MXPA98010022A - Metodo para determinar cuantitativamente colesteroles de lipoproteina de baja densidad - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para determinar cuantativamente colesterol de lipoproteína de baja densidad, incluyendo los pasos de agregar al suero un agente tensioactivo seleccionado de entreéteres fenílicos de polioxietilenalquileno yéteres tribencilfenílicos de polioxietilenalquileno y un reactivo enzimático para prueba de colesterol de modo que los colesteroles reaccionen preferencialmente en colesteroles de alta densidad y de muy baja densidad entre lipoproteínas, y subsecuentemente determinar la cantidad de colesterol que reacciona posteriormente;este método puede eliminar la necesidad de pretratamientos tales como la centrifugación y electroforesis, permitiendo que la determinación cuantitativa sea conducida de una manera sencilla y eficiente, y pueda ser aplicada a varios analizadores automáticos.

Description

MÉTODO PARA DETERMINAR CUANTITATIVAMENTE COLESTEROLES DE LIPOPROTEINA DE BAJA DENSIDAD CAMPO TECK CO La presente invención se refiera a un método para determinar cuantitativa y fraccionalmente colesterol de LDL (lipoproteína de baja densidad) y .colesterol en lipoproteínas distintas a LDL en una manera simple y eficiente. la cual requiere una pequeña cantidad de muestras y no requiere tratamiento para separación- tal como centrifugación o electro óresis.

TÉCNICA ANTECEDENTE Los lipidos tales como los colesteroles se unen a una apoproteína en suero para formar lipoproteínas. La lipoproteína es típicamente clasificada como quilomicrón» lipoproteína de muy baja densidad (LVDL). lipoproteína de baja densidad (LDL). lipoproteína de alta densidad (HDL). etc.. de acuerdo con las propiedades físicas. Entre ellas, se sabe que la LDL es una substancia causal que induce arterieesclerosis. Varios estudios epidemiológicos han permitido aclarar que el nivel de colesterol de LDL está fuertemente correlacionado a una frecuencia de inicio de enfermedad arterioesclerótica. Por consiguiente. la realización de mediciones de colesterol de LDL a través de un método de rutina simple» podría ser muy útil clínicamente. Con respecto a los métodos convencionales para medir el colesterol de LDL se conoce, por ejemplo» un método en el cual la LDL es separada de otras lipoproteínas por ultracentrifugación para medir el colesterol» y un método en el cual el lípido es teñido después de separación mediante electrofóresis para medir la intensidad del color desarrollado. Sin embargo. la mayoría de estos métodos no se usan habitualmente. debido a sus operaciones y limitaciones complejas en el manejo de un número de especímenes. Se conoce también un método en el cual un vehículo es sensibilizado con un anticuerpo el cual se une a una lipoproteína distinta a la LDL» se mezcla entonces con una muestra. y una fracción no unida al vehículo ee fraccionada para medir los colesteroles presentes. Aunque este método es más adecuado para una prueba de rutina comparativamente con los dos métodos previos, el procedimiento de prueba involucra pasos manuales, los cuales hacen difícil la atitomatización de los procedimientos de prueba. Así» el método es todavía inadecuado para el manejo de un gran número de especímenes. Mientras tanto, con respecto a un método para determinar cuantitativamente y fraccionalmente lipoproteínas en una muestra sin utilizar medios para separación» tales como ultracentri ugación o electrofóresis» se conoce un método en el cual» después de la determinación fraccional de colesteroles en HDL y otras lipoproteínas (es decir. quilomicrón» VLDL y LDL) se controla la reactividad de las enzimas empleadas k (típicamente colesterol oxidasa y colesterol esterasa) para inducir exclusivamente que el colesterol de HDL reaccione a la 5 enzima. Por ejemplo» la solicitud de patente japonesa abierta al público (Kokai) No. 7-301636» describe un método para medir exclusivamente el colesterol de HDL mediante el uso de un agente tensioactivo y un compuesto de azúcar» y la solicitud de patente japonesa abierta al público (Kokai) No 6— 42HO. lO describe un método para medir exclusivamente colesterol en una f lipoproteína objetivo mediante lipoproteínas aglutinantes distintas a la lipoproteína que será medida para controlar así la reactividad con una enzima. Estos métodos son signi icativamente útiles en vista de su aplicación a analizadores automáticos los cuales realizan automatización de todos los pasos. Sin embargo» estos métodos tienen limitaciones porque sólo permiten determinar cuantitativamente HDL fraccionada de lipoproteínas diferentes de HDL. y no tienen capacidad adicional para determinar cuantitativa y frascionalmente LDL de una mezcla de VLDL y quilomicrón. Por consiguiente» estos métodos no pueden lograr el objetivo de medir el colesterol de LDL sin utilizar medios de separación. La solicitud de patente japonesa abierta al público (Kokai) No 7—2S0S12» describe un método para determinar el colesterol de LDL. que comprende los pasos de aglutinar la LDL; remover colesteroles en otras lipoproteínas mediante un sistema el cual difiere de un sistema para determinar la LDL; disolver la aglutinación de LDL; y hacer reaccionar el colesterol de LDL. Sin embargo, similar a los métodos descritos en las dos publicaciones anteriores. la solicitud de patente japonesa abierta al público <Kokai) No 7-280B12» no propone una resolución a la determinación cuantitativa y fraccional de LDL y VLDL y/o quilomisrón» lo cual es absolutamente esencial para determinar el soleeterol de LDL. Existe también un problema con este método; no se puede aplicar a analizadores automáticos de uso común» debido a un gran número de pasos requeridos para la prueba» haciendo que este método sea de uso muy limitado. Así» con técnicas convencionales» ee posible que el solesterol de LDL nunca pueda ser puesto a prueba efectivamente sin la realización de una operación de separación y» además, no ha habido información alguna que indique la posibilidad de la medida anterior. Por consiguiente» un objetivo de la presente invención es proveer un método para determinar cuantitativa y frascionalmente en forma e icaz colesterol de LDL en una manera simple» mientras se elimina la necesidad de pretrata ientos tales como centrifugación o electrofóresis» y el cual se puede aplicar a varios analizadores automáticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En vista de lo anterior, los presentes inventores han realizado estudios formales, y han encontrado que la reacción con un reactivo enzimático para prueba de colesterol realizada en presencia de un agente tensioactivo específico que disuelve lipoproteínas. acelera la reacción del colesterol de HDL y colesterol de VLDL. y retarda notablemente la reacción del colesterol de LDL; que la reacción del colesterol de HDL y del colesterol de VLDL t€-rmina antes de la reacción del colesterol de LDL; y que el colesterol de LDL se puede medir suantitativa y frascionalmente mediante una selección apropiada de un punto de medición» permitiendo la aplicación de analizadores automatizados. La presente invención se llevó a cabo en base a estos hallazgos. Por consiguiente» la presente invención provee un método para determinar cuantitativamente colesterol de LDL» comprendiendo los pasos de agregar al suero un agente tensioactivo seleccionado entre éteres fenílicos de polioxietilenalquileno y éteres tribencilfenílicos de polioxietilenalquileno» y un reactivo enzimático para prueba de colesterol» para inducir así reacciones preferenc ales de colesteroles en lipoproteínas de alta densidad y de muy baja densidad entre lipoproteínas» y determinando subsecuentemente la cantidad de colesterol que reacciona posteriormente. La presente invención provee también un método para determinar cuantitativamente colesterol de LDL. caracterizado porque comprende los pasos de agregar al suero un agente tensioastivo seleccionado entre éteres fenílisos de polioxietilenalquileno y éteres tribencilfenílicos de polioxietilenalquileno» una substancia que exhibe afinidad de unión más fuerte a la VLDL que a la LDL» y un reactivo enzimático para prueba de colesterol» para inducir así reacciones pre erenciales de colesteroles en lipoproteínas de alta densidad y de muy baja densidad entre lipoproteínas» y determinando subsecuentemente la cantidad de colesterol que reacciona posteriormente. Además» la presente invención provee un equipo para determinar cuantitativamente colesterol de LDL» comprendiendo un reactivo enzimático para prueba de solesterol y un agente tensioastivo seleccionado entre éteres enílieos de polioxietilenalquileno y éteres tribenc lfenílicos de polioxietilenalquileno. Además» la presente invención provee un equipo para determinar cuantitativamente colesterol de LDL somo se describió anteriormente» comprendiendo además una substancia que exhibe afinidad de unión más fuerte a la VLDL que a la LDL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la correlación de mediciones de colesterol de LDL obtenidas en el ejemplo 1 mediante un método de la presente invención» y mediciones del solesterol de LDL obtenidas mediante ultracentri ugación. La figura 2 muestra la sorrelasión de mediciones de colesterol de LDL obtenidas en el ejemplo 2 mediante un método de la presente invención» y mediciones de colesterol de LDL obtenidas mediante ultracentri ugasión. La figura 3 muestra la sorrelasión de mediciones de solesterol de LDL obtenidas en el ejemplo 3 mediante un método de la presente invención» y mediciones de solesterol de LDL obtenidas mediante ultrasentri ugasión.

MEJORES FORMAS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Los agentes tensioas ivos que se utilizan en la presente invensión se seleccionan entre éteres fenílicos de polioxietilenalquileno y éteres tribencilfenílisos de polioxietilenalquileno» y disuelven lipoproteínas. Ejemplos de los primeros éteres incluyen Emulgen A-60 (producto de Kao Corporation)» y ejemplos de los últimos éteres incluyen Emulgen B66 (producto de Kao Corporation). Los agentes tensioactivos pueden ser utilizados solos o en combinación de dos o más especies. La cantidad de uso depende del so puesto y no es particularmente limitada. Bajo condiciones normales» los agentes tensioactivos se utilizan preferentemente a una concentración de 0.01-2% en peso» para así obtener una sensibilidad que permita la detección del solesterol de LDL dentro de un tiempo de prueba deseado» el cual difiere de acuerdo con el aparato analítico al cual un reactivo es aplicado. El método que se usa para poner a prueba el colesterol de conformidad con la presente invención. se practica preferentemente en presencia de una substancia que exhibe una afinidad de unión más fuerte a la VLDL que a la LDL. Particularmente» cuando el espécimen es suero que contiene quilomicrón. la adición de la substancia anterior provee resultados de prueba excelentes. Ejemplos de dichas substansias incluyen polianiones y substancias que forman una sal de metal divalente. Ejemplos específicos de los polianiones incluyen ácido fosfotungsténico y sales del mismo, sulfato de dextran y heparina; y ejemplos más específicos de las substancias anteriores incluyen cloruros de metal divalente» tales somo MgCla» CaCljg» M Cl-a» o NiCla,. o hidratos de los mismos. Estas substancias se pueden utilizar solas o en combinación con dos o más especies. La cantidad de uso depende del compuesto» y no es particularmente limitada. Pre erentemente» los polianiones se utilizan en una cantidad de O-002-lOJí en peso» y las substansias que forman iones de metal divalente ee utilizan en una cantidad de 0.01-1% en peso» ambos en términos de una consentraaión terminal en reassión. Un agente tensioactivo y una substancia que exhibe una afinidad de enlace más fuerte a la VLDL que a la LDL» se agregan al suero funcionando como espécimen» y se pueden agregar por separado o en forma de una ezsla. Brevemente el primero, la última y un reastivo enzimátiso para prueba de colesterol» se pueden agregar por separado; el primero y la última y una mezcla de la contraparte y un reactivo enzimático para prueba de solesterol se pueden agregar por separado; o una mezcla de los tres componentes se puede agregar como reactivo. Cualquier método de prueba enzimático conocido pueden ser utilizado para poner a prueba colesteroles. Ejemplos de métodoe incluyen un método que emplea una sombinación de colesterol esterasa y solesterol oxidasa como reactivo enzimático. así como también un método que emplea una combinación de colesterol esterasa y colesterol deshidrogenasa como reactivo enzimático. De estos, se prefiere un método que emplea una combinación de colesterol esterasa y colesterol oxidasa. No se impone una limitación particular sobre el método que permite detectar finalmente solesteroles después de la adición de estos reactivos enzimáticos para prueba de colesterol. y ejemplos del mismo incluyen un análisis de medición de la absorción que emplea una combinación adicional de peroxidasa y un cromógeno y detección directa de una coenzima o peróxido de hidrógeno. Para realizar una prueba de colesterol de LDL» se determina el grado de reacción relevante después de sonaluir las reacciones de colesteroles en lipoproteínas diferentes de la LDL. Se puede emplear un método en el cual la reacción de colesteroles en lipoproteínas diferentes de LDL eea ÍO substancialmente concluida después de permitir que la reacción proceda durante un tiempo específico» y se monitorea cinéticamente una reacción la cual procede posteriorme. Alternativamente» se puede emplear un método en el cual se añada ademáe un agente adicional de aceleración de la reacción para acelerar la reacción de la LDL; la reacción resultante se mide mediante un método de punto terminal de la reacción; y el valor se ajusta mediante el uso de un valor blanco (método de 2 puntos). Con respecto a los agentes que aceleran la reacción» se pueden utilizar en el método de 2 puntos los mismos agentes tensioactivos que se utilizan en la reacción de colesteroles en lipoproteínas diferentes de la LDL» en una concentración superior y otro tipo de agente tensioactivo. En el método de 2 puntos» los colesteroles pueden ser introdusidos en otro sistema de reassión aislado de un sistema para determinar LDL para detectar exclusivamente la reacción del colesterol de LDL durante la reacsión de los solesteroles en lipoproteínas distintas a LDL. Ejemplos de otras lipoproteínas contenidas en suero incluyen quilomicrón» que típicamente aparece exclusivamente después de la ingestión de alimento. El quilomicrón tiene aproximadamente la misma reactividad que la VLDL. Por lo tanto» la reactividad del quilomicrón es también acelerada en una manera similar al caso de la VLDL mediante la adición de polianiones» una substancia que forma iones de metal divalente» etc.. y la reacción del quilomicrón concluye también cuando la reasción de la VLDL consluye. Así» el colesterol de LDL se puede determinar cuantitativa y fraccionalmente midiendo después el grado de reacción de los colesteroles.

EJEMPLOS La presente invención se describirá a continuación mediante ejemplos, los cuales no deben ser considerados como limitantes de la invención.

EJEMPLO 1 Se sometieron a prueba especímenes normales de suero con lípidos para colesterol de LDL mediante un método de la presente invención usando un analizador automático Hitachi modelo 7070» y las mediciones se compararon con las obtenidas mediante ultrasentri ugasión. Los resultados se muestran en la figura 1. Por poco tiempo» a un espécimen (4 µl) se añadió un reastivo (300 µl) conteniendo fosfotungstato de sodio (0.0254 en peso) y MgCljjj-ßHsjO (0.2% en peso). Aproximadamente cinco minutos después» se agregó un reactivo de prueba para colesterol (100 µl ) conteniendo Emulgen A-60 (producto de Kao Corporation) (0.5% en peso)» colesterol esterasa (1 U/ml)» colesterol oxidasa £1 U/ml)» peroxidasa (1 U/ml)» 4-aminoantipiriña (O.005% en peso) y N»N—dimetil—m-toluidina (0.04X en peso), y se midieron los cambios de absorbencia a 545 nm durante el período de un minuto a cinco minutos después de la adición del segundo reactivo. Para ultracentrifugación. el suero se sometió a centrifugación a 100»OOO g durante dos horas por medio del uso de una ultracentrí uga» con lo cual se removió la capa superior. A una alícuota (1 ml) obtenida de la capa inferior resultante, se añadió una solución de heparina (40 µl; heparina = 5000 usp unidades/ml ) y una solución de ÍM MgCla» ( 50 µl ) » y la mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante 30 minutos» con lo cual se obtuvo un supernadante. La solución (que contenía LDL y HDL) de la capa inferior obtenida mediante ultracentrifugación y del supernadante fraccionado (que contenía HDL) obtenido mediante la agregación de una solución de heparina y una solución de MgCla se sometieron a una prueba de colesterol. y el valor obtenido substrayendo el último del primero representa el nivel del solesterol de LDL (Re erensia; Paul S. Bashorik y otros; Clin. Chem» 41/10. 1414-1420. 1995). Como se muestra en la figura 1. la presente invención provee mediciones que tienen correlación excelente de aquellas obtenidas mediante centrifugación convencional» aun cuando el método de la presente invención requiera una pequeña cantidad de la muestra y pueda ser llevada a cabo de una manera sencilla.

EJEMPLO 2 Un espécimen que contiene suero que contiene quilomicrón teniendo un nivel elevado de triglicéridos fue probado para colesterol de DL mediante un método de la presente invención usando un analizador automático Hitachi modelo 7070» y las mediciones fueron comparadas con aquellas obtenidas mediante ultrasentrifugasión. Loe resultados se muestran en la figura 2. En forma resumida» a un espécimen (4 µl ) » se añadió un reactivo (300 µl ) que contenía Emulgen BS6 (producto de Kao Corporation) (0.554 en peso), colesterol esterasa (0.3 U/ml)» colesterol oxidasa (O.3 U/ml ) » peroxidasa (0.3 U/ml) y 4— aminoantip rina (O.O02 % en peso). Aproximadamente sínso minutos después» se añadió un reastivo ( 100 µl) que contenía Tritón X-lOO ( 1% en peso) y N»N-dimetil-m-toluidina (0.04% en peso), y los cambios en absorción se midieron substrayendo de la absorbancia medida a 545 n antes de la adición del segundo reactivo de aquel medido cinco minutos después de la adición del mismo ( corrección en consideración del cambio en cantidad de los reactivos ) . En el paso de ultracentrifugación» se repitió el procedimiento del ejemplo 1. Como se muestra en figura 2» de manera similar al caso del ejemplo 1» en el ejemplo 2 se obtuvieron mediciones de colesterol de LDL que tuvieron excelente correlación con las obtenidas mediante centrifugasion sonvencional.

EJEMPLO 3 Se repitió el procedimiento del ejemplo 2 usando el mismo espécimen y reactivos excepto que el ácido fosfotúngstico (0.3% en peso) también se incorporó en el primer reactivo» y las mediciones fueron comparadas con aquellas obtenidas mediante ultracentrifugación. Los resultados se muestran en la figura 3. Como se muestra en la figura 3» de manera similar al caso del ejemplo l» en el ejemplo 3 se obtuvieron mediciones de colesterol de LDL que tuvieron excelente correlación con las obtenidas mediante centrifugación convencional, aun cuando se utilizó un espécimen de suero que contenía quilomicrón.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL La presente invención elimina la necesidad de pretratamiento tal como centrifugación y electroforesis» y permite que una determinación cuantitativa del solesterol de LDL» fraccional a colesteroles contenidos en otras lipoproteínas» se realice de una manera sencilla y eficiente, y por lo tanto pueda ser aplicada a varios analizadores automáticos utilizados en exámenes clínicos. Así» la invención es remarcadamente útil en el campo clíniso.

Claims (3)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES > 5 i . — Un método para determinar cuantitativamente colesterol de lipoproteína de baja densidad, que comprende los pasos de agregar a un suero un agente tensioactivo eelescionado de entre los éteres fenílisos de polioxietilenalquileno y éteres tribenailfenílisos de polioxietilenalquileno y un ÍO reastivo enzimático para prueba para soleeterol» para inducir ? así reacciones pre erenciales de colesteroles en lipoproteínas de alta densidad y de muy baja densidad entre lipoproteínas» y subsecuentemente determinando la cantidad de colesterol el cual reacciona posteriormente. 15 2.- Un método para determinar suantitativamente solesterol de lipoproteína de baja densidad, caracterizado porque comprende los pasos de añadir al suero un agente tensioactivo seleccionado de entre los éteres fenílicos de > polioxietilenalquileno y éteres tribencilfenílicos de 20 polioxietilenalquileno» una substancia que exhibe una afinidad de enlace muy fuerte a lipoproteína de muy baja densidad que a lipoproteína de baja densidad» y un reactivo enzimático para prueba de solesterol» para inducir así reacciones preferenciales de colesteroles en lipoproteínas de alta 25 densidad y de muy baja densidad entre las lipoproteínas» y subsecuentemente determinando la cantidad de colesterol que reacciona posteriormente. 3.- El método para determinar cuantitavamente colesterol de lipoproteína de baja densidad de conformidad con > la reinvin icacion 2» caracterizado además porque la substancia 5 que exhibe una afinidad de enlace muy fuerte a lipoproteína de muy baja densidad que a una lipoproteína de baja densidad es un polianión o una substancia que forma una sal metal divalente. 4.— Un equipo para determinar cuantat vamente colesterol de lipoproteína de baja densidad» que somprende un 10 reactivo enzimátiso para prueba de colesterol y un agente » tensioactivo seleccionado de entre los éteres fenílicos de polioxietilenalquileno y éteres tribensilfenílicos de polioxietilenalquileno. 5.- El equipo para determinar suantativamente de 15 conformidad son la reivindisación 4» carasterizado además porque comprende una substancia que exhibe una afinidad de enlace muy fuerte a lipoproteína de muy baja densidad que a la . lipoproteína de baja densidad.