CN109593764A - 石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器及其制备方法，其中，所述的石房蛤毒素适配体序列为5’SH‑(CH₂)₆‑CCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGT‑3’。该生物传感器提高了检测石房蛤毒素的灵敏性，最低可以检测出0.05ng/mL的石房蛤毒素。本发明将比色分析技术快速、超灵敏的优势与核酸适配体高亲和力、高选择性的特点紧密结合，兼具传感器操作简单、便携式的特色，可实现海水贝类复杂基质中石房蛤毒素的超灵敏、高特异性、快速检测、现场检测的需求，研究成果可为海水贝类中贝类毒素的快速检测技术和装备的研发提供技术支撑，具有重要的科研意义和市场价值。

Description

石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于生物分子学技术领域，具体涉及一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器及其制备方法。

背景技术

随着食品贸易全球化，加工食品的便利，人们餐饮习惯的改变，食品安全问题越来越深刻地影响人们的生活并受到全社会的高度关注。及时、快速而全面地从各环节监控食品安全状况需要能够满足这一要求的快速、方便、准确的食品安全快速检测技术来保障食品安全性。海水贝类如贻贝、扇贝等因其味美、营养价值高深受人们喜爱，浙江省作为海洋资源大省，其水产加工总产量超过全国1/10，是海上浙江最重要的支撑产业之一，但近年来从原料生产、产品加工、流通到消费各个环节发生的一些质量安全问题也日渐凸显，例如2011年5月份发生的“淡菜中毒”事件无疑给我们敲响了警钟，宁波、舟山等地出现部分消费者因食用贻贝等贝类产品后出现腹泻、呕吐等病例，经卫生部门调查和实验室检测，证实贻贝中贝类毒素引起的食源性疾病。目前浙江省嵊泗贻贝年产量近8万吨，产值达1亿多元，占舟山市海水养殖产量50％以上，2010年8月，嵊泗获得了“中国贻贝之乡”的称号。嵊泗贻贝产业关系到近400户个体养殖户及5000名从事贻贝养殖、加工、销售的渔民的直接利益。民以食为天，食以安为先，加强海水贝类中各类贝类毒素监测显得刻不容缓。

麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poison，PSP)是由石房蛤毒素(saxitoxin，STX)及其衍生物组成的一类赤潮生物毒素，成分达20多种，是全球分布范围最广、发生频率最高和危害程度最严重的海洋生物毒素之一。近岸海域中的PSP主要由有毒甲藻分泌产生，贝类因摄食有毒藻类并积累毒素而染毒。藻类被贝类摄食后，其毒素在贝体中转化为毒性更强，化学性质更稳定的毒素。该类毒素对贝类自身通常无毒害作用，但可通过阻断细胞的钠离子通道而对哺乳动物产生毒害作用，人类因而误食染毒贝类而中毒甚至死亡，在我国及世界范围内已发生多起因食用染毒贝类而中毒的事件。因此对STX的检测对保障人们的生命和健康安全和对各种海水贝类的开发利用至关重要，为保证海水贝类安全性，最大限度降低贝类毒素等对人类健康的危害，有必要建立快速、灵敏和可靠的检测方法。

目前，用于STX检测常用的检测方法有生物检测法、高效液相色谱-质谱联用等方法和免疫学检测等方法。生物检测法是小白鼠进行生物分析的方法其优点在于比较直观，可直接判断该样品是否可供使用，但检测周期长，灵敏度低，个体差异大，不能确定毒素的组成成分，定量困难，假阳性率高，重现性差。而HPLC及其质谱联用技术可准确检测样品中各组成成分及其含量，但需要专门的技术、仪器设备，仪器昂贵，且需专人操作，不便于现场操作，检测的周期较长，其应用受到限制。与小鼠生物法或HPLC比较，免疫学检测法具有更高的灵敏度，是一种快速、灵敏、经济、实用的检测方法，且与高效液相色谱法具有良好的重复性。目前国外已有多种商品试剂盒，但是利用ELISA方法检测生物毒素也存在不足，如系列标准毒素缺乏，抗体只是针对某种毒素建立，对其他毒素经常表现出较低的交叉反应等，这些均限制了该方法的深入广泛应用。此外还有其他方法例如：细胞毒性测试法、受体结合分析法、酶蛋白抑制法]等。另一方面，传统的常规检测技术已经无法适应水产品质量安全高效实时检测和快速评价的需求，目前快速检测检测技术已得到世界范围内广泛重视和研究，检测的手段和方法正向着多样化，检测速度越来越快，检测限越来越低，检测范围越来越广以及便携、高通量、具“特异性”的方向发展。因此，开发一种特异性强且灵敏度高的探针用于石房蛤毒素检测具有十分重要的意义。

生物传感器是一个多学科的交叉领域，涉及了生物、化学、材料、电子和机械等多学科知识。近年来，随着生物技术、材料科学、纳米技术、电子技术、微加工技术的快速发展，生物传感器无论是在理论基础还是在设计加工方面都得到了很大的进展。目前,利用生物传感器法测定海洋生物毒素的报道较少。Lehane开发了检测石房蛤毒素(STX)的组织生物传感器。这种传感器是将一个钠电极整合到一个含8％NaCl溶液的腔内，电极头上覆盖有三层膜，即在两层醋酸纤维素膜之间夹一层蛙的膀胀膜。该传感器极端灵敏，一次检测只需5min左右，可检测低于86fg/ml的STX。而且，在有0.003％NaN₃的情况下，这种传感器可持续使用约250h。另外由Kulagina等开发的神经元网络生物传感器，这种生物传感器利用的是STX对胞外动作电位的效应，这种生物传感器构建在人工培养的哺乳动物的神经元上，从小鼠胚胎的脊索组织中得到的神经元培养在64微电极阵列基板上。STX抑制动作电位的传播，并且抑制脊索神经元网络的平均的锋电位几率。STX检测限在缓冲溶液中为12pg/ml，在稀释25倍的海水中为28pg/ml。由于脊索网络神经极高的敏感性才会出现这么低的值，与小白鼠生物测定法的检测限相比，大约低30000倍。此外，阵列只对存在产生毒素的藻类做出反应，虽然该法不能完全确定或量化个别的毒素，但是作为筛选工具来应用还是合理的。但总体上这些传感器的制备及测试过程较复杂，检测灵敏度也有待于进一步提高。

自指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponentialEnrichment，SELEX)出现以来，能够与靶分子特异性结合的核酸适配体作为一种新型的敏感元件被用于许多生物传感器的应用研究中。纳米材料由于其独特的物理化学性质，使其给生物传感器的研究和应用带来了一场新的革命。同时，电子技术以及微加工技术的发展使得传感器逐渐往小型化，自动化集成化以及便携式的方向发展，从而逐步实现生物传感器的现场检验。核酸适配体(aptamer，apt)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的、能特异结合蛋白质或其它小分子物质的单链寡聚核苷酸。核酸适配体可以与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，作为一种新型分子识别元件，适配体一经发现便成为生物传感领域炙手可热的研究对象和分析工具。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，其自身的构型会随之发生变化(刚性G-四联体结构)。虽然传统的抗原抗体反应灵敏度和特异性均较好，尤其酶联免疫反应在各种生物分子的探测中发挥着举足轻重的作用，但是蛋白质作为探针分子，易受pH、温度等环境因素影响而变性、且制备价格昂贵。核酸适配体比蛋白质体积更小，经SELEX筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度。而且，制备核酸适配体无需进行动物体内免疫实验，可以在体外进行筛选并进行大量、快速的制备。对于靶分子的亲和性高于传统抗体，并且可以和核酸的一级、二级和三级结构相结合，用于较大范围靶分子的筛选，在临床上有一定有优势。此外，核酸适配体比抗体更稳定，保存时间长，可以在室温下进行运输。鉴于以上诸多优势，近年来关于核酸适配体的基础及应用研究均呈现了快速发展态势，是目前分析化学进展最迅速的学科前沿之一。核酸适配体的出现，使基于抗原抗体反应的分子识别体系发生了革命性的变化，大大弥补了现有抗体的不足，为传统免疫传感器的发展开辟了一条新的道路，同时也突破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和运载载体的认识。在不远的将来，基于核酸适配体的检测技术有望成为各种化学分子、生物靶标检测的有力武器。

比色法是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。它是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤，首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度。选取合适的反映条件和消除干扰是比色分析的关键问题。比色分析法操作简便、检测成本低，不需要昂贵的仪器设备，并且具有可用裸眼直接快速观察检测结果的等优点，得到了广泛深入的研究。其中，除了常见的染料外，一些具有特殊光学性质的纳米材料也可用于比色传感的研究分析^[50]。例如，Au纳米粒子不仅摩尔吸光系数较高，而且粒径不同其颜色也会随之发生改变，因此可以通过Au纳米粒子表面的功能化修饰，构建适配体比色生物传感器应用于靶物质的快速检测。Yang等利用Au纳米粒子作为指示剂，构建了适配体比色生物传感器用于灵敏检测赭曲酶毒素A(OTA)。由于OTA的适配体会在含有Mg²⁺和OTA的磷酸盐缓冲溶液中发生结构变化，由无规则的卷曲结构变成紧凑的刚性G-四联体结构，由于Au纳米粒子在盐作用下发生团聚，通过肉眼可以直接观察到颜色从红色变成蓝色，且单一检测时间仅需5min。实验结果标明，该适配体比色传感器具有20-625nM的较宽线性范围，检出限为20nM。Gao等用氧化钯纳米颗粒标记聚合酶螯合物，结合氯霉素核酸适配体，成功构建了能够特异性、灵敏性的快速检测样品中痕量氯霉素的比色适配体传感器，该方法具有较高的灵敏度并在0.02-150ng/mL范围内具有良好的相关性，检测下线为0.01ng/mL。此外，该方法已成功应用于分析鱼肉和鹅肉样品中的氯霉素，其结果与传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法相一致。

综上所述，由于石房蛤毒素(STX)是麻痹性贝类毒素(PSP)中危害最大且最典型的一种毒素，且由于其他PSP毒素的标准品较难获得，因此本研究选用STX作为研究比色适配体传感器法的对象。

发明内容

针对现有技术的缺陷和不足，本发明通过提供一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器，以实现海水贝类复杂基质中石房蛤毒素的超灵敏、高特异性、快速检测、现场检测的需求；该方法的建立是基于核酸适配体特异性结合目标物的高选择性能和多聚酶螯合物(PV)偶联胶体金纳米颗粒的信号放大效应，它能特异性灵敏性地快速检测样品中石房蛤毒素，该方法国内外均未见报道。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种石房蛤毒素适配体，所述适配体的核苷酸序列组成如下：

5’SH-(CH₂)₆-CCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGT-3’。

进一步，一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器，所述的生物传感器中含有所述的适配体。

进一步，一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)信号探针(cDNA-AuNPs-PV)的制备：以PV作为信号放大载体，标记硫醇化的cDNA进而偶联胶体纳米金颗粒，获得信号探针；

(2)捕获探针偶联物(AuMNPs-Apt)的制备：将适配体固定在金包磁纳米微球上，并利用通过磁分离技术去除多余的适配体，获得捕获探针偶联物；

(3)将步骤(2)制备的捕获探针偶联物50μL加入到由步骤(1)制备的过量信号探针中，将混合溶液在37℃轻轻搅拌45min，得到杂交复合物，在外部磁场作用下，即获得适配体生物传感器。

进一步，步骤(1)中，信号探针制备的具体过程是：首先利用K₂CO₃溶液将胶体金纳米金颗粒(AuNPs)的pH值调整至9.0，然后将PV试剂加入该溶液，并在室温下温育15min，在此过程中通过胶体金纳米金颗粒与PV抗体上的自由SH基之间的本位结合，PV共价结合到胶体金纳米金颗粒上；然后将硫醇化的cDNA加入到此混合溶液中，在4℃保持24h，10000rpm下离心15min，弃去上清，用PBS缓冲液将红色沉淀物洗涤几次，然后加入6-巯基已醇(MCH)在室温下温育30min，以阻止多余位点，最后将制备好的信号探针重新悬浮于500μL PBS缓冲液中，并贮存在4℃冰箱作进一步使用。

进一步，步骤(1)中，所述硫醇化的cDNA的核苷酸序列组成为：

5’SH-(CH₂)₆-CAATGAACATGTTTCCACGG-3’。该cDNA经过巯基化修饰可以通过Au-S键更好的结合胶体金纳米颗粒，并且可以和石房蛤毒素适配体互补结合。

进一步，步骤(2)中，捕获探针偶联物制备的具体过程如下：将金包磁纳米微球(AuMNPs)悬浮于PBS缓冲液中，过量巯基化的适配体Apt(50μM)加入到上述溶液并在室温下轻轻搅拌12h，将多余的适配体通过磁分离作用去除，然后加入6-巯基已醇(MCH)在室温下温育30min，以阻止多余位点，最后将制备好的捕获探针重新悬浮于500μL PBS缓冲液中并贮存在4℃冰箱作进一步使用。

进一步，步骤(2)中，0.02g四氧化三铁磁性纳米微球最终悬浮于500μL PBS缓冲液中，浓度为40mg·mL^-1，所制备的捕获探针浓度的最终浓度为38mg·mL^-1。

进一步，步骤(2)中，所述金包磁纳米微球的制备方法为：采用柠檬酸钠还原的方法合成胶体金纳米颗粒，加入0.02g四氧化三铁磁性纳米微球，在室温下搅拌8h，通过磁分离技术合成金包磁纳米微球；磁分离技术中所用的磁铁均为圆形磁铁，直径12mm，厚度3mm，施加磁场的方式是在反应试管外壁上贴附磁铁，施加磁场时间为1min。

进一步，所述适配体生物传感器在石房蛤毒素检测中的应用。

进一步，一种石房蛤毒素检测方法，包括以下步骤：

(1)上述适配体生物传感器溶液与100μL不同浓度石房蛤毒素的PBS缓冲液进行混合，溶液pH调整至7.0，在室温下温育30min，信号探针在外部磁场作用下从杂交复合物中释放并游离到上清液中；

(2)取步骤(1)的反应产物，加入50μL0.2mg·mL^-1TMB与0.015％H₂O₂，体系产生颜色变化进行定性以及半定量，并根据显色物质的吸光度运用紫外可见分光光度计进行定量检测。

进一步，所述的检测方法在0.1～50ng/mL的石房蛤毒素含量范围内具有良好的相关性；并且，y＝0.1684ln(x)+1.5211，R²＝0.996检测下限是0.05ng/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明将比色分析技术快速、超灵敏的优势与核酸适配体高亲和力、高选择性的特点紧密结合，兼具传感器操作简单、便携式的特色，可实现海水贝类复杂基质中石房蛤毒素的超灵敏、高特异性、快速检测、现场检测的需求，研究成果可为海水贝类中贝类毒素的快速检测技术和装备的研发提供技术支撑，具有重要的科学意义和市场价值。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明的基于比色适配体生物传感器的石房蛤毒素超灵敏检测原理示意图；

图2为分别在无外部磁场和有外部磁场作用下捕获探针的照片；

图3为不同浓度STX(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10ng/mL)的紫外可见吸收光谱(A)不同浓度STX的拟合曲线(B)显色照片(C)；

图4为利用本发明的适配体生物传感器的检测方法检测STX的特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器，如图1所示，其制备原理如下：

1、信号探针(cDNA-AuNPs-PV)和捕获探针偶连物(AuMNPs-Apt)的制备

(1)石房蛤毒素(STX)适配体的制备

根据STX适配体序列，设计适配体(Aptamer,Apt)和硫醇化互补DNA(cDNA)。

(2)信号探针(cDNA-AuNPs-PV)的制备技术

以PV作为信号放大载体，标记硫醇化互补DNA链(cDNA)进而偶联胶体纳米金颗粒(AuNPs)，合成纳米过氧化物复合物(cDNA-AuNPs-PV)作为信号探针，并进行表征分析。同时，比较不同信号探针在TMB-H₂O₂溶液中的信号放大效果，确定步骤(1)合成的硫醇化互补DNA序列作为信号探针放大效果最好。

(3)捕获探针(AuMNPs-Apt)的制备技术

采用柠檬酸钠还原的方法合成胶体金纳米颗粒(AuNPs)，加入Fe₃O₄通过磁分离技术合成金包磁纳米微球(即载体Fe3O4@Au磁性纳米颗粒，AuMNPs)，将适配体(Aptamer,Apt)固定化到AuMNPs，用于捕获和富集目标分析物。通过磁分离技术高灵敏性去除多余的Apt，最终获得捕获探针偶连物(AuMNPs-Apt)，并进行表征分析。

2、石房蛤毒素比色适配体生物传感器的制备

将制备好的捕获探针加入到过量信号探针中，在外部磁场作用下，通过核酸适配体和cDNA的杂交反应形成AuMNPs-Apt/cDNA-AuNPs-PV复合物，即获得本发明的适配体生物传感器。

实施例2

本发明所用STX适配体在文献报道的STX适配体序列基础上，进行了截短改造和巯基化修饰，合成大量的适配体列。采用改造前和改造后的适配体进行检测方法回收率验证，具体如下：采用经改造后的STX适配体，在STX加标量0.1～5.0ng/mL范围内进行添加回收率测定，回收率在97.0～110％之间；采用未经改造的STX适配体，在STX加标量0.1～5.0ng/mL范围内进行添加回收率测定，回收率在62.5～75.8％之间。由此说明，经过截短改造和巯基化修饰的STX适配体回收率更高，效果更优。

通过上述的方法筛选验证后，获得以下回收率最高、效果最好的适配体，该适配体的序列长度为39bp，其5’端进行了巯基化修饰，该适配体的具体核苷酸序列组成如下：

5’SH-(CH₂)₆-CCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGT-3’。

并确定所述的硫醇化的cDNA的核苷酸序列为：

5’SH-(CH₂)₆-CAATGAACATGTTTCCACGG-3’。

实施例3

一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1、信号探针(cDNA-AuNPs-PV)和捕获探针偶连物(AuMNPs-Apt)的制备

(1)石房蛤毒素(STX)适配体的制备

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成适配体(Aptamer,Apt)和硫醇化互补DNA(cDNA)。

所述适配体的具体核苷酸序列组成如下：

5’SH-(CH₂)₆-CCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGT-3’。

所述的硫醇化的cDNA的核苷酸序列为：

5’SH-(CH₂)₆-CAATGAACATGTTTCCACGG-3’。

(2)信号探针(cDNA-AuNPs-PV)的制备技术

首先利用K₂CO₃溶液将胶体金纳米金颗粒AuNPs的pH值调整至9.0，然后将PV试剂加入该溶液，并在室温下温育15min，在此过程中通过AuNPs与PV抗体上的自由SH基之间的本位结合，PV共价结合到AuNPs；然后将硫醇化的cDNA(该cDNA经过巯基化修饰可以通过Au-S键更好的结合胶体金纳米颗粒，并且可以和石房蛤毒素适配体互补结合。)加入到此混合溶液(即胶体金纳米金颗粒AuNPs和PV试剂的混合溶液中)中，在4℃保持24h，10000rpm下离心15min，弃去上清，用PBS缓冲液将红色沉淀物洗涤几次，然后加入6-巯基已醇(MCH)在室温下温育30min，以阻止多余位点，最后将制备好的信号探针重新悬浮于500μL PBS缓冲液中，并贮存在4℃冰箱作进一步使用。

(3)捕获探针(AuMNPs-Apt)的制备技术

将金包磁纳米微球(AuMNPs)悬浮于PBS缓冲液中，过量巯基化的适配体Apt(50μM)加入到上述溶液并在室温下轻轻搅拌12h，将多余的适配体通过磁分离作用去除，然后加入6-巯基已醇(MCH)在室温下温育30min，以阻止多余位点，最后将制备好的捕获探针重新悬浮于500μLPBS缓冲液中并贮存在4℃冰箱作进一步使用。0.02g四氧化三铁磁性纳米微球最终悬浮于500μL PBS缓冲液中，浓度为40mg·mL^-1，考虑到磁分离过程损失为5％，所制备的捕获探针浓度的最终浓度为38mg·mL^-1。

所述金包磁纳米微球的制备方法为：采用柠檬酸钠还原的方法合成胶体金纳米颗粒，加入0.02g四氧化三铁磁性纳米微球，在室温下搅拌8h，通过磁分离技术合成金包磁纳米微球；磁分离技术中所用的磁铁均为圆形磁铁，直径12mm，厚度3mm，施加磁场的方式是在反应试管外壁上贴附磁铁，施加磁场时间为1min。

2、石房蛤毒素比色适配体生物传感器的制备

将上述的捕获探针偶联物50μL加入到过量的上述信号探针中，将混合溶液在37℃轻轻搅拌45min，得到杂交复合物，在外部磁场作用下，即获得适配体生物传感器。

实施例4

一种基于石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的检测方法的建立，包括以下步骤：

(1)上述适配体生物传感器溶液与100μL不同浓度石房蛤毒素的PBS缓冲液进行混合，信号探针在外部磁场作用下从杂交复合物中释放并游离到上清液中；

(2)取步骤(1)的反应产物，加入50μL 0.2mg·mL^-1TMB与0.015％H₂O₂，体系产生颜色变化进行定性以及半定量，并根据显色物质的吸光度运用紫外可见分光光度计进行定量检测。

如图1所示，在STX检测中，该溶液与不同浓度STX的PBS缓冲液在室温下温育。由于STX适配体与STX之间特异性识别能力，使得杂交复合物上的cDNA与适配体分离，从而在外部磁铁作用下，使得部分信号探针从复合物中分离出来到上清液中(如图2所示)。随后加入辣根过氧化物酶催化3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine(TMB))与H₂O₂体系产生颜色变化。由于，信号探针中的PV能够催化TMB导致颜色变化，并能够通过肉眼观察进行初步定性，以及根据紫外可见分光光度计记录的显色物质的吸光度值变化进行定量检测。

同时，对该方法进行性能优化，比较不同pH、温育时间等，对信号响应的影响。

如图3所示，结果表明，适配体生物传感器溶液与石房蛤毒素的PBS缓冲液在pH＝7.0、温育时间在30min的实验室条件下反应，该方法具有较高的检测灵敏度并在0.1～50ng/mL范围内具有良好的相关性；回归方程y＝0.1684ln(x)+1.5211，R²＝0.996检测下限是0.05ng/mL。此外，该方法已经成功地应用于分析海产品中的STX，其结果与传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法相一致。

表1.STX加标回收率试验结果

注：ND＝not detect

实施例5

对本发明的检测方法的特异性、重复性、稳定性、灵敏度进行验证，具体如下：

对所建立的基于核酸适配体识别原理的增敏型STX检测方法的特异性进行了评价。选择漆沟藻毒素(GTX)、神经性贝类毒素(BTX)、大田软海绵酸(OA)、赭曲霉毒素(OTA)等相同类型贝类毒素作为干扰物质，考查该检测方法的特异性，同时通过重复检测进行批内、批间精密度实验和标准曲线测试，验证该检测方法的灵敏度和重复性。将捕获探针和信号探针在4℃冰箱存放一段时间，验证适配体传感器的稳定性。结果表明，如图4所示，所建立的基于核酸适配体识别原理的增敏型检测新方法具有很好的特异性，只对STX具有识别作用，对GTX、BTX、OA、OTA等其他的常见毒素没有交叉识别现象。由此说明，本发明所建立方法的高特异性主要来自于所采用的核酸适配体识别探针的高亲和性。

以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种石房蛤毒素适配体，其特征在于：所述适配体的核苷酸序列组成如下：

5’SH-(CH₂)₆-CCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGT-3’。

2.一种石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器，其特征在于：所述的生物传感器中含有权利要求1所述的适配体。

3.根据权利要求2所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)信号探针的制备：以PV作为信号放大载体，标记硫醇化的cDNA进而偶联胶体纳米金颗粒，获得信号探针；

(2)捕获探针偶联物的制备：将适配体固定在金包磁纳米微球上，并利用通过磁分离技术去除多余的适配体，获得捕获探针偶联物；

(3)将步骤(2)制备的捕获探针偶联物50μL加入到由步骤(1)制备的过量信号探针中，将混合溶液在37℃轻轻搅拌45min，得到杂交复合物，在外部磁场作用下，即获得适配体生物传感器。

4.根据权利要求3所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，信号探针制备的具体过程是：首先利用K₂CO₃溶液将胶体金纳米金颗粒的pH值调整至9.0，然后将PV试剂加入该溶液，并在室温下温育15min，在此过程中通过胶体金纳米金颗粒与PV抗体上的自由SH基之间的本位结合，PV共价结合到胶体金纳米金颗粒上；然后将硫醇化的cDNA加入到此混合溶液中，在4℃保持24h，10000rpm下离心15min，弃去上清，用PBS缓冲液将红色沉淀物洗涤几次，然后加入6-巯基已醇在室温下温育30min，以阻止多余位点，最后将制备好的信号探针重新悬浮于500μL PBS缓冲液中，并贮存在4℃冰箱作进一步使用。

5.根据权利要求4所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述硫醇化的cDNA的核苷酸序列组成为：

5’SH-(CH₂)₆-CAATGAACATGTTTCCACGG-3’。

6.根据权利要求3所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，捕获探针偶联物的制备的具体过程如下：将金包磁纳米微球悬浮于PBS缓冲液中，过量巯基化的适配体加入到上述溶液并在室温下轻轻搅拌12h，将多余的适配体通过磁分离作用去除，然后加入6-巯基已醇在室温下温育30min，以阻止多余位点，最后将制备好的捕获探针重新悬浮于500μL PBS缓冲液中并贮存在4℃冰箱作进一步使用。

7.根据权利要求6所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，0.02g四氧化三铁磁性纳米微球最终悬浮于500μL PBS缓冲液中，浓度为40mg·mL^-1，所制备的捕获探针浓度的最终浓度为38mg·mL^-1。

8.根据权利要求7所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述金包磁纳米微球的制备方法为：采用柠檬酸钠还原的方法合成胶体金纳米颗粒，加入0.02g四氧化三铁磁性纳米微球，在室温下搅拌8h，通过磁分离技术合成金包磁纳米微球；磁分离技术中所用的磁铁均为圆形磁铁，直径12mm，厚度3mm，施加磁场的方式是在反应试管外壁上贴附磁铁，施加磁场时间为1min。

9.根据权利要求2所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)上述适配体生物传感器溶液与100μL不同浓度石房蛤毒素的PBS缓冲液进行混合，溶液pH调整至7.0，在室温下温育30min，信号探针在外部磁场作用下从杂交复合物中释放并游离到上清液中；

(2)取步骤(1)的反应产物，加入50μL 0.2mg·mL^-1TMB与0.015％H₂O₂，体系产生颜色变化进行定性以及半定量，并根据显色物质的吸光度运用紫外可见分光光度计进行定量检测。

10.根据权利要求9所述的石房蛤毒素快速检测核酸适配体生物传感器的检测方法，其特征在于：所述的检测方法在0.1～50ng/mL的石房蛤毒素含量范围内具有良好的相关性；并且，y＝0.1684ln(x)+1.5211，R²＝0.996检测下限是0.05ng/mL。