CN107949632A - 用于使用高pH生产甜菊醇糖苷的发酵方法和由此获得的组合物 - Google Patents

用于使用高pH生产甜菊醇糖苷的发酵方法和由此获得的组合物 Download PDF

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Abstract

公开用于使用工程化酵母生产诸如莱苞迪苷D和莱苞迪苷M的甜菊醇糖苷的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在诸如约5.8或更大的高pH下用酵母进行发酵。在一些实施方案中，所述方法可通过首先在较低的第一pH下生长所述酵母、然后将所述pH调节至较高pH来进行。

Description

用于使用高pH生产甜菊醇糖苷的发酵方法和由此获得的组 合物
对序列表的引用
本申请包含对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，所述序列以2016年5月27日创建并且大小为92KB的标题为“CAR0210WO_Sequence_Listing.txt”的ASCII文本文件的形式与本文同时提交。根据37 C.F.R.§1.52(e)(5)，序列表据此以引用的方式整体并入。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月29日提交的美国临时申请号62/168,345的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于生产甜菊醇糖苷的发酵方法、发酵组合物和通过发酵产生的甜菊醇糖苷组合物。
发明背景
利用糖(诸如蔗糖、果糖和葡萄糖)为饮料、食物、药物和口腔卫生/美容产品提供令人愉悦的味道。特别是蔗糖，它赋予了消费者偏爱的味道。虽然蔗糖提供优异的甜味特征，但它有热量。已引入了无热量或较低热量的甜味剂来满足消费者需求，并且期望这些类型的甜味剂具有良好的味道特征。
甜菊属是向日葵科(菊科)中具有约240种草本和灌木的属，原产于北美洲西部到南美洲的亚热带和热带地区。物种甜叶菊(Stevia rebaudiana)通常称为甜叶、甜味叶、糖叶或简称甜菊，被广泛种植以获得其甜味的叶子。基于甜叶菊的甜味剂可通过从所述叶子中提取一种或多种甜味化合物来获得。这些化合物中有许多是甜菊醇糖苷，它们是二萜化合物甜菊醇的糖苷。这些二萜糖苷比糖甜约150至450倍。甜菊醇糖苷彼此之间的不同之处在于甜味能力以及促成诸如苦味、残留余味等味道品质的其他感官特点。参见Kinghorn，A.D.，Stevia：The genus Stevia，Taylor&Francis，London(2002)。
甜菊醇糖苷的实例在WO 2013/096420(参见例如图1中的列表)和Ohta等人，“Characterization of Novel Steviol Glycosides from Leaves of Steviarebaudiana Morita,”J.Appl.Glycosi.，57，199-209(2010)(参见例如第204页的表4)中有所描述。在结构上，二萜糖苷的特征在于单一骨架甜菊醇，并且不同之处在于在位置C13和C19处存在碳水化合物残基，如图2a-2k所呈现。还可参见PCT专利公布WO 2013/096420。
通常，以干重计，甜叶菊叶中存在的四种主要的甜菊醇糖苷是杜尔可苷A(0.3％)、莱苞迪苷C(0.6-1.0％)、莱苞迪苷A(3.8％)和甜菊苷(9.1％)。甜叶菊提取物中鉴定的其他糖苷包括莱苞迪苷B、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、甜菊双糖苷以及甜茶苷中的一种或多种。
虽然主要的甜菊醇糖苷Reb A通常用作饮料应用中的甜味剂，但它具有异味问题。最近，人们一直关注具有更好味道特性的某些次要的甜菊醇糖苷。例如，莱苞迪苷M具有较高的甜味强度，并且比其他甜菊醇糖苷更强效(例如，参见Prakash，I.等人(2013)Nat.Prod.Commun.，8：1523–1526和WO 2013/096420)。莱苞迪苷D尝起来比蔗糖甜约200-220倍，并且在感官评价中，其具有缓慢的甜味起效并且非常干净，即总体上比蔗糖甜，与蔗糖相比，残留的甜味余味少(例如，参见Prakash，I.等人(2012)Int.J.Mol.Sci.，13:15126-15136)。
分子技术已用于制备能够通过发酵合成甜菊醇糖苷的重组生物体。例如，具有编码参与甜菊醇糖苷合成的酶的多种转基因的酿酒酵母(S.cerevisiae)重组菌株已用于生产莱苞迪苷M和莱苞迪苷D(参见例如WO2014/122227)。
发明概述
本发明大体上涉及用于使用工程化酵母生产甜菊醇糖苷的方法，以及发酵组合物和包含一种或多种甜菊醇糖苷的发酵产物。本公开的发酵条件可促进来自工程化酵母的甜菊醇糖苷生产增加，并且还可提供期望的甜菊醇糖苷比率，诸如具有高的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M比率的发酵组合物。例如，在本发明的一些实施方案中，发酵组合物可包含1:20或更大的比率的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M。在又其他实施方案中，莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率在1:20至1:1的范围内。在其他实施方案中，第二pH下的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率大于工程化酵母在整个发酵过程中保持在第一pH下时所产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括在发酵期间将培养基改变到较高的pH条件以生产甜菊醇糖苷。
所述方法包括在第一pH的第一培养基中生长工程化酵母的步骤，其中工程化酵母能够产生一种或多种甜菊醇糖苷。“工程化酵母”是指具有引入到细胞中的至少一个外源性DNA序列的酵母细胞，所述序列被整合到细胞的基因组中或存在于染色体外的构建体(诸如质粒或附加体)上。接下来，将组合物添加到第一培养基以提供具有大于第一pH的第二pH的第二培养基。在第二培养基中，对工程化酵母进行发酵以产生一种或多种甜菊醇糖苷。添加到培养基的组合物可包含含氮化合物，诸如选自氢氧化铵、尿素、硫酸铵中的一种。添加到培养基的组合物可用于控制pH。还可通过非含氮碱(诸如氢氧化钾或氢氧化钠或氢氧化钙)以及用酵母氮碱、硫酸铵、尿素、酵母提取物或其他含氮营养物质补充培养基中的氮来控制pH。
在第二培养基中，pH可调节至大于约5、大于约5.5或大于约5.8，诸如在约5.8至7.5或5.8至6.2的范围内。添加到培养基的含氮化合物可以是碱(诸如氢氧化铵)，并且可用于形成第二、较高的pH条件。可替代地，含氮化合物可与非氮碱一起使用以提供较高的pH。诸如酵母提取物、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其组合的含氮化合物可以是发酵条件期间第二培养基中的主要氮组分。非氮碱可包括氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化钙。
示例性方法包括(a)在较低pH(诸如5.8以下)的具有碳水化合物(例如，葡萄糖)的培养基中生长工程化酵母，然后(b)将具有含氮化合物(诸如氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其组合)和任选的非含氮碱的组合物与另外的碳水化合物以及任选的其他发酵化合物一起添加到培养基以提供pH为5.8或更大的培养基，然后用工程化酵母发酵培养基以产生甜菊醇糖苷。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其中pH转变不是必需的，而是任选的。因此，另一个实施方案是一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其中所述方法包括在包含氮源的培养基中在5.8或更大的pH下生长工程化酵母和用工程化酵母发酵培养基的步骤。氮源选自氢氧化铵、尿素和硫酸铵、酵母提取物，并且这些化合物中的一种或组合是发酵期间的主要氮源。在发酵期间，工程化酵母产生一种或多种甜菊醇糖苷。例如，甜菊醇糖苷包含莱苞迪苷D、莱苞迪苷M或莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。在一些实施方案中，莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的摩尔比为1:20或更大。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于增加工程化酵母中第一、较低分子量甜菊醇糖苷相对于第二、较高分子量甜菊醇糖苷的生产的方法。所述方法包括在发酵培养基中在5.8或更大的pH下发酵能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母的步骤，其中工程化酵母在5.8或更大的pH下产生的第一甜菊醇糖苷和第二甜菊醇糖苷的比率大于在小于5.8的pH下产生的第一甜菊醇糖苷和第二甜菊醇糖苷的比率。例如，所述方法可在5.8或更大的pH下使第一甜菊醇糖苷和第二甜菊醇糖苷的比率比工程化酵母在较低pH下生长时的比率增加约10％或更大。
在另一个实施方案中，本发明还提供包含通过发酵过程产生的甜菊醇糖苷的组合物。因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种从发酵过程获得的包含莱苞迪苷D和莱苞迪苷M的组合物，其中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的摩尔比为1:20或更大。
附图说明
图1示出代表性甲羟戊酸途径。
图2示出代表性非甲羟戊酸途径。
图3示出用于甜菊醇生产的代表性途径。
图4示出用于由甜菊醇生物合成甜菊醇糖苷的代表性途径。
发明详述
本文所描述的本公开的实施方案并不意图穷举或将本发明限制于以下详述中所公开的精确形式。相反，所选择和描述的实施方案的目的是使得本领域技术人员对本发明的原理和实践的认识和理解可变得容易。
本公开的发酵方法使用能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母。能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可包含编码细胞中促进一种或多种甜菊醇糖苷形成的酶的一种或多种外源性核酸。例如，工程化酵母可具有提供用于合成甜菊醇糖苷RebM和RebD的途径的一组酶。
如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷。示例性甜菊醇糖苷包括但不限于莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G、莱苞迪苷H、莱苞迪苷I、莱苞迪苷J、莱苞迪苷K、莱苞迪苷L、莱苞迪苷M、莱苞迪苷N、莱苞迪苷O、甜菊苷、甜菊双糖苷、杜尔可苷A、甜茶苷。工程化酵母可产生与自然界中存在(“天然存在”)的甜菊醇糖苷相同的甜菊醇糖苷以及自然界中不存在的甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷可通过酶促过程而在工程化酵母中形成。
在结构上，根据下面所示骨架上的原子编号，甜菊醇糖苷具有中心分子部分即单一甜菊醇骨架，以及连接到甜菊醇骨架的C13和/或C19原子的吡喃葡萄糖基残基。即，吡喃葡萄糖基残基表示以下式中的基团R1和R2：
下表A示出各种甜菊醇糖苷和对应的R1和R2基团：
表A
Glu：葡萄糖
Rha：鼠李糖
根据当前的公开，甜菊醇糖苷是在包括在比典型酵母发酵条件高的pH下发酵工程化酵母的过程中产生的。通过比较，酵母酿酒酵母通常在4至5范围内的pH下进行发酵。
本公开的方法可使用工程化以提供一种或多种甜菊醇糖苷的途径的各种酵母宿主细胞。用于本公开的方法中的此类细胞可用编码用于甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种DNA构建体进行转化。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源性DNA构建体的宿主的示例性酵母包括但不限于假丝酵母属、克氏酵母属(有孢汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属的物种。示例性物种是白假丝酵母(Candida albicans)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。此外，宿主细胞除了包含甜菊醇糖苷途径的遗传修饰，还可包含可在发酵期间提供改善的性能的遗传修饰。
术语“外源性”是指引入到宿主酵母中的分子(诸如核酸)或活性(诸如酶活性)。外源性核酸可通过熟知的技术引入到酵母宿主中，并且可保持在宿主染色体物质的外部(例如，保持在非整合载体上)，或者可整合到酵母的染色体中，诸如通过重组事件。一般而言，工程化酵母的基因组通过稳定引入一种或多种重组基因来增强。外源性核酸可编码与酵母同源或异源的酶或其部分。外源性核酸可呈“重组基因或DNA构建体”的形式，是指通过分子技术以一种或多种方式调控而呈非天然存在的形式的核酸。
术语“异源的”(例如“非天然”)是指来自不同于参考分子或生物体的来源的分子或活性。因此，与参考生物体异源的基因或蛋白质是所述生物体中不存在的基因或蛋白质。在本公开的上下文中，“异源性糖基转移酶”是指不同于对宿主生物体而言可能是天然的任何糖基转移酶多肽的糖基转移酶多肽。例如，存在于第一物种中并且外源性地引入到不同于第一物种的宿主酵母生物体中的特定糖基转移酶基因对于宿主酵母是“异源的”。
工程化酵母可使用适合于选择具有编码甜菊醇糖苷途径酶的核酸的转化体的营养缺陷型标记。宿主酵母可包含控制营养缺陷型的一种或多种基因(诸如LYS2、LEU2、HIS3、URA3、URA5和TRP1)中的修饰(缺失等)。使用具有所需遗传背景的宿主细胞来引入一种或多种外源性基因，将一种或多种基因构建体引入到细胞中，以整合到基因组中或稳定地保持并允许表达。用于将基因构建体引入到宿主细胞中的方法包括转化、转导、转染、共转染和电穿孔。具体地，可使用乙酸锂方法、原生质体方法等来进行酵母转化。待引入的基因构建体可以质粒形式、或通过插入到宿主基因中、或通过与宿主基因同源重组而结合到染色体中。可用选择性标记(例如，如上所述的营养缺陷型标记)选择已引入基因构建体的转化酵母。可通过测量所表达蛋白质的活性或与所引入基因相关联的生物产物(诸如甜菊醇糖苷)的生产进行进一步确认。
包含甜菊醇途径基因的外源性核酸序列的转化可使用本领域熟知的方法进行确认。此类方法包括例如：核酸分析，诸如RNA印迹或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增；或用于基因产物表达的免疫印迹法；或测试所引入核酸序列或其对应基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应理解，外源性核酸以足以产生所需产物的量表达，并且应进一步理解，表达水平可被优化以使用本领域熟知且本文所公开的方法来获得足够的表达。
萜类化合物异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)可用作工程化酵母中甜菊醇糖苷的化学前体。一些生物体(包括植物、昆虫和一些微生物物种)具有甲羟戊酸(MVA)途径，其通过一系列化学中间体将乙酰-CoA转化成IPP和DMAPP。一些生物体通过非甲羟戊酸途径(也称为甲基D-赤藓醇4-磷酸或MEP途径)以甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)开始产生IPP和DMAPP。
酵母酿酒酵母天然表达甲羟戊酸途径的基因。甲羟戊酸途径基因编码的酶包括：(a1)乙酰乙酰CoA硫解酶(EC 2.3.1.9)；(b1)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)合酶(EC 4.1.3.5)；(c1)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.34)；(d1)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；(e1)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；以及(f1)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)。甲羟戊酸途径的酶如下将乙酰-CoA转化成IPP：乙酰-CoA→乙酰乙酰-CoA→3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA→甲羟戊酸→甲羟戊酸-5-磷酸→甲羟戊酸-5-焦磷酸→IPP。还可参见图1
在一些实施方案中，工程化酵母可包含一种或多种修饰以增加由乙酰-CoA到IPP和/或DMAPP的通量，从而提供用于甜菊醇途径中的增加的IPP和/或DMAPP库。修饰可包括例如增加一种或多种甲羟戊酸途径酶(a1)-(f1)的表达或活性，诸如通过使编码与酵母细胞同源或异源的酶的核酸处于提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸置换的变体酶)或与天然酶相比提供更高水平的酶活性的变体异源酶。
可替代地，非甲羟戊酸(MEP)途径可用于提供IPP和DMAPP作为甜菊醇糖苷生产的前体。酵母酿酒酵母并不天然地表达MEP途径的基因，但可任选地工程化以提供MEP途径基因。理论上，MEP途径通常在能量上更有效，因为与MVA途径相比，其作为CO2而失去的碳更少(MEP途径：1CO2/IPP；MVA途径：4CO2/IPP；糖作为碳源)。
具体地，在非甲羟戊酸(MEP)途径中，化合物异戊烯基二磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)通过一系列由甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)引起的中间体而生成，并且多种酶负责这种转化。参与G3P和PYR到IPP和DMAPP的生物合成途径的酶包括(a2)l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b2)l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(ispC)-、(c2)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶(IspD)、(d2)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(IspE)、(e2)2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、(f2)l-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、(g2)4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)和(h2)异戊烯基-二磷酸异构酶(IDI)，参见图2。
本公开的用于通过发酵生产甜菊醇糖苷的方法可使用具有一种或多种遗传修饰的工程化酵母，以增加由G3P和PYR到IPP和/或DMAPP的通量，从而提供用于甜菊醇途径中的增加的IPP和/或DMAPP库。修饰可包括例如增加一种或多种酶(a2)-(h2)的表达或活性，诸如通过使编码与酵母细胞异源的酶的核酸处于提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸置换的变体酶)或提供高水平的酶活性的变体异源酶。
本公开的用于通过发酵生产甜菊醇糖苷的方法可使用工程化酵母，其也可包含将IPP和/或DMAPP转化成甜菊醇的途径。例如，在一些方面，工程化酵母可包含表达以下酶的外源性核酸：(a3)香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)，(b3)柯巴基二磷酸合酶(CDPS)，(c3)贝壳杉烯合酶(KS)，(d3)贝壳杉烯氧化酶(KO)，以及(e3)异贝壳杉烯酸13-羟基化酶(KAH)。甲羟戊酸途径的酶如下将IPP和/或DMAPP转化成甜菊醇：IPP/DMAPP→香叶基香叶基二磷酸→柯巴基二磷酸→贝壳杉烯→异贝壳杉烯酸→甜菊醇。(参见图3)编码与酵母细胞异源的酶(a3)-(e3)的外源性核酸可处于提供增加表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸置换的变体酶)或提供高水平的酶促活性的变体异源酶。
本公开的用于通过发酵生产甜菊醇糖苷的方法可使用具有将甜菊醇转化成甜菊醇糖苷的任何途径的工程化酵母。如果工程化酵母中存在多于一种甜菊醇糖苷途径酶，则酵母可能能够产生不同的甜菊醇糖苷。例如，酵母可能能够产生两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同的甜菊醇糖苷物质。
甜菊醇糖苷途径可包括介导糖基残基从活化的核苷酸糖转移至受体分子的一种或多种尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)。在甜菊醇糖苷途径的情况下，单糖单元可转移到甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的羟基或羧基部分，或者转移到连接至甜菊醇骨架的葡萄糖基团上的羟基。参见图4基于序列同源性已将UGT分类为家族和亚族。参见Li等人，2001，J.Biol.Chem.276:4338-4343。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已鉴定了编码UGT(各自含有42个氨基酸共有序列)的超过100个基因的超家族，并且还在若干种其他高等植物物种中鉴定了编码UGT的基因。
示例性UDP-葡糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物以提供目标甜菊醇糖苷的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个实施方案中，工程化酵母可包括一种或多种UDP-葡糖基转移酶，其选自组UGT74G1(SEQ ID NO：1)、UGT85C2(SEQ ID NO：2)、UGT76G1(SEQ ID NO：3)、UGT91D2(SEQ ID NO：4)以及与这些多肽具有实质同一性(例如，>85％、>75％、>65％、>55％、>45％以及>35％)的UGT。工程化酵母可包含编码这些UGT的一个或多个外源性核酸分子。
工程化酵母还可包含一种或多种UGT和UDP-葡萄糖循环酶。能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜茶苷以形成甜菊苷的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT91D2(SEQ ID NO：4)。能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊苷以形成莱苞迪苷A的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1(SEQ ID NO：3)。能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱苞迪苷A以形成莱苞迪苷D的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT91D2(SEQ ID NO：4)。能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱苞迪苷D以形成莱苞迪苷M的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1(SEQ ID NO：3)。
描述用于甜菊醇糖苷生产的工程化微生物以及甜菊醇糖苷途径酶的示例性公布包括例如US2014/0357588、WO2014/193934、WO2014/193888和WO2014/122227，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，可用于生产甜菊醇糖苷的工程化酵母表达以下酶：香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯合酶(KS)、甜菊醇合酶(KAH)、细胞色素P450还原酶(CPR)、UGT74G1、UGT76G1、UGT91D2、UGT85C2和EUGT11。WO2014/122227描述了表达这些酶的工程化酵母菌株。UDP-葡糖基转移酶可以是编码多肽的基因，所述多肽例如UGT74G1(SEQ ID NO：1)、UGT85C2(SEQ ID NO：2)、UGT76G1(SEQ ID NO：3)、UGT91D2(SEQ ID NO：4)以及EUGT11(SEQ ID NO：13)；这些基因编码能够进行多种反应的多肽，诸如：a)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化的多肽的基因；(b)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化的多肽的基因；(c)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O-葡萄糖的C3’进行β1,3糖基化的多肽的基因；(d)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C3’进行β1,3糖基化的多肽的基因；(i)编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷的13-OH进行糖基化的多肽的基因；(j)编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基进行糖基化的多肽的基因。例如，UGT85C2进行反应(i)；UGT74G1进行反应(j)；UGT91D2进行反应(a；弱)、(b)；UGT76G1进行反应(c)和(d)；EUGT11进行反应(a)、(b；不太好)。
本公开的各个方面可相对于细胞培养的时期进行描述。例如，所述过程可包括培养工程化酵母的一个或多个“时期”或“阶段”。例如，所述过程可包括“接种/生长阶段”。如本文所用，“接种阶段”是指其间细胞在培养基中生长以适应将被用于随后的生长阶段中的培养基组分(碳水化合物、氮源、盐、维生素、痕量金属)并且以增加细胞数量的周期。本文所用的“生长阶段”是指其间细胞繁殖(例如，指数地)的周期。在接种/生长阶段期间，工程化酵母可通过出芽生殖(称为酵母分裂)开始繁殖。
接种/生长阶段可通过工程化酵母的快速繁殖来表征。接种/生长阶段可根据工程化酵母的倍增时间进行描述。在本公开的一些实施方案中，工程化酵母的生长可在较低(第一)pH(例如，约5.8或以下、或者约5.0或以下)下进行，然后在生长阶段中后期的某个时候或在随后发酵阶段中的某个时候，可将pH增加至较高(第二)pH(例如，约5.8或更大、或者约6.0或更大)。在本公开的其他实施方案中，工程化酵母的生长可在较高(第二)pH下进行，并且因此不需要在生长和发酵阶段期间调节至较高pH。
在生长阶段之后，工程化酵母可进入生长至少减慢的“发酵阶段”，并且工程化酵母积极地同化碳水化合物并产生所需的产物，例如甜菊醇糖苷。如本文所用，“发酵(fermentation/fermenting)”或其变体用于描述通过可在部分有氧、有氧或厌氧条件下发生的用酵母转化底物来显著生产甜菊醇糖苷的阶段。在部分有氧的条件下，发酵途径和呼吸途径均可以是有效的，并且可发生一些细胞生长。在部分有氧的条件下，消耗的氧气量可少于接种/生长阶段期间的。如本文所用，短语“在整个过程中”或“在整个...过程中”在用于提及各种阶段或处理时意指从生长阶段到产物形成。
在一些实践模式中，如果在生长阶段期间或在生长阶段开始时增加培养基的pH，则发酵阶段期间培养基的pH可处于较高pH。在其他实践模式中，可在发酵阶段期间的预定点处将pH调节至较高pH。如果pH在发酵期间增加，则其优选地增加到比发酵阶段结束时更接近发酵阶段开始时，并且更优选地在发酵阶段开始时或非常接近发酵阶段开始时。
在一些实践模式中，生长阶段期间培养基的pH在与发酵阶段相同的pH下进行。例如，在较高(第二)pH下进行生长阶段。例如，较高(第二)pH为约5.8或更大。
在一些实施方案中，本公开的用于生产甜菊醇糖苷的方法包括将工程化细胞所处的培养基改变至较高pH进行发酵和生产甜菊醇糖苷。因此，所述方法中的步骤可包括在第一、较低pH(例如，pH 5.8或更小、或者pH 5.0或更小)的第一培养基中生长工程化酵母，然后在第一、较低pH下的时间段之后，在比第一pH高的第二pH的培养基中发酵工程化酵母。工程化酵母在第二、较高pH(例如，pH 5.8或更大、或者pH 6.0或更大)下发酵以产生一种或多种甜菊醇糖苷，并且较高的pH条件可使得甜菊醇糖苷的量增加，并且使得甜菊醇糖苷在所产生的那些中的比率向更期望的比率转变。
术语“培养基”是指液体组合物，其中工程化酵母可保持、可生长、可发酵或其组合。“培养基”也可称为“发酵液”或“细胞培养物”，并且诸如“起始”或“发酵”的术语可用于更具体地定义培养基和其中发生的细胞活动。培养基可相对于培养基中存在的组分及其量进行定义，诸如：(a)碳源，包括碳水化合物，诸如葡萄糖和淀粉产物(诸如麦芽糖糊精)；(b)氮源，诸如酵母氮碱、氢氧化铵、尿素、硫酸铵、酵母提取物或其任何组合；(c)盐，诸如磷酸钾(一盐基、二盐基)、硫酸镁、氯化钠和氯化钙；(d)维生素，诸如生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、HCl吡哆醇、核黄素、HCl硫胺素和柠檬酸；(e)痕量金属，诸如硼酸、硫酸铜、氯化钴、氯化钙、碘化钾、氯化铁、硫酸镁、氯化锰、钼酸钠和硫酸锌。培养基中的组分可基于干重进行定义。此外，培养基是水基或“水性”组合物。培养基也可相对于其pH以及用于控制培养基中pH的生物相容性酸、碱和缓冲液进行定义。
可使用具有来源于任何植物和植物部分(诸如块茎、根、茎、叶和种子)的含有淀粉和/或糖的植物材料的培养基进行工程化酵母的发酵。含有淀粉和/或糖的植物材料可从谷物(诸如大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱、小米、大麦、马铃薯、木薯或稻及其任何组合)中获得。含有淀粉和/或糖的植物材料可诸如通过诸如碾磨、麦芽制造或部分麦芽制造的方法进行加工。在一些实施方案中，培养基(具有较高pH或较低pH)包含经处理的淀粉。例如，用于生长和/或发酵的培养基可包含部分水解的淀粉。部分水解的淀粉可包括高分子量糊精和高分子量麦芽糖糊精。可使用部分水解的淀粉产物，其淀粉和淀粉降解产物的量在有利于甜菊醇糖苷生产的所需范围内。
任选地，可将淀粉降解酶添加到包含淀粉材料的培养基，以便增加可被工程化酵母利用的单体糖(诸如葡萄糖)的浓度。示例性淀粉降解酶包括淀粉分解酶，诸如糖淀粉酶和淀粉酶。
在一些实践模式中，可在包含含有甜菊醇的化合物的培养基中进行发酵。此类化合物可由工程化酵母中的葡糖基转移酶直接使用。例如，任选地，可在含有甜菊醇、甜菊醇-13-O-葡糖苷或甜菊醇-19-O-葡糖苷的培养基中进行发酵。使用这种培养基，微生物可含有并表达编码功能性EUGT11(SEQ ID NO：13)、功能性UGT74G1(SEQ ID NO：1)、功能性UGT85C2(SEQ ID NO：2)、功能性UGT76G1(SEQ ID NO：3)和功能性UGT91D2(SEQ ID NO：4)的基因。化合物诸如莱苞迪苷A、莱苞迪苷D和莱苞迪苷M可从发酵培养基中获得。作为另一种选项，可在含有甜茶苷的培养基中进行发酵。使用这种培养基，微生物可含有并表达编码功能性EUGT11(SEQ ID NO：13)、功能性UGT76G1(SEQ ID NO：3)和功能性UGT91D2(SEQ ID NO：4)的基因。化合物诸如莱苞迪苷A、D和M可从发酵后的培养基中获得。如本文所用，术语“莱苞迪苷DM”、“Reb DM”及其变化形式是指主要是莱苞迪苷D和莱苞迪苷M(因此是“DM”)、其相关异构体(例如，天然或合成的)和/或其盐的糖苷。这种术语格式可用于具有糖苷的任何其他组合的糖苷，例如但不限于Reb DA、Reb MA、Reb DMA等。
在一些情况下，在工业容量的发酵罐中进行发酵，以便实现商业规模的经济益处和控制。在一个实施方案中，在容量为约10,000升或更多的发酵罐中进行发酵。
术语“第一培养基”和“第二培养基”(以及任选地，“第三”、“第四”、“第五”等，如果必要的话)可用于描述生产甜菊醇糖苷的方法的各个方面。在一种实践模式中，提供较低pH(例如，小于5.8或小于5.0)且含有工程化细胞的第一培养基，并且将其中的工程化酵母培养一段时间。随后，将不含细胞的液体组合物(例如，“进料组合物”)添加到第一培养基以提供具有相同或较高pH的第二培养基，其可用于工程化酵母的发酵。进料组合物可以连续或分批过程添加到第一培养基。在优选的实践模式中，以连续过程添加进料组合物以更精确地控制培养基中的发酵条件。在一些实施方案中，进料组合物与添加到第一培养基和添加到第二培养基的进料组成相同。
作为另一个实例，可将低pH(例如，小于5.8或小于5.0)且包含工程化酵母的第一培养基培养一段时间。然后可将第一培养基以分批或批量步骤添加到预定体积的不含细胞的液体组合物，以生成具有较高pH(例如，5.8或更大、或者6.0或更大)的第二培养基，其可用于工程化酵母发酵和甜菊醇糖苷生产。应理解，有多种方式可以具有较低pH的第一培养基开始制备具有较高pH的第二培养基。因此，第二培养基的形成可通过使用批量或连续添加一种或多种进料组分的“添加到”、“添加到...中”或“混合”的过程来进行。进料组分可呈液体或固体形式。在一些情况下，第二培养基的形成可通过多步骤过程来进行。在其他情况下，第一培养基和第二培养基的形成具有第二培养基的较高pH。
在一些实践模式中，第一培养基存在于容器中，然后调节培养基的pH以提供较高pH的第二培养基，其在相同容器中形成。在其他实践模式中，在第一容器中形成第一培养基，然后将其转移到第二容器，其中具有较高pH的第二培养基通过将第一培养基与其他组分或物质组合来形成。
具有较低pH的第一培养基可通过将接种培养物添加到包含碳水化合物、氮源(诸如酵母氮碱、氢氧化铵、尿素、硫酸铵、酵母提取物或其任何组合)、盐、维生素和痕量金属的液体组合物来形成。在一些实践模式中，第一培养基包含氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其组合作为培养基中的唯一氮源。可对第一培养基中组分的“初始”浓度进行描述，同时应理解，因为工程化细胞消耗组分，所以组分在第一培养基中的浓度可随时间降低。当具有较高pH(例如，5.8或更大、或者6.0或更大)的第二培养基形成时，氢氧化铵、尿素或硫酸铵可以是培养基中的唯一氮源。
在一些实践模式中，第一培养基(诸如酵母生长发生的培养基)的pH可小于约6.0、小于约5.9、小于约5.8、小于约5.7、小于约5.6、小于约5.5、小于约5.4、小于约5.3、小于约5.2、小于约5.1、小于约5.0，诸如在约3.0至约5.5、约3.5至约5.3或约4.0至约5.0的范围内。第一培养基中的示例性pH为约5.0。在第一培养基中的生长周期期间，pH可能会波动。例如，酵母细胞的生长可使得第一培养基在一段时间之后变得更酸。任选地，第一培养基中的pH可通过随时间监测pH来控制，并且如果必要的话，可通过诸如用碱或缓冲液调节pH以使其在第一培养基中的生长期间保持在所需范围内来控制。例如，可使用含氮碱诸如氢氧化铵来控制第一培养基的pH，使得pH保持在约4.8至约5.2的范围内。第一培养基中所使用的含氮碱可与第二培养基中所使用的含氮碱相同(例如，氢氧化铵)，不同之处在于第二培养基中所使用的碱的浓度较高以提供较高的pH。
在一些实践模式中，第一培养基的初始葡萄糖浓度可小于约50g/L、小于25g/L，诸如在约5g/L至约50g/L或约10g/L至约35g/L的范围内。第一培养基中的葡萄糖浓度也可相对于第二培养基中的葡萄糖浓度进行定义。
在示例性实践模式中，第一培养基中的生长在约25-35℃或28-32℃范围内的温度下进行，并且最优选地在约30℃下进行。
此外，工程化酵母的生长可在曝气和搅拌下进行。
例如，在第一培养基中和在生长阶段期间，可进行曝气。曝气可根据以mg min-1升-1为单位的溶解氧转移到培养基的速率进行描述。(例如，参见Anderlei，T.和Büchs，J.(2000)Biochem.Engin.J.3478:1-6)。可进行促进细小气泡形成的鼓泡技术以提供所需的曝气。在一些实践模式中，在第一培养基中的生长阶段期间，诸如以逐步的方式增加搅拌和曝气。曝气条件可对溶解在培养基中的氧气量产生影响，因此对工程化酵母可用的氧气产生影响。工程化酵母的氧摄取量可由氧气供应的速率和培养基中小氧气泡的形成来控制，所述小氧气泡的形成可通过搅拌和/或鼓泡来实现。在发酵阶段期间也可进行有限的曝气。
在调节到较高pH的第二培养基之前，工程化酵母在第一培养基中的生长可进行所需的时间段。在一些实践模式中，在调节到第二培养基之前，工程化酵母在第一培养基中的生长可进行所需的时间段，其中第一培养基和第二培养基具有较高的pH。例如，第一培养基中的生长可进行约两小时或更长、或者约10小时或更长的时间，诸如约两小时至约30小时或约10小时至约24小时范围内的时间段。在第一培养基中的时间可涵盖工程化酵母的生长停滞阶段的全部或部分以及生长对数(指数)阶段的全部或部分。此外，在较低pH的第一培养基中的时间期间，工程化酵母可具有预定的生长速率。例如，在第一培养基中，工程化酵母的倍增时间可在约2.31小时至约13.86小时或约2.77小时至约7.3小时的范围内。可替代地，生长速率可表示为稀释速率，其可在约0.05-0.31/h或约0.095-0.251/h的范围内。
可进行工程化酵母的生长以提供所需量的生物质。如本文所用，“生物质”是指工程化酵母的重量，其可以每升培养基的干细胞重量(DCW/L)的克数进行测量。在一些实践模式中，工程化酵母生长至生物质量为约20g dcw/L或更大、约30g dcw/L或更大，诸如在约20g dcw/L至约120g dcw/L或约40g dcw/L至约80g dcw/L的范围内。
在形成第二培养基时，可将碱添加到第一培养基，这引起从较低pH到较高pH的增加。添加碱的时间可基于诸如以下项的方面进行选择：工程化酵母已在第一培养基中耗费的时间，在特定时间点第一培养基中组分的浓度，或在特定时间点工程化酵母的生长特征，或这些方面的组合。在一些实践模式中，第一培养基的pH在第一培养基中工程化酵母的指数(生长)阶段至少一半的某个时候增加。例如，当工程化酵母从指数阶段出来时，可将第一培养基的pH增加到约5.8或更大、或者约6.0或更大，并且所述工程化酵母的生长减慢。因此，可在工程化酵母以较低的生长速率进入发酵阶段之前进行碱添加以提高pH。因此，在发酵周期中从工程酵母中显著生产甜菊醇糖苷后，可增加培养基的pH。然而，高pH条件优选地涵盖提供从工程化酵母生产甜菊醇糖苷的发酵周期。可替代地，可在工程化酵母进入发酵阶段之后进行碱添加以提高pH。
碱可以是诸如氢氧化铵的含氮碱或适合用于发酵培养基中的非氮碱。可任选地使用包含含氮碱和非含氮碱的混合物的组合物。可用于第二培养基中的其他任选的含氮碱可以是无水氨或氢氧化铵/氢氧化钾共混物。可用于第二培养基中的其他任选的非含氮碱可以是氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化钙。包含浓缩形式的含氮碱(例如，多至约15％(w/v)或更大的氢氧化铵)的组合物可用于改变pH。
碱可作为液体组合物添加到第一组合物，或者可作为固体添加，以形成第二培养基。碱可以批量方法或连续过程添加到第一组合物。在一些实践模式中，以连续过程添加碱以在所需时间段内实现所需pH。例如，从第一pH至第二pH的变化可在短的时间段(分钟)或较长时间(小时)或两者之间的任何时间内进行。例如，所述变化可发生约两分钟至约四小时、约五分钟至约四小时或约30分钟至约三小时范围内的时间段。在示例性实践模式中，从约pH 5.0至约pH 7.0的变化可发生在约30分钟至约180分钟范围内的时间段内。
第二培养基的形成还可包括向第一培养基提供进料培养基。在一些实践模式中，将碱添加到第一培养基以将pH从较低pH增加到较高pH，然后将进料组合物添加到较高pH的培养基。在其他实践模式中，进料培养基包含碱并且具有较高的pH，然后当将进料培养基添加到第一培养基时，所述进料培养基使pH增加以提供第二培养基。具有或不具有碱的进料培养基可与工程化酵母生长的第一培养基相同或不同。在一些实施方案中，添加到第一培养基的进料培养基与添加到第二培养基的进料培养基相同。
进料培养基可包含碳水化合物、氮源(诸如酵母提取物、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合)、盐、维生素和痕量金属等。进料培养基中组分的浓度可大于第一培养基中组分的浓度，从而使得当添加进料培养基时，其在适合于工程化酵母发酵的第二培养基中提供所需量的组分。在示例性实施方案中，发酵(例如，第二培养基)期间进料培养基中的葡萄糖浓度保持在约0g/L至约5g/L或0g/L至约2g/L的范围内。在示例性实施方案中，进料培养基中氮源(诸如酵母提取物、氮碱、氢氧化铵、尿素、硫酸铵)的浓度(总量)保持在约5g/L至约40g/L的范围内。在示例性实施方案中，进料培养基中盐的浓度(总量)，诸如包含硫酸镁的盐在约0g/L至约12g/L的范围内并且包含磷酸钾的盐在约0g/L至约22g/L的范围内。在示例性实施方案中，进料培养基中痕量金属的浓度(总量)保持在约0g/L至约0.4g/L或0g/L至约0.2g/L的范围内。
在工程化酵母处于第二培养基中的周期期间，诸如在发酵周期期间，pH可能会波动。然而，pH优选地保持在约pH 5.8或更大、或者约pH 6.0或更大，诸如在约pH 5.8至约pH8.0、pH 5.8至约pH 7.5或更大、约pH 6.0至约pH 7.0、约5.8至约6.5或约5.8至约6.2的范围内。在第二培养基中的周期期间，可监测(例如，周期性地或连续地)pH，并且如果pH落在所需范围之外，则可对第二培养基进行调节。例如，如果pH降至5.8以下，则可将另外的氢氧化铵添加到第二培养基，以便将pH调节至约5.8或更大。在示例性实施方案中，在发酵期间添加大约0.17kg至约0.2kg的12％NH4OH以将pH保持在5.0，并且在发酵期间添加大约0.20kg至约0.24kg的12％NH4OH以将pH保持在6.0。在典型发酵中的进料阶段期间，添加大约1.18kg至约1.21kg的进料培养基。
在示例性实施方案中，通过控制进料培养基的流速来限制葡萄糖浓度。两阶段进料策略可包括在10小时时开始的初始指数阶段，其中生长速率例如为u＝0.12 1/h，而第二进料(或进料阶段II)可在33小时时开始，其中恒定流速例如为0.180ml/分钟。可继续进料，直到约120小时时可获得约1.95升的最终体积。用于生产所需甜菊醇糖苷的进料速率的其他方法在标题为“Fermentation Methods for Producing Steviol Glycosides withMulti-phase Feeding”、美国专利申请号为62/168,372的申请和标题为“FermentationMethods for Producing Steviol Glycosides with Multi-phase Feeding”、代理人案卷号为N00293USP1(CAR0212/WO)且与本申请同时提交的国际PCT申请中有所描述，其中每个申请据此以引用的方式整体并入。
工程化酵母存在于第二培养基中的时间段可包括进行足够量的时间以产生所需量的甜菊醇糖苷的发酵周期。例如，具有较高pH的第二培养基可在自工程化酵母的初始培养起2小时或更迟、10小时或更迟、或者24小时或更迟的时候形成，并且可延长到多至自工程化酵母的初始培养起150小时、多至96小时或多至72小时的时候。工程化酵母的发酵和甜菊醇糖苷的生产可在工程化酵母在第二培养基中停留期间的某个点开始。优选地，甜菊醇糖苷的大部分(即大于50％)由工程化酵母在处于较高pH的第二培养基中时产生。
在示例性实践模式中，第二培养基中的发酵和任选的生长在约25-35℃或28-32℃范围内的温度下进行，并且最优选地在约30℃下进行。此外，第二培养基中工程化酵母的发酵和任选的生长可在曝气和搅拌下进行。
任选地，第二培养基中的pH可通过随时间监测pH来控制，并且如果必要的话，可通过诸如用碱或缓冲液调节第二培养基中的pH以使其在发酵期间保持在所需范围内来控制。例如，也可使用含氮碱诸如氢氧化铵来控制第二培养基的pH，使得pH保持在约5.8或更大，诸如在约pH 5.8至约pH 7.5或更大、约pH 6.0至约pH 7.0、约5.8至约6.5或5.8至约6.2的范围内。第二培养基中所使用的含氮碱可与第一培养基中所使用的含氮碱相同(例如，氢氧化铵)。
工程化酵母可在第二培养基中保持足够的时间段以产生一种或多种甜菊醇糖苷。例如，工程化酵母可在第二培养基中存在多至约150小时的周期，其可包括所述过程的生长和发酵阶段。第二培养基中的示例性周期在约20小时至约150小时、约30小时至约120小时或约40小时至约90小时的范围内。第二培养基中的周期可以是生长阶段的大部分和发酵阶段的全部、生长阶段的一部分和发酵阶段的全部、发酵阶段的全部或发酵阶段的大部分。
在另一个实施方案中，本公开提供一种用于使用工程化酵母生产甜菊醇糖苷的方法，其中在所述过程中的早期(诸如在生长阶段开始时)存在较高的pH条件。例如，所述过程的生长和发酵阶段均可在具有5.8或更大、约pH 6.0或更大，诸如在约pH 5.8至约pH 8.0、pH 5.8至约pH 7.5或更大、约pH 6.0至约pH 7.0、约5.8至约6.5或约5.8至约6.2范围内的pH的培养基中进行。培养基可包含选自氢氧化铵、尿素和硫酸铵的氮源。这些化合物中的一种或组合可以是所述过程的生长和发酵时期期间的主要氮源。
在以高pH开始的过程中，在工程化酵母生长和发酵的周期期间，pH可能会波动。然而，在生长和发酵周期期间，pH优选地保持在约pH 5.8或更大、或者约pH 6.0或更大，诸如在约pH 5.8至约8.0、pH 5.8至约pH 7.5或更大、或者约pH 6.0至约pH 7.0的范围内。在这些周期期间，可监测(例如，周期性地或连续地)pH，并且如果pH落在所需范围之外，则可对培养基进行调节。例如，如果pH降至5.8或6.0以下，则可将另外的氢氧化铵添加到培养基，以便将pH调节至约5.8或更大。
在其中工程化酵母在生长阶段开始或早期存在于较高pH的培养基中的一些实践模式中，可将工程化酵母在培养基中保持足够的时间段以产生一种或多种甜菊醇糖苷。例如，工程化酵母可在较高pH的培养基中存在约150小时或甚至更长的周期。第二培养基中的示例性周期在约40小时至约150小时、约50小时至约130小时或约60小时至约110小时的范围内。
在发酵期间，可监测较高pH培养基的甜菊醇糖苷生产。可在存在所需的甜菊醇糖苷总量和分布时停止发酵。
“总甜菊醇糖苷”(TSG)是指在发酵周期之后存在于培养基中的所有甜菊醇糖苷，其包括液体培养基中以及可从工程化酵母中获得的甜菊醇糖苷的量。甜菊醇糖苷含量可相对于培养基中的甜菊醇糖苷总量，或者培养基中一种或多种(而非所有)甜菊醇糖苷的量表示。组合物中甜菊醇糖苷的量可相对于彼此表示，或者相对于甜菊醇糖苷的总量表示，诸如通过甜菊醇糖苷总量的重量百分比或者比率或比率的范围，表示为重量百分比或摩尔百分比。通常在干燥(无水)基础上进行组合物中所有甜菊醇糖苷含量的总和。
甜菊醇糖苷的量也可相对于对照样品(诸如在较低pH下发酵的对照样品)进行表达。与在约5.0的pH(不调节至较高的pH)下生长和发酵的工程化酵母相比，示例性比较是在约5.0的pH下生长、然后调节至5.8至7.5范围内的pH进行发酵的工程化酵母。与在约5.0的pH下生长和发酵的工程化酵母相比，另一个示例性比较是在5.8至7.5范围内的pH下生长和发酵以用于发酵的工程化酵母。
例如，相对于在较低pH条件(例如，pH 5.0)下生长的工程化酵母菌株，在较高pH条件下发酵或在较高pH条件下生长和发酵的工程化酵母可表现出总甜菊醇糖苷量增加约1.2X或更大、约1.3X或更大、约1.4X或更大、约1.5X或更大、约1.6X或更大、约1.7X或更大、约1.8X或更大、约1.9X或更大、或者约2.0X或更大。
在较高pH条件下生产某些甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪苷D和莱苞迪苷M)也可相对于在较低pH条件下生长的工程化酵母进行描述。例如，相对于在较低pH条件(例如，pH 5.0)下生长的工程化酵母菌株，在较高pH条件下发酵或在较高pH条件下生长和发酵的工程化酵母可表现出莱苞迪苷D量增加约1.4X或更大、约1.5X或更大、约1.6X或更大、约1.7X或更大、约1.8X或更大、约1.9X或更大、约2.0X或更大、约2.1X或更大。发酵培养基中莱苞迪苷D的示例性滴度为约1g/L或更大、约1.25g/L或更大、约1.5g/L或更大、约1.75g/L或更大、或者约2.0g/L或更大。
作为另一个实例，相对于在较低pH条件(例如，pH 5.0)下生长的工程化酵母菌株，在较高pH条件下发酵或在较高pH条件下生长和发酵的工程化酵母可表现出莱苞迪苷M量增加约1.1X或更大、约1.2X或更大、约1.3X或更大、约1.4X或更大、约1.5X或更大、或者约1.6X或更大。
在高pH条件下发酵的工程化酵母还可表现出所生产的甜菊醇糖苷的相对量的变化。例如，在较低pH下，工程化酵母可表现出一定比率(例如，X:Y)的第一甜菊醇糖苷和第二甜菊醇糖苷的生产。在改变到较高pH的发酵条件时，工程化酵母可能不仅能够产生更大量的糖苷(包括第一糖苷和第二糖苷)，而且可能能够产生与在较低pH下第一糖苷和第二糖苷的生产不同的比率的第一糖苷和第二糖苷。在一些实践模式中，第一甜菊醇糖苷的分子量低于第二甜菊醇糖苷的。例如，关于莱苞迪苷D和莱苞迪苷M，与在较低pH(例如，pH 5.0)下生长的reb D：reb M比率相比，较高pH(例如，在5.8至7.5的范围内)下的发酵可增加reb D：reb M比率。
在一些实践模式中，所述方法提供一种发酵组合物，其中步骤(b)中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率为约1:20或更大，诸如在
约1:20至约1:1、约1:5至约1:1、约1:2至约1:1、约1:1.75至约1:1或约1:1.5至约1:1的范围内。例如，在较高pH条件下发酵或在较高pH条件下生长和发酵的工程化酵母可表现出莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率为约1:20或更大，诸如在约1:20至约1:1、约1:10至约1:1、约1:7.5至约1:1、约1:5至约1:1、约1:3至约1:1、约1:2至约1:1、约1:1.75至约1:1或约1:1.5至约1:1的范围内。
例如，相对于工程化酵母菌株在较低pH条件(例如，pH 5.8或更小、或者pH 5.0或更小)下生长时的reb D：reb M比率，在较高pH条件下发酵或在较高pH条件下生长和发酵的工程化酵母可表现出reb D：reb M比率增加约10％或更大、约20％或更大、约30％或更大、或者约40％或更大。
在较高pH下的发酵周期后，可使用各种技术从培养基中获得含有一种或多种甜菊醇糖苷的组合物。在一些实施方案中，可将诸如渗透剂的化合物添加到培养基以增强甜菊醇糖苷从细胞中去除并进入培养基中。
然后可将培养基离心或过滤以去除工程化细胞。可任选地处理培养基以去除低分子量组分(葡萄糖、基本营养物质和盐)，诸如通过膜透析。根椐所需用途，可使用包含一种或多种甜菊醇糖苷化合物的组合物。
在发酵之后，可任选地使用热处理方法处理工程化酵母以提高甜菊醇糖苷的回收率。在发酵之后但在任何热处理之前，培养基可含有次最佳量的甜菊醇糖苷，其中所需甜菊醇糖苷的一部分处于工程化酵母内。为了增加甜菊醇糖苷的回收率，在一些实践模式中，将组合物(诸如工程化酵母已发酵的较高pH的培养基)加热到50℃至95℃或70℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至48小时范围内的时间段。
如果期望提供具有富集或纯化形式的甜菊醇糖苷的组合物，或者在某些甜菊醇糖苷彼此分离的情况下，可进行进一步纯化。甜菊醇糖苷组分的这种富集或纯化可在发酵所发生的培养基上进行，或者然后可在纯化之前干燥培养基。例如，可使用冻干法干燥培养基以形成包含甜菊醇糖苷的干组合物(例如，粉末或薄片)，随后可对其进行加工。
在一些实践模式中，将富含甜菊醇糖苷的干燥发酵液用作用于纯化的起始物质。例如，可将溶剂或溶剂组合添加到干燥发酵液以溶解或悬浮包含甜菊醇糖苷的物质。用于溶解甜菊醇糖苷的示例性组合是水和醇(例如，50:50的乙醇:水)的混合物。为了促进溶解或悬浮，干燥的发酵液物质可在高于室温(诸如在40℃-60℃的范围内)的温度下加热。还可对干燥的发酵液物质进行机械破碎，诸如通过超声处理。在进一步纯化之前，可使用微米或亚微米过滤溶解或悬浮的发酵液物质，诸如通过制备型色谱法。
富含甜菊醇糖苷化合物的干燥发酵液可经受纯化，诸如通过反相液相色谱法。合适的树脂可用于将甜菊醇糖苷化合物保留在柱中、去除亲水性化合物(用液体诸如水将其从整个柱中洗涤下来)。从柱中洗脱甜菊醇糖苷可用合适的溶剂或溶剂组合(诸如乙腈或甲醇)来实现。
从反相柱洗脱甜菊醇糖苷可产生可用于多种目的中的任何一种的组合物。例如，纯化的甜菊醇糖苷组合物可用作用于经口摄取或经口使用的甜味剂组合物。组合物可相对于组合物中的甜菊醇糖苷进行定义。
产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株使用WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO2014/122227和WO 2014/122328中所描述的方法进行构建，所述专利各自以引用的方式整体并入。以下序列用于构建亲本菌株(菌株A)：编码聚球藻属某个种GGPPS多肽(SEQ ID NO:6)的重组基因，编码截短的玉米(Zea mays)CDPS多肽(SEQ ID NO:7)的重组基因，编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO:8)的重组基因，编码重组甜叶菊KO多肽(SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10)的重组基因，编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12)的重组基因，编码稻(Oryza sativa)EUGT 11多肽(SEQ ID NO:13)的重组基因，编码SrKAHe1多肽(SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15)的重组基因，编码甜叶菊CPR8多肽(SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17)的重组基因，编码甜叶菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO:2)的重组基因，编码甜叶菊UGT74G1多肽(SEQID NO:1)的重组基因，编码甜叶菊UGT76G1多肽(SEQ ID NO:3)的重组基因，以及编码产生甜菊醇糖苷的甜叶菊UGT91D2变体(或功能性同源物)UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO:4)的重组基因。
UGT91D2的UGT91D2e-b变体(来自PCT/US2012/050021的SEQ ID NO:5)包含位置211处甲硫氨酸对亮氨酸的置换以及位置286处丙氨酸对缬氨酸的置换。(除了PCT/US2012/050021的表12和实施例11中描述的T144S、M152L、L213F、S364P和G384C变体之外，可使用另外的变体。)GeneArt密码子优化的序列编码具有氨基酸修饰L211M和V286A的甜叶菊UGT91D2e-b(氨基酸序列SEQ ID NO:4；密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)。
菌株B来源于上述亲本菌株，并且另外包含来自甜叶菊的密码子优化的CPR1(SEQID NO:18，对应于氨基酸SEQ ID NO:19)。
菌株C来源于菌株B，并且另外包含编码根据SEQ ID NO：20的KO多肽的基因。
菌株D来源于菌株C，并且另外包含编码根据SEQ ID NO：21的KAH多肽的基因。
菌株E来源于菌株C，并且另外包含编码根据SEQ ID NO：22的CPR4497多肽的基因
下面提供一些另外的非限制性实施方案以进一步举例说明本公开：
1.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在第一pH的第一培养基中生长工程化酵母，其中所述工程化酵母能够产生一种或多种甜菊醇糖苷；
(b)将组合物添加到所述第一培养基以提供具有大于所述第一pH的第二pH的第二培养基；以及
(c)在所述第二pH的所述第二培养基中发酵所述工程化酵母以产生所述一种或多种甜菊醇糖苷。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述第一pH小于6.0。
3.如实施方案2所述的方法，其中所述第一pH在4.0至5.5的范围内。
4.如实施方案1所述的方法，其中所述第二pH大于5.0。
5.如实施方案4所述的方法，其中所述第二pH在5.5至8的范围内。
6.如实施方案5所述的方法，其中所述第二pH在5.8至7.5的范围内。
7.如实施方案1所述的方法，其中所述组合物包含含氮化合物，其选自由氢氧化铵、尿素和硫酸铵组成的组。
8.如实施方案7所述的方法，其中氢氧化铵、尿素或硫酸铵是所述工程化酵母在所述培养基中发酵的主要氮源。
9.如实施方案8所述的方法，其中氢氧化铵或尿素是所述工程化酵母在所述第二培养基中发酵的所述氮源的90％(重量)或更大、或者95％(重量)或更大。
10.如实施方案1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述组合物包含非氮碱。
11.如实施方案10所述的方法，其中所述非氮碱选自由氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化钙组成的组。
12.如实施方案8所述的方法，其中氢氧化铵、尿素或硫酸铵是所述工程化酵母在所述第二培养基中发酵的所述氮源的90％(重量)或更大、或者95％(重量)或更大。
13.如实施方案7所述的方法，其中在步骤(a)中，所述第一培养基包含氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合，并且在步骤(b)中，所述第二pH通过将包含氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合以及任选的非氮碱的所述组合物添加到所述第一培养基来实现。
14.如实施方案1所述的方法，其中所述第一培养基包含浓度不大于25g/L的葡萄糖。
15.如实施方案1所述的方法，其中所述第一培养基包含葡萄糖、除氢氧化铵或尿素之外的氮源、钾源、镁源、痕量金属和维生素。
16.如实施方案1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二培养基包含浓度在400g/L至750g/L范围内的葡萄糖。
17.如实施方案1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二培养基包含葡萄糖、氮源、钾源、镁源、磷源、镁源、痕量金属、维生素和消泡剂。
18.如实施方案1所述的方法，其中步骤(b)包括将另外的发酵物质连续或分批地添加到包含所述工程化酵母的所述第二培养基。
19.如实施方案1所述的方法，其中步骤(b)在自所述工程化酵母的初始培养起2小时或更迟的时候进行。
20.如实施方案1所述的方法，其中步骤(b)进行多至自所述工程化酵母的初始培养起150小时的时候。
21.如实施方案20所述的方法，其中步骤(b)在自所述工程化酵母的初始培养起10小时或更迟的时候进行，并且进行多至自所述初始培养起96小时的时候。
22.如实施方案21所述的方法，其中步骤(b)在自所述工程化酵母的初始培养起24小时或更迟的时候进行，并且进行多至自所述初始培养起72小时的时候。
23.如实施方案1所述的方法，其中所述工程化酵母在所述第二pH下在步骤(b)中产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量比工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量大10％或更大。
24.如实施方案23所述的方法，其中所述工程化酵母在所述第二pH下在步骤(b)中产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量比工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量大20％或更大。
25.如实施方案1所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷包含莱苞迪苷M、莱苞迪苷D或莱苞迪苷M和莱苞迪苷D两者。
26.如实施方案25所述的方法，其中所述工程化酵母在所述第二pH下在步骤(b)中产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率大于工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率。
27.如实施方案26所述的方法，其中步骤(b)中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的所述比率为1:20或更大。
28.如实施方案27所述的方法，其中步骤(b)中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的所述比率在1:20至1:1的范围内。
29.如实施方案1所述的方法，其中所述工程化酵母选自由以下项的物种组成的组：假丝酵母属、克氏酵母属(有孢汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。
30.如实施方案29所述的方法，其中所述工程化酵母是酿酒酵母。
31.如实施方案1所述的方法，其中所述工程化酵母表达一种或多种外源性核酸，其编码与所述酵母异源的以下蛋白质中的一种或多种：GGPPS多肽，对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽，贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽，贝壳杉烯合酶(KS)多肽，甜菊醇合酶(KAH)多肽，细胞色素P450还原酶(CPR)多肽，UGT74G1多肽，UGT76G1多肽，UGT91 d2多肽，以及EUGT11多肽
32.如实施方案1所述的方法，其中所述工程化酵母表达一种或多种外源性核酸，其编码与所述酵母异源的以下蛋白质中的一种或多种：GGPPS多肽，截短的玉米CDPS多肽，拟南芥KS多肽，甜叶菊KO多肽，拟南芥ATR2多肽，稻EUGT 11多肽，SrKAHe1多肽，甜叶菊CPR8多肽，甜叶菊UGT85C2多肽，甜叶菊UGT74G1多肽，甜叶菊UGT76G1多肽，甜叶菊UGT91D2变体或功能性同源物，以及UGT91D2e-b多肽。
33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括提供包含所述工程化酵母的接种培养基的步骤，其中所述接种培养基随后用于形成所述第一pH的所述第一培养基。
34.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(c)在单一容器中进行。
35.如实施方案1-33中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(c)在两个或更多个不同容器中进行。
36.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：在发酵培养基中在6.0或更大的pH下发酵工程化酵母，其中所述工程化酵母产生一种或多种甜菊醇糖苷。
37.如实施方案36所述的方法，其中所述发酵培养基包含选自氢氧化铵、尿素和硫酸铵的氮源。
38.如实施方案37所述的方法，其中所述pH在6.0至7.5的范围内。
39.如实施方案38所述的方法，其中所述pH在6.5至7.5的范围内。
40.如实施方案36所述的方法，其中氢氧化铵或尿素是所述工程化酵母在所述培养基中发酵的所述氮源的90％(重量)或更大、或者95％(重量)或更大。
41.如实施方案36所述的方法，其中所述培养基包含葡萄糖、氮源、钾源、镁源、磷源、镁源、痕量金属、维生素和消泡剂。
42.如实施方案36所述的方法，其还包括将另外的发酵物质连续或分批地添加到包含所述工程化酵母的所述培养基。
43.如实施方案36所述的方法，其进行多至150小时的时间段。
44.如实施方案43所述的方法，其进行8至88小时范围内的时间段。
45.如实施方案44所述的方法，其进行22至48小时范围内的时间段。
46.如实施方案36所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷包含莱苞迪苷M、莱苞迪苷D或莱苞迪苷M和莱苞迪苷D两者。
47.如实施方案33所述的方法，其中所述发酵培养基的生物质在20-120g dcw/L的范围内。
48.一种用于增加工程化酵母中第一、较低分子量甜菊醇糖苷相对于第二、较高分子量甜菊醇糖苷的生产的方法，所述方法包括在发酵培养基中在6.0或更大的pH下发酵能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母的步骤，其中所述工程化酵母在6.0或更大的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的比率大于在小于6.0的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的比率。
49.如实施方案48所述的方法，其中6.0或更大的pH下的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率比在小于6.0的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率大10％或更大。
50.如实施方案49所述的方法，其中6.0或更大的pH下的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率比在小于6.0的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率大25％或更大。
51.如实施方案48所述的方法，其中所述第一甜菊醇糖苷是莱苞迪苷D，并且所述第二甜菊醇糖苷是莱苞迪苷M。
52.一种来源于使用工程酵母来产生所述一种或多种甜菊醇糖苷的发酵方法的组合物，所述组合物包含比率分别为1:20或更大的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
53.如实施方案52所述的组合物，其包含比率分别在1:5至1:1范围内的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
54.如实施方案53所述的组合物，其包含比率分别在1:1.75至1:1范围内的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
55.如实施方案54所述的组合物，其包含比率分别在1:1.5至1:1范围内的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
56.如实施方案52-55中任一项所述的组合物，其是发酵培养基。
57.如实施方案56所述的组合物，其中所述发酵培养基的莱苞迪苷D浓度为1g/L或更大、1.25g/L或更大、1.5g/L或更大、1.75g/L或更大、或者2.0g/L或更大。
实施例1
在较高pH下以尿素或氢氧化铵作为主要N源的分批进料发酵中Reb D和Reb M的生产
对于接种物制备，将酵母菌株B和菌株C在1升摇瓶中的150mL接种烧瓶培养基中在250rpm和30℃下培养20-24小时。
表1-接种烧瓶培养基
组分 式 浓度 单位
Biospringer 0251酵母提取物 7.5 g/L
一水葡萄糖 C6H12O6*H2O 22.0 g/L
对于发酵，将75mL接种培养物转移到初始发酵培养基(表2、3和4)中，其中起始体积为0.75升。在2L New Brunswick BioFlo 310发酵罐中进行发酵。在整个过程中温度保持在30℃。在发酵期间，保持空气流速使得溶解氧小于20％，并且自动控制搅拌速率以从400rpm以逐步的方式增加至900rpm。通过控制进料培养基(表5)的流速来限制葡萄糖浓度。2阶段进料策略包括在10小时时开始的初始指数阶段，其中生长速率为u＝0.12 1/h，而第2进料阶段(或进料阶段II)在33小时时开始，其中恒定流速为0.180ml/分钟。继续进料直到120小时时获得1.95升的最终体积。
在具有菌株B的一组处理中，用12％NH4OH将pH控制在pH 5。然后在第2进料阶段，用NH4OH将pH控制在5或升高至pH 6或pH 7。通过利用具有10重量％消泡剂溶液(Ivanhoe1163B)的泡沫控制探针来控制消泡剂的添加。参见表6中的结果。
表7中示出用12％NH4OH将pH控制在pH 5的情况下的菌株C的结果。
在具有菌株B的另一组处理中，将发酵1)用12％NH4OH控制在pH 5.0，或者2)仅用6.2N KOH(pH漂移多至7)与存在于进料中的尿素进行控制。结果在表8中示出。
培养基是基于Verduyn等人(Verduyn C，Postma E，Scheffers WA，Van DijkenJP.Yeast.1992Jul；8(7):501-17)的，其具有如表2至5中所述的修改。对于尿素处理，在初始发酵培养基中将硫酸铵增加至15g/L，并且在发酵进料培养基中将尿素添加至39g/L。在尿素处理中使用KOH代替NH4OH作为用于pH控制的碱。
表2-初始发酵培养基
组分 式 浓度 单位
一水葡萄糖 C6H12O6*H2O 22.0 g/L
硫酸铵 (NH4)2SO4 5.0 g/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 3.0 g/L
七水硫酸镁 MgSO4*7H2O 0.5 g/L
痕量金属原液 10.0 ml/L
维生素原液 12.0 ml/L
表3-痕量金属储备溶液
组分 式 浓度 单位
依地酸二钠 C10H14N2Na2O8*2H2O 15 g/L
七水硫酸锌 ZnSO4*7H2O 4.5 g/L
四水氯化锰(II) MnCl2*4H2O 1.026 g/L
六水氯化钴(II) CoCl2*6H2O 0.32 g/L
七水硫酸铜(II) CuSO4*5H2O 0.3 g/L
二水钼酸钠 Na2MoO4*2H2O 0.4 g/L
二水氯化钙 CaCl2*2H2O 3 g/L
七水硫酸铁(II) FeSO4*7H2O 3 g/L
硼酸 H3BO3 1 g/L
碘化钾 KI 0.1 g/L
表4-维生素储备溶液
组分 式 浓度 单位
d-生物素 C10H16N2O3S 50 mg/L
泛酸钙 C18H32CaN2O10 1000 mg/L
烟酸 C6H5NO2 1000 mg/L
盐酸硫胺素 C12H17ClN4OS·HCl 1000 mg/L
盐酸吡哆醇 C8H11NO3·HCl 1000 mg/L
对氨基苯甲酸 C7H7NO2 200 mg/L
肌醇 C6H12O6 25000 mg/L
表5-发酵进料培养基
组分 式 浓度 单位
一水葡萄糖 C6H12O6*H2O 660 g/L
尿素(仅在尿素处理中) NH2CONH2 33 g/L
消泡剂 1.3 g/L
硫酸钾 K2SO4 4.2 g/L
硫酸钠 Na2SO4 0.336 g/L
七水硫酸镁 MgSO4*7H2O 6.12 g/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 10.8 g/L
痕量金属原液 14.4 mL/L
维生素原液 14.4 mL/L
基于所利用的总葡萄糖计算Reb DM相对于葡萄糖的产率。Reb DM相对于生物质的产率基于细胞干重。Reb DM生产率基于合计Reb D和Reb M浓度并除以最终发酵时间来计算，所述最终发酵时间确定为进料培养基耗尽的时间。细胞干重的生物质测定基于本领域中常见的过滤/烘箱方法。甜菊醇糖苷的定量可通过如下所述的高效液相色谱(HPLC)分析进行，并且与使用购自Chromadex的真实标准物而获得的校准曲线进行比较。
将100μL发酵培养基移取到2mL微量离心管中。将900μL的61％甲醇(提取溶剂)添加到2ml微量离心管中，并且通过置于样品旋转器上搅拌10分钟以提取甜菊醇糖苷。然后将样品在微型离心机中以10K rpm离心3min，并且将澄清的上清液移取到自动进样器小瓶中进行分析。
用于糖苷分离的UHPLC方法
使用串联的两个Agilent SB-C18 RRHD柱(2.1mm x 150mm，1.8um)与来自Optimize Technologies的安装为柱前过滤器的杆过滤器组件来分离甜菊醇糖苷。所使用的流动相是通道A：0.01％三氟乙酸(TFA)的水溶液以及通道B乙腈。流速为0.38mL/min，柱温为65℃，并且在210nm的紫外吸收下进行检测。梯度洗脱概况如下所示：
使用来自Cargill，Inc批1008-005的Reb A(98.85％纯度)的55％MeOH溶液以以下浓度进行校准：0.35、0.175、0.07、0.035、0.014、0.007mg/mL。所有糖苷均在Reb A曲线上进行定量。相对于Reb A测定Reb D、Reb M和Reb B的实验校正因子，而所有其他分析物通过分子量校正。附上典型发酵液的实例。
表6a和6b-用NH4OH和较高pH设定点进行的菌株B的SG生产
表6b
在表6a和6b中，Reb DM相对于葡萄糖的产率％＝Reb DM(g/L)/所消耗的葡萄糖(g/L)*100。Reb DM相对于生物质的产率％＝Reb DM(g/L)/所产生的生物质(g细胞干重(CDW或DCW))/L*100。Reb D和Reb M滴度最初以g/L测量。与对照的比较是处理值除以对照值*100％。例如，处理的Reb D(g/L)除以对照的Reb D*100％等于对照的％。
表7a和7b-用NH4OH和高pH设定点进行的菌株C的SG生产
表7B
表8a和8b-用尿素和较高pH进行的菌株B的SG生产
工程化酵母在较高pH下的发酵提供了增加的滴度、生产速率和产率，以及增加的甜菊醇糖苷Reb D和Reb M的特定比率。较高pH的发酵还提供增加的Reb D：Reb M比率。在较高的pH条件下，在多种菌株的情况下观察到Reb D和Reb M的滴度增加。
实施例2
较高pH下的分批进料发酵中Reb D和Reb M的生产
在2L(工作容积)发酵罐中有氧地进行分批进料发酵。使用在相同培养基中生长的接种培养物接种500mL初始矿物培养基(表9)以达到0.2的初始OD。培养以分批模式进行18小时，然后在～110小时期间使用4阶段指数进料曲线和表2中所描述的进料培养基以分批进料模式操作。利用葡萄糖作为碳源和能量源，并且通过控制流速来限制其浓度，以便允许完全呼吸代谢(使乙醇形成最小化)。在整个过程期间，气流保持在～1vvm，并且在前42小时期间将搅拌设定为800rpm，然后在剩余的过程中将其增加并保持在1200rpm。在整个发酵过程中温度控制在30℃。
在默认的发酵设置中，在前42小时期间使用8％NH4OH将pH控制在pH 5.0，然后在剩余的过程中换为16％NH4OH。
在一组处理中，在前42小时期间使用8％NH4OH将发酵初始控制在pH 5.0，然后用16％NH4OH以5h的时间间隔升高至pH 6.0(每小时增加0.2个pH单位)，直到过程结束。参见表13中所示的结果。在第二组处理中，在前42小时期间使用NH4OH在整个过程中将发酵的pH控制在pH 6.0，并且从所述时刻开始就使用16％NH4OH。参见表14中所示的结果。
在上述条件的所有组中，采用700mL的进料培养基。
取完整的培养物样品(不去除细胞)并在等体积的DMSO中煮沸以获得Reb D和RebM水平，如实施例1中所述。
表9-初始矿物发酵培养基
表10-发酵进料培养基
表11-痕量金属储备溶液
表12-维生素储备溶液
表13中示出在pH 5.0(对照)相对于高pH下使用酵母菌株E进行的发酵的结果概述。呈现针对总发酵液样品中测量的所有甜菊醇糖苷的归一化结果。
表13
表14中示出在pH 5.0(对照)相对于高pH下使用酵母菌株D进行的发酵的结果概述。下表中呈现针对总发酵液样品中测量的所有甜菊醇糖苷的归一化结果。
表14
在这个实例中，所有的发酵实耗时间都是相等的，并且进料底物(葡萄糖)的量在所有情况下都是相同的。因此，自分批阶段开始时或自前42小时之后进行升高时在pH 6.0下操作发酵过程使得Reb D和M的滴度在另外的菌株的情况下增加，相对于葡萄糖的产率增加，并且生产率增加。
序列表
<110> 嘉吉公司
埃沃尔瓦公司
<120> 用于使用高pH生产甜菊醇糖苷的发酵方法和由此获得的组合物
<130> CAR0210/WO
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 460
<212> PRT
<213> Stevia rebaudiana
<400> 1
Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys
20 25 30
Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His
35 40 45
Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile
50 55 60
Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser
65 70 75 80
Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser
85 90 95
Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp
100 105 110
Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile
115 120 125
Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val
130 135 140
Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu
145 150 155 160
Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu
165 170 175
Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser
180 185 190
Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val
195 200 205
Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr
210 215 220
Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met
225 230 235 240
Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu
245 250 255
Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro
260 265 270
Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly
275 280 285
Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val
290 295 300
Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu
305 310 315 320
Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp
325 330 335
Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val
340 345 350
Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val
355 360 365
Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys
370 375 380
Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu
385 390 395 400
Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile
405 410 415
Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp
420 425 430
Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn
435 440 445
Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala
450 455 460
<210> 2
<211> 481
<212> PRT
<213> Stevia rebaudiana
<400> 2
Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile
1 5 10 15
Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe
35 40 45
Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly
50 55 60
Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser
65 70 75 80
Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu
85 90 95
Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp
100 105 110
Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile
115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu
130 135 140
Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu
145 150 155 160
Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr
165 170 175
Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu
180 185 190
Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu
195 200 205
Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His
210 215 220
Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu
225 230 235 240
Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu
245 250 255
Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu
260 265 270
His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu
275 280 285
Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr
290 295 300
Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala
305 310 315 320
Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile
325 330 335
Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys
340 345 350
Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His
355 360 365
Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile
370 375 380
Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp
385 390 395 400
Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly
405 410 415
Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val
420 425 430
Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys
435 440 445
Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg
465 470 475 480
Asn
<210> 3
<211> 458
<212> PRT
<213> Stevia rebaudiana
<400> 3
Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile
1 5 10 15
Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu
20 25 30
Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr
35 40 45
Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg
50 55 60
Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro
65 70 75 80
Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His
85 90 95
Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser
100 105 110
Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr
115 120 125
Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu
130 135 140
Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln
145 150 155 160
Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu
165 170 175
Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser
180 185 190
Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile
195 200 205
Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
245 250 255
Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro
260 265 270
Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp
275 280 285
Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln
290 295 300
Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp
305 310 315 320
Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val
325 330 335
Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala
340 345 350
Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu
355 360 365
Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn
370 375 380
Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn
385 390 395 400
Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val
405 410 415
Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln
420 425 430
Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu
435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu
450 455
<210> 4
<211> 473
<212> PRT
<213> Stevia rebaudiana
<400> 4
Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val
1 5 10 15
Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln
20 25 30
Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser
35 40 45
Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile
50 55 60
Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp
65 70 75 80
Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys
85 90 95
Lys Ala Ser Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln
100 105 110
His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro
115 120 125
Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr
130 135 140
Thr Pro Trp Ala Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile
145 150 155 160
Asn Gly Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Lys Trp Phe Pro Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu
180 185 190
Ala Arg Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg
195 200 205
Met Gly Met Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr
210 215 220
His Glu Phe Gly Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln
225 230 235 240
Val Pro Val Val Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp
245 250 255
Glu Lys Asp Glu Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys
260 265 270
Gln Lys Gly Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Ala Leu Val
275 280 285
Ser Gln Thr Glu Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly
290 295 300
Leu Pro Phe Val Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser
305 310 315 320
Asp Ser Val Glu Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg
325 330 335
Gly Leu Val Trp Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His
340 345 350
Glu Ser Val Cys Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val
355 360 365
Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly
370 375 380
Asp Gln Pro Leu Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile
385 390 395 400
Glu Ile Pro Arg Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val
405 410 415
Ala Arg Ser Leu Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr
420 425 430
Lys Ala Asn Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val
435 440 445
Glu Lys Glu Tyr Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala
450 455 460
Arg Ala Val Ala Ile Asp His Glu Ser
465 470
<210> 5
<211> 1422
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 5
atggctactt ctgattccat cgttgacgat agaaagcaat tgcatgttgc tacttttcca 60
tggttggctt tcggtcatat tttgccatac ttgcaattgt ccaagttgat tgctgaaaag 120
ggtcacaagg tttcattctt gtctaccacc agaaacatcc aaagattgtc ctctcatatc 180
tccccattga tcaacgttgt tcaattgact ttgccaagag tccaagaatt gccagaagat 240
gctgaagcta ctactgatgt tcatccagaa gatatccctt acttgaaaaa ggcttccgat 300
ggtttacaac cagaagttac tagattcttg gaacaacatt ccccagattg gatcatctac 360
gattatactc attactggtt gccatccatt gctgcttcat tgggtatttc tagagcccat 420
ttctctgtta ctactccatg ggctattgct tatatgggtc catctgctga tgctatgatt 480
aacggttctg atggtagaac taccgttgaa gatttgacta ctccaccaaa gtggtttcca 540
tttccaacaa aagtctgttg gagaaaacac gatttggcta gattggttcc atacaaagct 600
ccaggtattt ctgatggtta cagaatgggt atggttttga aaggttccga ttgcttgttg 660
tctaagtgct atcatgaatt cggtactcaa tggttgcctt tgttggaaac attgcatcaa 720
gttccagttg ttccagtagg tttgttgcca ccagaaattc caggtgacga aaaagacgaa 780
acttgggttt ccatcaaaaa gtggttggat ggtaagcaaa agggttctgt tgtttatgtt 840
gctttgggtt ccgaagcttt ggtttctcaa accgaagttg ttgaattggc tttgggtttg 900
gaattgtctg gtttgccatt tgtttgggct tacagaaaac ctaaaggtcc agctaagtct 960
gattctgttg aattgccaga tggtttcgtt gaaagaacta gagatagagg tttggtttgg 1020
acttcttggg ctccacaatt gagaattttg tctcatgaat ccgtctgtgg tttcttgact 1080
cattgtggtt ctggttctat cgttgaaggt ttgatgtttg gtcacccatt gattatgttg 1140
ccaatctttg gtgaccaacc attgaacgct agattattgg aagataagca agtcggtatc 1200
gaaatcccaa gaaatgaaga agatggttgc ttgaccaaag aatctgttgc tagatctttg 1260
agatccgttg tcgttgaaaa agaaggtgaa atctacaagg ctaacgctag agaattgtcc 1320
aagatctaca acgataccaa ggtcgaaaaa gaatacgttt cccaattcgt tgactacttg 1380
gaaaagaatg ctagagctgt tgccattgat catgaatctt ga 1422
<210> 6
<211> 297
<212> PRT
<213> Synechococcus sp.
<400> 6
Met Val Ala Gln Thr Phe Asn Leu Asp Thr Tyr Leu Ser Gln Arg Gln
1 5 10 15
Gln Gln Val Glu Glu Ala Leu Ser Ala Ala Leu Val Pro Ala Tyr Pro
20 25 30
Glu Arg Ile Tyr Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys
35 40 45
Arg Leu Arg Pro Ile Leu Cys Leu Ala Ala Cys Glu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Ser Val Glu Gln Ala Met Pro Thr Ala Cys Ala Leu Glu Met Ile His
65 70 75 80
Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asn Asp Asp
85 90 95
Phe Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Asp Ile
100 105 110
Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Leu Ala Tyr Ala Phe Glu His Ile
115 120 125
Ala Ser Gln Thr Arg Gly Val Pro Pro Gln Leu Val Leu Gln Val Ile
130 135 140
Ala Arg Ile Gly His Ala Val Ala Ala Thr Gly Leu Val Gly Gly Gln
145 150 155 160
Val Val Asp Leu Glu Ser Glu Gly Lys Ala Ile Ser Leu Glu Thr Leu
165 170 175
Glu Tyr Ile His Ser His Lys Thr Gly Ala Leu Leu Glu Ala Ser Val
180 185 190
Val Ser Gly Gly Ile Leu Ala Gly Ala Asp Glu Glu Leu Leu Ala Arg
195 200 205
Leu Ser His Tyr Ala Arg Asp Ile Gly Leu Ala Phe Gln Ile Val Asp
210 215 220
Asp Ile Leu Asp Val Thr Ala Thr Ser Glu Gln Leu Gly Lys Thr Ala
225 230 235 240
Gly Lys Asp Gln Ala Ala Ala Lys Ala Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Gly
245 250 255
Leu Glu Ala Ser Arg Gln Lys Ala Glu Glu Leu Ile Gln Ser Ala Lys
260 265 270
Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Gly Ser Gln Ala Glu Pro Leu Leu Ala Leu
275 280 285
Ala Asp Phe Ile Thr Arg Arg Gln His
290 295
<210> 7
<211> 827
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 7
Met Val Leu Ser Ser Ser Cys Thr Thr Val Pro His Leu Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Gln Leu Gly Pro Trp Ser Ser Arg Ile Lys Lys Lys Thr
20 25 30
Asp Thr Val Ala Val Pro Ala Ala Ala Gly Arg Trp Arg Arg Ala Leu
35 40 45
Ala Arg Ala Gln His Thr Ser Glu Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly Ser
50 55 60
Ser Leu Thr Pro Ile Val Arg Thr Asp Ala Glu Ser Arg Arg Thr Arg
65 70 75 80
Trp Pro Thr Asp Asp Asp Asp Ala Glu Pro Leu Val Asp Glu Ile Arg
85 90 95
Ala Met Leu Thr Ser Met Ser Asp Gly Asp Ile Ser Val Ser Ala Tyr
100 105 110
Asp Thr Ala Trp Val Gly Leu Val Pro Arg Leu Asp Gly Gly Glu Gly
115 120 125
Pro Gln Phe Pro Ala Ala Val Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gln Leu Pro
130 135 140
Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Ala Leu Phe Ser Ala Tyr Asp Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Thr Leu Thr Arg Trp Ser Leu Glu
165 170 175
Pro Glu Met Arg Gly Arg Gly Leu Ser Phe Leu Gly Arg Asn Met Trp
180 185 190
Lys Leu Ala Thr Glu Asp Glu Glu Ser Met Pro Ile Gly Phe Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Pro Ser Leu Ile Glu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Val His Asp
210 215 220
Phe Pro Tyr Asp His Gln Ala Leu Gln Gly Ile Tyr Ser Ser Arg Glu
225 230 235 240
Ile Lys Met Lys Arg Ile Pro Lys Glu Val Met His Thr Val Pro Thr
245 250 255
Ser Ile Leu His Ser Leu Glu Gly Met Pro Gly Leu Asp Trp Ala Lys
260 265 270
Leu Leu Lys Leu Gln Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ala
275 280 285
Ala Thr Ala Tyr Ala Leu Met Asn Thr Gly Asp Asp Arg Cys Phe Ser
290 295 300
Tyr Ile Asp Arg Thr Val Lys Lys Phe Asn Gly Gly Val Pro Asn Val
305 310 315 320
Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ala Val Asp Arg Leu Glu
325 330 335
Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Gln Lys Glu Ile Glu Gln Cys Met
340 345 350
Asp Tyr Val Asn Arg His Trp Thr Glu Asp Gly Ile Cys Trp Ala Arg
355 360 365
Asn Ser Asp Val Lys Glu Val Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu
370 375 380
Leu Arg Leu His Gly Tyr Ser Val Ser Pro Asp Val Phe Lys Asn Phe
385 390 395 400
Glu Lys Asp Gly Glu Phe Phe Ala Phe Val Gly Gln Ser Asn Gln Ala
405 410 415
Val Thr Gly Met Tyr Asn Leu Asn Arg Ala Ser Gln Ile Ser Phe Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Val Leu His Arg Ala Gly Ala Phe Ser Tyr Glu Phe Leu
435 440 445
Arg Arg Lys Glu Ala Glu Gly Ala Leu Arg Asp Lys Trp Ile Ile Ser
450 455 460
Lys Asp Leu Pro Gly Glu Val Val Tyr Thr Leu Asp Phe Pro Trp Tyr
465 470 475 480
Gly Asn Leu Pro Arg Val Glu Ala Arg Asp Tyr Leu Glu Gln Tyr Gly
485 490 495
Gly Gly Asp Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr Arg Met Pro Leu
500 505 510
Val Asn Asn Asp Val Tyr Leu Glu Leu Ala Arg Met Asp Phe Asn His
515 520 525
Cys Gln Ala Leu His Gln Leu Glu Trp Gln Gly Leu Lys Arg Trp Tyr
530 535 540
Thr Glu Asn Arg Leu Met Asp Phe Gly Val Ala Gln Glu Asp Ala Leu
545 550 555 560
Arg Ala Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ser Val Tyr Glu Pro Cys Arg Ala
565 570 575
Ala Glu Arg Leu Ala Trp Ala Arg Ala Ala Ile Leu Ala Asn Ala Val
580 585 590
Ser Thr His Leu Arg Asn Ser Pro Ser Phe Arg Glu Arg Leu Glu His
595 600 605
Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Glu Glu Thr Asp Gly Ser Trp Phe Asn
610 615 620
Ser Ser Ser Gly Ser Asp Ala Val Leu Val Lys Ala Val Leu Arg Leu
625 630 635 640
Thr Asp Ser Leu Ala Arg Glu Ala Gln Pro Ile His Gly Gly Asp Pro
645 650 655
Glu Asp Ile Ile His Lys Leu Leu Arg Ser Ala Trp Ala Glu Trp Val
660 665 670
Arg Glu Lys Ala Asp Ala Ala Asp Ser Val Cys Asn Gly Ser Ser Ala
675 680 685
Val Glu Gln Glu Gly Ser Arg Met Val His Asp Lys Gln Thr Cys Leu
690 695 700
Leu Leu Ala Arg Met Ile Glu Ile Ser Ala Gly Arg Ala Ala Gly Glu
705 710 715 720
Ala Ala Ser Glu Asp Gly Asp Arg Arg Ile Ile Gln Leu Thr Gly Ser
725 730 735
Ile Cys Asp Ser Leu Lys Gln Lys Met Leu Val Ser Gln Asp Pro Glu
740 745 750
Lys Asn Glu Glu Met Met Ser His Val Asp Asp Glu Leu Lys Leu Arg
755 760 765
Ile Arg Glu Phe Val Gln Tyr Leu Leu Arg Leu Gly Glu Lys Lys Thr
770 775 780
Gly Ser Ser Glu Thr Arg Gln Thr Phe Leu Ser Ile Val Lys Ser Cys
785 790 795 800
Tyr Tyr Ala Ala His Cys Pro Pro His Val Val Asp Arg His Ile Ser
805 810 815
Arg Val Ile Phe Glu Pro Val Ser Ala Ala Lys
820 825
<210> 8
<211> 785
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 8
Met Ser Ile Asn Leu Arg Ser Ser Gly Cys Ser Ser Pro Ile Ser Ala
1 5 10 15
Thr Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ser Glu Val Gln Thr Arg Ala Asn Asn
20 25 30
Val Ser Phe Glu Gln Thr Lys Glu Lys Ile Arg Lys Met Leu Glu Lys
35 40 45
Val Glu Leu Ser Val Ser Ala Tyr Asp Thr Ser Trp Val Ala Met Val
50 55 60
Pro Ser Pro Ser Ser Gln Asn Ala Pro Leu Phe Pro Gln Cys Val Lys
65 70 75 80
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1 5 10 15
Tyr Leu Phe Thr Thr Gln Leu Arg Arg Lys Ser Ala Asn Leu Pro Pro
20 25 30
Thr Val Phe Pro Ser Ile Pro Ile Ile Gly His Leu Tyr Leu Leu Lys
35 40 45
Lys Pro Leu Tyr Arg Thr Leu Ala Lys Ile Ala Ala Lys Tyr Gly Pro
50 55 60
Ile Leu Gln Leu Gln Leu Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ile Ser Ser
65 70 75 80
Pro Ser Ala Ala Glu Glu Cys Phe Thr Asn Asn Asp Val Ile Phe Ala
85 90 95
Asn Arg Pro Lys Thr Leu Phe Gly Lys Ile Val Gly Gly Thr Ser Leu
100 105 110
Gly Ser Leu Ser Tyr Gly Asp Gln Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala
115 120 125
Ser Ile Glu Ile Leu Ser Val His Arg Leu Asn Glu Phe His Asp Ile
130 135 140
Arg Val Asp Glu Asn Arg Leu Leu Ile Arg Lys Leu Arg Ser Ser Ser
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Ser Pro Val Thr Leu Ile Thr Val Phe Tyr Ala Leu Thr Leu Asn Val
165 170 175
Ile Met Arg Met Ile Ser Gly Lys Arg Tyr Phe Asp Ser Gly Asp Arg
180 185 190
Glu Leu Glu Glu Glu Gly Lys Arg Phe Arg Glu Ile Leu Asp Glu Thr
195 200 205
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Asn Trp Leu Gly Val Lys Ser Leu Glu Lys Lys Leu Ile Ala Leu Gln
225 230 235 240
Lys Lys Arg Asp Asp Phe Phe Gln Gly Leu Ile Glu Gln Val Arg Lys
245 250 255
Ser Arg Gly Ala Lys Val Gly Lys Gly Arg Lys Thr Met Ile Glu Leu
260 265 270
Leu Leu Ser Leu Gln Glu Ser Glu Pro Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala Met
275 280 285
Ile Arg Ser Phe Val Leu Gly Leu Leu Ala Ala Gly Ser Asp Thr Ser
290 295 300
Ala Gly Thr Met Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Val Asn His Pro His
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Val Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Arg Val Ile Gly Asn Asn
325 330 335
Arg Leu Ile Asp Glu Ser Asp Ile Gly Asn Ile Pro Tyr Ile Gly Cys
340 345 350
Ile Ile Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Gly Pro Leu Leu Phe
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405 410 415
Leu Glu Gly Thr Arg Asp Gly Phe Lys Leu Met Pro Phe Gly Ser Gly
420 425 430
Arg Arg Gly Cys Pro Gly Glu Gly Leu Ala Ile Arg Leu Leu Gly Met
435 440 445
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450 455 460
Glu Met Val Asp Met Thr Glu Gly Leu Gly Val Thr Leu Pro Lys Ala
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Val Pro Leu Val Ala Lys Cys Lys Pro Arg Ser Glu Met Thr Asn Leu
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Leu Ser Glu Leu
500
<210> 16
<211> 2124
<212> DNA
<213> Stevia rebaudiana
<400> 16
atgcaatcta actccgtgaa gatttcgccg cttgatctgg taactgcgct gtttagcggc 60
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<212> PRT
<213> Stevia rebaudiana
<400> 17
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<213> Artificial Sequence
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<223> Codon optimized
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<210> 19
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<212> PRT
<213> Stevia rebaudiana
<400> 19
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Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Ser Leu Ala
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Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala
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Ala Asn Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asp Asp Lys Gly Glu Trp
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Leu Lys Lys Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln Tyr
195 200 205
Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Ile Val Val Asp Asp Lys Leu Thr Glu
210 215 220
Met Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln
225 230 235 240
Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Lys Glu Leu Val Trp Pro Glu
245 250 255
Leu Asp Gln Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Thr Ser Val Thr Thr Pro
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Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Val Tyr His Asp Lys Pro
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Ala Asp Ser Tyr Ala Glu Asp Gln Thr His Thr Asn Gly His Val Val
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Leu His Thr Ser Gln Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp
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Ile Ser His Thr Gly Leu Ser Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val
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<212> PRT
<213> Rubus suavissimus
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275 280 285
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<213> Rubus suavissimus
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130 135 140
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245 250 255
Lys Met Asn Lys Arg Met Asn Glu Ile Asn Glu Glu Ile Lys Gly Leu
260 265 270
Ile Arg Gly Ile Ile Ile Asp Arg Glu Gln Ile Ile Lys Ala Gly Glu
275 280 285
Glu Thr Asn Asp Asp Leu Leu Gly Ala Leu Met Glu Ser Asn Leu Lys
290 295 300
Asp Ile Arg Glu His Gly Lys Asn Asn Lys Asn Val Gly Met Ser Ile
305 310 315 320
Glu Asp Val Ile Gln Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Phe Ala Gly Gln Glu
325 330 335
Thr Thr Ser Val Leu Leu Ala Trp Thr Met Val Leu Leu Gly Gln Asn
340 345 350
Gln Asn Trp Gln Asp Arg Ala Arg Gln Glu Val Leu Gln Val Phe Gly
355 360 365
Ser Ser Lys Pro Asp Phe Asp Gly Leu Ala His Leu Lys Val Val Thr
370 375 380
Met Ile Leu Leu Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Val Ile Glu Leu
385 390 395 400
Ile Arg Thr Ile His Lys Lys Thr Gln Leu Gly Lys Leu Ser Leu Pro
405 410 415
Glu Gly Val Glu Val Arg Leu Pro Thr Leu Leu Ile His His Asp Lys
420 425 430
Glu Leu Trp Gly Asp Asp Ala Asn Gln Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ser
435 440 445
Glu Gly Val Ser Lys Ala Thr Lys Asn Arg Leu Ser Phe Phe Pro Phe
450 455 460
Gly Ala Gly Pro Arg Ile Cys Ile Gly Gln Asn Phe Ser Met Met Glu
465 470 475 480
Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Gln His Phe Thr Phe Glu Leu
485 490 495
Ser Pro Ser His Ala His Ala Pro Ser His Arg Ile Thr Leu Gln Pro
500 505 510
Gln Tyr Gly Val Arg Ile Ile Leu His Arg Arg
515 520
<210> 22
<211> 701
<212> PRT
<213> Siraitia grosvenorii
<400> 22
Met Lys Val Ser Pro Phe Glu Phe Met Ser Ala Ile Ile Lys Gly Arg
1 5 10 15
Met Asp Pro Ser Asn Ser Ser Phe Glu Ser Thr Gly Glu Val Ala Ser
20 25 30
Val Ile Phe Glu Asn Arg Glu Leu Val Ala Ile Leu Thr Thr Ser Ile
35 40 45
Ala Val Met Ile Gly Cys Phe Val Val Leu Met Trp Arg Arg Ala Gly
50 55 60
Ser Arg Lys Val Lys Asn Val Glu Leu Pro Lys Pro Leu Ile Val His
65 70 75 80
Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Asp Gly Lys Lys Lys Val Ser Ile Phe
85 90 95
Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala
100 105 110
Asp Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Arg Val Val Asp
115 120 125
Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Asp Gln Tyr Glu Glu Lys Leu Lys
130 135 140
Asn Glu Ser Phe Ala Val Phe Leu Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu
145 150 155 160
Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Ala Glu Gly Lys
165 170 175
Glu Arg Gly Glu Trp Leu Gln Asn Leu His Tyr Ala Val Phe Gly Leu
180 185 190
Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Val Ala Asp
195 200 205
Glu Leu Leu Glu Ala Gln Gly Gly Asn Arg Leu Val Lys Val Gly Leu
210 215 220
Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Ser Ala Trp Arg Glu
225 230 235 240
Ser Leu Trp Pro Glu Leu Asp Met Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Ala
245 250 255
Thr Thr Val Thr Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val
260 265 270
Val Phe His Asp Ser Ala Asp Val Ala Ala Glu Asp Lys Ser Trp Ile
275 280 285
Asn Ala Asn Gly His Ala Val His Asp Ala Gln His Pro Phe Arg Ser
290 295 300
Asn Val Val Val Arg Lys Glu Leu His Thr Ser Ala Ser Asp Arg Ser
305 310 315 320
Cys Ser His Leu Glu Phe Asn Ile Ser Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Glu
325 330 335
Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Cys Glu Asn Leu Thr Glu Thr Val
340 345 350
Asp Glu Ala Leu Asn Leu Leu Gly Leu Ser Pro Glu Thr Tyr Phe Ser
355 360 365
Ile Tyr Thr Asp Asn Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu
370 375 380
Pro Pro Pro Phe Pro Ser Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr
385 390 395 400
Ala Asp Leu Leu Asn Ser Pro Lys Lys Ser Ala Leu Leu Ala Leu Ala
405 410 415
Ala His Ala Ser Asn Pro Val Glu Ala Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Ala
420 425 430
Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Gln Ser Val Ile Gly Ser Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro
450 455 460
Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe
465 470 475 480
Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val
485 490 495
Thr Cys Ala Leu Val Tyr Asp Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys
500 505 510
Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ser Val Pro Met Glu Lys Ser
515 520 525
His Glu Cys Ser Trp Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys
530 535 540
Leu Pro Ala Glu Ser Lys Val Pro Ile Ile Met Val Gly Pro Gly Thr
545 550 555 560
Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys
565 570 575
Glu Ser Gly Val Glu Leu Gly Pro Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg
580 585 590
Asn Arg Arg Met Asp Tyr Ile Tyr Glu Asp Glu Leu Asn Asn Phe Val
595 600 605
Glu Thr Gly Ala Leu Ser Glu Leu Val Ile Ala Phe Ser Arg Glu Gly
610 615 620
Pro Thr Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Ala Glu Lys Ala Ser Asp
625 630 635 640
Ile Trp Asn Leu Ile Ser Glu Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp
645 650 655
Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Met
660 665 670
Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp Ser Ser Lys Ala Glu Ser Met Val Lys
675 680 685
Asn Leu Gln Met Asn Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp
690 695 700

Claims (68)

1.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：
在5.8或更大的pH下用工程化酵母对发酵培养基进行发酵，其中所述工程化酵母产生一种或多种甜菊醇糖苷；其中所述一种或多种甜菊醇糖苷包含莱苞迪苷D、莱苞迪苷M或D:M比率为1:20或更大的莱苞迪苷DM。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述pH在5.8至8的范围内。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述pH在6.0至7.5的范围内。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述pH在6.5至7.5的范围内。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述pH在5.8至6.5的范围内。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述pH在5.8至6.2的范围内。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基包含选自氢氧化铵、酵母提取物、尿素和硫酸铵的氮源。
8.如权利要求7所述的方法，其中氢氧化铵或尿素是所述工程化酵母在所述培养基中发酵的所述氮源的90％(重量)或更大、或者95％(重量)或更大。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含葡萄糖、氮源、钾源、镁源、磷源、镁源、痕量金属、维生素和消泡剂。
10.如权利要求1所述的方法，其还包括将另外的发酵物质连续或分批地添加到包含所述工程化酵母的所述培养基。
11.如权利要求1所述的方法，其进行多至150小时的时间段。
12.如权利要求11所述的方法，其进行8至88小时范围内的时间段。
13.如权利要求12所述的方法，其进行22至48小时范围内的时间段。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基的生物质在20-120g dcw/L的范围内。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述工程化酵母产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量比工程化酵母在整个发酵过程中保持在第一pH下时所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量大10％或更大。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述工程化酵母产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量比工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量大20％或更大。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述工程化酵母在5.8或更大的所述pH下产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率大于工程化酵母在整个发酵过程中保持在第一pH下时所产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率。
18.如权利要求1所述的方法，其中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的所述比率在1:20至1:1的范围内。
19.如权利要求1所述的方法，其还包括在第一pH的第一培养基中生长所述工程化酵母，其中所述第一pH与所述发酵培养基的所述pH相同。
20.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：
(a)在第一pH的第一培养基中生长工程化酵母，其中所述工程化酵母能够产生一种或多种甜菊醇糖苷；
(b)将组合物添加到所述第一培养基以提供具有大于所述第一pH的第二pH的第二培养基；以及
(c)在所述第二pH的所述第二培养基中用所述工程化酵母发酵第二培养基以产生所述一种或多种甜菊醇糖苷。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一pH小于5.8。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述第一pH在4.0至5.5的范围内。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述第二pH大于5.0。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述第二pH在5.8至8的范围内。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述第二pH在5.8至7.5的范围内。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述pH在6.5至7.5的范围内。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述pH在5.8至6.5的范围内。
28.如权利要求21所述的方法，其中所述pH在5.8至6.2的范围内。
29.如权利要求20所述的方法，其中所述组合物包含调节所述第二pH的碱。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述碱包括含氮化合物，其选自由氢氧化铵、酵母提取物、尿素和硫酸铵组成的组。
31.如权利要求20所述的方法，其中氢氧化铵、酵母提取物、尿素或硫酸铵是所述工程化酵母在所述培养基中发酵的主要氮源。
32.如权利要求31所述的方法，其中氢氧化铵或尿素是所述工程化酵母在所述第二培养基中发酵的所述氮源的90％(重量)或更大、或者95％(重量)或更大。
33.如权利要求20所述的方法，其中在步骤(b)中，所述组合物包含非氮碱。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述非氮碱选自由氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化钙组成的组。
35.如权利要求29所述的方法，其中氢氧化铵、尿素或硫酸铵是所述工程化酵母在所述第二培养基中发酵的所述氮源的90％(重量)或更大、或者95％(重量)或更大。
36.如权利要求20所述的方法，其中在步骤(a)中，所述第一培养基包含氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合，并且在步骤(b)中，所述第二pH通过将包含氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合以及任选的非氮碱的所述组合物添加到所述第一培养基来实现。
37.如权利要求20所述的方法，其中所述第一培养基包含浓度不大于25g/L的葡萄糖。
38.如权利要求20所述的方法，其中所述第一培养基包含葡萄糖、除氢氧化铵或尿素之外的氮源、钾源、镁源、痕量金属和维生素。
39.如权利要求20所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二培养基包含浓度在400g/L至750g/L范围内的葡萄糖。
40.如权利要求20所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二培养基包含葡萄糖、氮源、钾源、镁源、磷源、镁源、痕量金属、维生素和消泡剂。
41.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)包括将另外的发酵物质连续或分批地添加到包含所述工程化酵母的所述第二培养基。
42.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)在自所述工程化酵母的初始培养起2小时或更迟的时候进行。
43.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)进行多至自所述工程化酵母的初始培养起150小时的时间。
44.如权利要求42所述的方法，其中步骤(b)在自所述工程化酵母的初始培养起10小时或更迟的时候进行，并且进行多至自所述初始培养起96小时的时候。
45.如权利要求42所述的方法，其中步骤(b)在自所述工程化酵母的初始培养起24小时或更迟的时候进行，并且进行多至自所述初始培养起72小时的时候。
46.如权利要求20所述的方法，其中所述工程化酵母在所述第二pH下在步骤(b)中产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量比工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量大10％或更大。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述工程化酵母在所述第二pH下在步骤(b)中产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量比工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量大20％或更大。
48.如权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷包含莱苞迪苷M、莱苞迪苷D或莱苞迪苷M和莱苞迪苷D两者。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述工程化酵母在所述第二pH下在步骤(b)中产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率大于工程化酵母在整个发酵过程中保持在所述第一pH下时所产生的莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的比率。
50.如权利要求47所述的方法，其中步骤(b)中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的所述比率为1:20或更大。
51.如权利要求49所述的方法，其中步骤(b)中莱苞迪苷D与莱苞迪苷M的所述比率在1:20至1:1的范围内。
52.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母来自假丝酵母属、克氏酵母属(有孢汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述工程化酵母是酿酒酵母。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母表达一种或多种外源性核酸，其编码与所述酵母异源的以下蛋白质中的一种或多种：GGPPS多肽，对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽，贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽，贝壳杉烯合酶(KS)多肽，甜菊醇合酶(KAH)多肽，细胞色素P450还原酶(CPR)多肽，UGT74G1多肽，UGT76G1多肽，UGT91-D2多肽，以及EUGT11多肽
55.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母表达一种或多种外源性核酸，其编码与酵母异源的以下蛋白质中的一种或多种：GGPPS多肽(SEQ ID NO：6)，截短的玉米CDPS多肽(SEQ ID NO：7)，拟南芥KS多肽(SEQ ID NO：8)，甜叶菊KO多肽(SEQ ID NO：9)，拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO：11)，稻EUGT 11多肽(SEQ ID NO：13)，SrKAHe1多肽(SEQID NO：14)，甜叶菊CPR8多肽(SEQ ID NO：16)，甜叶菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO：2)，甜叶菊UGT74G1多肽(SEQ ID NO：1)，甜叶菊UGT76G1多肽(SEQ ID NO：3)，甜叶菊UGT91D2(SEQ IDNO：4)变体或功能性同源物，以及UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO:5)。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括提供包含所述工程化酵母的接种培养基的步骤，其中所述接种培养基随后用于形成所述第一pH的所述第一培养基。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(c)在单一容器中进行。
58.如权利要求20-56中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(c)在两个或更多个不同容器中进行。
59.一种用于增加工程化酵母中第一、较低分子量甜菊醇糖苷相对于第二、较高分子量甜菊醇糖苷的生产的方法，所述方法包括在发酵培养基中在5.8或更大的pH下发酵能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母的步骤，其中所述工程化酵母在5.8或更大的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的比率大于在小于5.8的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的比率。
60.如权利要求58所述的方法，其中5.8或更大的pH下的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率比在小于5.8的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率大10％或更大。
61.如权利要求59所述的方法，其中5.8或更大的pH下的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率比在小于5.8的pH下产生的所述第一甜菊醇糖苷和所述第二甜菊醇糖苷的所述比率大25％或更大。
62.如权利要求58所述的方法，其中所述第一甜菊醇糖苷是莱苞迪苷D，并且所述第二甜菊醇糖苷是莱苞迪苷M。
63.一种来源于使用工程酵母来产生所述一种或多种甜菊醇糖苷的发酵方法的组合物，所述组合物包含比率分别为1:20或更大的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
64.如权利要求62所述的组合物，其包含比率分别在1:5至1:1范围内的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
65.如权利要求63所述的组合物，其包含比率分别在1:1.75至1:1范围内的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
66.如权利要求64所述的组合物，其包含比率分别在1:1.5至1:1范围内的莱苞迪苷D和莱苞迪苷M。
67.如权利要求58-65中任一项所述的组合物，其是发酵培养基。
68.如权利要求66所述的组合物，其中所述发酵培养基的莱苞迪苷D浓度为1g/L或更大、1.25g/L或更大、1.5g/L或更大、1.75g/L或更大、或者2.0g/L或更大。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020062437A1 (zh) * 2018-09-29 2020-04-02 四川盈嘉合生科技有限公司 复合甜味剂及其生产方法
US11274328B2 (en) 2018-09-29 2022-03-15 Sichuan Ingia Biosynthetic Co., Ltd. Methods for producing rebaudioside D and rebaudioside M and compositions thereof

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2987630A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Cargill, Incorporated Fermentation methods for producing steviol glycosides with multi-phase feeding
US10612065B2 (en) 2015-05-29 2020-04-07 Cargill, Incorporated Heat treatment to produce glycosides
WO2017024313A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Cargill, Incorporated Fermentation methods for producing steviol glycosides
EP3497222B1 (en) 2016-08-12 2021-12-22 Amyris, Inc. Udp-dependent glycosyltransferase for high efficiency production of rebaudiosides
WO2018114995A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation process for producing steviol glycosides
WO2018144675A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Codexis, Inc. Engineered glycosyltransferases and steviol glycoside glucosylation methods
KR102615573B1 (ko) 2017-02-24 2023-12-20 콘 프로덕츠 디벨롭먼트, 인크. 맥아 제조에 있어서의 스테비올 글리코사이드의 용도
SG11202001058TA (en) 2017-08-11 2020-03-30 Amyris Inc Pisum sativum kaurene oxidase for high efficiency production of rebaudiosides
US11365417B2 (en) 2017-09-12 2022-06-21 Bio Capital Holdings, LLC Biological devices and methods of use thereof to produce steviol glycosides
AU2019312481A1 (en) 2018-07-24 2021-01-21 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycoside aggregates with specific particle size distribution
WO2020081468A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amyris, Inc. Stevia rebaudiana kaurenoic acid hydroxylase variants for high efficiency production of rebaudiosides
CN113631698A (zh) 2019-01-24 2021-11-09 阿迈瑞斯公司 用于高效生成瑞鲍迪苷的abc转运蛋白
EP4007815A1 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Amyris, Inc. Modified host cells for high efficiency production of vanillin
WO2022060867A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Amyris, Inc. Culture compositions and methods of their use for high yield production of vanillin
EP4301866A1 (en) 2021-03-01 2024-01-10 Cargill, Incorporated Xylosylated steviol glycosides and enzymatic methods for production
BR112023018940A2 (pt) 2021-03-19 2023-11-28 Amyris Inc Célula hospedeira geneticamente modificada capaz de produzir vanilina ou glucovanilina, método para produzir vanilina ou glucovanilina, e, vanilina ou glucovanilina

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031283A (zh) * 2011-10-08 2013-04-10 成都华高瑞甜科技有限公司 甜叶菊酶vi及莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的方法
WO2013176738A9 (en) * 2012-05-22 2014-02-06 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
CN104163839A (zh) * 2014-07-04 2014-11-26 苏州景泓生物技术有限公司 一种制备莱鲍迪苷m的工艺方法
WO2015014969A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycosides

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4549598B2 (ja) * 1999-09-30 2010-09-22 コグニス・アイピー・マネージメント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 改良型発酵方法
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
CA2426100A1 (en) 2000-11-03 2002-05-23 Genentech, Inc. Metabolic rate shifts in fermentations expressing recombinant proteins
US7923552B2 (en) 2004-10-18 2011-04-12 SGF Holdings, LLC High yield method of producing pure rebaudioside A
US7923231B2 (en) * 2004-12-17 2011-04-12 Cargill, Incorporated Production of glucuronic acid using myo-inositol oxygenase from cryptococcus neoformans
US8318459B2 (en) 2011-02-17 2012-11-27 Purecircle Usa Glucosyl stevia composition
US8518668B2 (en) 2006-09-27 2013-08-27 Novo Nordisk A/S Method for making maturated insulin polypeptides in a fungal cell
US20110081697A1 (en) 2007-09-27 2011-04-07 Chaogang Liu Progressive Fermentation of Lignocellulosic Biomass
US9005444B2 (en) 2008-05-13 2015-04-14 Cargill, Incorporated Separation of rebaudioside A from stevia glycosides using chromatography
CA2780415C (en) 2009-11-10 2018-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Microbial engineering for the production of chemical and pharmaceutical products from the isoprenoid pathway
WO2011112892A1 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 Purecircle Usa Inc. High-purity steviol glycosides
NZ700097A (en) * 2010-06-02 2015-10-30 Evolva Nutrition Inc Recombinant production of steviol glycosides
US9284570B2 (en) 2010-11-30 2016-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of natural sweeteners, diterpenoid steviol glycosides
WO2012087964A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Codexis, Inc. Gene disruptants producing fatty acyl-coa derivatives
SG10201606563PA (en) 2011-08-08 2016-10-28 Evolva Sa Recombinant production of steviol glycosides
EP3345490B1 (en) 2011-12-19 2023-11-08 The Coca-Cola Company Beverage comprising rebaudioside x
EA201400836A8 (ru) * 2012-01-23 2016-03-31 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Получение дитерпена
US9752174B2 (en) 2013-05-28 2017-09-05 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
MX369525B (es) * 2013-02-06 2019-11-11 Evolva Sa Métodos para mejorar la produccion de rebaudiosido d y rebaudiosido m.
AU2014213918B2 (en) 2013-02-11 2017-11-09 Evolva Sa Efficient production of steviol glycosides in recombinant hosts
US10189892B2 (en) 2013-03-15 2019-01-29 Alderbio Holdings Llc Fermentation process for antibody production
MX2015016379A (es) 2013-05-31 2016-04-13 Dsm Ip Assets Bv Produccion de diterpeno extracelular.
DK3004366T3 (da) 2013-05-31 2019-05-20 Dsm Ip Assets Bv Mikroorganismer til diterpenproduktion
EP3021689B1 (en) 2013-07-15 2021-03-24 DSM IP Assets B.V. Diterpene production
US10273519B2 (en) 2013-07-23 2019-04-30 Dsm Ip Assets B.V. Diterpene production in Yarrowia
WO2015014959A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Dsm Ip Assets B.V. Recovery of steviol glycosides
EP2902481A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-05 Danstar Ferment AG Method for obtaining low ethanol-producing yeast strains, yeast strains obtained therefrom and their use
US20160068870A1 (en) * 2015-03-03 2016-03-10 Edward Brian HAMRICK Methods for fermenting carbohydrate-rich crops
CA2987630A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Cargill, Incorporated Fermentation methods for producing steviol glycosides with multi-phase feeding
US10612065B2 (en) 2015-05-29 2020-04-07 Cargill, Incorporated Heat treatment to produce glycosides
WO2017024313A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Cargill, Incorporated Fermentation methods for producing steviol glycosides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031283A (zh) * 2011-10-08 2013-04-10 成都华高瑞甜科技有限公司 甜叶菊酶vi及莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的方法
WO2013176738A9 (en) * 2012-05-22 2014-02-06 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
WO2015014969A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycosides
CN104163839A (zh) * 2014-07-04 2014-11-26 苏州景泓生物技术有限公司 一种制备莱鲍迪苷m的工艺方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020062437A1 (zh) * 2018-09-29 2020-04-02 四川盈嘉合生科技有限公司 复合甜味剂及其生产方法
US11274328B2 (en) 2018-09-29 2022-03-15 Sichuan Ingia Biosynthetic Co., Ltd. Methods for producing rebaudioside D and rebaudioside M and compositions thereof

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