JP2016080685A - リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法及び試薬キット - Google Patents
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Abstract
Description
被験者から得た試料中のリポタンパク質と、標識コレステロールとを接触させることにより、標識コレステロールをリポタンパク質に取り込ませる工程、
上記の標識コレステロールを取り込んだリポタンパク質と、リポタンパク質と結合する抗体とを接触させることにより、リポタンパク質と上記の抗体との複合体を形成する工程、
上記の複合体から生じる標識を測定する工程、及び
測定結果に基づいて、上記の被験者の脂質異常に関する情報を取得する工程。
生体内では、HDLはコレステロールをエステル化して取り込むことから、この実施例では、BODIPY標識コレステロールがHDLのLCAT活性依存的にエステル化されるか否かを検討した。
健常者由来の血清(0.1 ml)に等量の22%ポリエチレングリコール4000(和光純薬工業株式会社)を添加し、懸濁した。得られた懸濁液を室温にて20分間静置した後、3000 rpmで15分間室温にて遠心分離した。そして、上清をHDL画分として回収し、これを4℃にて保存した。
上記で得られたHDL画分(20μl)に、LCAT阻害剤である100 mM ヨードアセトアミド(IAA)(和光純薬工業株式会社)を0.4μl(終濃度2mM)もしくは100 mM 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)(株式会社同仁化学研究所)を0.4μL(終濃度2mM)又は等量の水を添加し、37℃にて800 rpmで1時間振とうした。そして、得られたHDL含有液の一部を取り、ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)を用いてApoAI濃度を測定した。なお、具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。測定後、ApoAI濃度が100μg/mlとなるようにHDL含有液を反応バッファー(2%BSA及び2mM リポソーム(日本精化株式会社製)を含むPBS)で希釈した。なお、反応バッファーに含まれるリポソームの組成は、2mM ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、2mM コレステロール及び4mM 水素添加大豆ホスファチジルコリン(HSPC)である。また、PBSは、Phosphate buffered saline tablet(Sigma-Aldrich社)を水に溶解して調製した。得られた希釈液(50μl)に0.5 mM BODIPY標識コレステロール(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids社)を0.5μl添加し(終濃度5μM)、37℃にて800 rpmで一晩振とうした。そして、得られた液を、シリカゲルがコートされたガラス基板上にパスツールピペットでスポットし、薄層クロマトグラフィー(TLC)を行った。展開溶媒として、テトラヒドロフラン(THF):ヘキサン:酢酸=3:7:0.2の混合溶媒を用いた。基板上に展開された蛍光標識コレステロールを、蛍光イメージャー(PharosFX、Bio-Rad社製)により488 nmの励起波長で検出した。結果を図1に示す。
図1に示されるように、HDLとBODIPY標識コレステロールとを接触させたレーン(レーンNo.2)では、BODIPY標識コレステロール自体の移動距離とは異なる移動距離を示すバンドが検出されたが、LCAT阻害剤を添加したレーン(レーンNo.3及びNo.4)では、そのようなバンドは検出されなかった。このバンドは、HDLのLCATによりエステル化されたBODIPY標識コレステロールのバンドと考えられる。よって、BODIPY標識コレステロールは、健常者由来HDLのLCAT活性依存的にエステル化されることが確認された。
この実施例では、NBD標識コレステロールがHDLのLCAT活性依存的にエステル化されるか否かを検討した。
実施例1と同様にして健常者由来の血清検体から得たHDL画分(20μl)に、LCAT阻害剤である100 mM IAAを0.4μl(終濃度2mM)もしくは100 mM DTNBを0.4μL(終濃度2mM)又は等量の水を添加し、37℃にて800 rpmで1時間振とうした。そして、得られたHDL含有液の一部を取り、実施例1と同様にしてApoAI濃度を測定した。測定後、ApoAI濃度が100μg/mlとなるようにHDL含有液を反応バッファーで希釈した。得られた希釈液(50μl)に1mM NBD標識コレステロール(25-NBD Cholesterol、Avanti Polar Lipids社)を1μl添加し(終濃度 20μM)、37℃にて800 rpmで2時間振とうした。そして、得られた液を、シリカゲルがコートされたガラス基板上にパスツールピペットでスポットし、TLCを行った。展開溶媒には、実施例1と同じ混合溶媒を用いた。基板上に展開された蛍光標識コレステロールを、蛍光イメージャー(PharosFX、Bio-Rad社製)により488 nmの励起波長で検出した。結果を図2に示す。
図2に示されるように、HDLとNBD標識コレステロールとを接触させたレーン(レーンNo.2)では、NBD標識コレステロール自体の移動距離とは異なる移動距離を示すバンドが検出されたが、LCAT阻害剤を添加したレーン(レーンNo.3及びNo.4)では、そのようなバンドは検出されなかった。このバンドは、HDLのLCATによりエステル化されたNBD標識コレステロールのバンドと考えられる。よって、NBD標識コレステロールは、健常者由来HDLのLCAT活性依存的にエステル化されることが確認された。
この実施例では、BODIPY標識コレステロール及びHDL捕捉用抗体を用いる本実施形態の方法と、培養細胞を用いる従来方法との測定結果を比較して、本実施形態の方法の性能を評価した。
実施例1と同様にして、PEG4000を用いてヒト血清検体(n=12)からHDL画分を得た。これらのHDL画分を試料として、以下の操作に用いた。
(i) 測定用プレートの準備
固相としての96ウェルマイクロプレート(蛍光測定用黒色プレートH、住友ベークライト株式会社製)の各ウェルに50 mM Tris-HCl(pH 7.5)を200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計2回行った。各ウェルに、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)で10μg/mlの濃度に希釈した抗ApoAI抗体(MONO5030、SANBIO社)の溶液を100μlずつ添加し、4℃にて一晩以上静置した。抗体溶液を除去し、各ウェルにPBSを200μlずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を合計3回行った。各ウェルに4%BSA/PBSを200μlずつ添加し、25℃にて500 rpmで3時間振とうした。
上記で得た各HDL画分の一部を取り、実施例1と同様にしてApoAI濃度を測定した。測定後、ApoAI濃度が0.1μg/ml以下となるように各HDL画分に等量の反応バッファーを添加し、希釈した。得られた各希釈液(300μl)に0.5 mM BODIPY標識コレステロール(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids社)を3μl(終濃度5μM)ずつ添加し、37℃にて800 rpmで2時間振とうした。得られた各液(303μl)に酸化剤(8.8 M 過酸化水素、1.76 mM 亜硝酸ナトリウム及び0.86 mM DTPA)を34μlずつ添加した(各終濃度1M、0.2 mM、0.1 mM)。これらを37℃にて800 rpmで1時間振とうして、標識コレステロールを取り込ませたHDLを含む測定用試料を得た。
96ウェルマイクロプレートからBSA溶液を除去し、各測定用試料を100μlずつウェルに添加した。そして、プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうして、HDLと抗ApoAI抗体との複合体を形成させた。プレートから測定用試料を除去し、10 mM シクロデキストリン/PBSを100μlずつ各ウェルに添加し、25℃にて600 rpmで15分間振とうした。そして、蛍光強度を蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)200 Pro、TECAN社製)で測定した(励起光485 nm/蛍光535 nm)。
(i) 試料の調製
マウスマクロファージ様細胞株J774A.1を、48ウェルプレート(IWAKI製)に10% FBS含有DMEM培地(400μl培地/ウェル)を用いて、70,000 cells/ウェルの濃度で播種した。1日培養した後、培地を除去して、ウェルに、10 mM メチル-β-シクロデキストリン、10% FBS、0.9μM BODIPY標識コレステロール(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids社)及びフェノールレッドを含むDMEM培地を200μlずつ添加した。また、対照として、別のウェルに、10 mM メチル-β-シクロデキストリン、10% FBS、DMSO(900倍希釈)及びフェノールレッドを含むDMEM培地を200μlずつ添加した。そして、細胞を37℃にて5% CO2の雰囲気下で2.5時間インキュベーションした。培地を吸引除去し、血清及びフェノールレッドを含まないDMEM培地を400μlずつ各ウェルに添加して洗浄した。そして、各ウェルに、上記で得たHDL画分をHDL濃度0.78μg/mlで含む、血清及びフェノールレッド不含のDMEM培地を200μlずつ添加した。また、対照として、別のウェルに、ApoAI組換えタンパク質を6μg/mlの濃度で含む血清及びフェノールレッド不含DMEM培地を200μlずつ添加した。プレートを37℃にて5% CO2の雰囲気下で24時間インキュベーションした。
各ウェルの培養上清を新しい96ウェルV底プレートに移し、室温にて1600 rpmで2分間遠心分離した。得られた上清(180μl/ウェル)を新しい96ウェル平底黒色プレート(corning社製又はSUMILON社製)に移した。上清の蛍光強度を蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)200 Pro、TECAN社製)で測定した(励起光485 nm/蛍光535 nm)。一方で、培養上清を除かれた48ウェルプレートの各ウェルにPBSを500μlずつ添加して洗浄した。各ウェルに可溶化バッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1% CHAPS、5mM EDTA(pH 8.0)及び150 mM NaCl)を500μlずつ添加した。そして、プレートを25℃にて450 rpmで15分間振とうして、細胞を溶解させた。各ウェルから細胞可溶化液を200μlずつ回収し、上清が移された96ウェル平底黒色プレートの対応するウェルに添加した。上清と細胞可溶化液との混合物の蛍光強度を蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)200 Pro、TECAN社製)で測定した(励起光485 nm/蛍光535 nm)。
本実施形態の方法による測定結果を横軸にとり、従来法による測定結果を縦軸にとって、各血清検体のデータをプロットすると、直線に近似可能な散布図が得られた。これを図3に示す。また、エクセル(マイクロソフト社)により決定係数R2を求めると、0.7602であった。よって、BODIPY標識コレステロール及びHDL捕捉用抗体を用いたHDLのコレステロール取り込み機能の測定の結果は、培養細胞を用いた従来法による測定結果と相関し、本実施形態の方法は従来法と同程度の性能を示すことが確認された。
この比較例では、抗体によるHDLの捕捉後に蛍光標識コレステロールを取り込ませる手順で測定を行う場合について検討した。
実施例1と同様にして、PEG4000を用いてヒト血清検体(検体1および検体2)からHDL画分を得た。
実施例3の本実施形態の方法と同様にして、抗ApoAI抗体(MONO5030、SANBIO社)を96ウェルマイクロプレートの各ウェルに固相化し、BSA溶液でブロッキングして、測定用プレートを準備した。
(i) HDLと抗ApoAI抗体との複合体の形成
上記で得た各HDL画分の一部を取り、実施例1と同様にしてApoAI濃度を測定した。測定後、ApoAI濃度が0.1μg/mlとなるように各HDL画分を反応バッファーで希釈した。得られた各希釈液(300μl)に酸化剤(1M 過酸化水素、200μM 亜硝酸ナトリウム及び100μM DTPA)を34μlずつ添加して、37℃にて800 rpmで1時間振とうした。上記の測定用プレートからBSA溶液を除去し、酸化剤と反応させたHDL画分を100μlずつウェルに添加した。また、陰性対照として、HDL画分を添加しないウェルも用意した。そして、プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうして、HDLと抗ApoAI抗体との複合体を形成させた。プレートからHDL画分を除去し、実施例3と同様にして各ウェルをPBSで3回洗浄した。
3μlの0.5 mM BODIPY標識コレステロール(TopFluor Cholesterol、Avanti Polar Lipids社)と、300μlの反応バッファーとを混合した。得られた混合液(303μl)と、酸化剤(34μl)とを混合した。得られた標識コレステロール溶液を100μlずつ、上記のプレートの各ウェルに添加して、37℃にて800 rpmで1時間振とうした。プレートから標識コレステロール溶液を除去し、各ウェルをPBSで5回洗浄した。10 mM シクロデキストリン/PBSを100μlずつ各ウェルに添加し、25℃にて600 rpmで15分間振とうした。そして、蛍光強度を蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)200 Pro、TECAN社製)で測定した(励起光485 nm/蛍光535 nm)。
上記の測定後のプレートからシクロデキストリン溶液を除去し、各ウェルをPBSで3回洗浄した。ApoAI測定用キット(N-アッセイ TIA ApoAI-H、ニットーボーメディカル株式会社)のヤギ抗ApoAI血清をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで3回洗浄した。HRP標識ウサギ抗ヤギIgGポリクローナル抗体(P 0449、Dako社)をブロッキングバッファー(StartingBlock、Thermo Scientific社)で1000倍に希釈し、得られた希釈液を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで1時間振とうした後、希釈液を除去して、各ウェルをPBSで3回洗浄した。化学発光基質溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社)を100μlずつ各ウェルに添加した。プレートを25℃にて600 rpmで2分間振とうした後、発光量をマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)F200 Pro、TECAN社製)で測定した。
ELISA法によるHDL検出と蛍光強度の測定の結果を、それぞれ図4A及び4Bに示す。図4Aに示されるように、血清検体中のHDLは、プレートに固定化された抗ApoAI抗体によって捕捉されていることが確認された。一方、図4Bに示されるように、HDL画分と蛍光標識コレステロールとを接触させたにも関わらず、蛍光強度は、HDLを添加していない陰性対照と同程度であった。よって、抗ApoAI抗体によってHDLを捕捉してから、標識コレステロールと接触させても、標識コレステロールはHDLに取り込まれないことがわかった。
22:リポタンパク質に結合する抗体を含む第2試薬
33:固相(96ウェルマイクロプレート)
Claims (16)
- 試料中のリポタンパク質と、標識コレステロールとを接触させることにより、前記標識コレステロールを前記リポタンパク質に取り込ませる工程と、
前記標識コレステロールを取り込んだ前記リポタンパク質と、リポタンパク質に結合する抗体とを接触させることにより、前記リポタンパク質と前記抗体との複合体を形成する工程と、
前記複合体から生じる標識を測定する工程とを含む、リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法。 - 前記リポタンパク質が、高比重リポタンパク質である請求項1に記載の方法。
- 前記標識コレステロールが、蛍光標識コレステロールであって、
前記測定工程において、前記複合体から生じる蛍光の強度が測定される、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記標識コレステロールを前記リポタンパク質に取り込ませる工程において、前記標識コレステロールが、前記試料との接触によりエステル化され、エステル化された標識コレステロールが前記リポタンパク質に取り込まれる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識コレステロールを前記リポタンパク質に取り込ませる工程、複合体を形成する工程、及び標識を測定する工程を、無細胞系で行う請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リポタンパク質に取り込まれなかった遊離の標識コレステロールを除去する工程をさらに含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 複合体形成工程の後に、リポタンパク質に取り込まれなかった遊離の標識コレステロールを除去することにより、前記複合体と、遊離の標識コレステロールとを分離する工程をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リポタンパク質に結合する抗体が、抗ApoAI抗体である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗ApoAI抗体が固相に固定化されている、請求項8に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血清又は血漿である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識コレステロールが、有極性構造を有する蛍光団を含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識コレステロールが、下記の式(I):
- 前記ボロンジピロメテン骨格構造を有する蛍光団を含む蛍光標識コレステロールが、下記の式(III):
- 前記ベンゾオキサジアゾール骨格構造を有する蛍光団を含む蛍光標識コレステロールが、下記の式(IV):
- 標識コレステロールを含む第1試薬と、リポタンパク質と結合する抗体を含む第2試薬とを含むリポタンパク質のコレステロール取り込み能測定用試薬キット。
- 固相をさらに含む、請求項15に記載の試薬キット。
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