CN110470840A - 一种检测副溶血性弧菌的方法 - Google Patents

一种检测副溶血性弧菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110470840A
CN110470840A CN201910841691.0A CN201910841691A CN110470840A CN 110470840 A CN110470840 A CN 110470840A CN 201910841691 A CN201910841691 A CN 201910841691A CN 110470840 A CN110470840 A CN 110470840A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vibrio parahemolyticus
detection
antibody
test strips
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910841691.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110470840B (zh
Inventor
吴正宗
刘鹏飞
崔波
袁超
于滨
郭丽
赵海波
陶海腾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN201910841691.0A priority Critical patent/CN110470840B/zh
Publication of CN110470840A publication Critical patent/CN110470840A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110470840B publication Critical patent/CN110470840B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：（1）制备检测线包被副溶血性弧菌抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；（3）检测副溶血性弧菌含量。基于包被铂的金磁纳米颗粒（Fe3O4@Au@Pt）具有的内在的过氧化酶模拟酶特性，该试纸条可采用颜色法测定样品中的副溶血性弧菌含量。本发明的试纸条具有检测限低（10cfu/mL）、特异性好、成本低廉、检测时间短等优势，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。

Description

一种检测副溶血性弧菌的方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种检测副溶血性弧菌的方法。
背景技术
副溶血性弧菌，一种革兰氏阴性杆菌，是威胁人类健康的主要病原菌之一。由于其广泛存在于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品中，由其引发的疾病往往人群数量多，分布广，给食品安全和人们健康带来巨大的威胁。因此，食品中副溶血性弧菌的检测具有非常重要的意义。
目前常用的检测食源性致病菌的方法主要有平板计数法、重组酶聚合酶扩增法、即时聚合酶链锁反应法、酶联免疫吸附测定法、表面等离子共振法、石英晶体微天平传感器、阻抗型免疫传感器、颜色传感器、荧光免疫分析法等。这些现有的检测方法通常需要对样品进行分离、纯化培养、富集，步骤繁多、实验周期长，致使整个检测过程费时费力，不能满足现场快速检验的需要。
免疫层析技术因其成本低、快速、简单、便携等特点在食品安全领域有着巨大的应用前景。然而，传统的基于胶体金的免疫层析技术存在灵敏度低的缺陷，极大限制了其应用的广度和商业化的可能性。因此，采用新策略克服免疫层析技术灵敏度低的瓶颈问题，对于拓展其应用范围，提高其实用性就变得尤为必要。
发明内容
为了解决这一阻碍免疫层析技术应用的瓶颈，本发明中，我们通过将经典采用的胶体金置换为磁性Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒，采用外加磁场降低其在硝基纤维膜上的移动速率的方式克服了免疫层析技术灵敏度低的缺陷。该策略把磁性纳米颗粒的高选择性、可富集性及流速可控性与免疫层析技术高通量、快速、简捷的优势相结合，大幅提高了检测灵敏度。
酶催化变色法是另一种提高免疫层析技术灵敏度的途径。然而，目前广泛应用的天然酶易受pH、温度等外界环境条件的影响，较易变性失活，且一般价格昂贵，不适于大规模现场检测应用。本发明中我们采用具有过氧化酶活性的金属模拟酶-Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒，代替天然酶，在过氧化氢存在下，Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒可以催化TMB生产蓝色产物。蓝色信号要比传统胶体金产生的红色信号更易读取，从而使得免疫层析的检测灵敏度得以显著提高。
本发明涉及的方法的基本原理如下：不同于经典胶体金免疫层析法，本发明提出的基于“磁聚焦”策略的免疫层析技术使用Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒代替了胶体金纳米颗粒，并在试纸条检测区域下方放置一块小磁铁。
方法1中：将修饰副溶血性弧菌抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒喷在结合垫上。将副溶血性弧菌抗体和羊抗鼠IgG固定在硝基纤维膜的特定区域分别形成检测线和质控线。当将样品溶液滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，标记有抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒将与样品中含有的副溶血性弧菌结合，形成Fe3O4@Au@Pt-抗体-目标菌复合物。样品继续在硝基纤维膜上继续流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与Fe3O4@Au@Pt-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合副溶血性弧菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。
方法2：本发明中，我们在免疫层析进行前，首先采用免疫磁性纳米颗粒富集样品溶液中的目标菌，从而达到增强最终检测灵敏度的目的。在免疫层析过程进行前，首先采用修饰副溶血性弧菌抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒与样品溶液混合，富集样品中的副溶血性弧菌。随后在外加磁场条件下，将结合副溶血性弧菌的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒与上清液分离，并重新溶解在PBS溶液中并将溶液用于免疫层析检测。将溶解Fe3O4@Au@Pt-抗体-目标菌复合物的PBS溶液滴加到样品垫上，样品在毛细作用下在试纸条上流动，样品继续在硝基纤维膜上继续流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与Fe3O4@Au@Pt-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合副溶血性弧菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。
由于反应时间的延长，相应地，与未施加磁场的免疫层析方法相比，就会有更多的目标物被固定在检测区域的抗体所捕获。因此，最终的检测结果明显更好，即检测限更低、灵敏度更高。如果样品中的副溶血性弧菌浓度较高，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越多，会显示出Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒的颜色。相反，如果样品中的副溶血性弧菌浓度较低，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越少，则不会显示出Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒的颜色。这时，加入TMB和H2O2溶液，利用Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒的过氧化物酶催化作用产生大量蓝色信号增强检测信号，以检测出样品中低浓度的副溶血性弧菌。
本发明通过样品富集预处理和引入“磁聚焦”策略，大幅提升了免疫层析方法的灵敏度，方法1的检测限低至10cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的10000倍。方法2的检测限低至1cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的100000倍。本发明为食品体系中有害组分的快速现场检测指明了新方向。
优选地，在本方法中所述的磁铁的磁场强度为20mT-200mT。所采用的金磁纳米颗粒（Fe3O4@UCNPs）直径在50-200nm的范围内。
有益效果
基于样品富集预处理和“磁聚焦”策略，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题。该发明中所使用的包被铂的金磁纳米颗粒（Fe3O4@Au@Pt）既用于在样品预处理步骤中富集空肠弯曲杆菌，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。基于Fe3O4@Au@Pt具有的内在的过氧化酶模拟酶特性，该试纸条可采用颜色法测定样品中的副溶血性弧菌含量。本发明的试纸条具有检测限低（1、10cfu/mL）、特异性好、成本低廉、检测时间短等优势，且不需要任何额外的仪器设备，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。
附图说明
图1 用于新型免疫层析检测的模具；
图2副溶血性弧菌浓度范围为30-105 cfu/mL时基于采集的磁性数据建立的标准曲线；
图3副溶血性弧菌浓度范围为10-105 cfu/mL时基于采集的磁性数据建立的标准曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：
（1）磁性金属模拟酶的制备与修饰：
Fe3O4纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5 mL 0.1M NH3·H2O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；
Fe3O4@Au纳米颗粒的制备：超声条件下，将20 mL ①合成的Fe3O4溶液与15 mL 1%的氯金酸溶液混合20 min。接着，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最后，将制得的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，保存于4℃下备用；
Fe3O4@Au@Pt的制备：5mL 100μM碘化钠、10mL 0.05M十六烷基三甲基溴化铵溶液和5mL ②中制备的Fe3O4@Au溶液加入到29mL去离子水中，充分混合。然后加入0.5mL0.2mM硝酸银溶液和0.5mL 0.1M抗坏血酸溶液，混合液在70℃条件下反应1小时。接着，加入0.48 mL0.1M 盐酸溶液和0.45mL 2mM六水合氯铂酸溶液，70℃条件下反应4小时；
Fe3O4@Au@Pt的修饰：首先，将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL ③中制备的Fe3O4@Au@Pt纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122 μL5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe3O4@Au@Pt纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中；
（2）结合垫的处理：将3μL Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液喷于结合垫上，37℃烘干，得到处理后的标记物结合垫；
（3）硝基纤维膜的处理：将0.3 μg副溶血性弧菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3 μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测副溶血性弧菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；
（5）外加磁场的施加：将其应用于样品中副溶血性弧菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为100mT的小磁铁（图1）；
（6）标准曲线的建立：向不含副溶血性弧菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为30 cfu/mL，102 cfu/mL，103 cfu/mL，104 cfu/mL和105 cfu/mL。吸取100 μL含有致病菌的饮用水缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红）对样品中的副溶血性弧菌含量进行定量测定，绘制标准曲线（图2）。
（7）样品的检测：吸取100 μL含有致病菌的饮用水样品溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。样品溶液在试纸条上层析结束后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红）对样品中的副溶血性弧菌含量进行定量测定，最终得到的T/C值为0.51，基于已建立的标曲，推导出样品中空肠弯曲杆菌含量为740 cfu/mL。
实施例2
一种检测副溶血性弧菌方法，包括以下步骤：
（1）磁性金属模拟酶的制备与修饰：
Fe3O4纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5 mL 0.1M NH3·H2O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；
Fe3O4@Au纳米颗粒的制备：超声条件下，将20 mL ①合成的Fe3O4溶液与15 mL 1%的氯金酸溶液混合20 min。接着，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最后，将制得的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，保存于4℃下备用；
Fe3O4@Au@Pt的制备：5mL 100μM碘化钠、10mL 0.05M十六烷基三甲基溴化铵溶液和5mL ②中制备的Fe3O4@Au溶液加入到29mL去离子水中，充分混合。然后加入0.5mL0.2mM硝酸银溶液和0.5mL 0.1M抗坏血酸溶液，混合液在70℃条件下反应1小时。接着，加入0.48 mL0.1M 盐酸溶液和0.45mL 2mM六水合氯铂酸溶液，70℃条件下反应4小时；
④Fe3O4@Au@Pt的修饰：首先，将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL ③中制备的Fe3O4@Au@Pt纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122 μL5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe3O4@Au@Pt纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中；
（2）硝基纤维膜的处理：将0.3 μg副溶血性弧菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3 μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（3）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测副溶血性弧菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；
（4）外加磁场的施加：将其应用于样品中副溶血性弧菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为100mT的小磁铁；
（5）标准曲线的建立：向不含副溶血性弧菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为10 cfu/mL，102 cfu/mL，103 cfu/mL，104 cfu/mL和105 cfu/mL。将10μL修饰副溶血性弧菌抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液加入到饮用水溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的副溶血性弧菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合副溶血性弧菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中。吸取100 μL经过预处理的PBS溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“splitchannels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像对样品中的副溶血性弧菌含量进行定量测定，绘制标准曲线（图3）。
（6）样品的检测：将10μL修饰副溶血性弧菌抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液加入到饮用水溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的副溶血性弧菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合副溶血性弧菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中。吸取100 μL经过预处理的PBS溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。吸取100 μL经过预处理的PBS溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10min。溶液在试纸条上层析结束后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红），基于已经建立的标准曲线，对样品中的副溶血性弧菌含量进行定量测定。
其他条件不变，去除实施例2中的第（4）外加磁场的施加：将其应用于样品中副溶血性弧菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为100mT的小磁铁。
检测的结果（表1）：
如表1所示，施加磁场的新型免疫层析试纸条检测灵敏度明显优于未施加磁场试纸条。此外，施加磁场的新型免疫层析试纸条的检测结果与传统的平板计数法检测所得结果无显著差异，展示出该新型检测方法的实用性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备磁性金属模拟酶Fe3O4@AuNPs，制备检测线包被副溶血性弧菌抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；
（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；
（3）磁性金属模拟酶的制备：Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒表面修饰副溶血性弧菌抗体；
（4）检测预处理的样品中副溶血性弧菌含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的磁铁的磁场强度在20mT-200mT。
3.根据权利要求1所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、磁性纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被副溶血性弧菌抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求3所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：
（1）磁性金属模拟酶的制备：合成磁性纳米颗粒Fe3O4，在其表面包被一层金壳，得到Fe3O4@Au纳米颗粒，接着在Fe3O4@Au纳米颗粒表面包被一层铂，得到Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒；在Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒表面修饰副溶血性弧菌抗体；
（2）样品富集预处理：将修饰副溶血性弧菌抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液加入到样品溶液中充分反应，富集样品中存在的副溶血性弧菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合副溶血性弧菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在PBS溶液中；
（3）硝基纤维膜的处理：将副溶血性弧菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测副溶血性弧菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
5.根据权利要求1所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，试纸条还包括模纳米颗粒标记物结合垫有修饰副溶血性弧菌抗体的包被铂的金磁纳米颗粒Fe3O4@Au@Pt。
6.根据权利要求1所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，金磁纳米颗粒Fe3O4@UCNPs直径为50-200nm。
7.根据权利要求6所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述的试纸条包括包括衬板、样品垫、纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、磁性纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被副溶血性弧菌抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体；所述模纳米颗粒标记物结合垫有修饰副溶血性弧菌抗体的包被铂的金磁纳米颗粒Fe3O4@Au@Pt。
8.根据权利要求6或7所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：
（1）磁性金属模拟酶的制备：合成磁性纳米颗粒（Fe3O4），在其表面包被一层金壳，得到Fe3O4@Au纳米颗粒，接着在Fe3O4@Au纳米颗粒表面包被一层铂，得到Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒；在Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒表面修饰副溶血性弧菌抗体；
（2）结合垫的处理：将合成的修饰副溶血性弧菌抗体的Fe3O4@Au@Pt纳米颗粒溶液喷于结合垫上，37℃烘干，得到处理后的标记物结合垫；
（3）硝基纤维膜的处理：将副溶血性弧菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测副溶血性弧菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
9.根据权利要求1-8之一所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，副溶血性弧菌为单克隆抗体或多克隆抗体。
10.根据权利要求1-8之一所述的一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，样品溶液在试纸条上层析结束后，在检测区域加入一定量的3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液，反应5分钟后，拍下检测区域的图像，基于图像定量测定样品中的副溶血性弧菌含量。
CN201910841691.0A 2019-09-06 2019-09-06 一种检测副溶血性弧菌的方法 Active CN110470840B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910841691.0A CN110470840B (zh) 2019-09-06 2019-09-06 一种检测副溶血性弧菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910841691.0A CN110470840B (zh) 2019-09-06 2019-09-06 一种检测副溶血性弧菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110470840A true CN110470840A (zh) 2019-11-19
CN110470840B CN110470840B (zh) 2022-05-27

Family

ID=68515087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910841691.0A Active CN110470840B (zh) 2019-09-06 2019-09-06 一种检测副溶血性弧菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110470840B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112760356A (zh) * 2020-12-23 2021-05-07 浙江农林大学 一种副溶血性弧菌检测方法
CN113325179A (zh) * 2021-04-14 2021-08-31 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种基于Au@Pt酶的免疫层析试纸条及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105013479A (zh) * 2015-08-06 2015-11-04 厦门大学 一种银核/铂壳的核壳结构纳米材料及其制备方法
CN105548551A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 南昌大学 一种快速检测副溶血性弧菌的方法
CN107202884A (zh) * 2017-06-16 2017-09-26 吉林大学 基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒
WO2017211214A1 (zh) * 2016-06-07 2017-12-14 江南大学 基于沙门氏菌核心多糖单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的胶体金试纸条的制备方法
CN107913741A (zh) * 2016-10-09 2018-04-17 天津工业大学 一种mof‑199负载纳米粒子复合材料的制备方法
CN108362879A (zh) * 2018-01-12 2018-08-03 华南农业大学 一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105013479A (zh) * 2015-08-06 2015-11-04 厦门大学 一种银核/铂壳的核壳结构纳米材料及其制备方法
CN105548551A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 南昌大学 一种快速检测副溶血性弧菌的方法
WO2017211214A1 (zh) * 2016-06-07 2017-12-14 江南大学 基于沙门氏菌核心多糖单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的胶体金试纸条的制备方法
CN107913741A (zh) * 2016-10-09 2018-04-17 天津工业大学 一种mof‑199负载纳米粒子复合材料的制备方法
CN107202884A (zh) * 2017-06-16 2017-09-26 吉林大学 基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒
CN108362879A (zh) * 2018-01-12 2018-08-03 华南农业大学 一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIYAN SUN 等: "Synthesis of Fe3O4-Au Nanocomposites with Enhanced Peroxidase-Like Activity", 《EUROPEAN JOURNAL OF INORGANIC CHEMISTRY》, no. 1, 19 November 2012 (2012-11-19), pages 109 - 114 *
JIN LUO 等: "Core/Shell Nanoparticles as Electrocatalysts for Fuel Cell Reactions", 《ADVANCED MATERIALS》, vol. 20, no. 22, 26 May 2008 (2008-05-26), pages 4342 - 4347, XP071808004, DOI: 10.1002/adma.200703009 *
武娇阳 等: "Fe3O4@Au核/壳结构纳米粒子合成研究进展", 《精细石油化工进展》, vol. 20, no. 3, 30 June 2019 (2019-06-30), pages 38 - 43 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112760356A (zh) * 2020-12-23 2021-05-07 浙江农林大学 一种副溶血性弧菌检测方法
CN113325179A (zh) * 2021-04-14 2021-08-31 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种基于Au@Pt酶的免疫层析试纸条及其制备方法
CN113325179B (zh) * 2021-04-14 2024-02-27 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种基于Au@Pt酶的免疫层析试纸条及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110470840B (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bu et al. Dual recognition strategy and magnetic enrichment based lateral flow assay toward Salmonella enteritidis detection
Zhao et al. Prussian blue nanoparticles based lateral flow assay for high sensitive determination of clenbuterol
Hu et al. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor
Wang et al. Ultrasensitive and multiplex detection of four pathogenic bacteria on a bi-channel lateral flow immunoassay strip with three-dimensional membrane-like SERS nanostickers
Alamer et al. Rapid colorimetric lactoferrin-based sandwich immunoassay on cotton swabs for the detection of foodborne pathogenic bacteria
Ozalp et al. Pathogen detection in complex samples by quartz crystal microbalance sensor coupled to aptamer functionalized core–shell type magnetic separation
Chemburu et al. Detection of pathogenic bacteria in food samples using highly-dispersed carbon particles
Chattopadhyay et al. Functionalized polymeric magnetic nanoparticle assisted SERS immunosensor for the sensitive detection of S. typhimurium
Yan et al. Effect of physiochemical property of Fe3O4 particle on magnetic lateral flow immunochromatographic assay
Seo et al. Development of a rapid response biosensor for detection of Salmonella typhimurium
Zhang et al. Fe3O4@ CuS-based immunochromatographic test strips and their application to label-free and dual-readout detection of Escherichia coli O157: H7 in food
Ilhan et al. The coupling of immunomagnetic enrichment of bacteria with paper-based platform
Pappert et al. Immunomagnetic nanoparticle-based sandwich chemiluminescence-ELISA for the enrichment and quantification of E. coli
Ren et al. Plasmonic enhancement in lateral flow sensors for improved sensing of E. coli O157: H7
Xing et al. Novel immunochromatographic assay based on Eu (III)-doped polystyrene nanoparticle-linker-monoclonal antibody for sensitive detection of Escherichia coli O157: H7
Zhu et al. Core-shell red silica nanoparticles based immunochromatographic assay for detection of Escherichia coli O157: H7
Yan et al. A label-free immunosensor for detecting common acute lymphoblastic leukemia antigen (CD10) based on gold nanoparticles by quartz crystal microbalance
Cheng et al. Synthesis of two-dimensional graphene oxide-fluorescent nanoprobe for ultrasensitive and multiplex immunochromatographic detection of respiratory bacteria
Švitel et al. Surface plasmon resonance based pesticide assay on a renewable biosensing surface using the reversible concanavalin A monosaccharide interaction
Ren et al. A net fishing enrichment strategy for colorimetric detection of E. coli O157: H7
CN101907556A (zh) 利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法
Jin et al. Gold decorated polystyrene particles for lateral flow immunodetection of Escherichia coli O157: H7
CN110470840A (zh) 一种检测副溶血性弧菌的方法
Chen et al. Joint-detection of Salmonella typhimurium and Escherichia coli O157: H7 by an immersible amplification dip-stick immunoassay
Wei et al. Recent progress on lateral flow immunoassays in foodborne pathogen detection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant