MXPA00002025A - Metodo para cuantificar el colesterol en lipoproteina de alta densidad - Google Patents

Abstract

Se describe un método para cuantificar el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en agregar al suero un agente tensioactivo seleccionado deéteres alquilfenílicos de polietileno yéteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno y un reactivo de enzima para probar el colesterol, opcionalmente junto con una sustancia capaz de inhibir la reacción de colesterol en lipoproteínas en el suero con el reactivo de enzima anterior, y determinar la cantidad de colesterol reaccionado dentro de un periodo de tiempo en el cual el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, entre otras lipoproteínas, preferiblemente reacciona con el reactivo de enzima anterior;al utilizar este método, el colesterol en lipoproteínas de alta densidad puede cuantificarse conveniente y eficientemente sin la necesidad de ningún pretratamiento tal como centrifugación;por lo tanto, se puede aplicar a varios analizadores automáticos.

Description

MÉTODO PARA CUANTIFICAR EL COLESTEROL EN LIPOPROTEINA DE ALTA DENSIDAD CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a un método que con una pequeña cantidad de muestra, permite cuantificar eficientemente el colesterol en lipoproteína de alta densidad (HDL), por separado del colesterol en lipoproteínas distintas a HDL mediante procedimientos sencillos sin la necesidad de procedimientos tales como centrifugación.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA ANTERIOR Los lípidos tales como el colesterol forman complejos con apoproteínas en el suero para formar lipoproteínas. Dependiendo de las diferencias físicas en proteínas, las lipoproteínas se clasifican en quilomicrón, lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL), y así sucesivamente. Entre estas lipoproteínas, se sabe que la LDL es una de las sustancias causantes de inducir arteriosclerosis, mientras que la HDL presenta actividad anti-arteriosclerótica. Epidemiológicamente, se sabe que el nivel de colesterol en HDL muestra una correlación inversa con la frecuencia de ataque de enfermedad arteriosclerótica. Actualmente, las mediciones de colesterol en HDL se realizan ampliamente para la prevención o diagnosis de enfermedades isquémicas del corazón. Algunos métodos conocidos para la medición de colesterol en HDL, son, por ejemplo, un método en donde HDL se separa de 5 otras lipoproteínas mediante ultracentrifugación y luego se somete a una medición de colesterol; y otro método en donde subsecuente a la separación de HDL de otras lipoproteínas por electroforesis, se tiñe su lípido, y se mide la intensidad del color desarrollado. Sin embargo, estos métodos no se han utilizado con frecuencia, debido a que implican uno o más problemas como que dichos procedimientos son tediosos y muchas muestras no pueden manejarse. Un método para la medición de colesterol en HDL, que se utiliza general y ampliamente en la actualidad en el campo de pruebas clínicas, es el método de precipitación en donde un reactivo de precipitación se agrega a una muestra para aglutinar lipoproteínas distintas a HDL, el material aglutinado resultante se remueve por centrifugación, y el colesterol en el sobrenadante que sólo contiene HDL es aislado y luego medido. Este método es más simple en comparación con la ultracentrifugación o electroforesis, pero debido a la inclusión de los procedimientos de agregar el reactivo de precipitación y realizar la separación, requiere que cada muestra tenga una cantidad relativamente grande, involucra un problema potencial de producir un error analítico, y no permite automatizar por completo los pasos completos del análisis. ¡^g?¡jgdíS?^ Por otro lado, se han estudiado métodos para la cuantificación fraccional enzimática de colesterol en HDL. Algunos métodos conocidos incluyen, por ejemplo, realizar una reacción enzimática en presencia de una sal biliar y un agente tensioactivo no ¡ónico (JP 63-126498 A). Este método aplica el hecho de que una reacción enzimática actúa en proporción a una concentración de LDL en una etapa inicial de la reacción y luego en proporción a la concentración de colesterol en HDL. Sin embargo, existe un problema de precisión debido a que la reacción con colesterol en HDL y la reacción con colesterol en otras lipoproteínas no puede distinguirse por completo. Entre los métodos conocidos también se incluye aglutinar las lipoproteínas distintas a HDL por adelantado, para provocar que el colesterol en HDL reaccione enzimáticamente por sí solo, y desactivar la enzima y al mismo tiempo, redisolver el material aglutinado, seguido por la medición de una absorbancia (JP 6-242110 A). Este método, sin embargo, requiere por lo menos tres procedimientos para añadir los reactivos para que puedan aplicarse sólo a algunos analizadores automáticos, conduciendo así a un problema de amplio campo de aplicación. Asimismo, este método no es satisfactorio desde el punto de vista de daños en los equipos analíticos y eliminación de reactivos por el uso de una sal a una alta concentración después de la redisolución de un material aglutinado. Además, la patente japonesa No. 2,600,065 describe un método que hace uso combinado de un reactivo de precipitación, que se utiliza en jm H| ¿tay |H|f^^ métodos de precipitación general y provoca la precipitación de lipoproteínas distintas a HDL, y un reactivo de medición de colesterol común para medir el colesterol no precipitado en HDL. Sin embargo, es imposible medir el colesterol en HDL sin importar el ejemplo que se lea de esa patente. Por lo 5 tanto, se considera que dicha patente no incluye un elemento esencial de su invención, y no puede servir como técnica anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Con respecto a la medición de colesterol en lipoproteínas en el suero, los inventores de la presente han seguido con una investigación en diferentes formas. En el curso de la investigación, se encontró que, cuando se realiza una reacción entre el suero y un reactivo de enzima para cuantificar el colesterol en presencia de un agente tensioactivo específico capaz de disolver lipoproteínas, sólo el colesterol en HDL reacciona primero, después de la reacción en HDL reacciona el colesterol en VLDL, y con un retraso sustancial, finalmente reacciona el colesterol en LDL. Como resultado de investigación adicional, también se encontró que el colesterol en HDL por sí solo puede medirse seleccionando un punto de medición como se desee para que la primera reacción que depende de la concentración de colesterol en HDL pueda medirse, que la reacción que depende de la concentración del colesterol en HDL solo pueda mantenerse durante un tiempo extenso elaborando una sustancia, que inhibe la reacción — - - . . ».. n .. . ftiÉifilfi^^ entre el colesterol en lipoproteínas en el suero y el reactivo de cuantificación de colesterol, existente en el sistema, y que estos métodos puedan aplicarse a analizadores automáticos, llevando así a la consumación de la presente invención. 5 Por lo tanto, la presente invención provee un método para la cuantificación de colesterol en lipoproteína de alta densidad, que consiste en agregar al suero un agente tensioactivo, que se selecciona de éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno, y un reactivo de enzima para cuantificar el colesterol; y luego 10 medir una cantidad reaccionada de colesterol en la lipoproteína de alta densidad en un tiempo en el que el colesterol en la lipoproteína de alta densidad preferiblemente reacciona con el reactivo de enzima para cuantificar el colesterol. La presente invención también provee un método para la 15 cuantificación de colesterol en HDL como se describió con anterioridad, en donde se agrega adicionalmente una sustancia que tiene el efecto de inhibir una reacción entre el colesterol en las lipoproteínas en el suero y el reactivo de enzima para cuantificar el colesterol. La presente invención también provee una enzima para 20 cuantificar y un equipo de reactivo, que hace posible practicar ventajosamente cada uno de los métodos descritos con anterioridad. j ¡í ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^?^^^^^^^^^^^^^^^Í^^^^^^^g^y^^^^^^^^^^^^fcgj^j^^^ BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama que muestra una correlación entre los datos del análisis obtenidos por el método de la presente invención y los que 5 se obtuvieron mediante el método de precipitación en el ejemplo 1 ; y La figura 2 es un diagrama que ilustra una correlación entre los datos del análisis obtenidos por el método de la presente invención y los que se obtuvieron por el método de precipitación en el ejemplo 2.

MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN El agente tensioactivo (de aquí en adelante denominado "agente de disolución de lipoproteína") que se utiliza en el método de la presente invención, el cual se selecciona de éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno, es un agente tensioactivo que tiene el efecto de disolver lipoproteínas. Estos agentes tensioactivos pueden incluir "Emulgen A-60" (producto de Kao Corporation) como un ejemplo comercialmente disponible del primero y "Emulgen B66" (producto de Kao Corporation) como un ejemplo comercialmente disponible del último. 20 Estos agentes tensioactivos pueden utilizarse solos o en combinación. La cantidad de agente tensioactivo que deberá utilizarse depende del tipo de agente tensioactivo, y no se impone limitación en particular de la misma. Puede determinarse empíricamente para cada analizador, en el cual se aplica el reactivo, para establecer la sensibilidad del analizador y de esta forma permitir la detección de colesterol en HDL dentro de un tiempo de medición deseado. En general, se prefiere el uso de un agente tensioactivo a una concentración de alrededor de 0.01 a 5% en peso. 5 El método de cuantificación de acuerdo con la presente invención puede realizarse preferiblemente en presencia de una sustancia (de aquí en adelante denominada "inhibidor de reacción") que tiene el efecto de inhibir la reacción entre el colesterol en las lipoproteínas en el suero y el reactivo de enzima para cuantificar el colesterol. A diferencia del caso en que 10 no existe un inhibidor de reacción, la presencia del inhibidor de reacción permite retener durante un tiempo más prolongado una reacción que sólo depende de la concentración de colesterol en HD. Algunos ejemplos de inhibidores de reacción para uso en la presente invención son sustancias que muestran afinidad de unión a 15 lipoproteínas y también agentes tensioactivos que no disuelven lipoproteínas. Estos pueden usarse solos o en combinación. Ejemplos de sustancias (de aquí en adelante denominadas "sustancias de unión") que muestran afinidad de unión a lipoproteínas pueden incluir combinaciones de polianiones y sustancias capaces de formar sales de 20 metal divalente. También puede ser sustancias que forman complejos con HDL para formar precipitados. Algunos ejemplos específicos de polianiones pueden incluir sulfato de dextrano, ácido fosfotúngstico y heparina, mientras que ejemplos de sustancias capaces de formar sales de metal divalente ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^?^tí^^|j|agíg^^^^^^se^^^^^^^^^^^^^^^^^^g^^ incluyen cloruros de metales divalentes, tales como MgCI2, CaCI2, MnCI2 y N¡CI2, y sus hidratos. Estas sustancias de unión pueden utilizarse solas o en combinación. La cantidad de la sustancia de unión que deberá utilizarse varía dependiendo de su tipo, y no se impone ninguna limitación en la misma. Sin embargo, es deseable utilizarlas en escalas tales que a medida que las concentraciones lleguen al punto final de la reacción, las cantidades de polianion alcancen de 0.002 a 10% en peso y la sustancia capaz de formar una sal de metal divalente alcancen de 0.01 a 5% en peso, respectivamente. Además, el agente tensioactivo (de aquí en adelante denominado "agente de no disolución de lipoproteína") que no disuelve las lipoproteínas puede ser, por ejemplo, un agente tensioactivo seleccionado de éteres alquílicos de polioxietileno, éter alquilfenílico de polioxietileno, condensado de polioxietileno-polioxipropileno, étersulfatos alquílicos de polioxietileno y sales de alquilbenzensulfonato. Entre éstos, se prefiere el éter cetílico de polioxietileno [como un producto comercial, "Emulgen 220" (producto de Kao Corporation)] como un éter alquílico de polioxietileno; éter nonilfenílico de polioxietileno [como un producto comercial, "Emulgen 913" (producto de Kao Corporation] como un éter alquilfenílico de polioxíetileno; "Pluronic F-88" (producto de Asahi Denka Kogyo K.K.) como un condensado de polioxietileno-polioxipropileno; sal de sodio de étersulfato laurílico de polioxietileno [como un producto comercial, "EMAL 20C" (producto de Kao Corporation)]; y dodecilbencensulfonato de sodio como un alquilbencensulfonato.

Estos agentes de no disolución de lipoproteína pueden utilizarse solos o en combinación. No se imponen limitaciones particulares en las cantidades utilizadas, pero es deseable que se utilicen en una escala que, cuando se mezclen con una muestra, sus cantidades de concentración alcancen de 0.01 a 5% en peso, especialmente 0.05 a 1 % en peso. Después de agregar el agente de disolución de lipoproteína y el reactivo de enzima para cuantificar el colesterol (de aquí en adelante denominado "reactivo de colesterol") en el suero como una muestra, pueden agregarse por separado o en conjunto como una mezcla. Por otro lado, el 10 inhibidor de reacción puede utilizarse agregándolo a uno de los agentes de disolución de lipoproteína y el reactivo de colesterol o a una mezcla de los mismos. Cuando se utiliza una pluralidad de inhibidores de reacción, pueden mezclarse juntos y utilizarse de la misma manera que si se utilizara un solo inhibidor de reacción. Como alternativa, pueden agregarse por separado al 15 agente de disolución de lipoproteína y al reactivo de colesterol, respectivamente. Ejemplos de reactivo de colesterol útiles para la cuantificación de colesterol en la presente invención puede incluir reactivos de colesterol conocidos tales como una combinación de colesterol esterasa y colesterol 20 oxidasa y una combinación de colesterol esterasa y colesterol deshidrogenasa. De estos, se prefiere la combinación de colesterol esterasa y colesterol oxidasa. No se impone ninguna limitación en particular sobre un método * **- _.-___._. «..A^.,- .. ^......^ ^ ^^_t_________ _____^^..>.^^-- que se utiliza para medir finalmente la cantidad reaccionada de colesterol subsecuente a la adición de estos reactivos de colesterol. Un ejemplo es la espectroscopia de absorbancia que se realiza combinando adicionalmente una peroxidasa con un cromógeno, y un método en el cual se detecta directamente una coenzima o peróxido de hidrogeno. En el método de la presente invención, es necesario detectar la reacción entre el colesterol en HDL y el reactivo de enzima para cuantificar el colesterol en el tiempo en que el colesterol en HDL preferiblemente reacciona con el reactivo de enzima para cuantificar el colesterol. Algunos métodos ilustrativos útiles para la detección anterior pueden incluir un método en donde una reacción que ocurre subsecuente al mezclado del agente de disolución de lipoproteína, el reactivo de colesterol y la muestra se monitorea dinámicamente; y un método (método de dos puntos) en donde la reacción de colesterol en HDL se mide por el método de punto final de la reacción y el resultado de la medición se corrige mediante un valor en blanco. Cuando es necesario monitorear la reacción de HDL durante un tiempo extendido, la reacción que depende de la concentración de colesterol en HDL por sí solo puede prolongarse agregando un inhibidor de reacción y así retrasar la reacción de detección del colesterol. Los siguientes son ejemplos de un reactivo o equipo de reactivo útiles para practicar ventajosamente el método de la presente invención: (1 ) Reactivos o equipos de reactivo incluyendo los siguientes dos ingredientes (a) y (b): ^^^^^^^^^^^^-^^^^^=M^jí^S|Mg^^te^^^^^^^^^^^^^^te^^^^^^^^ (a) Agente de disolución de lipoproteína, y (b) reactivo de colesterol. (2) Los siguientes ingredientes (a) a (c): (a) Agente de disolución de lipoproteína, (b) Inhibidor de reacción (sustancia de unión, agente de no disolución de lipoproteína), y (c) Reactivo de colesterol. Estos reactivos o equipos de reactivo pueden combinarse con los agentes de disolución de lipoproteína definidos con anterioridad, reactivos de colesterol (colesterol esterasa, colesterol oxidasa, colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, etc), inhibidores de reacción (sustancias de unión, agentes de no disolución de lipoproteína), peroxidasa, cromógenos, coenzimas, reguladores de pH apropiados, antioxidantes, vehículos, y/o similares. Formas ilustrativas de dichos reactivos o equipos de reactivo pueden incluir, además de las formas líquidas, las que se obtienen liofilizando dichas formas líquidas.

EJEMPLOS A continuación la invención se describirá adicionalmente mediante ejemplos. Sin embargo, deberá tomarse en cuenta que la presente invención no se limita por ningún motivo mediante los ejemplos. imJiianaftigM j- EJEMPLO 1 Con respecto a cada 50 muestras de suero que contenían lipoproteínas, se cuantificó el colesterol en HDL mediante el método de la 5 presente invención y el método de precipitación convencional, y se compararon los valores de medición. De acuerdo con el método de la presente invención, se agregó un regulador MES de 100 mM (primer reactivo; pH 6.5) (300 µL) a cada muestra de suero (3 µL), y aproximadamente 5 minutos después, un reactivo para cuantificar el colesterol (segundo reactivo) (100 µL) -que estaba compuesto de 1 % de "Emulgen B-66", 1 U/mL de colesterol esterasa, 1 U/mL de colesterol oxidasa, 5 U/mL de peroxidasa, y se agregó regulador MES de 100 mM (pH 6.5) que contenía 0.04% de disulfobutilmetatoluidina y 0.004% de 4-aminoantipirina. Poco antes de agregar el segundo reactivo y cinco minutos después de su adición, se midió la absorbancia a 600 nm (longitud de onda secundaria: 700 nm). A partir de la diferencia en absorbancia se determinó la concentración de colesterol en HDL en la muestra de suero (método de dos puntos). Como una sustancia de calibración, se utilizó una muestra de suero control con una concentración conocida. Los procedimientos anteriores se realizaron utilizando un analizador automático "Hitachi Modelo 7150". Por otro lado, para cuantificar el colesterol en HDL mediante el método de precipitación, se mezcló una solución acuosa (200 µL) que contenía 0.3% de sulfato de dextrano y 2% de cloruro de magnesio con la ^gg*g¡^¡^^^^^^^^^^^^^t»fea^^ muestra (200 µL), seguido por centrifugación a 3,000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante (50 µL) se recogió, seguido por la mezcla con un reactivo para cuantificar el colesterol (3 mL) compuesto de 1 % de Tritón X-100, 1 U/mL de colesterol esterasa, 1 U/mL de colesterol oxidasa, 5 U/mL de peroxidasa y regulador MES de 100 mM (pH 6.5) que contenía 0.04% de disuífobutilmetatoluidina y 0.004% de 4-aminoantipirina. Después de que la mezcla resultante se incubó a 37°C durante 10 minutos, se midió la absorbancia a 600 nm para determinar la concentración de colesterol en HDL. En la figura 1 se muestra un diagrama de correlación de los resultados obtenidos por el método de la invención y el método de precipitación. El método de la invención, a pesar de sus procedimientos sencillos, mostró una correlación extremadamente buena con el método de precipitación convencional.

EJEMPLO 2 Con respecto a cada 50 muestras de suero, se cuantificó el colesterol en HDL utilizando los mismos reactivos y los mismos procedimientos que en el ejemplo 1 excepto porque se agregó 1% de "Emulgen A-60" en vez de "Emulgen B-66" en el segundo reactivo. Específicamente, el primer reactivo (300 µl) se agregó a la muestra (3 µl), y aproximadamente 5 minutos después, se agregó el segundo reactivo (100 µl). Se midieron las variaciones en absorbancia a 546 nm __MMÉ&flí_AjÉ fi_______Í_M¡i ifpff_______rfl?_lr^ — " (longitud de onda secundaria: 660 nm) desde el decimosegundo hasta el vigesimocuarto segundo subsecuente a la adición del segundo reactivo, y se determinó la concentración de colesterol en HDL en la muestra de suero. Como sustancias de calibración, se utilizaron dos muestras de suero control 5 con concentraciones conocidas (baja concentración y alta concentración). Los procedimientos anteriores se realizaron utilizando el analizador automático "Hitachi Modelo 7150". Con respecto a la misma muestra, el colesterol en HDL se cuantificó mediante el mismo método de precipitación de manera similar que 10 en el ejemplo 1. Se compararon dichos valores de medición. Los resultados se muestran en la figura 2. A partir de los resultados de la figura 2, el método de la invención, a pesar de sus procedimientos sencillos, mostró una buena correlación con el método de precipitación convencional. 15 EJEMPLO 3 Utilizando el mismo segundo reactivo que el que se empleó en el ejemplo 2 y el primer reactivo descrito más adelante, se cuantificó el colesterol 20 en HDL en cada 50 muestras de suero, que contenían lipoproteínas, mediante el método de la invención y el método de cuantificación convencional, y se compararon los valores de medición. Incidentalmente, el primer reactivo A (el mismo que el del ejemplo 2) se agregó como un control.

[Primer reactivo] Primer reactivo A: Regulador MES de 100 mM (pH 6.5). Primer reactivo B: 5 0.2% de solución acuosa de "Pluronic F-88" (producto de Asahi Denka Kogyo K.K). Primer reactivo C: Una solución acuosa que contenía 0.2% de fosfotungstato de sodio y 100 mM de cloruro de magnesio (pH 6.4). 10 Primer reactivo D: Una solución acuosa que contenía 0.2% de "Pluronic F-88", 0.2% de fosfotungstato de sodio y 100 mM de cloruro de magnesio (pH 6.4). Para confirmar los efectos de la adición de los inhibidores de 15 reacción, la absorbancia se midió utilizando diferentes tiempos de medición espectroscópicos, es decir, desde el decimosegundo hasta el vigesimocuarto segundo, desde el decimosegundo hasta el centesimo sexagesimoctavo segundo, y del decimosegundo al tricentésimo decimosegundo segundo, todo esto después de la adición del segundo reactivo, utilizando "Hitachi Modelo 20 7150". Por otro lado, las mediciones de HDL mediante el método de precipitación se realizaron de manera similar que en el ejemplo 1 , y se realizó una investigación para la correlación con el método de la invención bajo las _-M__fc___L. ^__.__ . j*~??ft1 T[ *tmiftim t_tBfr__rt-- _rt__ili-i-l^ mismas condiciones. Los coeficientes de correlación se muestran en el cuadro CUADRO 1 Como puede apreciarse a partir de los resultados, el primer reactivo que no contenía ningún inhibidor de reacción mostró buenos resultados sólo en la medición de absorbancia en la etapa inicial de la reacción. Por otra parte, de acuerdo con los resultados de las mediciones en donde los reactivos contenían uno o más inhibidores de reacción, es decir, los 0.2% de solución acuosa de "Pluronic F-88" (producto de Asahi Denka Kogyo K.K.), la solución acuosa que contenía 0.2% de fosfotungstato de sodio y 100 mM de cloruro de magnesio (pH 6.4) y la solución acuosa que contenía 0.2% de "Pluronic F-88", 0.2% de fosfotungstato de sodio y 100 mM de cloruro de magnesio (pH 6.4) se utilizaron como primeros reactivos, respectivamente, todos los resultados mostraron buenas correlaciones (mientras más cerca de 1 , mayor correlación) en las mediciones durante tiempos extendidos. Por lo tanto, se ha confirmado que el inhibidor de reacción es efectivo para prolongar una reacción que depende de la cantidad de colesterol en HDL.

«¿J???O?f*. iaaáfeM&i^^^^te^£-^a_^__=á Campo de aplicación Industrial De acuerdo con la presente invención, el colesterol en HDL puede cuantificarse efectivamente mediante procedimientos sencillos sin la necesidad de un pretratamiento tal como separación por centrifugación. Ya que una medición específica es posible con una muestra en una pequeña cantidad mediante procedimientos sencillos, la presente invención puede aplicarse a varios analizadores automáticos y son extremadamente útiles en el campo de pruebas clínicas.

Claims (5)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
2. REIVINDICACIONES 5 1.- Un método para cuantificar el colesterol en lipoproteína de alta densidad, que consiste en agregar un agente tensioactivo, que se selecciona de éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno, y un reactivo de enzima para cuantificar el colesterol en el suero; y luego medir una cantidad reaccionada 10 dicho colesterol en dicha lipoproteína de alta densidad en un tiempo en donde dicho colesterol en dicha lipoproteína de alta densidad preferiblemente reacciona con dicho reactivo de enzima para cuantificar el colesterol. 2.- Un método para cuantificar el colesterol en lipoproteína de alta densidad, que consiste en agregar al suero un agente tensioactivo 15 seleccionado de éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno, una sustancia que tiene el efecto de inhibir una reacción entre el colesterol en las lipoproteínas en el suero y un reactivo de enzima para cuantificar el colesterol y dicho reactivo de enzima para cuantificar el colesterol; y luego medir una cantidad reaccionada de dicho 20 colesterol en dicha lipoproteína de alta densidad en un tiempo en el que dicho colesterol en dicha lipoproteína de alta densidad preferiblemente reacciona con dicho reactivo de enzima para cuantificar el colesterol.
3. 3.- Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha sustancia que tiene el efecto de inhibir dicha reacción entre el colesterol en dichas lipoproteínas en el suero y dicho reactivo de enzima para cuantificar el colesterol, es una combinación de un agente tensioactivo, que no disuelve las lipoproteínas, o un polianion y una sustancia capaz de formar iones de metal divalentes.
4. 4.- Un reactivo o equipo de reactivo para la cuantificación de colesterol en lipoproteína de alta densidad, que comprende los siguientes ingredientes (a) y (b): (a) un agente tensioactivo seleccionado de éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno; y (b) un reactivo de enzima para cuantificar el colesterol.
5. 5.- Un reactivo o equipo de reactivo para cuantificar el colesterol en lipoproteína de alta densidad, que comprende los siguientes ingredientes (a), (b) y (c): (a) un agente tensioactivo seleccionado de éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno; (b) una sustancia que tiene el efecto de inhibir una reacción entre el colesterol en lipoproteínas en el suero y un reactivo de enzima para cuantificar el colesterol; (c) dicho reactivo de enzima para cuantificar el colesterol. -TT?G G— ÍITIÍAMG-T -I ?rtffi?fr?iftrtr i i Ml-M».] n7É^