CN105300951A - 一种全血快速测定同型半胱氨酸的方法及试剂卡 - Google Patents
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Abstract
本发明一种全血快速测定同型半胱氨酸的方法，包括以下步骤：(1)通过过滤材料对全血进行过滤处理，以过滤掉全血中的红细胞；(2)通过抗红细胞抗体对过滤处理后的全血进行吸附处理，以吸附掉未被过滤掉的红细胞；(3)通过还原剂将吸附处理后的全血中的同型半胱氨酸还原成还原态同型半胱氨酸，然后通过同型半胱氨酸裂解酶对还原态同型半胱氨酸进行裂解，产生H2S；(4)令H2S与显色剂进行荧光反应，最后判读结果。本发明不需要使用专门的分离装置，通过过滤材料和抗红细胞抗体能够去除全血中的红细胞，而且去除效果非常好，从而能够保证测试准确度，极大地简化了操作。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域，具体地说涉及一种全血快速测定同型半胱氨酸的方法及试剂卡。
背景技术
同型半胱氨酸(HCY)是蛋氨酸代谢生产的一种含硫氨基酸，80％的HCY在血中通过二硫键与蛋白质结合，只有很少一部分游离同型半胱氨酸参加循环。同型半胱氨酸作为独立的心血管风险指标已被广泛接受，是高血脂、吸烟、糖尿病之外的又一危险因子。尽管许多有关高同型半胱氨酸血症的生物化学基础有待明确，其检测与各种疾病的关系和治疗检测将需进一步探讨。
目前测定人体内同型半胱氨酸的方法主要有：化学发光法，胱硫醚法，水解酶法，液体荧光法等，以上所有的方法均需要对全血进行预先分离红细胞再进行测试，需要专门的分离装置，因为全血中的红细胞含有大量的同型半胱氨酸，对测试结果有很大的影响，溶血或红细胞去除不干净，均会影响测定结果。而且上述所有的方法均为液相反应体系，需要专门的设备进行反应。因此上述所有的方法都不能实现高效、简便地进行同型半胱氨酸的测试，更不方便在户外及偏远地区进行即时检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够简便、快速、准确，在任何地方进行即时检测的全血快速测定同型半胱氨酸的方法及试剂卡。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种全血快速测定同型半胱氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)通过过滤材料对全血进行过滤处理，以过滤掉全血中的红细胞；
(2)通过抗红细胞抗体对过滤处理后的全血进行吸附处理，以吸附掉未被过滤掉的红细胞；
(3)通过还原剂将吸附处理后的全血中的同型半胱氨酸还原成还原态同型半胱氨酸，然后通过同型半胱氨酸裂解酶对还原态同型半胱氨酸进行裂解，产生H2S；
(4)令H2S与显色剂进行荧光反应，最后判读结果。
优选的，所述过滤材料为纤维素膜，所述还原剂为2-巯基乙醇，所述显色剂包括三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺。
本发明全血快速测定同型半胱氨酸的方法的优点在于：
1.本发明不需要使用专门的分离装置，通过过滤材料和抗红细胞抗体能够去除全血中的红细胞，而且去除效果非常好，从而能够保证测试准确度，并极大地简化了操作。
2.本发明通过还原剂将吸附处理后的全血中的同型半胱氨酸还原成还原态同型半胱氨酸，然后通过同型半胱氨酸裂解酶对还原态同型半胱氨酸进行裂解，产生H2S，最后通过H2S显色的经典方法与三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺发生荧光反应，所得产物在660nm的激光照射下发出710nm的荧光，最后通过荧光测定仪判读结果即可，非常地快捷方便；另外，除能通过荧光判读外，该产物在可见光下也可以识别，因此可以进行人工判读，适用于在没有仪器设备的环境条件下使用，十分方便。
3.本发明直接采全血进行测定，不容易发生溶血现象，因此测量结果更加准确。
本发明提供一种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，从上到下依次包括过滤层、试剂层和显色层，所述过滤层采用过滤材料制成，所述过滤层中含有抗红细胞抗体，所述试剂层中含有还原剂和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层中含有显色剂。
本发明提供另一种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，从上到下依次包括过滤层、吸附层、试剂层和显色层，所述过滤层采用过滤材料制成，所述吸附层中含有抗红细胞抗体，所述试剂层中含有还原剂和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层中含有显色剂。
作为第一种和第二种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优选，所述过滤材料为纤维素膜，所述还原剂为2-巯基乙醇，所述显色剂包括三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺。
作为第一种和第二种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优选，所述试剂层采用硝酸纤维素膜制成，所述显色层采用定性滤纸制成。
作为第二种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优选，所述吸附层采用纤维素膜制成。
作为第一种和第二种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优选，2-巯基乙醇的用量为0.1—1g/dm2，同型半胱氨酸裂解酶的用量为1—10KU/dm2，三氯化铁的用量为40—60mmol/dm2，N,N'-二正丁基对苯二胺的用量为24—36mmol/dm2。
作为第一种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优选，所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述过滤层中：用磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.1—0.5mg/ml，然后放入过滤层，摇床浸泡1—2小时，再将过滤层取出，吸干水分，干燥处理后即可。
作为第二种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优选，所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述吸附层中：用磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.1—0.5mg/ml，然后放入吸附层，摇床浸泡1—2小时，再将吸附层取出，吸干水分，干燥处理后即可。
本发明全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的优点在于：
1.本发明不需要使用专门的分离装置，通过过滤材料和抗红细胞抗体能够去除全血中的红细胞，而且去除效果非常好，从而能够保证测试准确度，并极大地简化了操作。
2.本发明通过还原剂将吸附处理后的全血中的同型半胱氨酸还原成还原态同型半胱氨酸，然后通过同型半胱氨酸裂解酶对还原态同型半胱氨酸进行裂解，产生H2S，最后通过H2S显色的经典方法与三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺发生荧光反应，所得产物在660nm的激光照射下发出710nm的荧光，最后通过荧光测定仪判读结果即可，非常地快捷方便；另外，除能通过荧光判读外，该产物在可见光下也可以识别，因此可以进行人工判读，适用于在没有仪器设备的环境条件下使用。
3.本发明不需要专门的设备进行反应，所有的反应过程，包括还原反应、裂解反应和荧光反应均在试剂卡上完成，极大地简化了操作；另外同型半胱氨酸的还原和还原态同型半胱氨酸的裂解几乎是同时发生，极大地加快了测试进程。
4.本发明直接采全血进行测定，不容易发生溶血现象，因此测量结果更加准确。
综上，本发明能够简便、快速、准确测定人血清中同型半胱氨酸的含量，实现了在任何地方即时检测的目的。
附图说明
图1是本发明实施例1、2、3的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的结构示意图。
图2是本发明实施例4的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的结构示意图。
图3是本发明实施例1的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的相关性曲线图。
图4是本发明实施例1的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的产品线性曲线图。
附图中各部件的标记为：1过滤层、2吸附层、3试剂层、4显色层。
具体实施方式
下面结合附图、实施例对本发明作进一步描述：
本部分对本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。例如，纤维素膜为市售的WhatmanLF1型号，同型半胱氨酸购自SIGMA。
实施例1
参见图1，本实施例的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，从上到下依次包括过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4，所述过滤层1和吸附层2采用纤维素膜制成，所述吸附层2中含有抗红细胞抗体，所述试剂层3采用硝酸纤维素膜(NC)制成，所述试剂层3中含有还原剂2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层4采用定性滤纸制成，所述显色层4中含有显色剂三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺；
过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4的厚度分别为200μm、370μm、250μm、120μm，2-巯基乙醇的用量为0.5g/dm2，同型半胱氨酸裂解酶的用量为5KU/dm2，三氯化铁的用量为50mmol/dm2，N,N'-二正丁基对苯二胺的用量为30mmol/dm2；
具体制作时，所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述吸附层2中：用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.3mg/ml，然后放入吸附层2，摇床浸泡1.5小时，再将吸附层2取出，用吸水纸吸干水分，在37℃的条件下干燥处理7h即可；将2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶混合后喷涂到试剂层3上，晾干即可；将三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺混合后喷涂到显色层4上，晾干即可；最后将过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4复合在一起。
实施例2
参见图1，本实施例的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，从上到下依次包括过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4，所述过滤层1和吸附层2采用纤维素膜制成，所述吸附层2中含有抗红细胞抗体，所述试剂层3采用硝酸纤维素膜(NC)制成，所述试剂层3中含有还原剂2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层4采用定性滤纸制成，所述显色层4中含有显色剂三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺；
过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4的厚度分别为120μm、250μm、120μm、370μm，2-巯基乙醇的用量为0.1g/dm2，同型半胱氨酸裂解酶的用量为1KU/dm2，三氯化铁的用量为40mmol/dm2，N,N'-二正丁基对苯二胺的用量为24mmol/dm2；
具体制作时，所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述吸附层2中：用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.1mg/ml，然后放入吸附层2，摇床浸泡2小时，再将吸附层2取出，用吸水纸吸干水分，在37℃的条件下干燥处理3h即可；将2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶混合后喷涂到试剂层3上，晾干即可；将三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺混合后喷涂到显色层4上，晾干即可；最后将过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4复合在一起。
实施例3
参见图1，本实施例的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，从上到下依次包括过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4，所述过滤层1和吸附层2采用纤维素膜制成，所述吸附层2中含有抗红细胞抗体，所述试剂层3采用硝酸纤维素膜(NC)制成，所述试剂层3中含有还原剂2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层4采用定性滤纸制成，所述显色层4中含有显色剂三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺；
过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4的厚度分别为370μm、120μm、370μm、200μm，2-巯基乙醇的用量为1g/dm2，同型半胱氨酸裂解酶的用量为10KU/dm2，三氯化铁的用量为60mmol/dm2，N,N'-二正丁基对苯二胺的用量为36mmol/dm2；
具体制作时，所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述吸附层2中：用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.5mg/ml，然后放入吸附层2，摇床浸泡1小时，再将吸附层2取出，用吸水纸吸干水分，在37℃的条件下干燥处理12h即可；将2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶混合后喷涂到试剂层3上，晾干即可；将三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺混合后喷涂到显色层4上，晾干即可；最后将过滤层1、吸附层2、试剂层3和显色层4复合在一起。
实施例1至实施例3提供的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡测试过程为：将全血滴在过滤层1上，全血向下渗透，经过过滤层1时，血中的红细胞被过滤掉，经过吸附层2时，血中的未被过滤掉的红细胞被抗红细胞抗体吸附掉，这样剩余的血清渗入试剂层3中，在试剂层3中，血清中的同型半胱氨酸被2-巯基乙醇还原成还原态同型半胱氨酸，还原态同型半胱氨酸被同型半胱氨酸裂解酶(HCYase)裂解，产生H2S，上述还原和裂解过程几乎同时发生，最后血清带着H2S渗入显色层4，H2S与三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺发生荧光反应(H2S显色的经典方法)，所得产物在660nm的激光照射下发出710nm的荧光，最后通过荧光测定仪判读，得出血清中同型半胱氨酸的含量。H2S与三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺(DBPDA)的反应式如下：
实施例4
参见图2，本实施例的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，从上到下依次包括过滤层1、试剂层3和显色层4，所述过滤层1采用纤维素膜制成，所述过滤层1中含有抗红细胞抗体，所述试剂层3采用硝酸纤维素膜制成，所述试剂层3中含有还原剂2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层4采用定性滤纸制成，所述显色层4中含有显色剂三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺；
过滤层1、试剂层3和显色层4的厚度分别为370μm、120μm、200μm，2-巯基乙醇的用量为0.5g/dm2，同型半胱氨酸裂解酶的用量为5KU/dm2，三氯化铁的用量为50mmol/dm2，N,N'-二正丁基对苯二胺的用量为30mmol/dm2；
具体制作时，所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述过滤层1中：用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.3mg/ml，然后放入过滤层1，摇床浸泡1.5小时，再将过滤层1取出，用吸水纸吸干水分，在37℃的条件下干燥处理7h即可；将2-巯基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶混合后喷涂到试剂层3上，晾干即可；将三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺混合后喷涂到显色层4上，晾干即可；最后将过滤层1、试剂层3和显色层4复合在一起。
实施例4提供的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡测试过程近似实施例1至实施例3提供的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，不同之处仅在于对红细胞的过滤和吸附同时发生在过滤层1中，从而可以加快测试进程。
实施例5
测定效果试验
1.标准曲线的绘制
配制同型半胱氨酸标准溶液，然后用实施例1的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡进行检测，最后用荧光测定仪测量并绘制出标准曲线。
2.全血测定同型半胱氨酸对比试验
用实施例1的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡对200个临床全血样本进行测定，并与经典胱硫醚法的测定结果进行相关性比对，因表格篇幅所限，仅列出部分测定结果见下表1：
表1
参见图3，最终得到相关性曲线为：y＝0.9975x+0.055，R2＝0.9902。
从相关性曲线可以看出，本发明全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的测定结果与最为经典的胱硫醚法的测定结果相关性良好，R2达到0.9902，这表明本发明具有非常高的测试准确度，但是相比经典的胱硫醚法，本发明操作更加简单、方便、快捷。
3.精密度试验
用实施例1的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡对两份全血样本分别进行重复测定(20次)，并计算重复测定结果的平均值、SD值和CV值，试验结果见下表2。
表2
从精密度试验的结果可以看出，本发明全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡精密度较好，低值和高值标本测试的CV值均低于10％，满足临床使用要求。
4.产品线性试验
取浓度为100μmol/L的同型半胱氨酸标准溶液，经倍比稀释后，采用实施例1的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡进行测试，测试结果见下表3：
表3
参见图4，最终得到产品线性曲线为：Y＝0.953X+1.237，R2＝0.998。
从产品线性曲线可以看出，本发明全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡的测试线性可达100μmol/L，优于目前经典方法的50μmol/L。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，在不脱离本发明精神实质的情况下，都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种全血快速测定同型半胱氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)通过过滤材料对全血进行过滤处理，以过滤掉全血中的红细胞；
(2)通过抗红细胞抗体对过滤处理后的全血进行吸附处理，以吸附掉未被过滤掉的红细胞；
(3)通过还原剂将吸附处理后的全血中的同型半胱氨酸还原成还原态同型半胱氨酸，然后通过同型半胱氨酸裂解酶对还原态同型半胱氨酸进行裂解，产生H2S；
(4)令H2S与显色剂进行荧光反应，最后判读结果。
2.如权利要求1所述的全血快速测定同型半胱氨酸的方法，其特征在于：所述过滤材料为纤维素膜，所述还原剂为2-巯基乙醇，所述显色剂包括三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺。
3.一种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：从上到下依次包括过滤层、试剂层和显色层，所述过滤层采用过滤材料制成，所述过滤层中含有抗红细胞抗体，所述试剂层中含有还原剂和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层中含有显色剂。
4.一种全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：从上到下依次包括过滤层、吸附层、试剂层和显色层，所述过滤层采用过滤材料制成，所述吸附层中含有抗红细胞抗体，所述试剂层中含有还原剂和同型半胱氨酸裂解酶，所述显色层中含有显色剂。
5.如权利要求3或4所述的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：所述过滤材料为纤维素膜，所述还原剂为2-巯基乙醇，所述显色剂包括三氯化铁和N,N'-二正丁基对苯二胺。
6.如权利要求3或4所述的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：所述试剂层采用硝酸纤维素膜制成，所述显色层采用定性滤纸制成。
7.如权利要求4所述的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：所述吸附层采用纤维素膜制成。
8.如权利要求5所述的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：2-巯基乙醇的用量为0.1—1g/dm2，同型半胱氨酸裂解酶的用量为1—10KU/dm2，三氯化铁的用量为40—60mmol/dm2，N,N'-二正丁基对苯二胺的用量为24—36mmol/dm2。
9.如权利要求3所述的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述过滤层中：用磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.1—0.5mg/ml，然后放入过滤层，摇床浸泡1—2小时，再将过滤层取出，吸干水分，干燥处理后即可。
10.如权利要求4所述的全血快速测定同型半胱氨酸的试剂卡，其特征在于：所述抗红细胞抗体通过以下方法包含在所述吸附层中：用磷酸盐缓冲液将抗红细胞抗体稀释至0.1—0.5mg/ml，然后放入吸附层，摇床浸泡1—2小时，再将吸附层取出，吸干水分，干燥处理后即可。
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| CN106353291A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-01-25 | 浙江达美生物技术有限公司 | 同型半胱氨酸的测定试剂及其制备方法 |
| CN111855648A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-10-30 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种干式同型半胱氨酸测试卡及其应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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