CN103224974A - 一种复合转氨酶校准物质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种复合转氨酶校准物质的制备方法，该制备方法包括如下步骤：1）高纯度酶原料的制备、纯化及测定；2）基质物质的制备与分析，包括如下：2.1基础性血清基质物质制备；2.2基质物质A的成分分析；2.3根据分析结果对重要的组成成分浓度进行调节，得到血清类似物B；2.4以渗透压调节剂调节血清类似物B的渗透压，使其成为等渗溶液，得到与血清渗透压相同的基质物质C；2.5根据ALT、AST的反应性质以及影响因素，加入两种酶的不同浓度的稳定剂，确定为候选校准物质D、E；2.6根据以上结果确定不同的基质物质，并添加为终浓度为80IU/L左右的AST、ALT混合物作为校准物质的候选物F、G；选择稳定性及互通性均符合要求的为最终的转氨酶复合校准物质。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种用于检验医学、与血清具良好互换性、稳定性的转氨酶校准物质的制备方法，属于医学检验体外诊断试剂的技术领域。
背景技术
人体内的转氨酶主要有丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT,EC2.6.1.2）以及天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST,EC2.6.1.1)，丙氨酸氨基转移酶广泛存在于肝脏、心肌、骨胳肌、肾、脑、胰、肺、白细胞和红细胞中，可逆地催化丙酮酸和谷氨酸之间的氨基转移。天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST,EC2.6.1.1)，在体内各组织中广泛存在，以心脏活性最高，其次是肝细胞。正常人血清中含量甚微，当心肌细胞或肝细胞受到损伤，天冬氨酸氨基转移酶会大量释放到人体血液中，导致血液中天冬氨酸氨基转移酶升高。
氨基转移酶测定是临床酶学测定项目中测定量最大、应用最广泛的项目，并且ALT和AST往往同时检测。在临床诊断、治疗监测、药理毒性研究、流行病学调查、健康体检及临床用血检查中，都离不开这两种酶的检测。
大中型医院实验室中，血清氨基转移酶测定普遍通过动力学法试剂盒于全自动生化分析仪完成。由于医院所用的产品来自于不同厂家的校准品，在溯源性、互通性以及稳定性方面的不明确性，另外缺含高值转氨酶性的校准物质，不同医院间结果准确性差别较大，难以得到准确、可比的信息。研制位于重要医学决定值水平附近的氨基转移酶复合校准物质，对于医学检验仪器的校准以及医学测量的质量控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种可溯源至国际参考物质与人血清标本，具良好互换性、高稳定性的位于重要医学决定值附近的人源性丙氨酸氨基转移酶与天冬氨酸氨基转移酶的复合转氨酶校准物质的制备方法，主要用于临床检验中常规诊断试剂中校准物质的配备以及医院的日常质量控制。
本发明的目的是通过如下技术方案完成的：
1）．高纯度酶原料的制备、纯化及测定，
以已克隆的ALT、AST基因表达载体表达至大肠杆菌的工程菌后，以ALT、AST的粗酶原料，经硫酸铵分级盐析，透析，柱层析等步骤，得到高纯度的ALT和AST纯品；
以纯化的ALT和AST为样品，用常规的生物化学方法测定血清中常见的其他酶含量，确保纯化的两种转氨酶中，基本无其他杂酶存在，对ALT与AST的活力测定无影响；
2）．基质物质的制备与分析，具体如下：
2.1基础性血清基质物质制备，
（1）以正常人血清为原料，选择健康献血志愿者样本，筛选并收集经过通过艾滋、梅毒、乙肝、丙肝指标的检测符合要求的血清样本，选择转氨酶在正常值范围内的样本，作为基质物质制备的原料；
（2）将已经筛选的血清进行：稳定性维持---去颗粒---去脂---去浊等几个步骤确定为基础性血清基质物质A；
2.2基质物质A的成分分析：用全自动生化分析仪对基础性血清基质物质A进行分析；
2.3根据分析结果对重要的组成成分浓度进行调节，其中主要为蛋白质浓度，以及离子浓度，尽量做到与正常血清一致才可，得到血清类似物B；其中目标酶浓度为正常酶浓度的2-3倍左右；
2.4渗透压调节：以渗透压调节剂调节血清类似物B的渗透压，使其成为等渗溶液，得到与血清渗透压相同的基质物质C；
2.5适量ALT,AST稳定剂：根据ALT、AST的反应性质以及影响因素，加入两种酶的不同浓度的稳定剂，确定为候选校准物质D、E；
2.6候选校准物稳定性和互通性分析：根据以上结果确定不同的基质物质，并添加为终浓度为80IU/L左右的AST、ALT混合物作为校准物质的候选物F、G；选择稳定性及互通性均符合要求的为最终的转氨酶复合校准物质。
本发明所述的步骤1）中，以基因重组的人丙氨酸氨基转移酶作为丙氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-ALT。酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后取上清；将超声破碎后的上清经过30%及50%硫酸铵沉淀进行分级分离；再将50%硫酸铵沉淀进行透析；将透析后的粗酶用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的ALT；
以基因重组的人天冬氨酸氨基转移酶作为天冬氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-AST；酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后高速离心取上清；将超声破碎后的上清经过0.45μm的滤膜过滤后，用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的AST。
本发明所述的步骤2）中的（2），将已经筛选的血清进行如下几个分步骤，然后确定为基础性血清基质物质A：
1）将收集的血清在-80℃～4℃～37℃之间反复冻融2-4次；
2）冻融处理后的血清4000～8000rpm，离心15min，弃掉沉淀；
3）将离心后的血清物质经过粗滤、精滤两次过滤后，作为候选血清基质，并将该基质物质与原血清进行比对分析。
本发明制备的校准物质，其最重要的作用为：首先是具有与人血清反应性相同，即具有互通性，另外，则必须有高度的稳定性和溯源性。
本发明主要用于临床检验中常规诊断试剂中校准物质的配备以及医院的日常质量控制；通过本发明所述的制备方法获得的复合转氨酶校准物质，其可溯源至国际参考物质与人血清标本具良好互换性、高稳定性。
附图说明
图1是本发明所述的ALT的纯化电泳图。
图2是本发明所述的AST的纯化电泳图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种复合转氨酶校准物质的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1）．高纯度酶原料的制备、纯化及测定，
以已克隆的ALT、AST基因表达载体表达至大肠杆菌的工程菌后，以ALT、AST的粗酶原料，经硫酸铵分级盐析，透析，柱层析等步骤，得到高纯度的ALT和AST纯品；
以纯化的ALT和AST为样品，用常规的生物化学方法测定血清中常见的其他酶含量，确保纯化的两种转氨酶中，基本无其他杂酶存在，对ALT与AST的活力测定无影响；
2）．基质物质的制备与分析，具体如下：
2.1基础性血清基质物质制备，
（1）以正常人血清为原料，选择健康献血志愿者样本，筛选并收集经过通过艾滋、梅毒、乙肝、丙肝指标的检测符合要求的血清样本，选择转氨酶在正常值范围内的样本，作为基质物质制备的原料；
（2）将已经筛选的血清进行：稳定性维持---去颗粒---去脂---去浊等几个步骤确定为基础性血清基质物质A；
2.2基质物质A的成分分析：用全自动生化分析仪对基础性血清基质物质A进行分析；
2.3根据分析结果对重要的组成成分浓度进行调节，其中主要为蛋白质浓度，以及离子浓度，尽量做到与正常血清一致才可，得到血清类似物B；其中目标酶浓度为正常酶浓度的2-3倍左右；
2.4渗透压调节：以渗透压调节剂调节血清类似物B的渗透压，使其成为等渗溶液，得到与血清渗透压相同的基质物质C；
2.5适量ALT,AST稳定剂：根据ALT、AST的反应性质以及影响因素，加入两种酶的不同浓度的稳定剂，确定为候选校准物质D、E；
2.6候选校准物稳定性和互通性分析：根据以上结果确定不同的基质物质，并添加为终浓度为80IU/L左右的AST、ALT混合物作为校准物质的候选物F、G；选择稳定性及互通性均符合要求的为最终的转氨酶复合校准物质。
本发明所述的步骤1）中，以基因重组的人丙氨酸氨基转移酶作为丙氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-ALT。酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后取上清；将超声破碎后的上清经过30%及50%硫酸铵沉淀进行分级分离；再将50%硫酸铵沉淀进行透析；将透析后的粗酶用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的ALT；
以基因重组的人天冬氨酸氨基转移酶作为天冬氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-AST；酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后高速离心取上清；将超声破碎后的上清经过0.45μm的滤膜过滤后，用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的AST。
本发明所述的步骤2）中的（2），将已经筛选的血清进行如下几个分步骤，然后确定为基础性血清基质物质A：
1）将收集的血清在-80℃～4℃～37℃之间反复冻融2-4次；
2）冻融处理后的血清4000～8000rpm，离心15min，弃掉沉淀；
3）将离心后的血清物质经过粗滤、精滤两次过滤后，作为候选血清基质，并将该基质物质与原血清进行比对分析。
实施例：
1.高纯度的转氨酶的获得，
以基因重组的人丙氨酸氨基转移酶作为丙氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料。基因表达载体为pReceiver-ALT。酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达。将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体。超声破碎后取上清。将超声破碎后的上清经过30%及50%硫酸铵沉淀进行分级分离。再将50%硫酸铵沉淀进行透析。将透析后的粗酶用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的ALT，见图1所示；图1中，2：蛋白标准Marker；2：大肠杆菌超声破碎上清；3：ALT纯化产物。
以基因重组的人天冬氨酸氨基转移酶作为天冬氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料。基因表达载体为pReceiver-AST。酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达。将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体。超声破碎后高速离心取上清。将超声破碎后的上清经过0.45μm的滤膜过滤后，用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的AST，见图2所示；图2中1：蛋白标准Marker；2：大肠杆菌超声破碎上清；3：镍柱流穿液；4:镍柱30mmol/L咪唑洗脱；5：镍柱75mmol/L咪唑洗脱；6：镍柱100mmol/L咪唑洗脱；7：镍柱150mmol/L咪唑洗脱；8：镍柱200mmol/L咪唑洗脱。
以ALT、AST的粗酶原料，经硫酸铵分级盐析，透析，柱层析等步骤，得到高纯度的ALT和AST纯品。
以纯化的ALT和AST为样品，用常规的生物化学方法测定血清中常见的其他酶含量。确保纯化的两种转氨酶中，基本无其他杂酶存在，对ALT与AST的活力测定无影响。（数据见表1A、表1B）。
表1A 纯化的ALT中杂酶的含量
表1B 纯化的AST中杂酶的含量
2．基质物质的制备与分析，
制备人血清基质的ALT/AST复合校准物质候选物，最关键的需得到与临床各种样本互换性良好的复合标准物质；这样可以避免基质效应，具体的发明如下：
2.1基础性血清基质物质，
（1）以正常人血清为原料，选择健康献血志愿者样本，筛选并收集经过通过艾滋、梅毒、乙肝、丙肝指标的检测符合要求的血清样本，选择转氨酶在正常值范围内的样本，作为基质物质制备的原料；
（2）将已经筛选的血清进行：稳定性维持---去颗粒---去脂---等几个步骤后确定为基础性血清基质物质A；
具体如下：
3）将收集的血清在-80℃～4℃～37℃之间反复冻融2-4次；
4）冻融处理后的血清4000～8000rpm，离心15min，弃掉沉淀；
5）将离心后的血清物质经过粗滤、精滤两次过滤后，作为候选血清基质，并将该基质物质与原血清进行比对分析；
2.2基质物质A成分分析：用全自动生化分析仪对基础性血清基质物质进行分析。具体结果可以见表2；
表2 血清基质物质A与原血清成分的比较
2.3根据表2的检测结果对重要的组成成分的浓度进行调节，其中主要为蛋白质浓度，以及离子浓度。尽量做到与正常血清一致才可；
蛋白质：主要蛋白质：白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白等。
目标酶：依据高浓度酶产物分别以含各种离子的高浓度母液浓度确定添加的量使其终浓度为150IU/L左右。
重要的离子包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子等，调节以上品种离子的浓度得到血清类似物B。
2.4.渗透压调节：以渗透压调节剂调节血清类似物B的渗透压，使其成为等渗溶液，即相当于0.9％NaCl溶液。
2.5适量ALT,AST稳定剂添加：根据ALT、AST的反应性质以及酶活力影响因素，加入一定浓度的稳定的稳定剂。并筛选出可维持ALT、AST活力以确定为两种不同的校准物质候选物。
2.6复合校准物的确定：根据以上结果确定2种不同的校准候选质，以互通性作为最后的选择。
2.7校准物稳定性和互通性分析：见附件。
3．ALT/AST复合校准物质的分装
校准物质用5ml玻璃瓶包装，每支为1ml，分装后于-70℃冰冻保存。标准物质活力设计两个水平：水平1位于医学决定值40-60U/L附近，水平2位于120U/L附近。
4．ALT/AST复合校准物质的溯源
以国际参考物质方法溯源至国家级标准物质。
ATL/AST复合校准物质基本性质评估：基质效应是指检测系统检测样品中的分析物时，处于分析物周围的所有非分析物质对分析物参与反应的影响。本实验按照EP14A文件介绍的方法来评估样本在分析过程中是否存在基质效应。即是否与正常血清具有互换性。
评估方法为：质量稳定的进口试剂在日立7020全自动生化仪测定简称“常规A方法”、质量稳定的国产试剂在雅培C16000全自动生化仪测定简称“常规B方法”；比对方法为：IFCC参考方法（无磷酸吡哆醛）。
试验步骤为：
第一，收集20份新鲜血清，并且值水平能包括待评估样品。
第二，将待评估样品随机排列在20份新鲜血清中，用待评估方法对所有样本按顺序测定1次。逆序将每个样本重复测定1次，按单双数顺序再重复测定1次，共测定三次。
第三，用比对方法对所有样本进行测定，方法同上。
第四，以比对方法测得的值为横坐标，以待评估方法测得的值为纵坐标，绘制散点图，进行统计分析。
分析结果表明：两种评估方法中，复合标准物质候选物（Lev1和Lev2）中ALT和AST的测定均值均在临床新鲜血清样本95%的可信区间内，说明复合标准物质候选物（Lev1和Lev2）和临床新鲜血清样本相比在ALT和AST检测中表现均一致，无明显的基质效应。即所制备的校准物质与正常血清具有互换性。
Claims (3)
1.一种复合转氨酶校准物质的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：
1）．高纯度酶原料的制备、纯化及测定，
以已克隆的ALT、AST基因表达载体表达至大肠杆菌的工程菌后，以ALT、AST的粗酶原料，经硫酸铵分级盐析，透析，柱层析等步骤，得到高纯度的ALT和AST纯品；
以纯化的ALT和AST为样品，用常规的生物化学方法测定血清中常见的其他酶含量，确保纯化的两种转氨酶中，基本无其他杂酶存在，对ALT与AST的活力测定无影响；
2）．基质物质的制备与分析，包括如下：
2.1基础性血清基质物质制备，
（1）以正常人血清为原料，选择健康献血志愿者样本，筛选并收集经过通过艾滋、梅毒、乙肝、丙肝指标的检测符合要求的血清样本，选择转氨酶在正常值范围内的样本，作为基质物质制备的原料；
（2）将已经筛选的血清进行：稳定性维持---去颗粒---去脂---去浊等几个步骤确定为基础性血清基质物质A；
2.2基质物质A的成分分析：用全自动生化分析仪对基础性血清基质物质A进行分析；
2.3根据分析结果对重要的组成成分浓度进行调节，其中主要为蛋白质浓度，以及离子浓度，尽量做到与正常血清一致才可，得到血清类似物B；其中目标酶浓度为正常酶浓度的2-3倍左右；
2.4渗透压调节：以渗透压调节剂调节血清类似物B的渗透压，使其成为等渗溶液，得到与血清渗透压相同的基质物质C；
2.5适量ALT,AST稳定剂：根据ALT、AST的反应性质以及影响因素，加入两种酶的不同浓度的稳定剂，确定为候选校准物质D、E；
2.6候选校准物稳定性和互通性分析：根据以上结果确定不同的基质物质，并添加为终浓度为80IU/L左右的AST、ALT混合物作为校准物质的候选物F、G；选择稳定性及互通性均符合要求的为最终的转氨酶复合校准物质。
2.根据权利要求1所述的复合转氨酶校准物质的制备方法，其特征在于步骤1）中，以基因重组的人丙氨酸氨基转移酶作为丙氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-ALT。酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后取上清；将超声破碎后的上清经过30%及50%硫酸铵沉淀进行分级分离；再将50%硫酸铵沉淀进行透析；将透析后的粗酶用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的ALT；
以基因重组的人天冬氨酸氨基转移酶作为天冬氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-AST；酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后高速离心取上清；将超声破碎后的上清经过0.45μm的滤膜过滤后，用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的AST。
3.根据权利要求1所述的复合转氨酶校准物质的制备方法，其特征在于步骤2）中的（2），将已经筛选的血清进行如下几个分步骤，然后确定为基础性血清基质物质A：
1）将收集的血清在-80℃～4℃～37℃之间反复冻融2-4次；
2）冻融处理后的血清4000～8000rpm，离心15min，弃掉沉淀；
3）将离心后的血清物质经过粗滤、精滤两次过滤后，作为候选血清基质，并将该基质物质与原血清进行比对分析。
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