DE69737108T2 - Methode zur quantifizierung von cholesterol in lipoproteinen geringer dichte - Google Patents

Methode zur quantifizierung von cholesterol in lipoproteinen geringer dichte Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin in Lipoproteinen geringer Dichte (LDL; das Cholesterin in Lipoproteinen geringer Dichte wird im weiteren Verlauf hierin auch als "LDL-Cholesterin" bezeichnet, wobei die Bezeichnung "Cholesterin" in vorliegender Beschreibung sowohl Cholesterin als Ester als auch freies Cholesterin umfasst), das für die Diagnose von Arteriosklerose wichtig ist.
  • Stand der Technik
  • LDL spielt beim Transport von Cholesterin im Blut eine wichtige Rolle, und der Hauptanteil des an den Blutgefäßwänden abgelagerten Cholesterins bei der pulpösen Arteriosklerose rührt von LDL her. Eine Erhöhung der LDL-Menge im Plasma ist einer der Hauptrisikofaktoren bei pulpöser Arteriosklerose, wie z.B. ischämischer Herzerkrankung, sodass eine getrennte Quantifizierung von LDL-Cholesterin klinisch wichtig ist.
  • Herkömmliche Verfahren zur Quantifizierung von LDL-Cholesterin umfassen ein Zweistufenverfahren, das aus einem Fraktionierungsschritt und einem Schritt der Cholesterinquantifizierung besteht, sowie ein Verfahren, bei dem die Blutspiegel von Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und Triglycerid bestimmt werden und die Menge des LDL-Cholesterins anhand der Friedewald-Gleichung ermittelt wird.
  • Der Fraktionierungsschritt umfasst Ultrazentrifugationsverfahren, Fällungsverfahren, immunchemische Verfahren und dergleichen. In Ultrazentrifugierungsverfahren wird LDL abgetrennt, wodurch der Unterschied im spezifischen Gewicht mit einer Zentrifuge ausgewertet und die darin enthaltene Menge an Cholesterin gemessen wird. In Fällungsverfahren werden Anti-HDL-Antikörper, Polyanionen und ein zweiwertiges Kation zugesetzt, um einen unlöslichen Niederschlag zu bilden und das LDL-Cholesterin im Überstand nach der Zentrifugation wird quantifiziert (WPI Zugangsnr. 85-116848/20). In immunchemischen Verfahren werden Anti-HDL-Antikörper, Anti- VLDL-Antikörper und Anti-CM-Antikörper an Latexteilchen gebunden, und die Latexteilchen werden durch Zentrifugation oder Leiten durch ein Filter nach Agglutination entfernt, gefolgt von der Quantifizierung des LDL-Cholesterins (WPI Zugangsnr. 84-301275/49). Diese herkömmlichen Verfahren sind jedoch hinsichtlich Einfachheit oder Kosten problematisch.
  • Anhand der Friedewald-Gleichung wird die Menge des LDL-Cholesterins durch Abziehen der Menge des HDL-Cholesterins von der Menge des Gesamtcholesterins und durch weiteres Abziehen von 1/5 der Triglyceridmenge berechnet. Da dieses Verfahren jedoch den Einfluss der Ernährung und individuelle Unterschiede nicht berücksichtigt, ist dieses Verfahren hinsichtlich der Genauigkeit problematisch.
  • Kürzlich wurde über ein Verfahren zur Quantifizierung von LDL-Cholesterin berichtet, das keinen Fraktionierungsschritt erfordert (WPI Zugangsnr. 83-766269/38). In diesem Verfahren ist die Spezifität für LDL jedoch nicht ausreichend.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahren zur Quantifizierung von LDL-Cholesterin, durch das LDL-Cholesterin ohne erforderlichen komplizierten Zentrifugationsschritt auf einfache Weise getrennt quantifiziert wird.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die Menge an LDL-Cholesterin quantifiziert werden kann, indem anderes Cholesterin im Lipoprotein als Cholesterin geringer Dichte im ersten Schritt entfernt und das restliche Cholesterin im darauf folgenden zweiten Schritt gemessen wird, was zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung führte.
  • Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin in Lipoproteinen geringer Dichte in einer Testprobe bereit, die Lipoproteine geringer Dichte, Lipoproteine hoher Dichte, Lipoproteine sehr geringer Dichte und/oder Chylomikron enthalten kann, wobei das Verfahren einen ersten Schritt des Ent fernens von Cholesterin in Lipoproteinen hoher Dichte, Lipoproteinen sehr geringer Dichte und Chylomikron in einer Testprobe und einen zweiten Schritt der Quantifizierung des restlichen Cholesterins in der Testprobe umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Quantifizierung von LDL-Cholesterin bereit, in dem LDL-Cholesterin ohne erforderlichen komplizierten Zentrifugationsschritt auf einfache Weise getrennt quantifiziert wird.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Korrelation zwischen den Ergebnissen der Messung des LDL-Cholesterins in Beispiel 1 und der anhand der Friedewald-Gleichung berechneten Menge.
  • 2 zeigt die Korrelation zwischen den Ergebnissen der Messung des LDL-Cholesterins in Beispiel 2 und der anhand der Friedewald-Gleichung berechneten Menge.
  • 3 zeigt die Korrelation zwischen der Konzentration des LDL-Cholesterins in Abwesenheit oder Gegenwart von HDL, VLDL und CM und der gemäß vorliegender Erfindung in Beispiel 1 gemessenen Extinktion.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • In Lipoproteinen enthaltenes Cholesterin umfasst Cholesterin als Ester (Cholesterinester) und freies Cholesterin. In dieser Beschreibung umfasst die Bezeichnung "Cholesterin", sofern nicht anders angegeben, beides.
  • Die Testprobe, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wird, kann jede beliebige Probe sein, die Lipoproteine, wie z.B. HDL, LDL, VLDL und CM, enthalten kann. Beispiele für die Testproben umfassen Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, Serum und Plasma sowie Verdünnungen davon, obwohl die Testproben nicht darauf beschränkt sind.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst einen ersten und einen zweiten Schritt. Im ersten Schritt wird das Cholesterin in HDL, VLDL und CM in der Testprobe entfernt, und im zweiten Schritt wird das in der Testprobe verbleibende Cholesterin quantifiziert. Da das Cholesterin in HDL, VLDL und CM im ersten Schritt entfernt wird, ist das im zweiten Schritt quantifizierte Cholesterin hauptsächlich das Cholesterin in LDL in der Testprobe.
  • Die Bezeichnung "entfernen" im ersten Schritt bedeutet hierin, dass das Cholesterin abgebaut wird und die Abbauprodukte im darauf folgenden zweiten Schritt nicht mehr nachgewiesen werden können. Die Verfahren zum selektiven Entfernen des Cholesterins in anderen Lipoproteinen als LDL, d.h. HDL, VLDL, CM und dergleichen, umfassen nachstehend angeführte Verfahren.
  • Cholesterin-Esterase und Cholesterin-Oxidase werden auf die Testprobe in Gegenwart eines Tensids, das auf andere Lipoproteine als Lipoproteine geringer Dichte wirkt, einwirken gelassen, und das gebildete Wasserstoffperoxid wird entfernt.
  • Verfahren zum Entfernen von Wasserstoffperoxid umfassen ein Verfahren, bei dem Wasserstoffperoxid mittels Katalase zu Wasser und Sauerstoff zersetzt wird; sowie ein Verfahren, bei dem ein Wasserstoffdonor auf Phenolbasis oder Anilinbasis mit Wasserstoffperoxid umgesetzt wird, um das Wasserstoffperoxid in ein farbloses Chinon überzuführen, obwohl die Verfahren zur Entfernung von Wasserstoffperoxid nicht auf diese Verfahren beschränkt sind.
  • Die Konzentration der Cholesterin-Esterase im Reaktionsgemisch im ersten Schritt kann vorzugsweise etwa 0,2 bis 1,0 U/ml betragen, und die Cholesterin-Esterase kann vorzugsweise aus einem Bakterium stammen, das zur Gattung Pseudomonas gehört. Die Konzentration der Cholesterin-Oxidase beträgt vorzugsweise etwa 0,1 bis 0,7 U/ml, und die Cholesterin-Oxidase stammt vorzugsweise aus einem Bakterium oder einem Hefepilz. Die Konzentration der Katalase kann vorzugsweise etwa 40 bis 100 U/ml und die Konzentration der Peroxidase, mit der das Wasserstoffperoxid umgesetzt wird, beträgt vorzugsweise etwa 0,4 bis 1,0 U/ml. Die Konzentration des Wasserstoffperoxiddonors auf Phenolbasis oder Anilinbasis beträgt vorzugsweise etwa 0,4 bis 0,8 mmol/l.
  • Bevorzugte Tenside, die auf andere Lipoproteine als LDL einwirken können und im ersten Schritt verwendet werden, umfassen Polyalkylenoxidderivate mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 13 und nicht mehr als 15, vorzugsweise von nicht weniger als 13 und nicht mehr als 14. Beispiele für hierin verwendete Derivate umfassen Kondensationsprodukte mit höheren Alkoholen, Kondensationsprodukte mit höheren Fettsäuren, Kondensationsprodukte mit höheren Fettsäureamiden, Kondensationsprodukte mit höheren Alkylaminen, Kondensationsprodukte mit höheren Alkylmercaptanen und Kondensationsprodukte mit Alkylphenolen. Das Verfahren zur Ermittlung des HLB von Tensiden ist allgemein bekannt und wird beispielsweise von Hiroshi HORIGUCHI in "New Surfactants", Sankyo Shuppan (1986), beschrieben.
  • Bevorzugte spezifische Beispiele für Polyalkylenoxidderivate mit HLB-Werten von nicht weniger als 13 und nicht mehr als 15 umfassen Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylencetylether, Polyoxyethylenoleylether, Ether von Polyoxyethylen mit einem höheren Alkohol, Polyoxyethylenoctylphenylether, Polyoxyethylennonylphenylether und dergleichen, deren HLB-Wert nicht weniger als 13 und nicht mehr als 15 beträgt, obwohl das Tensid nicht darauf beschränkt ist.
  • Als im ersten Schritt verwendetes Tensid kann auch ein kationisches Tensid eingesetzt werden. In diesem Fall werden kationische Tenside bevorzugt, die ein quaternäres Ammoniumsalz als hydrophile Gruppe aufweisen und folgender Formel (I) entsprechen:
    Figure 00050001
    worin die R unabhängig voneinander unverzweigte C1-C8-Alkylgruppen darstellen und R1 eine C3-C20-Alkylgruppe darstellt.
  • Die Konzentration der oben angeführten im ersten Schritt eingesetzten Tenside beträgt vorzugsweise etwa 0,1 bis 10 g/l, noch bevorzugter etwa 0,5 bis 5,0 g/l.
  • Die Reaktion im ersten Schritt erfolgt vorzugsweise in einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8, und der Puffer kann vorzugsweise ein aminhältiger Puffer sein, wie z.B. Trispuffer, Triethanolamin oder Good-Puffer. Insbesondere werden Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES und POPSO, die Good-Puffer sind, bevorzugt. Die Konzentration des Puffers beträgt vorzugsweise etwa 10 bis 500 mM.
  • Um die Reaktion mit LDL zu hemmen und den Grad der Entfernung anderer Lipoproteine zu erhöhen, kann ein zweiwertiges Metallion im Reaktionsgemisch enthalten sein. Bevorzugte Beispiele für das zweiwertige Metallion umfassen Kupferionen, Eisenionen und Magnesiumionen. Davon werden Magnesiumionen besonders bevorzugt. Die Konzentration der zweiwertigen Metallionen kann vorzugsweise etwa 5 bis 200 mM betragen.
  • Im ersten Schritt kann zum Reaktionsgemisch optional eine Lipoprotein-Hydrolase zugesetzt werden. Die Zugabe dieses Enzyms wird bevorzugt, da speziell das Cholesterin in VLDL rasch reagiert. Die Konzentration dieses Enzyms im Reaktionsgemisch kann vorzugsweise etwa 5,0 bis 10,0 U/ml betragen.
  • Die Reaktionstemperatur im ersten Schritt kann vorzugsweise etwa 25 °C bis 40 °C betragen, wobei 37 °C besonders bevorzugt sind. Die Reaktionszeit kann etwa 2 bis 10 Minuten betragen.
  • Im folgenden zweiten Schritt wird das im der Testprobe verbleibende Cholesterin quantifiziert. Dies kann durchgeführt werden, indem beispielsweise ein Tensid zugesetzt wird, das zumindest auf LDL wirkt, und das Wasserstoffperoxid durch die Wirkung der im ersten Schritt zugesetzten Cholesterin-Esterase und Cholesterin-Oxidase quantifiziert wird. Dabei kann das Tensid, das zumindest auf LDL wirkt, ein Tensid sein, das selektiv ausschließlich auf LDL wirkt, oder ein Tensid, das auf sämtliche Lipoproteine wirkt.
  • Bevorzugte Beispiele für das Tensid, das auf sämtliche Lipoproteine wirkt, umfassen Polyalkylenoxidderivate mit HLB-Werten von nicht weniger als 11 und nicht mehr als 13, vorzugsweise nicht weniger als 12 und nicht mehr als 13. Beispiele für die hierin verwendeten Derivate umfassen Kondensationsprodukte mit höheren Alkoholen, Kondensationsprodukte mit höheren Fettsäuren, Kondensationsprodukte mit höheren Fettsäureamiden, Kondensationsprodukte mit höheren Alkylaminen, Kondensationsprodukte mit höheren Alkylmercaptanen und Kondensationsprodukte mit Alkylphenolen.
  • Bevorzugte spezifische Beispiele für die Polyalkylenoxidderivate mit HLB-Werten von nicht weniger als 11 und nicht mehr als 13 umfassen Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylencetylether, Polyoxyethylenoleylether, Ether von Polyoxyethylen mit einem höheren Alkohol, Polyoxyethylenoctylphenylether, Polyoxyethylennonylphenylether und dergleichen, deren HLB-Wert nicht weniger als 11 und nicht mehr als 13 beträgt, wobei das Tensid aber nicht darauf beschränkt ist.
  • Beispiele für Tenside, die selektiv auf LDL allein wirken, umfassen anionische Tenside. Obwohl die hierin verwendeten anionischen Tenside keinen Einschränkungen unterliegen, werden solche mit einem oder mehreren aromatischen Ringen, an die eine oder mehrere unverzweigte oder verzweigte C4-C18-Alkylgruppen gebunden sind, bevorzugt. Dabei kann der aromatische Ring vorzugsweise ein solcher sein, der aus Kohlenstoffatomen und Wasserstoffatomen besteht, wie z.B. Benzol, Naphthalin und Diphenyl. Noch bevorzugter sind solche, in denen eine oder mehrere hydrophile Gruppen, wie z.B. Sulfonatgruppen, an den oben angeführten aromatischen Ring gebunden sind. Bevorzugte Beispiele für solche anionische Tenside umfassen solche der nachstehenden Formeln (II) bis (VI):
    Figure 00070001
    Figure 00080001
  • In den Formeln (II) bis (VI) stehen die R unabhängig voneinander für unverzweigte oder verzweigte C4-C18-Alkylgruppen. Bevorzugte Beispiele für die anionischen Tenside, die im zweiten Schritt verwendet werden können, umfassen auch Natriumsulfate höherer Alkohole und dergleichen.
  • Die Konzentration der im zweiten Schritt verwendeten Tenside beträgt vorzugsweise etwa 0,1 bis 100 g/l, noch bevorzugter etwa 1 bis 50 g/l.
  • Andere bevorzugte Reaktionsbedingungen im zweiten Schritt sind gleich wie die bevorzugten Reaktionsbedingungen im ersten Schritt.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen detaillierter beschrieben. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die nachfolgenden Beispiele beschränkt ist. Beispiel 1 Erste Reagenzien
    BES-Puffer, pH 6,0 100 mmol/l
    HDAOS: N-(2-Hydroxysulfopropyl)-3,5-dimethyoxyanilin 0,7 mmol/l
    Cholesterin-Esterase von einem Bakterium der Gattung Pseudomonas (Handelsbezeichnung "CEN", von Asahi Chemical Industry Co. Ltd. erhältlich) 0,8 U/ml
    Cholesterin-Oxidase von einem Bakterium Streptomyces (Handelsbezeichnung "COO", von der Gattung Toyobo Co. Ltd. erhältlich) 0,5 U/ml
    Katalase 80 U/ml
    Magnesiumchlorid 10 mmol/l
    Emulgen B66, (Polyoxyethylenderivat (HLB = 13,2)), von der KAO CORPORATION erhältlich 0,2 %
    Zweite Reagenzien
    BES-Puffer, pH 7,0 50 mmol/l
    4-Aminoantipyrin 4,0 mmol/l
    Peroxidase 2,4 U/ml
    Natriumazid 0,1 %
    Emulgen A60 (Polyoxyethylenderivat (HLB = 12,8)), von der KAO CORPORATION erhältlich 5,0 %
  • Zu jeder dieser 4 Proben, die ein Volumen von 4 μl aufwiesen und gereinigtes HDL, LDL, VLDL und CM jeweils in einer Konzentration von 100 mg/dl enthielten, wurden 300 μl der oben beschriebenen ersten Reagenzien, die zuvor auf 37 °C vorerwärmt worden waren, zugesetzt, und jedes der resultierenden Gemische wurde 5 Minuten lang bei 37 °C reagieren gelassen. Danach wurden 100 μl der zweiten Reagenzien zu jedem Gemisch zugesetzt, und jedes der resultierenden Gemische wurde 5 Minu ten lang reagieren gelassen, wonach eine Messung der Extinktion bei 600 nm folgte. Basierend auf den gemessenen Extinktionen wurden die Mengen des Cholesterins sowie das Verhältnis zwischen der so ermittelten Menge und der Menge des Cholesterins in der Probe, das als einfangener Anteil definiert ist, ermittelt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1
    Figure 00100001
  • Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, wird der Hauptanteil des Cholesterins in LDL eingefangen, während das Cholesterin in anderen Lipoproteinen nicht wesentlich eingefangen wurde, sodass das Cholesterin in LDL selektiv quantifiziert werden kann. Beispiel 2 Erste Reagenzien
    PIPES-Puffer, pH 7,0 50 mmol/l
    HDAOS: 0,7 mmol/l
    Cholesterin-Esterase von einem Bakterium der Gattung
    Pseudomonas (Handelsbezeichnung "CEN", von Asahi Chemical Industry Co. Ltd. erhältlich) 0,8 U/ml
    Cholesterin-Oxidase von einem Bakterium der Gattung Streptomyces (Handelsbezeichnung "COO", von Toyobo Co. Ltd. erhältlich) 0,5 U/ml
    Katalase 80 U/ml
    Magnesiumchlorid 10 mmol/l
    Emulgen B66, von der KAO CORPORATION erhältlich 0,2 %
    Zweite Reagenzien
    PIPES-Puffer, pH 7,0 50 mmol/l
    4-Aminoantipyrin 4,0 mmol/l
    Peroxidase 2,4 U/ml
    Natriumazid 0,1
    Triton X100 3,0 %
  • Es wurden die gleichen Vorgänge wie in Beispiel 1 wiederholt und die Reaktivität für jedes Lipoprotein gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2
    Figure 00110001
  • Beispiel 3
  • Unter Verwendung von Seren normaler Individuen als Testproben wurden die Vorgänge in den Beispielen 1 oder 2 wiederholt, um die Konzentrationen von LDL-Cholesterin zum messen. Als Kontrollen wurden die Konzentrationen von LDL-Cholesterin in den Seren unter Anwendung der Friedewald-Gleichung (Clin. Chem. 41, 1414 (1995)) gemessen. Die Ergebnisse werden in den 1 und 2 gezeigt, welche die Korrelation zwischen den durch diese Verfahren erzielten Ergebnissen zeigen.
  • Wie aus den 1 und 2 hervorgeht, stimmten die Messergebnisse beider Verfahren gut überein, wodurch bewiesen werden konnte, dass Cholesterin in LDL mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens genau quantifiziert werden kann. Beispiel 4 Erste Reagenzien
    Good-Puffer, pH 7,0 50 mmol/l
    HDAOS: 0,7 mmol/l
    Cholesterin-Esterase 0,8 U/ml
    Cholesterin-Oxidase 0,5 U/ml
    Katalase 80 U/ml
    Magnesiumchlorid 10 mmol/l
    kationisches Tensid (Lauryltrimethylammoniumchlorid) 0,1 %
    Zweite Reagenzien
    4-Aminoantipyrin 4,0 mmol/l
    Peroxidase 2,4 U/ml
    Natriumazid 0,1 %
    nichtionisches Tensid (Polyoxyethylenlaurylether) 0,1 %
    • (Das nichtionische Tensid wurde in der zweiten Reaktion eingesetzt.)
  • 20 μm einer Probe wurden mit 180 μl der ersten Reagenzien, die zuvor auf 37 °C erwärmt worden waren, vermischt, und das resultierende Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 37 °C reagieren gelassen. Danach wurden 60 μl der zweiten Reagenzien zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 5 Minuten lang reagieren gelassen, wonach eine Messung der Extinktion bei 600 nm folgte.
  • 3 zeigt das Verhältnis zwischen der Konzentration des LDL-Cholesterins und der Extinktion. Wie aus 3 hervorgeht, kann das LDL-Cholesterin spezifisch und konzentrationsabhängig sogar in Gegenwart von HDL, VLDL und CM gemessen werden.
  • Beispiel 5
  • Unter Verwendung von Seren als Testproben wurden die gleichen Vorgänge wie in Beispiel 4 wiederholt, um die Konzentration des LDL-Cholesterins zu bestimmen. Als Kontrollen wurden die Konzentrationen von LDL-Cholesterin in den Seren unter Anwendung der Friedewald-Gleichung (Clin. Chem. 41, 1414 (1995)) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt. Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, stimmten die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Ergebnisse gut mit den gemäß der Friedewald-Gleichung berechneten Ergebnissen überein. Tabelle 3
    Figure 00130001

Claims (13)

  1. Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin in Lipoproteinen geringer Dichte in einer Testprobe, die Lipoproteine geringer Dichte, Lipoproteine hoher Dichte, Lipoproteine sehr geringer Dichte und/oder Chylomikron enthalten kann, wobei das Verfahren einen ersten Schritt des Entfernens von Cholesterin in Lipoproteinen hoher Dichte, Lipoproteinen sehr geringer Dichte und Chylomikron in einer Testprobe und einen zweiten Schritt der Quantifizierung des restlichen Cholesterins in der Testprobe umfasst, wobei der erste Schritt durch die Wirkung von Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase in Gegenwart eines Tensids, das auf Lipoproteine einwirkt, die keine Lipoproteine geringer Dichte sind, und durch Entfernen des gebildeten Wasserstoffperoxids durchgeführt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der zweite Schritt das Zusetzen eines Tensids, das zumindest auf das Lipoprotein geringer Dichte einwirkt, sowie das Quantifizieren des durch die Wirkung der Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase gebildeten Wasserstoffperoxids umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Tensid, welches zumindest auf das Lipoprotein geringer Dichte einwirkt, ein Tensid ist, das auf sämtliche Lipoproteine einwirkt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das im ersten Schritt verwendete Tensid, das auf Lipoproteine einwirkt, die keine Lipoproteine geringer Dichte sind, ein Polyalkylenoxidderivat mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 13 und nicht mehr als 15 ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, worin das im zweiten Schritt verwendete Tensid, das auf sämtliche Lipoproteine einwirkt, ein Polyalkylenoxidderivat mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 11 und weniger als 13 ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das im ersten Schritt verwendete Tensid, das auf Lipoproteine einwirkt, die keine Lipoproteine geringer Dichte sind, ein kationisches Tensid ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das kationische Tensid ein quaternäres Ammoniumsalz aufweist.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, worin das im zweiten Schritt verwendete Tensid, das zumindest auf Lipoproteine geringer Dichte einwirkt, ein anionisches Tensid ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der erste Schritt bei einer Tensidkonzentration von 0,1 bis 10 g/l durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 5 oder 8, worin das Polyoxyalkylenderivat mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 11 und weniger als 13 oder das im zweiten Schritt verwendete anionische Tensid eine Konzentration von 1 bis 100 g/l aufweisen.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der erste und zweite Schritt in einem Puffer mit einem pH von 5 bis 8 durchgeführt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Puffer ein Amin enthält.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der erste und zweite Schritt bei einer Temperatur von 25 bis 40 °C durchgeführt werden.
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