CN102071241B

CN102071241B - 一种利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物c16,17位脱氢的方法

Info

Publication number: CN102071241B
Application number: CN2010102676237A
Authority: CN
Inventors: 王敏; 孙华; 刘增兵; 付玉婉
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-08-31
Also published as: CN102071241A

Abstract

本发明涉及一种利用球形节杆菌的生物脱氢反应对强心苷苷元类化合物C16，17位进行结构改造的生物学方法。步骤为：将强心苷苷元类化合物为底物，采用球形节杆菌为菌种，经过一级种子培养和二级发酵培养，在菌体发酵液中投入底物进行转化反应，经有机溶剂萃取和硅胶分离与纯化得到C16，17脱氢产物。本发明采用工业微生物球形节杆菌对强心苷苷元类化合物进行生物脱氢转化，高效、专一地在强心苷苷元类化合物母核D环C16，17位点形成新的双键，扩大了球形节杆菌ATCC31250的应用范围，得到新型转化反应和具有新颖结构的强心苷类化合物。

Description

一种利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物C16,17位脱氢的方法

技术领域

本发明属于微生物制药及医药工程领域，是一种利用球形节杆菌(ArthrobacterGlobiformis)ATCC31250生物转化进行强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢的方法。

背景技术

强心苷苷元类化合物的结构比较复杂，含有多个手性中心，用化学方法进行结构修饰选择性差，易发生氧化、环化和聚合等副反应，一些特殊位点的结构改造难以进行，获得结构多样的新化合物的难度大。球形节杆菌ATCC31250是常用于甾体类药物中间体C_1，2脱氢反应的菌株，而球形节杆菌ATCC31250对转化底物甾体类药物中间体在C16，17脱氢的反应还从未发现有相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种目的产物的产量高、副产物少、反应条件温和的利用球形节杆菌生物转化进行甾体类化合物C16，17位脱氢的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢的方法，步骤是：

(1)种子与发酵培养：取球形节杆菌ATCC31250菌种接种于一级种子培养基中，140-180r/min、30-34℃、培养20-30h，得到种子培养液，以5％-10％接种量转接于新鲜的发酵培养基，进行二级发酵培养，得到菌体发酵液；

(2)转化：在菌体发酵液中加入强心苷苷元类化合物，30-35℃，150-200r/min转化70-80h后终止反应；

(3)产物的提取与精制：步骤(2)转化反应结束后，抽滤，分离菌丝体和发酵液，分别用有机溶剂萃取菌丝体和发酵液数次，合并萃取液，干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离得到强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢产物；

所述的球形节杆由美国典型微生物菌种保藏中心保存，编号为：ATCC 31250。

而且，所述一级种子培养基和二级发酵培养采用的培养基组成(g/L)：葡萄糖5-20，玉米浆5-15，蛋白胨2-8，磷酸二氢钾2-5，pH7.0-7.4。

而且，所述强心苷苷元类化合物投入的终浓度为：0.1-1g/L。

而且，所述强心苷苷元类化合物为异羟基洋地黄毒苷元、3-氧代异羟基洋地黄毒苷元或1，2-烯-3-氧代异羟基洋地黄毒苷元之一。

而且，所述强心苷苷元类化合物结构式如下：

其中：

R₁为氧代；H；α或β构型的OH；乙酰基；

R₂为氧代；H；α或β构型的OH；乙酰基；

R₃为α或β构型的H；OH；CH₃；乙酰基；醛基；

R₄为α或β构型的H；OH；CH₃；乙酰基；醛基；

R₅为α或β构型的H；OH；CH₃；乙酰基；醛基；

C₁C₂为CH₂-CH₂；CH＝CH。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明是一种用球形节杆菌ATCC31250对底物强心苷苷元类药物中间体进行生物转化的方法，本方法可在特定的分子部位进行特定的反应，具有目的产物的产量高、副产物少、反应条件温和、无毒、无污染、能耗低等优点。

2、本发明采用工业微生物球形节杆菌ATCC31250对强心苷苷元类化合物进行转化，找到了球形节杆菌ATCC31250的新的作用位点，即C16，17位，得到新型转化反应或新颖的强心苷苷元类化合物。

附图说明

图1-1为本发明异羟基洋地黄毒苷元高分辨质谱；

图1-2为本发明异羟基洋地黄毒苷元的¹H-NMR图谱；

图1-3为本发明异羟基洋地黄毒苷元的¹³C-NMR图谱；

图2-1为本发明3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元高分辨质谱；

图2-2为本发明3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元¹H-NMR谱；

图2-3为本发明3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元¹³C-NMR谱；

图3-1为本发明3-氧代异羟基洋地黄毒苷元高分辨质谱；

图3-2为本发明3-氧代异羟基洋地黄毒苷元¹H-NMR谱；

图3-3为本发明3-氧代异羟基洋地黄毒苷元¹³C-NMR谱；

图4-1为本发明3-氧代-1(2)，16(17)-二烯异羟基洋地黄毒苷元高分辨质谱；

图4-2为本发明3-氧代-1(2)，16(17)-二烯异羟基洋地黄毒苷元¹H-NMR谱；

图4-3为本发明3-氧代-1(2)，16(17)-二烯异羟基洋地黄毒苷元¹³C-NMR谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明的主题构思如下：

一、使用菌种：生产菌种为球形节杆菌ATCC31250，将该生产菌株在琼脂斜面上30-34℃恒温培养1-3天，菌体培养成熟后置于4℃冰箱保藏。

二、培养基：

其斜面培养基(g/L)：葡萄糖5-20，酵母膏5-20，琼脂10-30，pH7.0-7.4；

种子与发酵培养基：(g/L)：葡萄糖5-20，玉米浆5-15，蛋白胨2-8，磷酸二氢钾2-5，pH7.0-7.4。

本发明中采用采用球形节杆菌ATCC 31250转化强心苷苷元类化合物得到C16，17位脱氢产物的转化反应式如图所示。

R₁可以是但不仅限于氧代；H；α或β构型的OH；乙酰基；

R₂可以是但不仅限于氧代；H；α或β构型的OH；乙酰基；

R₃可以是但不仅限于α或β构型的H；OH；CH₃；乙酰基；醛基；

R₄可以是但不仅限于α或β构型的H；OH；CH₃；乙酰基；醛基；

R₅可以是但不仅限于α或β构型的H；OH；CH₃；乙酰基；醛基；

C₁、C₂可以是但不仅限于CH₂-CH₂；CH＝CH。

下面通过具体实施实例进一步描述本发明。

实施例1：

本实施例中强心苷苷元类化合物为异羟基洋地黄毒苷元。

一种利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢的方法，其步骤为：

(1)一级种子培养：将球形节杆菌ATCC31250作为生产菌种从斜面上取菌苔一满环，接种于灭菌后的装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，置旋转式摇床于160r/min，32℃振荡培养22h，得到适于接种的种子培养液；

(2)二级发酵培养基：将种子液按5％体积比接入装有30mL发酵培养基的250mL发酵瓶中，置旋转式摇床于160r/min，32℃培养约24h，得到菌体发酵液；

(3)转化：取下摇瓶，在菌体发酵液中加入用无水乙醇溶解配制的异羟基洋地黄毒苷元溶液100μL(135mmol/L)，继续摇床培养，32℃，180r/min转化72h后终止发酵；

(4)产物的提取与精制：转化结束后，抽滤，分离菌丝体和发酵液，分别用50mL乙酸乙酯萃取菌丝体和发酵液3次，合并萃取液，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离产物，洗脱液为氯仿∶甲醇＝25∶1。

异羟基洋地黄毒苷元转化产物为3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元。

实施例2：

本实施例中强心苷苷元类化合物为3-氧代异羟基洋地黄毒苷元。

(3)转化：取下摇瓶，在菌体发酵液中加入用无水乙醇溶解配制的3-氧代异羟基洋地黄毒苷元溶液100μL(135mmol/L)，继续摇床培养，32℃，180r/min转化72h后终止发酵；

3-氧代异羟基洋地黄毒苷元转化产物为3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元。

实施例3：

本实施例中强心苷苷元类化合物为1，2-烯-3-氧代异羟基洋地黄毒苷元。

(3)转化：取下摇瓶，在菌体发酵液中加入用1，2-烯-3-氧代异羟基洋地黄毒苷元溶液100μL(135mmol/L)，继续摇床培养，32℃，180r/min转化72h后终止发酵；

1，2-烯-3-氧代异羟基洋地黄毒苷元转化产物为3-氧代-1(2)，16(17)-二烯异羟基洋地黄毒苷元。

实施例1中原料代异羟基洋地黄毒苷元结构检测数据如下：

FT-ICR-MS M/Z：413.2298[M+Na]⁺，分子式：C₂₃H₃₄O₅Na⁺。(见附图1-1)

¹H-NMR(C₅D₅N，600Hz)：δ_H 0.98(3H，S，Me-18)，1.23(3H，S，Me-19)，3.73(1H，m，H-12)，4.36(1H，S，H-3)，5.25(1H，d，H-21a，J＝18Hz)，5.10(1H，d，H-21b，J＝18Hz)，6.22(1H，S，H-22).(见附图1-2)

¹³H-NMR(C₅D₅N，600Hz)：δ_C30.06(C-1)，28.20(C-2)，65.60(C-3)，33.87(C-4)，36.33(C-5)，26.88(C-6)，21.96(C-7)，41.35(C-8)，32.45(C-9)，35.31(C-10)，30.45(C-11)，74.28(C-12)，56.37(C-13)，85.04(C-14)，33.13(C-15)，27.46(C-16)，46.22(C-17)，9.68(C-18)，23.64(C-19)，174.18(C-20)，73.55(C-21)，116.98(C-22)，176.02(C-23)。(见附图1-3)。

实施例1中产物3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元结构检测数据如下：

FT-ICR-MS m/z：409.1986[M+Na]⁺，分子式：C₂₃H₃₀O₅N_a ⁺。(见附图2-1)

¹H-NMR(C₅D₅N，600Hz)：δ_H 0.99(3H，S，Me-18)，1.26(3H，S，Me-19)，3.74(1H，m，H-12)5.24(1H，d，H-21a，J＝18Hz)，5.10(1H，d，H-21b，J＝18Hz)，5.85(1H，s，H-16)6.23(1H，S，H-22)(见附图2-2)。

¹³C-NMR(C₅D₅N，600Hz)：δ_C36.07(C-1)，38.82(C-2)，198.09(C-3)，46.48(C-4)，46.94(C-5)，28.39(C-6)，17.41(C-7)，41.66(C-8)，33.15(C-9)，33.55(C-10)，30.64(C-11)，74.11(C-12)，56.52(C-13)，84.80(C-14)，34.40(C-15)，124.32(C-16)，117.65(C-17)，10.05(C-18)，27.80(C-19)，174.60(C-20)，73.99(C-21)，169.67(C-22)，176.16(C-23)(见附图2-3)。

与原料异羟基洋地黄毒苷元结构数据相比，分子量少了4，3位氢消失，并结合碳谱数据，可知3位羟基形成了羰基，并在其它位置脱了2H，形成了双键。由于碳谱中典型的16和17位的化学位移27.91(C-16)，46.66(C-17)消失，增加了124.32(C-16)和117.65(C-17)，而1和2位的化学位移36.97(C-1)和37.27(C-2)基本没有变化，可知是16和17位脱氢，而不是1和2位脱氢。另外，在氢谱数据中增加了5.85一个信号峰，而如果是1和2位脱氢应该产生两个双键的信号峰，这也说明是16和17位脱氢，而不是1和2位脱氢C16，17。

实施例2中原料3-氧代异羟基洋地黄毒苷元结构检测数据如下：

FT-ICR-MS M/Z：411.2140[M+Na]⁺，分子式：C₂₃H₃₂O₅N_a ⁺。(见附图3-1)

¹H-NMR(C₅D₅N，600Hz)：δ_H0.88(3H，S，Me-18)，1.24(3H，S，Me-19)，3.74(1H，m，H-12)5.25(1H，d，H-21a，J＝18Hz)，5.11(1H，d，H-21b，J＝18Hz)，6.23(1H，S，H-22)。(见附图3-2)

¹³C-NMR(C₅D₅N，600Hz)：δ_C36.97(C-1)，37.27(C-2)，211.19(C-3)，42.41(C-4)，43.97(C-5)，27.06(C-6)，21.91(C-7)，41.58(C-8)，33.57(C-9)，35.37(C-10)，30.86(C-11)，74.43(C-12)，56.85(C-13)，85.29(C-14)，30.87(C-15)，27.91(C-16)，46.66(C-17)，10.15(C-18)，22.57(C-19)，174.63(C-20)，74.02(C-21)，117.58(C-22)，176.32(C-23)。(见附图3-3)

实施例2中产物见3-氧代-16(17)-烯异羟基洋地黄毒苷元的数据及附图同实施例1产物附图。

实施例3中产物3-氧代-1(2)，16(17)-二烯异羟基洋地黄毒苷元结构检测数据如下：

FT-ICR-MS m/z：407.1830[M+Na]⁺，分子式：C₂₃H₂₈O₅N_a ⁺。(见附图4-1)

¹H-NMR(C₅D₅N，400Hz)：δ_H1.05(3H，S，Me-18)，1.27(3H，S，Me-19)，3.66(1H，m，H-12)5.24(1H，d，H-21a，J＝18Hz)，5.11(1H，d，H-21b，J＝18Hz)，5.81(1H，s，H-16)6.23(1H，S，H-22)，6.38(1H，d，H-2，J＝10Hz)，7.05(1H，d，H-1，J＝10Hz)。(见附图4-2)

¹³C-NMR(C₅D₅N，400Hz)：δ_C155.23(C-1)，127.90(C-2)，185.72(C-3)，44.84(C-4)，46.34(C-5)，30.07(C-6)，18.57(C-7)，43.17(C-8)，32.89(C-9)，33.25(C-10)，32.97(C-11)，73.94(C-12)，56.63(C-13)，84.38(C-14)，41.28(C-15)，124.18(C-16)，117.58(C-17)，10.09(C-18)，27.64 (C-19)，174.68(C-20)，73.61(C-21)，168.51(C-22)，176.21(C-23)。(见附图4-3)16和17位脱氢的分析同上，1和2同时脱氢也证明了16和17脱氢的正确性。

Claims

1.一种利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢的方法，其特征在于：步骤是：

所述的球形节杆菌由美国典型微生物菌种保藏中心保存，编号为：ATCC 31250；

所述强心苷苷元类化合物为异羟基洋地黄毒苷元、3-氧代异羟基洋地黄毒苷元或1，2-烯-3-氧代异羟基洋地黄毒苷元之一。

2.根据权利要求1所述的利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢的方法，其特征在于：所述一级种子培养基和二级发酵培养采用的培养基组成：葡萄糖5-20g/L，玉米浆5-15g/L，蛋白胨2-8g/L，磷酸二氢钾2-5g/L，pH7.0-7.4。

3.根据权利要求1所述的利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物C16，17位脱氢的方法，其特征在于：所述强心苷苷元类化合物投入的终浓度为：0.1-1g/L。