KR980010430A - Ldl-콜레스테롤 양의 측정 방법 - Google Patents

Ldl-콜레스테롤 양의 측정 방법 Download PDF

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노부꼬 이마조
토시로 하나다
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다나까 모또아끼
와꼬 쥰야꾸 고오교 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 높은 정확도로 시료 중의 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 방법 및 이 방법에 사용된 시약을 제공하며, 기존의 방법으로는 불가능하였던 통상의 자동분석기에 의해 LDL-콜레스테롤 양의 직접 측정할 수 있는 방법이다.

Description

LDL-콜레스테롤 양의 측정 방법
제1도는 실시예1에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제2도는 실시예1에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제3도는 실시예1에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제4도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제5도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제6도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제7도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제8도 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제9도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제10도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제11도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제12도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제13도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제14도는 실시예2에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제15도는 실시예3에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제16도는 실시예4에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제17도는 실시예4에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
제18도는 실시예4에서 얻어진 여러 종류의 지질단백을 포함하는 여러 종류의 시료의 반응 곡선을 나타낸다.
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
본 발명은 혈장 및 혈청과 같은 생체시료에 존재하는 저밀도 지질단백(이하로는 LDL로 표시)중의 콜레스테롤 양을 측정하는 방법 및 시약에 관한 것이다.
혈장 중의 지질은 주로 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질 등이며, 그러한 혈장 지질은 아포단백질과 결합하여 혈액 중에 순환하는 지질단백을 형성한다. 지질단백은, 그 밀도에 따라, 고밀도 지질단백(HDL), LDL, 매우 낮은 밀도 지질단백(VLDL), 카일로마이크론(CM) 등으로 분류한다. 이러한 지질단백 중에서, HDL은 조직에 저장된 과량의 콜레스테롤을 간으로 이동시키는 작용을 하며, 그에 따라 동맥경화증을 방지하는 작용을 갖는다. 반면에, LDL은 주로 간으로부터 조직으로 콜레스테롤을 이동시키는 역할을 하므로 LDL의 증가는 동맥경화증과 밀접한 관계가 있다.
그러므로, LDL 중의 콜레스테롤(이하로는 LDL-콜레스테롤로 표시)은 동맥경화증과 허혈성 심장질환(관상동맥 질환)의 위험 요소로서 간주되어 왔으며, LDL중의 콜레스테롤의 양은 진단, 치료 및 질병의 예방에 중요한 요소로서 작용한다.
LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 방법에 있어서, 침전법, 초원심분리법, 전기영동법, 산술 방정식에 기초한 산술법 등이 사용되어 왔다. 그러한 공지의 방법들 중에서, 침전법, 초원심분리법 및 전기영동법은 침전/원심분리 처리, 초원심분리 처리 혹은 전기영동 처리를 통해서 다른 불필요한 지질단백으로부터 LDL을 분리 하는 전처리 과정이 필요하기 때문에 조작이 불편하고, 현재 임상 시험에서 널리 사용되는 자동 분석기만의 사용으로는 직접적인 측정을 하는 것이 불가능하다는 문제점이 있다.
게다가 그동안 사용되어 온 프리데발트 식(Friedewald equation)으로 알려져 있는 총콜레스테롤량, HDL-콜레스테롤량 및 트리글리세라이드양으로부터 LDL-콜레스테롤을 산출하는 방법은 시료 중에 트리글리세라이드가 500 mg/dl이상 들어 있을 경우 LDL-콜레스테롤의 양을 정확히 구할 수 없다는 문제점이 있었다.
최근에는, 기존의 방법에서 상기 언급한 문제점들을 해결하기 위하여 많은 방법들이 개발되어 왔다. 예를 들어, JP-A 7-280812(일본 특허 공개)에 기술된 방법도 이러한 예이다. 즉, 응집제 및/또는 항체를 사용하여 LDL을 응집시키고, LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤을 바람직한 정량반응과 관련되지 않은 별도의 반응계에 도입하고 소비시킨 후, 응집된 LDL을 정량 분석이 가능한 정도의 계면활성제 및/또는 무기염을 사용해서 용해시키고, 최종적으로 LDL-콜레스테롤을 정량 반응하여 반응액에서의 흡광도를 측정한다.
그러나, 이 방법에는 3 또는 4종의 시약이 필요하고, 따라서 3 또는 4종의 시약을 사용해 측정할 수 있는 제한된 종류의 자동분석기 만을 이용할 수 있으며, 2종류의 시약을 사용하여 측정할 수 있는 자동분석기는 적용할 수 없다는 문제점이 있다. 게다가, 이 방법에서는 3 또는 4종의 시약을 사용하기 때문에 측정의 재현성이 감소된다는 문제점이 있다.
또한, 전처리의 문제가 없는 측정방법인 JP-A 58-165800 (일본 특허 공개)가 있다. 그러나, 이 방법은, 시약 중의 사용 가능한 콜레스테롤 에스테르화 효소와 계면활성제의 농도 범위가 더 제한적이고, 따라서 이 시약의 제조는 까다로운 과정을 거쳐야 하며, pH나 측정시간 간격 등의 측정조건이 엄격하게 적용되어야 하며, 또한, HDL 중의 콜레스테롤이 어느 정도 반응에 관계되므로, 속도-분석법(rate-assay method)에 의한 측정인 LDL-콜레스테롤의 동력학적 측정방법 만을 쓸 수 있다. 이러한 이유로 이 방법은 실용적이지 않다.
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
위에서 언급한 상황하에서, 본 발명이 해결하고자 하는 문제점은 공지의 방법에서 요구 되었던, LDL을 제외한 불필요한 지질단백으로부터 LDL을 분리하기 위해서 까다로운 전처리 없이 널리 사용되는 자동분석기를 이용해서 직접 생체시료로부터 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 방법을 제공하고, 또한 이 방법에 사용하는 시약을 제공하는 것이다.
[발명의 구성 및 작용]
본 발명은 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재하에서 콜레스테의 양을 측정하는 것으로 이루어진, LDL에서 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 생체시료를 수성 매질로 구성되는 제1시약과 혼합한 후, 생성된 반응액의 흡광도(OD1)를 측정하고, 그 결과액을 콜레스테롤 산화효소 및 콜레스테롤 에스테르화효소를 함유하는 제2시약과 혼합한 후, 생성된 반응 용액의 흡광도(OD2)를 측정하여, OD1에 보정계수를 곱하여 구한 값을 OD2로 부터 빼서 OD3을 구하고, 이렇게 구한 OD3를 미리 소정량의 콜레스테롤을 포함하는 표준 시료로 위의 과정을 거쳐 준비한 콜레스테롤의 양과 OD3와의 관계를 나타낸 검량선에 적용하여 이루어진 것으로서, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)을 함유하는 지방족 아민 각각은 제1시약 및 제2시약중 적어도 하나에 포함되며 커플링제, 전개제 및 과산화효소 각각은 제1시약 및 제2시약중 적어도 하나에 포함된 것을 특징으로 하는 생체시료의 저밀도 지질단백 중의 콜레스테롤 양의 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 포함하는 지방족 아민으로 이루어진 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 시약에 관한 것이다.
더욱이 본 발명은 커플링제와 전개제중 하나를 함유하는 제1시약 및 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소 및 커플링제와 전개제중 하나를 함유하는 제2시약으로 이루어진 것으로서, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)을 함유하는 지방족 아민 각각이 제1시약 및 제2시약 중의 적어도 한쪽에 포함된 LDL의 콜레스테롤을 측량하는 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 양쪽성 계면활성제와 커플링제와 전개제중 하나를 포함하는 제1시약 및 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소 및 커플링제와 전개제중 하나를 함유하는 제2시약으로 이루어진 것으로서, 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민이 제1시약 및 제2시약 중의 적어도 한쪽에 포함된 LDL의 콜레스테롤 양을 측정하는 장치에 관한 것이다.
즉, 본 발명자들은 LDL을 제외한 다른 불필요한 지질단백의 분리를 위해 전처리 없이 직접 자동분석기로 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 방법을 오랜 기간 연구한 결과, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재하에서 콜레스테롤을 측정함으로서 LDL을 제외한 다른 불필요한 지질단백의 분리 없이 LDL-콜레스테롤만을 선택적으로 측정할 수 있다는 발견에 기초하여 본 발명을 완성했다.
본 발명에서 양쪽성 계면활성제는 LDL을 제외한 다른 지질단백 중의 콜레스테롤이 콜레스테롤 측정반응에 관여하는 것을 억제할 수 있는 한, 특별히 제한되지는 않으며, 그 예로는 알킬 베타인 유도체(예를 들어, 라우릴 베타인, 스테아릴 베타인, 라우릴 디메틸암모늄 베타인, 코코넛 베타인, 야자유 지방산 아미드 프로필 베타인, 라우르산 아미드 프로필 베타인 등)와 같은 베타인 유도체, 이미다졸 리늄 베타인 유도체(예를 들어, 2-라우릴-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 및 2-운데실-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리니움 베타인과 같은 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인, 2-알킬-N-카르복시에틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 등) 및 술포 베타인 유도체(예를 들어, N-옥틸-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술폰산, N-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술폰산, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술폰산, N-테트라도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술폰산, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술폰산 등), 알킬 글리신, 알킬 비스(아미노에틸) 글리신, 디옥틸 폴리아미노에틸 글리신, N-알킬 폴리아미노에틸 글리신 및 β-알라닌 유도체와 같은 아미노 카르복실산 유도체, 비스 (2-운데실-N-히드록시에틸 이미다졸린) 클로로아세트산 복합체 및 알킬 이미다졸린 유도체와 같은 이미다졸린 유도체, 라우릴 디메틸아민 옥사이드 등과 같은 아민 옥사이드 유도체 등이다.
이러한 화합물 중에서,라우릴 베타인, 야자유 지방산 아미드 프로필 베타인, 라우르산 아미드 프로필 베타인, 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리니움 베타인 및 2-알킬-N-카복시에틸-N-히드록시에틸 이미다졸리니움 베타인으로 구성되는 군으로부터 선택된 양쪽성 계면활성제가 더욱 바람직하다.
사용된 양쪽성 계면활성제의 농도는 LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤이 콜레스테롤 측정 반응에 관여하는 것을 억제 할 수 있는 한, 특별히 제한되지는 않으며, 일반적으로 반응액에서의 최종 농도가 0.0001 에서 10%(w/v), 바람직하게는 0.001 에서 1 %(w/v)이 되도록 첨가하는 것으로 되어 있다. 양쪽성 계면활성제는 단독으로 또는 2 이상의 적절한 조합으로 사용된다.
게다가, 본 발명에서 비이온성 계면활성제의 존재가 콜레스테롤 측정 반응에서 LDL을 제외한 지질단백의 콜레스테롤과의 연관성을 증가시킬 수 있으므로, 비이온성 계면활성제가 없을 때 본 발명을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 카르복시 또는 술폰산기(들)을 함유하는 지방족 아민은 콜레스테롤 측정 반응에서 LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤이 콜레스테롤 측정 반응에 관여하는 것을 억제할 수 있는 한, 특별히 제한되지는 않으며, 위에서 언급 한 성질을 갖는 아미노산, 아미노에탄술폰산 유도체, 아미노프로판술폰산 유도체 및 글리신 유도체를 포함한다.
아미노산의 예는 특히 알라닌, 글루타민 및 글루타민산이다.아미노에탄술폰산 유도체의 특정예는 N-(2-아세타미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산(CHES), 2-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕에탄술폰산(HEPES), 2-모르포리노에탄술폰산(MES), 피페라진-1, 4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), N-트리스(히드록시메틸) 메틸-2-아미노에탄술폰산(TES)등이 있고, 아미노프로판술폰산 유도체의 예는 N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산(CAPS), N-시클로헥실-2-히드록시-3-아미노프로판술폰산(CAPSO), 3-〔N, N-비스(2-히드록시에틸)아미노〕-2-히드록시-프로판술폰산(DIPSO), 3-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕프로판술폰산(EPPS), 2-히드록시-3-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕프로판술폰산(HEPPSO), 3-모르포리노프로판술폰산(MOPS), 2-히드록시-3-모르포리노 프로판술폰산(MOPSO), 피페라진-1, 4-비스(2-히드록시-3-프로판술폰산)(POPSO), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS), 2-히드록시-N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPSO) 등이 있으며, 글리신 유도체의 예는 N-(2-아세타미도)이미노디아세트산(ADA), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (비신, Bicine), N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕 글리신(트리신, Tricine) 등이 있다.
이러한 화합물 중에서, 2-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕에탄술폰산(HEPES), 2-모르포리노에탄술폰산(MES), 피페라진-1, 4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 3-모르포리노프로판술폰산(MOPS) 및 N-(2-아세타미도)이미노디아세트산(ADA)로 구성된 군으로부터 선택된 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민이 보다 바람직하다.
사용된 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 농도는 LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤이 콜레스테롤 측정 반응에 관여하는 것을 억제할 수 있는 한, 특별히 제한되지는 않으며, 일반적으로 반응액의 최종 농도는 1mM에서 2M, 바람직하게는 10mM에서 1M, 보다 바람직하게는 100에서 700mM, 더욱 바람직하게는 200에서 600mM이다.이 화합물은 단독으로 또는 2 이상의 적절한 조합으로 사용된다.
본 발명의 측정 방법은 위에서 언급한 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)을 함유하는 지방족 아민을 함께 사용하는 것을 제외하고는, 기존의 콜레스테롤의 측량법으로 수행할 수 있으며, 사용되는 시약은 기존의 방법에서 적당한 것을 선택할 수 있다.
즉, 혈장 및 혈청과 같은 생체시료에 존재하는 LDL-콜레스테롤은, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재하에서 기존의 콜레스테롤 양의 측정 방법으로 측정함으로써, 생체시료 내의 LDL-콜레스테롤을 명확히 측정할 수 있다.
콜레스테롤 양을 측정하는 이러한 공지의 방법은, 바람직한 예로써, 시료 중의 콜레스테롤 에스테르를 콜레스테롤 에스테르화 효소(CHE)에 의해 유리 콜레스테롤과 지방산으로 분해시켜, 콜레스테롤 산화 효소(COD)에 의해 원래 있던 유리 콜레스테롤을 산화시켜 콜레스트-4-엔-3-온과 과산화수소를 형성하고, 과산화효소(POD)의 존재하에서 생성된 과산화수소의 작용에 의해 산화성 정색시약을 발색시켜, 이로부터 생성된 색소의 비색정량법을 실시하는 것으로 이루어진 효소 반응을 이용하는 산화 비색정량법 및 시료 중의 콜레스테롤 에스테르를 콜레스테롤 에스테르화 효소(CHE)에 의해 유리 콜레스테롤과 지방산으로 분해시켜, 콜레스테롤 탈수소효소(CHD)의 존재하에서 원래 있던 유리 콜레스테롤을 NAD와 반응시켜 생성된 NADH를 340 nm 파장에서 측정하는 것으로 이루어진 자외선(UV) 분광법이 있다.
본 발명의 측정에 사용된 콜레스테롤 산화효소는 특별히 한정된 것은 아니고, 노카디아(Nocardia)속 및 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물로부터 유래된 것 및 소의 췌장 등과 같은 동물의 내부기관으로부터 유래된 것과 같이 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것은 모두 사용 가능하다. 사용된 콜레스테롤 산화효소의 양은 콜레스테롤을 측정하는 반응액 중의 농도로서 일반적으로 0.02에서 10u/ml, 바람직하게는 0.1에서 2u/ml이다.
본 발명의 측정법에 사용된 콜레스테롤 에스테르화효소는 특별히 한정된 것은 아니고, 칸디다(Candida)속 및 슈도모나스(Pseudomonas)속에 미생물로부터 유래된 것 및 소의 췌장 등과 같은 동물의 내부기관으로부터 유래된 것과 같이 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것은 모두 사용 가능하다. 사용된 콜레스테롤 에스테르화효소의 양은 콜레스테롤을 측정하는 반응액 중의 농도로서 일반적으로 0.02에서 10u/ml, 바람직하게는 0.1에서 2u/ml이다.
본 발명의 측정에 사용된 과산화효소는 특별히 한정된 것은 아니고, 양고추냉이 및 무와 같은 식물로부터 유래된 것, 곰팡이 및 효소와 같은 미생물로부터 유래된 것 및 동물의 백혈구 및 갑상선 등으로부터 유래된 것과 같이 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것은 모두 사용 가능하다. 사용된 과산화효소의 양은 콜레스테롤을 측정하는 반응액 중의 농도로서 일반적으로 0.01에서 50u/ml, 바람직하게는 0.1에서 5 u/ml이다.
본 발명에서 측량에 사용된 산화성 정색시약은 POD 존재 하에서 과산화수소와 반응해서 정색하는 것이면 어느것이든 가능하고, 4-아미노안티피린과 페놀 화합물, 나프톨 화합물 또는 아닐린 화합물의 조합, 3-메틸-2-벤조티아졸리논과 아닐린 화합물과의 조합 등을 포함하는, 4-아미노안티피린과 같은 커플링제와 커플링제와 함께 산화 축합에 의해 색소를 형성하는 전개제의 조합 및 2, 2´-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산), 트리페닐메탄형 류코 염료, 디페닐아민 유도체, 벤지딘 유도체, 트리알릴 이미다졸 유도체, 류코 메틸렌 블루 유도체, o-페닐렌디아민 유도체등과 같이 산화에 의해서 스스로 색을 형성하는 발색제가 그러한 예이다.
전개제로서 페놀 화합물의 특정예는 페놀, p-클로로페놀, 2, 4-디클로로페놀 등이고, 나프톨 화합물의 예는 1-나프톨, 1-나프톨-2-술폰산, 1-나프톨-2-카르복실산 등이 있다. 아닐린 화합물의 예는 N,N-디에틸아닐린, N-에틸-N-(β-히드록시에틸)-m-톨루이딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린(DAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시-4-플루오로아닐린(FDAOS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘(TOOS), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N´-숙시닐-에틸렌디아민 (EMSE) 등이 있다.
커플링제와 전개제의 조합을 사용할 때, 사용되는 커플링제의 양은 조합되는 커플링제와 전개제의 종류에 따라 다르므로 일반화되어 있지는 않고, 일반적으로 콜레스테롤 측정에서 반응액 중의 농도로서, 보통 0.01에서 100mM, 바람직하게는 0.1에서 10mM 의 범위에서 선택되며, 커플링제로 4-아미노안티피린을 사용할 때는, 콜레스테롤 측정에서 반응액 중의 농도로서 보통 0.01에서 50mM, 바람직하게는 0.1에서 5mM 의 범위에서 선택된다.
사용되는 전개제의 양은 사용되는 전개제와 조합되는 커플링제의 종류에 따라 다르므로 일반화되어 있지는 않고, 콜레스테롤 측정에서 반응액 중의 농도로서, 보통 0.01에서 50mM, 바람직하게는 0.1에서 5mM의 범위에서 선택된다.
트리페닐메탄형 류코 염료의 특정예는 류코 말라카이트 그린, 비스(p-디에틸아미노페닐)-2-술포페닐메탄, 비스(p-디에틸아미노페닐)-3, 4-디술포프로폭시페닐메탄 디소듐 염 등이 있고, 디페닐아민 유도체의 예로는 비스 〔4-디(2-부톡시에틸)아미노-2메틸페닐〕아민, N,N-비스〔4-디에틸아미노-2-메틸페닐〕-N´-p-톨루엔술포닐우레아 등이 있으며, 류코 메틸렌 블루 유도체에는 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3, 7-비스(디메틸아미노)페노티아진 나트륨 염, 10-〔3-(메톡시 카르보닐아미노메틸)페닐메틸아미노카르보닐〕-3, 7-비스(디메틸아미노)페노티아진 등이 있고, 벤지딘 유도체에는 벤지딘, o-톨리딘, o-디아니시딘, 3, 3´-디아미노벤지딘, 3, 3´, 5, 5´-테트라아미노벤지딘 등이 있고, 트리알릴이미다졸에는 2-(4-카르복시페닐)-3-N-메틸카바모일-4,5-비스(4-디에틸아미노페닐)이미다졸, 2-(3-메톡시-4-디에틸아미노페닐)-3- N-메틸카바모일-4, 5-비스(2-메틸-4-디에틸아미노페닐)이미다졸 등이 있다.
사용되는 발색제의 양은 통상적으로 이 분야에서 사용되는 범위에서 선택된다.
본 발명에서 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는데 사용되는 시약은 혈장 및 혈청과 같은 생체시료에서 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는데 사용되며, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)와 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민에 부가하여, 상기 언급한 콜레스테롤 측정법에 사용하는 시약은 COD, CHE, POD, 산화성 정색 시약, 완충제 등을 포함하는 산화성 비색정량법에 사용되는 시약 및 CHE, CHD, NAD, 완충제 등 UV 분광법에 사용되는 시약이고, 통상 사용되는 만큼의 양을 사용하며, 바람직한 구체예와 양은 위에서 언급한 바와 같다.
본 발명에서 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는데 사용되는 시약은 1-시약계 혹은 2-또는 그 이상의 시약계로 제조될 수 있고, 특별한 제한은 없다.양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)와 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민은 2-또는 그 이상의 시약계 중 적어도 어느 시약에 포함될 수 있다. 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 에스테르화효소 및 다른 효소들은 또한 어느 시약에 포함될 수 있다.
본 발명에서 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는데 사용되는 시약에는, 폴리안이온(예를 들어, 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 포스포텅스트산 등)과 같은 음이온 화합물을 포함하는 이온 화합물이 포함될 수도 있다. 그러한 것들은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이들은 Mg2+, Mn2+및 Ca2+(혹은 양이온을 생성하는 금속염)과 같은 양이온과의 조합으로 사용할 수 있다. 사용되는 이온 화합물의 농도는 제한되어 있지 않으며, 일반적으로 반응액 중의 농도가 0.01에서 10% (w/v)인 범위에서 선택된다.
본 발명의 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 시약에는, LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤이 콜레스테를 측정반응에 관여하지 못하게 하기 위해 하나 이상의 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체가 포함될 수 있다.
이러한 목적으로 사용되는 항체는 항-아포리포프로테인 A항체, 항-아포리포프로테인 C항체, 항-아포리포프로테인 E항체, 항-α 리포프로테인 항체 등이다.
사용된 항체의 농도는 LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤이 콜레스테롤 측정반응에 관여하는 것을 억제할 수 있는 한, 특별히 제한되지는 않으며, 반응액에서의 최종 농도가 일반적으로 0.001 에서 10mgAb/ml. 바람직하게는 0.01에서 1mgAb/ml 되도록 항체를 반응계에 첨가한다.
본 발명에서 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 방법은 2액법으로 수행될 수 있다.
이 방법에서, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민 각각은 제1시약 및 제2시약 중 적어도 어느 하나에 포함될 수 있으며, 각 커플링제, 전개제 및 과산화효소도 제1시약 및 제2시약 중 적어도 어느 하나에 포함될 수 있다.
제1시약과 제2시약에 있어서, 그 성분들은 수성매질 중에 용해되어 있다.
수용액은 물과 완충액을 포함하며, 일반적으로 완충액이 더 바람직하다.
제1시약으로는, 아무런 성분이 들어 있지 않은 수용액 만을 함유한 것을 사용할 수 있다.
제1시약의 수성매질이 물인 경우에, 제2시약의 수성매질은 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
수성매질로 완충액이 사용될 경우, 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민을 갖지 않는 제1시약이나 제2시약 중 어느 하나에 완충액을 포함시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정법에서 사용된 완충제는 pH 5에서 11의 완충능력을 갖고 LDL-콜레스테롤의 측정 반응에 방해되지 않는 한, 특별히 제한되어 있지는 않고, 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 모두 사용할 수 있다.
전형적인 예는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 굳즈 완충제(Good's buffering agent), 인산염, 붕산염 등이다. 사용되는 완충제의 농도는 특별히 제한되어 있지는 않으나, 일반적으로 1mM 에서 2M, 바람직하게는 10mM에서 1M의 범위에서 선택되고, 유지되어야 할 pH 범위는 일반적으로 5에서 11, 바람직하게는 6에서 8, 더욱 바람직하게는 약 7에서 선택된다.
측량법의 바람직한 구체예 중 하나는 아래와 같다.
혈장 및 혈청과 같은 생체시료를 수성매질, 커플링제, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민, 필요할 경우 이온 화합물, 양이온, 항체 등으로 구성되는 제1시약과 혼합한 후, 2 내지 40℃에서 1 내지 30분 동안 반응시켜서, 생성된 반응액의 흡광도(OD1)를 측정한다. 그리고, 생성된 반응액을 콜레스테롤 에스테르화효소, 콜레스테롤 산화효소, 과산화효소, 전개제 및 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민을 포함하는 제2시약과 혼합한 후, 2 내지 40℃에서 1 내지 60분 동안 반응시켜서, 흡광도(OD2)를 측정한다. OD1 에서 나온 측정치(예를 들어, OD1에 보정 계수를 곱해 얻은 수치)는 흡광도(OD3)를 구하기 위해 OD2에서 뺀다. 이렇게 구한 OD3는 미리 소정량의 콜레스테롤을 포함하는 표준 시료로 위의 과정을 거쳐 콜레스테롤 양과 OD3의 관계를 나타내는 검량선에 적용하여, 생체시료 안의 LDL-콜레스테롤 양을 측정할 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 콜레스테롤 양의 측정법은 다음과 기술되는 1액법으로 수행된다.
혈장 및 혈청과 같은 생체시료를 콜레스테롤 에스테르화효소, 콜레스테롤 산화효소, 과산화효소, 산화성 정색 시약(또는 커플링제 및 전개제), 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민 및 필요한 경우에 이온 화합물, 양이온, 항체 등을 함유한 시약과 혼합한 후, 2 내지 40℃에서 1 내지 30분 동안 반응시켜서, 흡광도(OD1)를 측정한다. 생체시료 대신 생리식염수를 사용한다는 점을 제외하고는 동일한 시료를 사용하는 동일한 방법으로 맹검치(black value)(ODB1)를 측정한다. ODI´으로부터 0DB1을 빼서 흡광도(OD2´)를 구하고, 이렇게 구한 OD2´는 미리 소정량의 콜레스테롤을 포함하는 표준 시료로 위의 과정을 거쳐 준비한 콜레스테롤 양과 OD2´의 관계를 나타내는 검량선에 적용하여 생체시료 내의 LDL-콜레스테롤 양을 측정할 수 있다.
부가적으로 위에서 언급한 완충제는 시약액 중에 포함시킬 수 있다.
본 발명에서 LDL-콜레스테롤 양을 측정하는 장치는 혈장 및 혈청과 같은 생체시료에서의 LDL-콜레스테롤을 측량하는데 사용되며, 커플링제 및 전개제중 하나를 함유하는 제1시약과, 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소, 다른 커플링제 및 전개제를 함유하는 제2시약으로 이루어진 것으로서, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)나 술폰산기(들)을 함유하는 지방족 아민이 제1시약 및 제2시약중 적어도 어느 하나에 포함되며,각 성분의 바람직한 구체예와 특정예는 위에서 언급한 바와 같다. 장치는 표준 시료와 조합될 수 있다.
양쪽성 계면활성제는 콜레스테롤 에스테르화효소를 비활성화시켜, 바람직하게는 각각이 분리된다. 이러한 상황에서, 저장안정성을 고려하여 본 발명의 LDL-콜레스테롤 측량 장치의 조합은 다음에 기술되는 것이 더 바람직하다.
장치는 양쪽성 계면활성제 및 커플링제와 전개제중 하나를 함유하는 제1시약과 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소, 커플링제 와 전개제 중 다른 하나를 포함하는 제2시약으로 이루어진 것으로서, 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민이 제1시약 및 제2시약중 적어도 하나에 포함되어 있다. 이 장치는 표준 시료와 조합될 수 있다.
본 발명에서 LDL-콜레스테롤 측량에 사용하는 방법 및 장치의 특성은 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들)나 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재 하에서 콜레스테롤의 측량이 가능하고, HDL 뿐 아니라, VLDL 및 CM 과 같이 LDL을 제외한 지질단백 중의 콜레스테롤이 실질적으로 반응에 관여되지 않으며, LDL-콜레스테롤과 특징적으로 반응이 일어날 수 있다는 것이다. 그러므로, 종래법으로는 수행하기 어려웠던 종점 분석(end point assay)에 의한 LDL-콜레스테롤의 측정이 가능하게 되었다. 표준 시료는 순품 콜레스테롤을 사용하여 만든 표준액일 필요는 없다. 예를 들어, 본 발명에서는, 사람 또는 동물의 혈청을 사용해서 만든 표준 혈청이 표준 시료로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예와 참고예를 언급하여 보다 상세히 설명되며, 여기에만 국한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
초원심분리에 의해 분획된 지질단백의 반응성은 자동 분석기 히타치 7170 〔히타치 사에 의해 제조, 판매〕를 사용해서 본 발명의 측정법과 비교할 수 있다.
시료
공지의 초원심분리법으로 혈청에서 얻어진 HDL 분획(64.9 mg/dl), LDL 분획(148.2 mg/dl), VLDL 분획(76.3 mg/dl) 및 CM 분획(28.4 mg/dl)을 시료로 사용하였다.
시약
시약 1
R-1; R-1은 1mM의 4-아미노안티피린을 함유하는 200 mM의 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스) 완충 용액(pH 7.0)이다.
R-2; R-2는 2 u/ml의 콜레스테롤 산화효소(CHO″Amano″VW; 아마노 제약회사의 제품명), 2 u/ml의 콜레스테롤 에스테르화효소(제품 번호; T-18, 아사히 화학공업사의 제품), 1 u/ml의 과산화효소(제품번호; PEO-302, 토요보 사의 제품), 1mM의 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 나트륨염(DAOS) 및 0.08 %(W/V)의 암피톨 24 B(카오 사의 제품명, 코코넛 베타인)을 함유하는 200 mM의 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스) 완충 용액(pH 7.0)이다.
시약 2
R-1; R-1은 1mM의 4-아미노안티피린을 함유하는 200mM의 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 완충 용액(pH 7.0)이다.
R-2; R-2는 2u/ml의 콜레스테롤 산화효소(CHO″Amano″VW; 아마노 제약회사의 제품명), 2u/ml의 콜레스테롤 에스테르화효소(제품 번호; T-18, 아사히 화학공업사의 제품), 1 u/ml의 과산화효소(제품번호; PEO-302, 토요보 사의 제품), 1mM의 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린 나트륨 염(DAOS) 및 0.08 %(W/V)의 암피톨 24 B(카오 사의 제품명, 코코넛 베타인)을 함유하는 200mM의 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 완충 용액(pH 7.0)이다.
시약 3
R-1; R-1은 1mM의 4-아미노안티피린을 함유하는 200mM의 N-(2-아세타미도)이미노디아세트산(ADA) 완충 용액(pH 7.0)이다.
R-2; R-2는 2 u/ml의 콜레스테롤 산화효소(CHO″Amano″VW; 아마노 제약회사의 제품명), 2 u/ml의 콜레스테롤 에스테르화효소(제품 번호; T-18, 아사히 화학공업사의 제품), 1u/ml의 과산화효소(제품번호; PEO-302, 토요보 사의 제품), 1mM의 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 나트륨 염(DAOS) 및 0.1%(W/V)의 소프타졸린 LPB-R(카와켄 파인 케미칼 사의 제품명, 라우르산 아미드 프로필 베타인)을 함유하는 200mM의 N-(2-아세타미도)이미노디아세트산(ADA) 완충 용액(pH 7.0)이다.
측정 조건
측정 변수를 다음과 같이 정해서 측정을 한다.
측정법; 2 포인트 엔드(point end) [16] - [34]
시료양; 3μl
R-1; 270μl
R-2; 90μl
측정 파장; 700/600nm
측정 온도; 37℃
결과
시약 1, 2, 3을 사용한 측정결과를 각각 제1도, 제2도, 제3도에 나타내었다.
제1도 부터 제3도 까지에서, □는 HDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, ◆는 LDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ◇는 VLDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, x는 CM을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ●는 지질단백을 함유하지 않는 시료에서 얻어진 결과를 각각 나타낸다.
제1도의 측정 결과로부터, 양쪽성 계면활성제로서 암피톨 24 B를 포함하나, 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민을 포함하지 않는 시약 1은 지질단백 중의 콜레스테롤과 거의 반응하지 않는다는 것을 알 수 있다.
반면, 도2의 측정 결과로부터, 암피톨 24B 및 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민으로서 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산) (PIPES)의 존재하에서 지질단백 중의 콜레스테롤양을 측정함으로써 LDL-콜레스테롤의 양을 특징적으로 구할 수 있다는 것을 알 수 있다. 이와 유사하게 도 3의 측정 결과로부터, 카르복시기(들)를 함유하는 지방족 아민으로서 소프타졸린 LPB-R 및 N-(2-아세타미드)이미노 디아세트산(ADA)의 존재하에서 지질단백 중의 콜레스테롤 양을 측정함으로써 LDL-콜레스테롤의 양을 특징적으로 구할 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기로부터, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재하에서 지질단백 중의 콜레스테롤 양을 측정함으로써 LDL-콜레스테롤의 양을 특징적으로 구할 수 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 2]
시료 실시예 1과 동일하다
시약
R-1; R-1은 1mM의 4-아미노안티피린을 함유하는 200 mM의 2-모르포리노에탄술폰산(MES) 완충 용액(pH 7.0)이다.
R-2; R-2는 2 u/ml의 콜레스테롤 산화효소(CHO″Amano″VW; 아마노 제약회사의 제품명), 2 u/ml의 콜레스테롤 에스테르화효소(제품 번호; T-18, 아사히 화학공업사의 제품), 1 u/ml의 과산화효소(제품번호; PEO-302, 토요보 사의 제품), 1mM의 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 나트륨 염(DAOS)및 다음 표 1에 나열된 소정 농도의 계면활성제를 포함하는 200 mM의 2-모르포리노에탄술폰산(MES) 완충 용액(pH 7.0)이다.
실시예 1과 동일하다.
결과
계면활성제로서 에멀겐 709(Emulgen 709)을 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 에멀겐 120(Emulgen 120)을 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과,계면활성제로서 n-옥틸-β-D-글리코사이드를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 에말 NC-35(Emal NC-35)를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 콜산을 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 n-도데실 트리메틸암모늄 클로라이드를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 헥사데실 피리디니움 클로라이드를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 소프타졸린 CPB(Softazoline CPB)를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 아미폴 AD(Amipol AD)를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 레본 101-H(Lebon 101-H)를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과 및 계면활성제로서 암피톨 20 N(Amphitol 20 N)를 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과를 각각 제4도, 제5도, 제6도, 제7도, 제8도, 제9도, 제10도, 제11도, 제12도, 제13도 및 제14도에나타내었다.
제4도에서 제13도 까지에서, □는 HDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, ◆는 LDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ◇는 VLDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, x는 CM을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ●는 지질단백을 함유하지 않는 시료에서 얻어진 결과를 각각 나타낸다.
제4도에서 제10도의 측정결과에서 명확하듯이, 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제를 함유하는 시약 R-2를 사용하면 LDL을 제외한 지질단백에 함유된 콜레스테롤은 또한 반응에 관계됨을 알 수 있다.
반면에, 제11도에서 제14도의 측정결과에서 양쪽성 계면활성제를 함유하는 시약 R-2를 사용하면, LDL의 콜레스테롤이 특징적으로 측정될 수 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 3]
시료
공지의 초원심분리법으로부터 얻어진 HDL 분획(63.1 mg/dl), LDL 분획(138.1 mg/dl), VLDL 분획(77.3mg/dl) 및 CM 분획(35.0 mg/dl)을 시료로 사용하였다.
시약
R-1; R-1은 400mM의 글루타민산과 0.6mM의 N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS)을 함유하는 100 mM의 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스) 완충 용액(pH 7.0)이다.
R-2; R-2는 2u/ml의 콜레스테롤 산화효소(CHO″Amano″VW; 아마노 제약회사의 제품명), 1.6u/ml의 콜레스테롤 에스테르화효소(제품 번호; T-18, 아사히 화학 공업사의 제품), 6u/ml의 과산화효소(제품번호; PEO-302, 토요보 사의 제품), 3mM의 4-아미노안티피린 및 0.1 %(W/V)의 소프타졸린 CL(카와켄 파인케미칼사의 제품명, 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시메틸 이미다졸리늄 베타인)을 함유하는 100 mM의 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스) 완충 용액(pH 7.0)이다.
측정 조건
실시예1과 동일.
결과
측정 결과는 제15도에 나타냈다.
제15도에서, □는 HDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, ◆는 LDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ◇는 VLDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, ○는 CM을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ●는 지질단백을 함유하지 않는 시료에서 얻어진 결과를 각각 나타낸다.
제15도의 측정 결과로부터, 양쪽성 계면활성제로서 소프타졸린 CL 및 아미노산으로서 글루타민산의 존재하에서 지질단백 중의 콜레스테롤양을 측정함으로써 LDL-콜레스테롤의 양을 특징적으로 구할 수 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 4]
시료
실시예 3과 동일.
시약
R-1; R-1은 0.6mM의 N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린(HDAOS)을 함유하는 400 mM의 피페라진-1, 4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 완충 용액(pH 7.0)이다.
R-2; R-2는 2u/ml의 콜레스테롤 산화효소(CHO″Amano″VW; 아마노 제약회사의 제품명), 1.6u/ml의 콜레스테롤 에스테르화효소(제품 번호; T-18, 아사히 화학 공업사의 제품), 6 u/ml의 과산화효소(제품번호; PEO-302, 토요보 사의 제품), 3mM의 4-아미노안티피린 및 0.08 %(W/V)의 다음 표 2에 나열된 양쪽성 계면활성제를 함유하는 400 mM의 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 완충 용액(pH 7.0)이다
실시예 1과 동일.
결과
계면활성제로서 소프타졸린 CL을 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 소프타졸린 NS을 포함하는 R-2를 사용한 측정 결과, 계면활성제로서 에나지콜 C-40H(Enagicol C-40H)을 함유하는 R-2를 사용한 측정 결과를 각각 도 16, 도 17 및 도 18에 나타내었다.
제16도 부터 도 18 까지에서, □는 HDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, ◆는 LDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ◇는 VLDL을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내고, ▲는 CM을 함유하는 시료에서 얻어진 결과를 나타내며, ●는 지질단백을 함유하지 않는 시료에서 얻어진 결과를 각각 나타낸다.
제16도부터 도18의 측정 결과로부터 명확하듯이, 양쪽성 계면활성제 및 카르복실기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재하에서 지질단백 중의 콜레스테롤양을 측정함으로써 LDL-콜레스테롤의 양을 특징적으로 구할 수 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 5]
혈장 및 혈청과 같은 생체시료의 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 장치의 전형적인 예는 다음과 같다.
(1) 제 1 시약 (pH 6.5-7.5)
커플링제 및 전개제 중 하나 , 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민.
(2) 제 2 시약 (pH 6.5-7.5)
콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤에스테르화효소, 과산화효소, 커플링제 및 전개제 중 다른 하나, 양쪽성 계면활성제, 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민.
[실시예 6]
(1) 제 1 시약 (pH 6.5-7.5)
양쪽성 계면활성제, 커플링제 및 전개제 중 하나 , 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를을 함유하는 지방족 아민.
(2) 제 2 시약 (pH 6.5-7.5)
콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소, 커플링제 및 전개제 중 다른 하나, 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민.
[발명의 효과]
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 높은 정확도로는 시료 중의 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는 방법 및 이 방법에 사용된 시약을 제공하며, 기존의 방법으로는 불가능 하였던 통상의 자동분석기에 의해 LDL-콜레스테롤 양의 직접 측정을 가능하게 함으로써 이러한 기술 분야에 큰 기여를 할 수 있다.

Claims (12)

  1. 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 존재하에서 콜레스테롤을 측량하는 것을 특징으로 하는 저밀도 지질단백 중의 콜레스테롤 양의 측정 방법.
  2. 생체시료를 수성매질로 구성되는 제1시약과 혼합한 후, 생성된 반응액의 흡광도(OD1)를 측정하고, 그 결과액을 콜레스테롤 산화효소 및 콜레스테롤 에스테르화효소를 함유하는 제2시약과 혼합한 후, 생성된 반응 용액의 흡광도(OD2)를 측정하여, OD1에 보정계수를 곱하여 구한 값을 OD2로부터 빼서 OD3을 구하고, 이렇게 구한 OD3를 미리 소정량의 콜레스테롤을 포함하는 표준 시료로 위의 과정을 거쳐 준비한 콜레스테롤 양과 OD3와의 관계를 나타낸 검량선에 적용하여 이루어진 것으로서, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민 각각은 제1시약 및 제2시약중 적어도 하나에 포함되며 커플링제, 전개제 및 과산화효소 각각은 제1시약 및 제2시약중 적어도 하나에 포함된 것을 특징으로 하는 생체시료의 저밀도 지질단백 중의 콜레스테롤 양의 측정 방법.
  3. 제2항에 있어서, 커플링제와 전개제중 하나가 제1시약에, 다른 하나가 제2시약에 함유된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 양쪽성 계면활성체가 제1시약에 함유된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 양쪽성 계면활성체가 베타인 유도체, 아미노 카르복실산 유도체, 이미다졸린 유도체 및 아민 산화물 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민이 아미노산, 아미노에탄술폰산 유도체, 아미노프로판술폰산 유도체 및 글리신 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 측정이 비이온성 계면활성제의 부재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민으로 이루어진 것을 특징으로 하는 저밀도 지질단백 중의 콜레스테롤 양의 측정용 시약.
  9. 제8항에서, 상기 시약이 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소 및 산화성 발색제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
  10. 제9항에 있어서, 산화성 발색제가 커플링제와 전개제로 이루어진 것을 특징으로 하는 시약.
  11. 커플링제와 전개제중 하나를 함유하는 제1시약 및 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화요소, 과산화효소 및 커플링제와 전개제중 다른 하나를 함유하는 제2시약으로 이루어진 것으로서, 양쪽성 계면활성제 및 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)를 함유하는 지방족 아민의 각각이 제1시약 및 제2시약 중의 적어도 하나에 포함된 것을 특징으로 하는 저밀도 지질단백 중의 콜레스테롤 양의 측정 장치.
  12. 양쪽성 계면활성제 및 커플링제와 전개제중 하나를 함유하는 제1시약 및 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화효소, 과산화효소 및 커플링제와 전개제중 다른 하나를 함유하는 제2시약으로 이루어진 것으로서, 카르복시기(들) 또는 술폰산기(들)(들)를 함유하는 지방족 아민이 제1시약 및 제2시약 중의 적어도 하나에 포함된 것을 특징으로 하는 저밀도 지질단백 중의 콜레스테롤 양의 측정 장치.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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