコシル化するための方法であって、前記方法が、ＵＤＰ－糖の存在下で前記基質をＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素と接触させることを含み、前記ＵＧＴ酵素が、配列番号８４、配列番号８０、配列番号４６、配列番号８３、配列番号８２、配列番号７３、配列番号７２、配列番号７８、配列番号５４、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２９、及び配列番号７９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記方法。
  127. 前記基質を、配列番号８４、配列番号８０、配列番号４６、配列番号８３、配列番号８２、配列番号７３、配列番号７２、配列番号７８、配列番号５４、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２９、及び配列番号７９から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＧＴ酵素と接触させる、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記基質を、配列番号８４、配列番号８０、配列番号８３、配列番号７３、配列番号７２、配列番号５４、及び配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＧＴ酵素と接触させる、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記基質を、配列番号８４、配列番号８０、配列番号８３、配列番号７３、配列番号７２、配列番号５４、及び配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＧＴ酵素と接触させる、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記基質が、植物抽出物またはその画分として提供される、請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の方法。
  131. 前記植物抽出物が、モンクフルーツ抽出物またはその画分である、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記植物抽出物が、モグロール、ｍｏｇ．Ｉ－Ａ、ｍｏｇ．Ｉ－Ｅ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅ、ｍｏｇ ＩＩＩ、ｍｏｇ ＩＶＡ、ｍｏｇ．ＩＶ、及びシアメノシドから選択される１つ以上の基質を含む、請求項１３０または１３１に記載の方法。
  133. 前記グリコシル化生成物が、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ．ＶＩ、またはシアメノシドを含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記ＵＧＴ酵素が、モグロールコアのＣ３及びＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１－２及び１－６分岐グリコシル化が可能である、請求項１２６～１３３のいずれか１項に記載の方法。
  135. 前記基質が、前記ＵＧＴ酵素を発現する微生物細胞と共に培養される、請求項１２６～１３４のいずれか１項に記載の方法。
  136. 前記微生物細胞が、細菌細胞である、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．である、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａである、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記細菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記細菌細胞が、ＵＤＰ－糖の利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する、請求項１３６～１３９のいずれか１項に記載の方法。
  141. 前記細菌細胞が、スクロースシンターゼを発現し、前記スクロースシンターゼが、任意に、配列番号１～１２の１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１３９または１４０に記載の方法。
  142. 前記微生物細胞が、任意に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、またはＹａｒｒｏｗｉａから選択される酵母細胞である、請求項１３５に記載の方法。
  143. 前記基質が、前記ＵＧＴ酵素を含む細胞溶解物と共にインキュベートされるか、または精製された組み換えＵＧＴ酵素と共にインキュベートされる、請求項１２６～１３４のいずれか１項に記載の方法。
  144. 前記グリコシル化生成物が、前記反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または前記反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、前記温度を少なくとも約５０℃に増加させること、及び１つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去することにより回収される、請求項１２６～１４３のいずれか１項に記載の方法。
  145. グリコシド生成物を製造するための方法であって、
    無細胞反応または微生物培養における１つ以上の糖部分の酵素的転移により、グリコシル化のための基質を標的グリコシド生成物に変換すること、及び
    前記反応物または培養物から前記グリコシド生成物を回収すること、を含み、前記回収することが、前記反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または前記反応物もしくは培養物のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、前記温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド可溶化剤を添加することのうちの１つ以上とそれに続く、酵素またはバイオマスを除去することを含む、前記方法。
  146. グリコシル化のための前記基質が、植物抽出物またはその画分として提供される、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記基質が、テルペノイドまたはテルペノイドグリコシド、フラボノイドまたはフラボノイドグリコシド、カンナビノイドまたはカンナビノイドグリコシド、ポリケチドまたはポリケチドグリコシド、スチルベノイドまたはスチルベノイドグリコシド、及びポリフェノールまたはポリフェノールグリコシドから選択される二次代謝生成物である、請求項１４５または１４６に記載の方法。
  148. 前記基質が、テルペノイドグリコシドを含む、請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記テルペノイドグリコシドが、ステビオールグリコシドまたはモグロールグリコシドを含む、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記基質が、１、２、３、または４つのグリコシル基を有する、請求項１４７～１４９のいずれか１項に記載の方法。
  151. 前記グリコシル基が、独立して、グルコシル、ガラクトシル、マンノシル、キシロシル、及びラムノシル基から選択される、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記グリコシル化生成物が、少なくとも５つのグリコシル基、または少なくとも６つ、もしくは少なくとも７つのグリコシル基を有する、請求項１５１に記載の方法。
  153. 前記生成物の生合成が、前記基質の少なくとも２つのグリコシル化反応物を含む、請求項１４５～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  154. 前記植物抽出物が、ステビア葉抽出物またはその画分である、請求項１４５～１５３のいずれか１項に記載の方法。
  155. 前記ステビア葉抽出物が、ステビオシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、ズルコシドＡ、ズルコシドＢ、レバウジオシドＣ、及びレバウジオシドＦのうちの１つ以上を含む、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記抽出物またはその画分中の前記ステビオールグリコシドの少なくとも約３０％が、ステビオシド、ステビオールビオシド、及びレバウジオシドＡから選択される、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＭを含む、請求項１５４～１５６のいずれか１項に記載の方法。
  158. 前記ＵＧＴ酵素が、ステビオールコアのＣ１３及びＣ１９ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１－２及び１－３分岐グリコシル化が可能である、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＥ及び／またはＲｅｂＤを含む、請求項１５４～１５６のいずれか１項に記載の方法。
  160. 前記微生物細胞が、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～２つのグリコシル化が可能な１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項１５９に記載の方法。
  161. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＢを含む、請求項１５４～１５６のいずれか１項に記載の方法。
  162. 前記ＵＧＴ酵素が、ステビオールＣ１９の一次グリコシル基の脱グリコシル化が可能である、請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記グリコシル化生成物が、ＲｅｂＩを含む、請求項１５４～１５６のいずれか１項に記載の方法。
  164. １つ以上のＵＧＴ酵素が、ステビオールＣ１３及びＣ１９の一次グリコシル基の１～３つのグリコシル化が可能である、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記植物抽出物が、モンクフルーツ抽出物またはその画分である、請求項１４５～１５３のいずれか１項に記載の方法。
  166. 前記モンクフルーツ抽出物が、モグロール、ｍｏｇ．Ｉ－Ａ、ｍｏｇ．Ｉ－Ｅ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ａ、ｍｏｇ．ＩＩ－Ｅ、ｍｏｇ ＩＩＩ、ｍｏｇ ＩＶＡ、ｍｏｇ．ＩＶ、及びシアメノシドから選択される１つ以上の基質を含む、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記グリコシル化生成物が、ｍｏｇ．ＩＶ、ｍｏｇ．ＩＶＡ、ｍｏｇ．Ｖ、ｍｏｇ．ＶＩ、またはシアメノシドを含む、請求項１６５または１６６に記載の方法。
  168. 前記ＵＧＴ酵素が、モグロールコアのＣ３及びＣ２４ヒドロキシルにおける一次グリコシル化、ならびに前記Ｃ３及び／またはＣ２４の一次グリコシル基の１つ以上の１－２及び／または１－６分岐グリコシル化が可能である、請求項１６５～１６７のいずれか１項に記載の方法。
  169. 前記酵素的転移が、微生物培養物中で生じ、前記微生物培養物が、１つ以上のウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を発現する微生物株を含む、請求項１４５～１６８のいずれか１項に記載の方法。
  170. 前記微生物株が、グリコシル化のための前記基質を産生する生合成経路を発現し、前記１つ以上のＵＧＴ酵素を発現する、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記微生物株が、前記１つ以上のＵＧＴ酵素を発現し、前記株が、供給された基質と共に培養される、請求項１６９に記載の方法。
  172. 前記酵素的転移が、任意に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、またはＹａｒｒｏｗｉａから選択される酵母株の微生物培養によるものである、請求項１６９～１７１のいずれか１項に記載の方法。
  173. 前記酵素的転移が、細菌株の微生物培養によるものである、請求項１６９～１７１のいずれか１項に記載の方法。
  174. 前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．である、請求項１７３に記載の方法。
  175. 前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａである、請求項１７４に記載の方法。
  176. 前記細菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１７５に記載の方法。
  177. 前記細菌細胞が、ＵＤＰ－糖の利用可能性を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する、請求項１７３～１７６のいずれか１項に記載の方法。
  178. 前記細菌細胞が、スクロースシンターゼを発現し、前記スクロースシンターゼが、任意に、配列番号１～１２の１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１７３～１７７のいずれか１項に記載の方法。
  179. 前記細菌細胞が、前記遺伝子改変を含み、ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭまたはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；ｐｇｉまたはそのオルソログが、欠失しているか、不活化されているか、または発現もしくは活性が低減しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｍ（配列番号９２）及び／またはｙｃｊＵ（配列番号９４）またはそのオルソログもしくは誘導体が、過剰発現されているか、または活性が増加しており；Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＵ（配列番号９３）及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｕｇｐＡ（配列番号９５）またはそのオルソログもしくは誘導体が、過剰発現されているか、または活性が増加している、請求項１７７または１７８に記載の方法。
  180. 前記プロセスが、バッチ式、連続式、または半連続式で実施される、請求項１４５～１７９のいずれか１項に記載の方法。
  181. 前記方法が、流加連続法、または半連続法で実施される、請求項１８０に記載の方法。
  182. 前記酵素的転移が、少なくとも１０，０００Ｌ、または少なくとも５０，０００Ｌ、または少なくとも１００，０００Ｌ、または少なくとも１５０，０００Ｌ、または少なくとも２００，０００Ｌ、または少なくとも５００，０００Ｌの容積を有するバイオリアクター内で生じる、請求項１８０または１８１に記載の方法。
  183. 前記グリコシド中間体が、前記微生物株と共に少なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間インキュベートされる、請求項１８２に記載の方法。
  184. 前記グリコシド中間体が、前記微生物株と共に約７２時間以下でインキュベートされる、請求項１８２または１８３に記載の方法。
  185. 前記ｐＨが、約２～約４の範囲内、任意に、約３．５のｐＨに調整される、請求項１４５～１８４のいずれか１項に記載の方法。
  186. 前記ｐＨが、約９～約１２の範囲内のｐＨに調整される、請求項１４５～１８４のいずれか１項に記載の方法。
  187. 前記温度が、約５０℃～約９０℃、任意に、約７０℃または約８０℃の温度に調整される、請求項１４５～１８６のいずれか１項に記載の方法。
  188. 反応培地または培養培地が、ｐＨ及び／または温度調整のために反応タンクから採取タンクに移され、前記反応タンク及び採取タンクが、任意にインラインである、請求項１８５～１８７のいずれか１項に記載の方法。
  189. 前記ｐＨの調整及び温度調整が、同じ採取タンク内で行われる、請求項１８８に記載の方法。
  190. 前記ｐＨ調整及び温度調整が、異なる採取タンク内で行われる、請求項１８８に記載の方法。
  191. ｐＨ調整が、温度調整前に行われる、請求項１８９または１９０に記載の方法。
  192. 温度調整が、ｐＨ調整前に行われる、請求項１８９または１９０に記載の方法。
  193. ｐＨ調整及び温度調整が、実質的に同時に行われる、請求項１８９に記載の方法。
  194. ｐＨ調整が、有機酸または無機酸の添加によるものである、請求項１８５～１９３のいずれか１項に記載の方法。
  195. １つ以上のグリコシド溶解促進剤を添加することを含む、請求項１４５～１９４のいずれか１項に記載の方法。
  196. 温度調整が、前記反応培地または培養物を予熱された採取タンクに移すことにより行われる、請求項１８７～１９５のいずれか１項に記載の方法。
  197. バイオマス及び／または酵素が、遠心分離で除去され、それにより、清澄化ブロスが調製される、請求項１４５～１９６のいずれか１項に記載の方法。
  198. 前記プロセスが、ディスクスタック分離機を用いたバイオマス除去を含む、請求項１９７に記載の方法。
  199. 前記分離されたバイオマスが、グリコシド生成物の回収のために再処理される、請求項１９８に記載の方法。
  200. 前記バイオマスが、廃棄物として処理される、請求項１９８に記載の方法。
  201. 前記清澄化ブロスが、１つ以上の結晶化容器に直接的または間接的に移される、請求項１９７～２００のいずれか１項に記載の方法。
  202. 結晶化前に、濾過、イオン交換、活性炭、ベントナイト、アフィニティークロマトグラフィー、及び消化から選択される１つ以上のプロセスを使用して、グリコシド生成物が、前記清澄化ブロスから精製される、請求項２０１に記載の方法。
  203. 前記アフィニティークロマトグラフィーが、スチレン－ジビニルベンゼン吸着樹脂、強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂、及び疎水性相互作用樹脂のうちの１つ以上を用いる、請求項２０２に記載の方法。
  204. 前記プロセスが、模擬移動床クロマトグラフィーを用いる、請求項２０２または２０３に記載の方法。
  205. 結晶化前に、グリコシド生成物が、任意に、約５ｋＤの膜孔径を有する、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）で精製される、請求項２０３に記載の方法。
  206. 回収にいずれの有機溶媒も用いられない、請求項２０２～２０５のいずれか１項に記載の方法。
  207. 少なくとも２つの結晶化ステップが用いられる、請求項２０２～２０６のいずれか１項に記載の方法。
  208. 再結晶化ステップの前に、前記溶液もしくは懸濁液のｐＨを約ｐＨ５未満に低下させるか、または前記溶液もしくは懸濁液のｐＨを約ｐＨ９超に上昇させること、前記溶液または懸濁液の温度を少なくとも約５０℃に上昇させること、及び１つ以上のグリコシド可溶化剤を添加することにより、グリコシド生成物が再可溶化される、請求項２０７に記載の方法。
  209. 再結晶化が約４～約１２のｐＨで実施される、請求項２０７に記載の方法。
  210. 再結晶溶媒が水であり、任意に、約５体積％～約５０体積％のエタノール、または約２５体積％～約５０体積％のエタノール、または約３０％～約４０体積％を含む、請求項２０８または２０９に記載の方法。
  211. 再結晶化が、約０．１重量％～約２重量％の範囲の１つ以上の溶解促進剤の存在下で実施される、請求項２１０に記載の方法。
  212. 前記溶解促進剤が、グリセロールである、請求項２１１に記載の方法。
  213. 結晶化ステップに、静的結晶化、撹拌結晶化、及び蒸発結晶化のうちの１つ以上の相が含まれる、請求項２０２～２１２のいずれか１項に記載の方法。
  214. 結晶化ステップが、静止相とそれに続く撹拌相を含む、請求項２１３に記載の方法。
  215. バスケット型遠心分離機またはベルトフィルターを使用して、結晶を単離し、それにより、グリコシドウェットケーキを単離する、請求項２０７～２１４のいずれか１項に記載の方法。
  216. 前記ステビオールグリコシドのウェットケーキが、洗浄されている、請求項２１５に記載の方法。
  217. 前記ウェットケーキが、任意に、エタノールを含む、水溶液中で洗浄されている、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記ケーキが、溶解され、再結晶化されている、請求項２１７に記載の方法。
  219. 再結晶化前に、前記生成物が、濾過及び／または活性炭で精製されている、請求項２１８に記載の方法。
  220. 前記フィルター材料が、親水性であり、任意に、ポリエーテルスルホン、ナイロン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、及びフルオロアルキル末端ポリエチレングリコールでコーティングされたＰＴＦＥまたはＰＶＤＦである、請求項２１９に記載の方法。
  221. 前記フィルターの孔径が、約０．２ミクロンである、請求項２１９または２２０に記載の方法。
  222. 濾過が、熱濾過及び／またはタンジェンシャルフロー濾過を含む、請求項２１９に記載の方法。
  223. 濾過が、孔径が約０．５ｋＤの膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過を含む、請求項２２２に記載の方法。
  224. 清澄化ブロスからの前記回収プロセスが、非クロマトグラフィーであり、任意に、本質的に濾過及び結晶化からなる、請求項１４５～２２３のいずれか１項に記載の方法。
  225. 任意に、ベルト乾燥機、パドル乾燥機、または噴霧乾燥機を使用して、再結晶による前記ウェットケーキを乾燥させる、請求項２１１～２２４のいずれか１項に記載の方法。
  226. 前記ドライケーキが、粉砕され、任意に、包装されている、請求項２２５に記載の方法。
  227. 前記標的グリコシド生成物が、前記回収された組成物の少なくとも約７５重量％である、請求項１４５～２２６のいずれか１項に記載の方法。
  228. 前記標的グリコシド生成物が、前記回収された組成物の少なくとも約８０重量％、または少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９５重量％である、請求項２２７に記載の方法。
  229. 前記グリコシル化生成物の生産量が、前記培養物または反応物の体積に対して、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、または少なくとも約５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約７５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｇ／Ｌ、または少なくとも約１２５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｇ／Ｌである、請求項１４５～２２８のいずれか１項に記載の方法。
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