KR100540086B1 - 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법 - Google Patents

Abstract

번잡한 원심분리조작을 필요로 하지 않고, LDL콜레스테롤을 간편하게 분별정량하는 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량방법은, 피검시료 중의 고밀도 리포단백질, 초저밀도 리포단백질 및 카이로미크론 중의 콜레스테롤을 제거하는 제1공정과, 이어서 피검시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량하는 제2공정으로 이루어진다.

Description

저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법{METHOD FOR QUANTITATING CHOLESTEROL PRESENT IN LOW DENSITY LIPOPROTEINS}

본 발명은, 동맥경화증의 임상진단에 중요한 저밀도 리포단백질(LDL)중의 콜레스테롤(이하, 「LDL콜레스테롤」이라고 하는 경우가 있다. 본 명세서에서 간단히 「콜레스테롤」이라고 하는 경우에는 에스테르형 콜레스테롤 및 유리형(遊離型) 콜레스테롤의 양자를 포함한다)의 분별정량법에 관한 것이다.

LDL은, 혈액중에서의 콜레스테롤 운반의 주역인 죽상(粥狀) 동맥경화에 있어서 혈관벽에 달라붙는 콜레스테롤은 주로 LDL에 유래하고 있다. 혈장에서의 LDL의 증가는 허혈성(虛血性)심질환 등의 죽상 경화성 질환의 주요한 위험인자 중 하나이며, LDL콜레스테롤을 분별정량하는 것은 임상적으로 유용하다.

종래의 LDL콜레스테롤의 정량법은, 분화조작과 콜레스테롤 정량조작의 2단계로부터 얻는 방법과 혈중의 총 콜레스테롤, HDL중의 콜레스테롤, 트리글리세리드를 각각 구하는 Friedewald식에 의해 산출하는 방법이 있다.

분화조작에는 초원심법, 침전법, 면역화학적 방법 등이 있다. 초원심법을 사용하는 경우에는, 비중차를 이용하여 초원심분리기에 의해 LDL을 분리하고, 그 콜레스테롤량을 측정한다. 침전법은 HDL항체, 폴리음이온 및 2가의 양이온을 첨가하고, 불용성 침전물을 생성시켜서 원심분리에 의해 상청 중의 LDL콜레스테롤을 정량하는 방법(WPI Acc No.85-116848/20)이다. 면역화학적 방법은 HDL, VLDL, CM에 대한 항체를 라텍스에 결합시키고, 응집반응후에 원심 또는 필터에 의해 제거하고, LDL콜레스테롤을 정량하는 방법(WPI Acc No.84-301275/49)이 보고되어 있지만, 모두 간편성이나 경제성에 문제가 있다.

Friedewald식에서는 총 콜레스테롤로부터 HDL콜레스테롤을 인출하고, 트리글리세리드의 1/5량을 더 인출하여 LDL콜레스테롤을 구한다. 그러나, 식사의 영향이나 개체차를 가미하고 있지 않기 때문에 정확성에 문제가 있다.

또한 최근에, 분화조작을 필요로 하지 않는 LDL콜레스테롤의 정량법(WPI Acc No.83-766269/38)이 보고되고 있지만, LDL에 대한 특이성이 불충분하다.

본 발명의 과제는, 번잡한 원심분리조작을 필요로 하지 않고, LDL콜레스테롤을 간편하게 분별정량하는 방법을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 제1공정에서 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 이외의 콜레스테롤을 제거하고, 다음 제2공정에서 잔존하는 콜레스테롤을 측정함으로써, 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다는 것을 발견하여 본원 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 피검시료 중의 고밀도 리포단백질, 초저밀도 리포단백질 및 카이로미크론 중의 콜레스테롤을 소거하는 제1공정과, 이어서 피검시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량하는 제2공정으로 이루어지고, 저밀도 리포단백질, 고밀도 리포단백질, 초저밀도 리포단백질 및/또는 카이로미크론을 포함할 수도 있는 피검시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법을 제공한다.

본 발명에 의해, 번잡한 원심분리조작을 필요로 하지 않고 간편하게 LDL콜레스테롤을 분별정량하는 방법이 제공된다.

도 1은, 실시예 1에 있어서의 LDL콜레스테롤의 측정결과와, Friedewald 산출값과의 상관관계를 나타내는 도면이다.

도 2는, 실시예 2에 있어서의 LDL콜레스테롤의 측정결과와, Friedewald 산출값과의 상관관계를 나타내는 도면이다.

도 3은, 실시예 4에 있어서의, HDL, VLDL 및 CM 비존재 및 존재하에서의 LDL콜레스테롤 농도와 본 발명의 방법에 의해 측정된 흡광도와의 상관관계를 나타내는 도면이다.

리포단백질 중에 포함되는 콜레스테롤로서는, 에스테르형 콜레스테롤(콜레스테롤 에스테르) 및 유리형 콜레스테롤이 있다. 본 명세서에서, 간단히 「콜레스테롤」이라고 하는 경우에는 이들 양자를 포함한다.

본 발명의 방법에 제공되는 피검시료로서는, HDL, LDL, VLDL 및 CM 등의 리포단백질을 포함할 수도 있는 시료이면 어느 것이어도 좋고, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장 등의 체액이나 그 희석물을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 제1공정 및 제2공정으로 이루어지고, 제1공정에서는 피검시료 중의 HDL, VLDL 및 CM 중의 콜레스테롤을 소거하고, 다음 제2공정에서는 피검시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량한다. 제1공정에서 HDL, VLDL 및 CM 중의 콜레스테롤이 소거되어있으므로, 제2공정에서 정량되는 콜레스테롤은 주로 피검시료의 LDL 중의 콜레스테롤이다.

제1공정에 있어서의 「소거」란, 콜레스테롤을 분해하고, 또 이 분해산물이 다음 제2공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. LDL 이외의 리포단백질, 즉 HDL, VLDL, CM 등에 함유되는 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법으로는 이하의 방법을 들 수 있다.

즉, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 생긴 과산화수소를 소거한다.

과산화수소를 소거하는 방법으로는, 카탈라아제를 작용시켜 물과 산소로 분해하는 방법 및 페록시다아제를 사용하여 페놀계 또는 아닐린계 수소공여체 화합물과 과산화수소를 반응시켜서 무색 퀴논으로 전화하는 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

제1공정의 반응액 중의 콜레스테롤 에스테라아제 농도는 0.2∼1.0 U/ml 정도가 바람직하고, 유래적으로는 슈도모나스속 세균으로부터 생성되는 것이 효과적이다. 또한, 콜레스테롤 옥시다아제의 농도는 0.1∼0.7 U/ml 정도가 바람직하고, 세균이나 효모로부터 유래된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱이, 카탈라아제의 농도는 40∼100 U/ml 정도가 바람직하다. 또, 과산화수소를 무색 퀴논으로 전환하는 경우의 페록시다아제의 농도는 0.4∼1.0 U/ml가 바람직하고, 페놀계 또는 아닐린계 수소공여체 화합물의 농도로는 0.4∼0.8mmol/L가 바람직하다.

제1공정에서 사용되는 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로는, HLB값이 13이상 15이하, 바람직하게는 13이상 14이하인 폴리알킬렌옥사이드 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로는 고급 알콜 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다. 또, 계면활성제의 HLB 산출방법은 공지되어 있으며, 예컨대 「신계면활성제」, 굴내박(掘內博)저, 소화 61년, 삼공출판에 기재되어 있다.

HLB 값이 13이상 15이하인 폴리알킬렌옥사이드 유도체의 바람직한 구체적인 예로는, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급알콜에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등으로 HLB 값이 13이상 15이하인 화합물을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 제1공정에서 사용되는 계면활성제로서 양이온 계면활성제를 사용할 수도 있다. 이 경우의 양이온 계면활성제로는, 하기 화학식(Ⅰ)으로 표시되는 제4급 암모늄염을 친수기로서 보유하는 것이 바람직하다.

단, 식(Ⅰ)중, R은 서로 독립적으로, 탄소수 1∼8의 직쇄형 알킬기를 나타내고, R1은 탄소수 3∼20의 알케닐기를 나타낸다.

제1공정에서 사용되는 상기 계면활성제의 농도는, 0.1∼10g/l 정도가 바람직하고, 더 바람직하게는 0.5∼5.0g/l 정도이다.

제1공정은 pH 5∼8의 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하고, 완충액으로는 트리스, 트리에탄올아민, 구드(Good)의 완충액 등의 아민을 포함하는 완충액이 바람직하다. 특히 구드 완충액인 Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES 및 POPSO가 바람직하고, 완충액의 농도는 10∼500mM 정도가 바람직하다.

제1공정에서, LDL과의 반응을 억제하고 다른 리포단백질의 소거를 더욱 높이기 위하여, 반응액 중에 2가의 금속이온을 함유시켜도 좋다. 2가의 금속이온으로는 구리이온, 철이온 및 마그네슘 이온을 사용할 수 있지만, 특히 마그네슘 이온이 바람직하다. 2가의 금속이온의 농도는 5∼200mM 정도가 바람직하다.

또, 제1공정의 반응액 중에는 임의적으로 리포단백질 분해효소를 첨가할 수가 있다. 이 효소를 첨가함으로써, 특히 VLDL 중의 콜레스테롤이 반응하기 쉽게 되므로 바람직하다. 이 효소의 반응액 중 농도는, 5.0∼10.0 U/ml 정도가 바람직하다.

제1공정의 반응온도는 25∼40℃ 정도가 적당하고, 37℃가 가장 바람직하다. 또한, 반응시간은 2∼10분 사이의 정도가 좋다.

다음 제2공정에서는 피검시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량한다. 이것은, 예컨대 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제를 첨가하고, 제1공정에서 가해진 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제의 작용에 의해 생긴 과산화수소를 정량함으로써 행해질 수 있다. 여기에서, 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제는, LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제이어도 좋고, 모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제이어도 좋다.

모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로는, HLB 값이 11이상 13미만, 바람직하게는 12이상 13미만인 폴리알킬렌옥사이드 유도체를 들 수가 있다. 유도체의 예로는 고급 알콜 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수가 있다.

HLB 값이 11이상 13미만인 폴리알킬렌옥사이드 유도체의 바람직한 구체적인 예로는, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등으로 HLB 값이 11이상 13미만인 화합물을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제로는 음이온 계면활성제를 들 수 있다. 여기에서 사용되는 음이온 계면활성제로는, 특별히 한정되지는 않지만, 방향환에 탄소수 4∼18의 직쇄형 또는 분지형 알킬기가 결합된 것을 보유한 것이 바람직하다. 여기에서, 방향환은 벤젠, 나프탈렌, 디페닐 등과 같이 탄소와 수소만으로 이루어진 것이 바람직하다. 또한, 상기 방향환에 술폰산염과 같은 친수성기가 결합된 것이 바람직하다. 이와 같은 바람직한 음이온 계면활성제의 예를 하기 화학식(Ⅱ) 내지 (Ⅵ)으로 나타낸다.

단, 식 (Ⅱ)∼(Ⅵ)에서, R은 각각 독립적으로 탄소수 4∼18의 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 나타낸다. 또한 제2공정에서 사용되는 바람직한 음이온 계면활성제로는 고급 알콜 황산나트륨 등을 들 수 있다.

제2공정에서 사용되는 계면활성제의 농도는, 0.1∼100g/l 정도가 바람직하고, 더 바람직하게는 1∼50g/l 정도이다.

제2공정의 그 이외의 바람직한 반응조건은 제1공정에서의 바람직한 반응조건과 동일하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

(제1시약)

BES 완충액, pH 6.0 100 mmol/L

HDAOS:N-(2-하이드록시술포프로필)-3,5-디메틸옥시아닐린 0.7 mmol/L

슈도모나스속 세균 유래의 콜레스테롤 에스테라아제

(욱화성공업사(旭化工業社)제 상품명 「CEN」) 0.8 U/ml

스트렙토미세스속 세균 유래의 콜레스테롤 옥시다아제

(동양방적사(東洋紡積社)제 상품명 「COO」) 0.5 U/ml

카탈라아제 80 U/ml

염화마그네슘 10 mmol/L

화왕사(花王社)제 에멀겐 B66

(폴리옥시에틸렌 유도체 (HLB=13.2)) 0.2%

(제2시약)

BES 완충액, pH 7.0 50 mmol/L

4-아미노안티피린 4.0 mmol/L

페록시다아제 2.4 단위/ml

아디화 나트륨 0.1%

화왕사제 에멀겐 A60

(폴리옥시에틸렌 유도체 (HLB=12.8)) 5.0%

콜레스테롤 농도로서 100mg/dl로 정제한 HDL, LDL, VLDL, CM 을 각각 함유하는 4종류의 시료 각 4㎕에 미리 37℃의 온도로 가열한 제1시약 300㎕을 혼합하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 제2시약 100㎕을 첨가하여 5분간 반응시키고, 600nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도로부터 콜레스테롤의 양을 산출하고, 시료 중의 콜레스테롤 양과의 비를 산출하여 포착율을 구하였다. 결과를 하기의 표 1에 나타낸다.

포착율
CM	VLDL	LDL	HDL
＜1.0%	＜5.0%	70.0%	＜1.0%

표 2에 나타내는 바와 같이, 상기 방법에 의하면, LDL 중의 콜레스테롤은 상당 부분에 대하여 포착되지만, 그 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤은 거의 포착되어 있지 않으므로, LDL 중 콜레스테롤을 선택적으로 정량할 수 있음을 알 수 있다.

(실시예 2)

(제1시약)

PIPES 완충액, pH 7.0 50 mmol/L

HDAOS 0.7 mmol/L

슈도모나스속 세균 유래의 콜레스테롤 에스테라아제

(욱화성공업사제 상품명 「CEN」) 0.8 U/ml

스트렙토미세스속 세균 유래의 콜레스테롤 옥시다아제

(동양방적사제 상품명 「COO」) 0.5 U/ml

카탈라아제 80 U/ml

염화마그네슘 10 mmol/L

화왕사제 에멀겐 B66 0.2%

(제2시약)

PIPES 완충액, pH 7.0 50 mmol/L

4-아미노안티피린 4.0 mmol/L

페록시다아제 2.4 단위/ml

아디화 나트륨 0.1%

Triton ×100 3.0%

실시예 1과 동일한 조작을 행하여 각 리포단백질과의 반응성을 구하였다. 결과를 하기의 표 2에 나타낸다.

포착율
CM	VLDL	LDL	HDL
＜1.0%	＜5.0%	71.0%	＜1.0%

(실시예 3)

시료로서 건장한 사람의 혈청을 사용하고, 실시예 1, 2의 조작을 행하여, LDL콜레스테롤 농도를 구하였다. 대조법으로서 Friedewald의 계산식(CLIN. CHEM., 41, 1414, 1995)을 이용하여 혈청 중의 LDL콜레스테롤 농도를 구하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2의 상관도로서 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타내듯이, 양 방법에 의한 정량결과는 매우 잘 일치하고 있어, 본 발명의 방법에 의해 정확하게 LDL 중의 콜레스테롤이 정량될 수 있음이 밝혀졌다.

(실시예 4)

(제1시약)

구드 완충액, pH 7.0 50 mmol/l

HDAOS 0.7 mmol/l

콜레스테롤 에스테라아제 0.8 U/ml

콜레스테롤 옥시다아제 0.5 U/ml

카탈라아제 80 단위/ml

양이온 계면활성제(라우릴트리메틸암모늄클로라이드) 0.1%

(제2시약)

4-아미노안티피린 4.0 mmol/l

페록시다아제 2.4 단위/ml

아디화 나트륨 0.1%

비이온 계면활성제(폴리옥시에틸렌라우릴에테르) 0.1%

(비이온 계면활성제는 제2반응에 사용)

시료 20㎕에 미리 37℃의 온도로 가열한 제1시약 180㎕를 혼합하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 제2시약을 60㎕ 첨가하고 5분간 반응시켜 600nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 3은 LDL콜레스테롤 농도와 흡광도와의 관계를 나타낸 것으로서, HDL, VLDL 및 CM 존재하에서도 LDL콜레스테롤을 특이적이고도 농도의존적으로 측정할 수 있음을 보여주고 있다.

(실시예 5)

시료로서 혈청을 사용하고, 실시예 4의 조작을 행하여 LDL콜레스테롤 농도를 구하였다. 대조법으로서 Friedewald의 계산식(CLIN. CHEM., 41, 1414, 1995)을 이용하여 혈청 중의 LDL콜레스테롤 농도를 구하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내듯이, 본 발명의 방법에 의한 결과는 Friedewald의 계산식에 의한 결과와 양호한 상호관련성을 나타내었다.

	Friedewald	실시예 4
검체 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	73.0 91.0 136.4 97.7 75.2 195.7 140.5 112.8 160.6 120.4	60.1 85.8 124.0 98.0 81.8 195.4 112.9 113.2 153.5 111.1

Claims (14)

1. 피검시료 중의 고밀도 리포단백질, 초저밀도 리포단백질 및 카이로미크론 중의 콜레스테롤을 제거하는 제1공정과, 이어서 피검시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량하는 제2공정으로 이루어지는, 저밀도 리포단백질, 고밀도 리포단백질, 초저밀도 리포단백질 및 카이로미크론 중 1 이상을 포함하는 피검시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1공정이, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 생긴 과산화수소를 소거하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 제2공정이, 상기 제1공정의 산물에 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제를 첨가하고, 상기 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제의 작용에 의해 생긴 과산화수소를 정량하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 적어도 저밀도 리포단백질과 작용하는 계면활성제는 모든 리포단백질에 작용하는 것임을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1공정에서 사용되는 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제는, HLB 값이 13이상 15이하인 폴리알킬렌옥사이드 유도체인 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 제2공정에서 사용되는 모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제는, HLB 값이 11이상 13미만인 폴리알킬렌옥사이드 유도체인 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 제1공정에서 사용되는 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제는 양이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 양이온 계면활성제는 제4급 암모늄염을 보유하는 것임을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
9. 제3항에 있어서, 상기 제2공정에서 사용되는 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제는 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
10. 제2항 내지 제 4항, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1공정이, 상기 계면활성제 농도를 0.1∼10g/l로 하여 행하여지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
11. 제6항 또는 제9항에 있어서, 상기 제2공정은, HLB 값이 11이상 13미만인 상기 폴리옥시알킬렌 유도체 또는 상기 음이온 계면활성제의 농도를 1∼100g/l로 하여 행하여지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
12. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1공정 및 제2공정은 pH 5∼8인 완충액 중에서 행하여지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 완충액은 아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.
14. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제9항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1공정 및 제2공정은, 25∼40℃의 온도에서 행하여지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 정량방법.

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