WO1998047005A1 - Procede pour determiner le taux de cholesterol present dans des lipoproteines de basse densite - Google Patents

Description

明細書

低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法

技術分野

本発明は、 動脈硬化症の臨床診断に重要な低密度リポ蛋白 （L D L) 中のコレス テロール （以下、 「し D Lコレステロール」 ということがある。 本明細書において 単に 「コレステロール」 という場合にはエステル型コレステロール及び遊離型コレ ステロールの両者を包含する） の分別定量法に関する。

背景技術

LD Lは血液中におけるコレステロール運搬の主役であり粥状動脈硬化において 血管壁に沈着したコレステロールは主に LDしに由来している。 血漿における LD Lの増加は虚血性心疾患等の粥状硬化性疾患の主要な危険因子の 1つであり、 L D Lコレステロールを分別定量することは臨床的に有用である。

従来の LD Lコレステロールの定量法は、 分画操作とコレステロール定量操作の 2段階から求める方法と血中の総コレステロール、 H D L中のコレステロール、 ト リグリセリ ドをそれぞれに求める F r i e d e w a I dの式により算出する方法が める。

分画操作には、 超遠心法、 沈殿法、 免疫化学的方法等がある。 超遠心法を用いる 場合には、 比重の差を利用して超遠心分離機により L D Lを分離し、 そのコレステ ロール量を測定するものである。 沈殿法は H D L抗体、 ポリア二オン及び 2価の陽 イオンを添加し、 不溶性沈殿物を生成させて遠心分離により上清中の LD Lコレス テロールを定量する方法 （WPI Acc No.85-116848/20)である。 免疫化学的方法は H D L、 V LD L、 CMに対する抗体をラテックスに結合させ、 凝集反応後に遠心又 はフィルタにより取り除き、 LD Lコレステロールを定量する方法 （WPI Acc No.8 4-301275/49)が報告されているが、 いずれも簡便性や経済性に問題がある。

F r i e d e w a I dの式では総コレステロールから H D Lコレステロールを引 き、 さらに卜リグリセリ ドの 1ノ 5量を引き L D Lコレステロールを求める。 しか し、 食事の影響や個体差を加味していないため正確性に問題がある。

また近年、 分画操作を要しない LD Lコレステロールの定量法 （WPI Acc No.83 - 766269/38)が報告されているが、 L D Lに対する特異性が不十分である。

発明の開示

本発明の課題は、 煩雑な遠心分離操作を要せず、 L D Lコレステロールを簡便に 分別定量する方法を提供することである。

本願発明者らは第 1工程で低密度リポ蛋白中のコレステロール以外のコレステロ ールを消去し、 続く第 2工程において残存するコレステロールを測定することによ リ、 低密度リポ蛋白中のコレステロールを定量することができることを見出し本願 発明を完成した。

すなわち、 本発明は、 被検試料中の高密度リポ蛋白、 超低密度リポ蛋白及びカイ 口ミクロン中のコレステロールを消去する第 1工程と、 次いで、 被検試料中の残存 コレステロールを定量する第 2工程とから成る、 低密度リポ蛋白、 高密度リポ蛋白、 超低密度リポ蛋白及びノ又は力イロミクロンを含むかもしれない被検試料中の低密 度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を提供する。

本発明により、 煩雑な遠心分離操作を要せず簡便に L D Lコレステロールを分別 定量する方法が提供された。

図面の簡単な説明

図 1は、 実施例 1における L D Lコレステロールの測定結果と、 Friedewald算出 値との相関関係を示す図である。

図 2は、 実施例 2における LD Lコレステロールの測定結果と、 Friedewald算出 値との相関関係を示す図である。

図 3は、 実施例 4において HD L、 V LD L及び CM非存在下及び存在下におけ る L D Lコレステロール濃度と本発明の方法によリ測定された吸光度との相関関係 を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、 エステル型コレステロール （コ レステロールエステル） 及び遊離型コレステロールがある。 本明細書において、 単 に 「コレステロール」 という場合には、 これらの両者を包含する。

本発明の方法に供される被検試料としては、 HD L、 LD L、 V L D L及び CM 等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、 例えば、 血 液、 血清、 血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定される ものではない。

本発明の方法は、 第 1工程及び第 2工程から成り、 第 1工程では被検試料中の H Dし、 VL D L及び CM中のコレステロールを消去し、 続く第 2工程では、 被検試 料中の残存コレステロールを定量する。 第 1工程で HD L、 V LD L及び CM中の コレステロールが消去されているので、 第 2工程で定量されるコレステロールは、 主として被検試料中の LD L中のコレステロールである。

第 1工程における 「消去」 とは、 コレステロールを分解し、 かつ、 その分解産物 が次の第 2工程で検出されないようにすることを意味する。 LD L以外のリポ蛋白、 すなわち、 HD L、 V L D L、 CM等に含まれるコレステロールを選択的に消去す る方法としては以下の方法を挙げることができる。

すなわち、 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下におい て、 コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼを作用させ、 生 じた過酸化水素を消去する。

過酸化水素を消去する方法としては、 カタラーゼを作用させて水と酸素に分解す る方法、 及びペルォキシダーゼを用いてフエノール系又はァニリン系水素供与体化 合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、 これらに限定されるものではない。

第 1工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は 0. 2〜1. O UZm

I程度が好ましく、 由来としてはシユードモナス属細菌から生成されるものが効果 的である。 また、 コレステロールォキシダ一ゼの濃度は 0. 1 〜 0. 7 UZm l 程度が好ましく、 細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。 さらに、 力タラ ーゼの濃度は 40〜1 O O UZm I程度が好ましい。 また、 過酸化水素を無色キノ ンへ転化する場合のペルォキシダーゼの濃度は 0. 4〜1 . O U m lが好ましく、 フエノール系又はァニリン系水素供与体化合物の濃度としては 0. 4〜0. 8mm o I ZLが好ましい。

第 1工程で用いられる、 LD L以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい 例として、 1"11_巳値が1 3以上 1 5以下、 好ましくは 1 3以上 1 4以下であるポリ アルキレンォキサイド誘導体を挙げることができる。 誘導体の例としては高級アル コール縮合物、 高級脂肪酸縮合物、 高級脂肪酸アミド縮合物、 高級アルキルアミン 縮合物、 高級アルキルメルカブタン縮合物、 アルキルフエノール縮合物を挙げるこ とができる。 なお、 界面活性剤の H LB算出方法は周知であり、 例えば 「新界面活 性剤」 、 堀内博著、 昭和 61年、 三共出版に記載されている。

H LB値が 1 3以上 1 5以下のポリアルキレンォキサイド誘導体の好ましい具体 例としては、 ポリオキシエチレンラウリルエーテル、 ポリオキシエチレンセチルェ 一テル、 ポリオキシエチレンォレイルエーテル、 ポリオキシエチレン高級アルコー ルエーテル、 ポリオキシエチレンォクチルフエニルエーテル、 ポリオキシエチレン ノニルフ Iニルエーテル等で H LB値が 1 3以上 1 5以下の化合物を挙げることが できるがこれらに限定されるものではない。

また、 第 1工程で用いられる界面活性剤として陽イオン界面活性剤を用いること もできる。 この場合の陽イオン界面活性剤としては、 下記一般式 （ で示される、 第 4級アンモニゥム塩を親水基として有するものが好ましい。

R

R— N^— R C1" (I)

R ただし、 式 （ I ) 中、 Rは互いに独立に、 炭素数 1〜 8の直鎖状のアルキル基を示 し、 R1 は炭素数 3〜 20のアルケニル基を示す。

第 1工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、 0. 1〜1 0 gZ I程度が好ま しく、 さらに好ましくは 0. 5〜5. O gZ l程度である。

第 1工程は、 p H5〜8の緩衝液中で行うことが好ましく、 緩衝液としてはトリ ス、 トリエタノールァミン、 ダットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。 特にグッ卜緩衝液である B i s— T r i s、 P I PES, MOPSO、 BES、 H E PES及び POPS Oが好ましく、 緩衝液の濃度は 1 0〜50 OmM程度が好ま しい。

第 1工程で、 LD Lとの反応を抑え、 他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために, 反応液中に 2価の金属イオンを含ませてもよい。 2価の金属イオンとしては銅ィォ ン、 鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用することができるが、 特にマグネシゥ ムイオンが好ましい。 2価の金属ィォンの濃度は 5〜 2 0 0 mM程度が好ましい。 なお、 第 1工程の反応液中には、 任意的に、 リポ蛋白分解酵素を加えることもで きる。 この酵素を加えることにより、 特に V L D L中のコレステロールが反応しや すくなるので好ましい。 この酵素の反応液中濃度は、 5 . 0〜1 0 . O U Zm l程 度が好ましい。

第 1工程の反応温度は 2 5〜4 0 °C程度が適当であり、 3 7 °Cが最も好ましい。 また、 反応時間は 2〜1 0分間程度でよい。

続く第 2工程では、 被検試料中の残存コレステロールを定量する。 これは、 例え ば、 少なくとも L D Lに作用する界面活性剤を加え、 第 1工程で加えたコレステロ ールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼの作用により生じた過酸化水素 を定量することにより行なうことができる。 ここで、 少なくとも L Dしに作用する 界面活性剤は、 L D Lのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、 全てのリポ 蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。

全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、 H L B値が 1 1以上 1 3未満、 好ましくは 1 2以上 1 3未満であるポリアルキレンォキサイド誘導体を 挙げることができる。 誘導体の例としては高級アルコール縮合物、 高級脂肪酸縮合 物、 高級脂肪酸アミド縮合物、 高級アルキルアミン縮合物、 高級アルキルメルカプ タン縮合物、 アルキルフエノール縮合物を挙げることができる。

H L B値が 1 1以上 1 3未満のポリアルキレンォキサイド誘導体の好ましい具体 例として、 ポリオキシエチレンラウリルエーテル、 ポリオキシエチレンセチルエー テル、 ポリオキシエチレンォレイルエーテル、 ポリオキシエチレン高級アルコール エーテル、 ポリオキシエチレンォクチルフエ二ルエーテル、 ポリオキシエチレンノ ニルフエニルエーテル等で H L B値が 1 1以上 1 3未満の化合物を挙げることがで きるがこれらに限定されるものではない。

また、 L D Lのみに選択的に作用する界面活性剤として、 陰イオン界面活性剤を 挙げることができる。 ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、 特に限定さ /JP97/03663

6 れないが、 芳香環に炭素数 4〜1 8の直鎖状又は分枝状アルキル基が結合したもの を有するものが好ましい。 ここで、 芳香環は、 ベンゼン、 ナフタレン、 ジフェニー ル等のように炭素と水素のみから成るものが好ましい。 さらに、 上記芳香環にスル ホン酸塩のような親水基が結合したものが好ましい。 このような好ましい陰イオン 界面活性剤の例を下記式 （II) ないし （VI) に示す。

但し、 式 （II) 〜 （VI) において、 Rはそれぞれ独立に炭素数 4〜1 8の直鎖状又 は分枝状アルキル基を示す。 また、 第 2工程で用いられる好ましい陰イオン界面活 性剤として、 高級アルコール硫酸ナトリウム等を挙げることができる。

第 2工程で用いられる界面活性剤の濃度は、 0. 1〜1 OO gZ I程度が好まし く、 さらに好ましくは 1 〜50 I程度である。

第 2工程のその他の好ましい反応条件は、 第 1工程における好ましい反応条件と 同様である。

以下、 本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。

実施例 1

第 1試薬

BES緩衝液、 p H 6.0 100 mmol/L

HDA0S:N -（2—ヒドロキシスルホプロピル）- 3,5- ジメチォキシァニリン 0.7 mmol/L シユードモナス属細菌由来コレステロールエステラーゼ

(旭化成工業社製商品名 Γ〇ΕΝ」 ） 0.8 U/ml ストレブトミセス属細菌由来コレステロールォキシダーゼ

(東洋紡績社製商品名 「COO」 ） 0.5 U/ml カタラーゼ 80 U/ml 塩化マグネシウム 10 隱 ol/L 花王社製ェマルゲン B 66

(ポリオキシエチレン誘導体 （HLB=13.2) ) 0.2 % 第 2試薬

BES緩衝液、 p H 7.0 bl) 國 ol/し 4- ァミノアンチピリン 4.0 mmo I /し ペルォキシダーゼ 2.4単位/ ml アジ化ナトリウム 0.1%

花王社製ェマルゲン A 60

(ポリオキシエチレン誘導体 （HLB=12.8) ) 5.0%

コレステロール濃度として 100mg/dlに精製した HD L、 Dし、 V l_ Dし、 C

Mをそれぞれ含む 4 種類の試料各 4 μ I に、 あらかじめ 37°Cで加温した第 1試薬 300 μ I を混和し、 37°Cで 5 分間反応させた後に、 第 2試薬 100 μ I を加え 5 分 間反応させ、 600nm における吸光度を測定した。 測定された吸光度からコレステロ 一ル量を算出し、 試料中のコレステロール量との比を計算して捕捉率を求めた。 結 果を下記表 1に示す。

表 1

表 2に示されるように、 上記方法によれば、 L D L中のコレステロールはかなり の部分について捕らえているが、 それ以外のリポ蛋白中コレステロールはほとんど 捕らえておらず、 LD L中コレステロールを選択的に定量できることがわかる。 実施例 2

第 1試薬

P I PES緩衝液、 p H 7.0 50隱 ol/し

H D AOS 0.7睡 ol/し シユードモナス属細菌由来コレステロールエステラーゼ

(旭化成工業社製商品名 「CENJ ) 0.8 U/ml ストレプトミセス属細菌由来コレステロールォキシダーゼ

(東洋紡績社製商品名 「COO」 ） 0.5 U/ml カタラーゼ 80 U/ml 塩化マグネシウム 10睡 ol/L 花王社製ェマルゲン B 66 0.2 % 第 2試薬

P I PES緩衝液、 p H 7.0 50訓 olん

4- ァミノアンチピリン 4.0 mmol/し ペルォキシダーゼ 2.4単位/ ml アジ化ナトリウム 0.1% Triton X 100 3.0%

実施例 1 と同様な操作を行い各リポ蛋白との反応性を求めた。 結果を下記表 2 示す。

表 2

実施例 3

試料として健常人血清を用い、 実施例 1、 2の操作を行い、 LD Lコレステロ一 ル濃度を求めた。 対照法として F r i e d e wa I dの計算式 （GLIN.CHEM.、 41、 1414、 1995) を用いて血清中の LD Lコレステロール濃度を求めた。 その結果を図 1及び図 2の相関図として示した。

図 1及び図 2に示されるように、 両方法による定量結果は非常によく一致してお リ、 本発明の方法により正確に LD L中のコレステロールが定量できることが明ら かになつた。

実施例 4

第 1試薬

グッド緩衝液、 p H 7. 0 50 mmo I / I

H D AOS 0. I mmoi

コレステロールエステラーゼ 0.8 U/ml

コレステロールォキシダーゼ 0.5 U/ml

カタラーゼ 80 単位/ ml

陽イオン界面活性剤 （ラウリルトリメチル

アンモニゥ厶クロライド） 0.1% 第 2I¾喿

4ーァミノアンチピリン 4.0 mmol/l

ペルォキシダーゼ 2.4 単位/ ml CT P97/03663

0 アジ化ナトリウム o.n

非イオン界面活性剤 （ポリオキシエチレン

ラウリルエーテル） 0.1%

(非ィォン界面活性剤は第 2反応に使用）

試料 20 μ Iに予め 37°Cで加温した第 1試薬 1 80 I を混和し、 37°Cで 5 分間反応させた後に、 第 2試薬を 60 I加え 5分間反応させ 600 nmにおける 吸光度を測定した。

図 3は LDLコレステロール濃度と吸光度との関係を示すもので、 HD L、 V L D L及び CM存在下においても L D Lコレステロールを特異的かつ濃度依存的に測 定できることを示している。

実施例 5

試料として血清を用い、 実施例 4の操作を行い LD Lコレステロール濃度を求め た。 対照法として Friedewaldの計算式 (CLIN. CHEM.， 41， 1414, 1995)を用いて血清 中の LD Lコレステロール濃度を求めた。 その結果を表 3に示す。 表 3に示すよう に、 本発明の方法による結果は Friedwald の計算式による結果と良好な相関を示し

表 3

Fr idewald 実施例 4

検体 1 73.0 60.1

2 91.0 85.8

3 136.4 124.0

4 97.7 98.0

5 75.2 81.8

6 195.7 195.4

7 140.5 112.9

8 112.8 113.2

9 160.6 153.5

1 0 120.4 111.1

Claims

請求の範囲

1 . 被検試料中の高密度リポ蛋白、 超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコ レステロールを消去する第 1工程と、 次いで、 被検試料中の残存コレステロールを 定量する第 2工程とから成る、 低密度リポ蛋白、 高密度リポ蛋白、 超低密度リポ蛋 白及び Z又はカイロミクロンを含むかもしれない被検試料中の低密度リポ蛋白中の コレステロールの定量方法。

2 . 前記第 1工程は、 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存 在下において、 コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼを作 用させ、 生じた過酸化水素を消去することから成る、 請求項 1記載の方法。

3 . 前記第 2工程は、 前記第 1工程の産物に、 少なくとも低密度リポ蛋白に作用 する界面活性剤を加え、 前記コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキ シダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することから成る、 請求項 2記載の 方法。

4 . 前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用する界面活性剤は、 全てのリポ蛋白に 作用するものである請求項 3記載の方法。

5 . 前記第 1工程で用いられる、 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面 活性剤は、 H L B値が 1 3以上 1 5以下であるポリアルキレンォキサイド誘導体で ある請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の方法。

6 . 前記第 2工程で用いられる、 全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤は、 H L B値が 1 1以上 1 3未満であるポリアルキレンォキサイド誘導体である請求項 4記 載の方法。

7 . 前記第 1工程で用いられる、 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面 活性剤は陽イオン界面活性剤である、 請求項 2記載の方法。

8 . 前記陽ィォン界面活性剤は第 4級ァンモニゥム塩を有する請求項 7記載の方 法。

9 . 前記第 2工程で用いられる、 少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性 剤は陰イオン界面活性剤である請求項 3記載の方法。

1 0 . 前記第 1工程は、 前記界面活性剤濃度を 0 . 1 〜 1 0 gノ I として行われ る請求項 2ないし 9のいずれか 1項に記載の方法。

1 1. 前記第 2工程は、 ^1し8値が1 1以上 1 3未満である前記ポリオキシアル キレン誘導体又は前記陰イオン界面活性剤の濃度を 1〜1 OO gZ I として行われ る請求項 6又は 9記載の方法。

1 2. 前記第 1及び第 2の工程は、 pH5〜8の緩衝液中で行なわれる請求項 1 ないし 1 1のいずれか 1項に記載の方法。

1 3. 前記緩衝液はァミンを含む請求項 1 2記載の方法。

1 4. 上記第 1及び第 2工程は、 温度 25〜 40 °Cで行なう請求項 1ないし 1 3 のいずれか 1項に記載の方法。