CN111624244A - 一种葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

一种葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器及其制备和应用，酶基生物传感器在生物医疗、生命健康、食品安全、环境安全、食品发酵等领域具有广阔的应用前景，目前限制其商品化的主要因素是酶传感器的稳定性有待进一步提高。本发明提供了一种高稳定性酶传感器的制备方法及应用，即基于酶分子纳米胶囊制备酶传感器的方法。该酶纳米胶囊传感器的制备主要包括以下步骤：首先，利用原位自由基聚合法制备酶单分子纳米胶囊(或酶多分子纳米胶囊)；然后将上述酶分子纳米胶囊用于制备酶纳米胶囊传感器。该酶传感器的优势在于其热稳定性、有机溶剂耐受性、存储和使用寿命等得到了明显提高。本发明所得到的酶纳米胶囊传感器在人体可穿戴设备、生物医疗、分析检测、食品发酵等多个领域具有巨大市场应用潜力。

Description

一种葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物传感器和分析检测领域，具体涉及一种基于酶纳米胶囊包括葡萄糖氧化酶纳米胶囊的传感器及其制备方法与在葡萄糖检测和人体可穿戴设备等领域的应用。
背景技术
血糖检测是糖尿病诊断、治疗和管理的基础。目前全球糖尿病患者4.2亿人以上，2015年仅中国糖尿病患者人数就高达1.09亿人。血糖仪和血糖试纸(即酶基电化学葡萄糖传感器)的全球市场容量高达200多亿美元。目前市售血糖试纸主要有两种：一种是葡萄糖氧化酶(GOx)电极测量法，此种试纸占主导地位，通过检测血糖试纸上血液中氧气浓度的变化来指示血糖浓度，优点是对葡萄糖具有专一选择性，缺点是存储稳定性较差(一般为3个月之内，试纸从容器中取出后要在5分钟之内使用完毕)，测量重现性差(约15％误差)。另一种是葡萄糖脱氢酶电极测量法，优点是易保存稳定性较好，缺点是血液中的木糖、麦芽糖、半乳糖等会产生干扰。1997-2009年间，美国食品药品监督局(FDA)接到至少13起致命报告，美国FDA曾经连续3次发出缺陷警告，使用葡萄糖脱氢酶(GDH-PQQ)技术的血糖仪或试纸，可能会造成治疗过程中异常的低血糖、昏迷甚至是死亡。为解决血糖试纸(葡萄糖传感器)存在的存储稳定性、测量准确性和重复性方面的问题，包括众多跨国公司在内的国内外科学家仍在不懈的努力。
血糖试纸存在的问题也是酶基生物传感器存在的一些共性问题。从国内外来看，酶基生物传感器研究的一个主要焦点就集中在如何进一步提高传感器的长期稳定性、测量准确性和重复性等关键科学问题上，这也是限制酶基生物传感器发展的关键共性问题。在传统的酶电极(包括血糖试纸)上，一般是利用生物相容性聚合物或纳米材料等将酶通过物理包埋或化学交联的方式固定在酶电极上，传统的酶电极制备方法并没有有效改变酶作为生物活性分子容易失活的现状，所以如何进一步提高酶分子和传感器的稳定性和使用寿命是要解决的第一个核心问题，这也是研究者永远不懈的追求。特别是近年来随着可穿戴设备的兴起，对酶传感器的稳定性提出了更高的要求。传统的血糖试纸都是一次性可拋型，并不能满足人体可穿戴设备对酶传感器稳定性和可重复使用性的要求。提高酶传感器的稳定性等关键性能，解决传统的血糖试纸存在的问题，并满足人体可穿戴设备对传感器稳定性等性能的需求，已迫在眉睫。
生物体含有复杂的亚细胞单元，在真核细胞内，多数酶在胞液内并不自由扩散，而是被空间限定在亚细胞(细胞器)内，或与其他酶空间限定在一起成为酶复合物。这些被空间限定在亚细胞和细胞器内的酶分子和酶复合物比自由酶分子具有更高的活性(Wilner,O.I.,et al.,Nature nanotechnology 2009,vol 4,p249.；Liu Y.,et al.,NatureNanotechnology,2013,vol 8,p187.)。这些酶能够保证底物分子的有效转化和传输，并及时消除毒性代谢产物。卢云峰教授等团队(Wei W.,et al.,Adv.Mater.2013,vol 25,p.2212)开创性的将有机磷水解酶包埋在聚合物纳米胶囊内用于有机磷的去污染、脱毒，不仅可以明显提高有机磷水解酶在不同条件下的活性，而且能够成倍提高酶在各种环境条件下的稳定性，包括提高的热稳定性(在65℃环境下，天然酶1.5h内完全失活，而酶纳米胶囊1.5h后仍能保持60％的最初活性)、长期存储稳定性、耐有机溶剂等。这些探索性的前沿工作初步显示了酶纳米胶囊具有的巨大应用潜力，但遗憾的是该新技术还未应用于酶传感器等领域。通过模拟细胞(细胞器)内酶的微环境，将单酶单分子或单酶多分子限定在类似细胞的聚合物纳米胶囊内，利用纳米胶囊提供的生物相容性微环境和空间限域效应可显著提高酶分子和酶传感器的稳定性(长期稳定性、热稳定性、有机溶剂耐受性等)。而且由于聚合物纳米胶囊具有类似网状的多孔结构，底物分子、产物分子、电子、离子都可自由扩散进出纳米胶囊，不影响酶分子与底物分子之间的物质传输和信号交换(电子/离子等)，是酶基生物传感器上非常理想的酶固载方式。
相对于传统的使用原始的酶(未修饰)制备传感器的技术，酶纳米胶囊技术为生物分子的长期稳定性、热稳定性和生物活性的保持提供了一个有利工具，有望极大提高酶传感器的热稳定性、长期存储稳定性、使用寿命、测量准确性等关键性能，解决限制酶传感器领域发展的关键共性科学问题，推动更多种类的酶传感器实现商品化。文献中曾报道将酶固载到介孔碳、介孔硅等多孔无机纳米材料中以提高酶稳定性的技术，由于这两类无机纳米材料的宏观尺度较大(孔是纳米级和微米级，但是材料的三维尺寸是微米或毫米级)，所以无机纳米材料固载的酶的水相分散性相对较差，酶底物的扩散阻力也较大。本发明中酶纳米胶囊技术通过在酶表面形成一薄层网状的聚合物，其在水相中的分散性更好，酶底物的扩散阻力更小，而且更重要的是该聚合物对酶分子的生物相容性比无机纳米材料更好，所以酶纳米胶囊的热稳定性和有机溶剂耐受性等性能都显著优于之前的文献报道(ChemSusChem,2012,5,1918-1925；中国专利ZL201110377608.2)。本发明所得到的酶纳米胶囊传感器在葡萄糖检测相关的人体可穿戴设备、生命健康、分析检测、食品和饮料发酵等多个领域具有巨大市场应用潜力。
我们对国内外相关文献和专利进行了检索，虽然有用于具有长期作用的蛋白递送的单蛋白纳米胶囊(专利申请号201080020405.1)、利用纳米胶囊口服递送酶以实现酒精或有毒代谢物的靶向代谢(专利申请号201280043352.4)、一种抗氧化酶纳米胶囊气雾剂及其在消除烟气自由基方面的应用(申请公布号CN104549085A)相关的专利申请和文献报道，但未发现将酶分子纳米胶囊特别是葡萄糖氧化酶纳米胶囊用于酶传感器的相关文献报道和专利申请。
发明内容
本发明主要目的是提供一种具有较高稳定性的用于葡萄糖检测的酶传感器制备方法及其应用。该方法使用葡萄糖氧化酶纳米胶囊(nGOx)作为酶传感器的生物识别元件或作为生物识别原件的一部分，研制的传感器可用于水溶液或有机溶剂中葡萄糖浓度以及血糖、尿糖、汗液葡萄糖、体液葡萄糖等的检测。相较于传统的基于原始的(native)葡萄糖酶分子的传感器，基于葡萄糖氧化酶纳米胶囊的酶传感器在热稳定性、存储寿命、使用寿命、有机溶剂耐受性等方面具有优势，在传统的血糖检测等领域尤其是人体可穿戴设备等领域具有突出优势。本发明采用如下技术方案：
本发明一方面提供一种生物传感器，所述生物传感器使用酶纳米胶囊作为酶电极生物识别分子或者作为酶电极生物识别元件的一部分，所述酶纳米胶囊包括蛋白纳米胶囊。基于以上技术方案，所述酶纳米胶囊为酶单分子纳米胶囊或酶多分子胶囊。
基于以上技术方案，优选的，所述酶纳米胶囊的尺寸小于100nm；所述酶纳米胶囊包含至少一个酶分子作为内核或者作为内核的一部分；所述内核外面包裹了一层网状的聚合物薄膜作为外壳；所述聚合物薄膜的厚度为0.1nm～100nm，所述聚合物薄膜为单体或聚合物通过共价方式形成；所述单体或聚合物含有羧基、氨基、正电荷、负电荷或双键基团中至少一种。
基于以上技术方案，所述的酶纳米胶囊中的酶种类包括氧化还原酶类、水解酶类、异构酶类、合成酶类(聚合酶类)、转移酶类、裂解酶类。这些酶类经形成纳米胶囊以后，在稳定性方面会有明显的提高，可作为酶电极生物识别分子或者作为酶电极生物识别元件的一部分以提高传感器的性能。本方案侧重葡萄糖检测，故下述方案以葡萄糖氧化酶纳米胶囊为例进行详细描述，其他酶类不再赘述。需要指出的是，其他酶类基于下述的类似方案等同 替代，也可以取得提高传感器稳定性等性能的明显效果。基于以上技术方案，优选的，所述酶纳米胶囊为葡萄糖氧化酶纳米胶囊。
基于以上技术方案，优选的，所述葡萄糖氧化酶纳米胶囊的尺寸为小于100nm；所述葡萄糖氧化酶纳米胶囊包含至少一个葡萄氧化酶分子作为内核；所述内核外面包裹了一层网状的聚合物薄膜作为外壳；所述聚合物薄膜的厚度一般为0.1～100nm，优选为0.1nm～20nm；聚合物薄膜厚度以不明显影响酶的底物分子传输和生物传感器的信号交换为宜；所述聚合物薄膜为单体或聚合物通过共价方式形成聚合物薄膜外壳锚定到上述内核(以葡萄糖氧化酶分子为核心)表面；所述单体或聚合物为含有羧基、氨基、正电荷、负电荷或双键基团中至少一种。所述聚合物薄膜外壳内可以只包裹葡糖糖氧化酶分子，也可以在包裹酶分子的同时还包裹辅酶、氧化还原媒介体、纳米材料、酶稳定剂中的一种或几种。
酶纳米胶囊的制备方法很多，例举的典型制备过程分为两个过程，首先是在合适浓度的酶的缓冲盐水溶液或有机溶剂中，通过吸附、共价交联等方式将带双键(烯基)的有机小分子(如N-丙烯基琥珀酰亚胺)固定到酶分子表面使酶成为带可聚合基团(双键)的酶单分子(在合适浓度下，被小分子包裹的酶在溶液中通常呈单分子分布)，然后加入至少一种带双键的有机单体分子(比如丙烯酰胺等)和/或带两个双键的有机单体分子交联剂(比如N,N’-亚甲基双丙烯酰胺)，最后加入过硫酸氨和四甲基乙二胺等引发剂在合适的反应温度下(室温或低温下等)引发原位(可控)自由基聚合反应，使反应产生的聚合物在酶分子表面形成一薄层网状聚合物形成酶单分子(或酶多分子)纳米胶囊。
上述的葡萄糖氧化酶纳米胶囊，其中，葡萄糖氧化酶单分子(或酶的多分子)表面通过物理或化学方法形成一个薄层的聚合物薄膜，该薄膜可以起到保护酶分子提高酶稳定性的作用，同时又不会明显影响酶与底物分子之间的物质传输和信号(电子、离子等)传输。该传感器使用葡萄糖氧化酶纳米胶囊作为生物识别分子，研制的葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器可用于葡萄糖浓度的检测。
本发明另一方面提供一种上述传感器的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)电极的准备：清洗电极表面得到干净的电极备用，主要步骤为：利用物理、化学或电化学方法抛光电极表面，或(和)用乙醇等有机溶剂和水清洗，然后在氮气流下干燥或自然干燥以获得干净的电极表面备用。以玻碳电极为例，用于制备生物传感器的玻碳电极在使用之前，首先用去离子水清洗玻碳电极表面，并依次使用1.0微米、0.3微米和0.05微米中多种或一种氧化铝粉末在抛光布上适当抛光玻碳电极表面，抛光的电极分别在乙醇和水中进行超声处理，以除去任何附着的氧化铝粉末，然后，用去离子水冲洗玻碳电极并在氮气流下干燥以获得干净的抛光玻碳镜面备用。抛光、清洗的目的是为了得到干净电极表面，消除电极表面的杂质对于传感器制备的影响，保证不同批次制备的传感器重复性好。
(2)电极增敏材料溶液的配制：将电极增敏材料溶于水或助溶剂中，经超声分散制备得到电极增敏材料溶液；(3)电极成膜材料溶液的配制：将电极成膜材料溶解于缓冲盐溶液或纯净水中，得到电极成膜材料溶液；所述缓冲盐优选为醋酸盐或磷酸盐；所述缓冲盐溶液的浓度为0.05～1.0mg mL-1，优选为0.1mg mL-1；(4)葡萄糖氧化酶纳米胶囊(nGOx)溶液的准备：将葡萄糖氧化酶纳米胶囊(nGOx)溶解于缓冲盐溶液中得到葡萄糖氧化酶纳米胶囊溶液，所述缓冲盐溶液的pH为5～9，优选为磷酸缓冲溶液；所述葡萄糖氧化酶纳米胶囊溶液的浓度为0.1～30mg mL-1，优选10mg mL-1；
(5)传感器制备：
方法一：将所述电极增敏材料溶液和电极成膜溶液与超纯水混合，得到混合溶液，然后将所述混合溶液滴加、浇注或打印到电极的抛光镜面上，干燥，得到传感器前体；最后，将所述nGOx溶液滴注到所述传感器前体上上，干燥，得到所述生物传感器；所述混合溶液中，电极增敏材料和电极成膜材料浓度为0.05～20mg mL-1，优选为2mg mL-1；所述混合溶液的滴加量为每平方毫米电极表面滴加0.1～3微升；所述nGOx溶液的滴加量为每平方毫米电极表面滴加0.1～3微升；
方法二：将所述电极增敏材料溶液、电极成膜材料溶液、nGOx溶液与超纯水混合，得到混合溶液，然后将所述混合溶液滴加、打印或浇注到所述电极表面上，干燥，得到所述生物传感器；所述混合溶液中电极增敏材料和电极成膜材料的浓度分别为0.0～20.0mgmL-1，优选为2mg mL-1；所述混合溶液中nGOx溶液的浓度分别为0.1～30mg mL-1，优选为5.0mg mL-1；所述混合溶液的滴加量为0.1～3μL/mm2。本发明的传感器的制备方法中，可以将电极增敏材料、电极成膜材料和葡萄糖氧化酶纳米胶囊与溶剂混合，形成混合溶液，也可以将电极增敏材料、电极成膜材料和葡萄糖氧化酶纳米胶囊先分别配置成溶液，然后将溶液混合形成混合溶液，只需要保证混合溶液中电极增敏材料、电极成膜材料和葡萄糖氧化酶纳米胶囊的浓度。
基于以上技术方案，优选的，所述步骤(5)中的混合溶液中还可以包括助溶剂，所述混合溶液中，助溶剂与水的体积比为0:100～100:0；所述助溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、亲水性表面活性剂或亲水性离子液体等可与水互溶的溶剂或助溶试剂；所述混合溶液中，助溶剂与水的体积比为0:100～100:0，优选为20:80。
基于以上技术方案，优选的，所述用于制备生物传感器的电极可以是玻碳电极(GCE)、金属电极、导电玻璃电极、石墨电极、丝网印刷电极、试纸电极、柔性电极等。
基于以上技术方案，优选的，所述电极增敏材料优选石墨粉、碳纳米材料等导电性良好的微纳米尺度材料，也可以是惰性金属纳米材料、金属氧化物纳米材料、金属-有机框架化合物等具备导电性或半导体性质的纳米材料或常规材料，或包含上述任一纳米材料的复合材料。
基于以上技术方案，更进一步优选的，所述碳纳米材料为碳纳米管、石墨烯、介孔碳、或杂原子掺杂的碳纳米材料；所述杂原子为氮、磷、硼、氧、氢、羟基、羧基或醌基；所述惰性金属纳米材料中的惰性金属为金、银或铂；所述过渡金属氧化物纳米材料中过渡金属氧化物为ZnO、Fe3O4、Co3O4、TiO2、MnO2、NiO、ZrO2；更为优选的，所述电极增敏材料为氮掺杂的碳纳米管(N-CNTs)，所述电极增敏材料可以替换为与N-CNTs等效或者具有更好增敏效果的材料
基于以上技术方案，优选的，所述电极成膜材料可以是壳聚糖(包含寡聚糖)、明胶、蚕丝蛋白、海藻酸(盐)、Nafion乳液、导电胶(含碳粉或银粉)或硅的溶胶-凝胶等成膜性能良好的聚合物材料溶液或水凝胶溶液；所述成膜材料可替换为与壳聚糖等效或者具有更好成膜效果的材料。
本发明的传感器制备不限于上述的制备方法，也可以采用其他方法。对于制备传感器的材料也不限于上述材料，其他有利于提高性能的材料也可以用于传感器的制备，或者不用此类材料能达到类似效果也是可以的。
本发明另一方面提供一种上述的传感器的应用。
基于以上技术方案，优选的，所述应用为使用所述传感器检测水溶液、有机溶剂或混合溶液中葡萄糖浓度以及用于检测血糖、尿糖或汗液葡萄糖、体液葡萄糖、食品中葡萄糖的浓度。
基于以上技术方案，优选的，所述应用为所述传感器在血糖试纸、可穿戴设备、可植入设备、食品发酵、酶化工、分析检测等领域的应用。
有益效果
传统生物传感器的稳定性不够高是限制其商品化和大规模应用的主要障碍。相对于传统的使用原始的酶(未修饰)制备传感器的技术，本发明中葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器具有热稳定性更高、存储寿命和使用寿命更长、有机溶剂耐受性更好等方面优势，生物传感器在多种环境(高温、有机溶剂等)中使用的适应性和耐受性得到了极大的提高。文献中曾报道将酶固载到介孔碳、介孔硅等多孔无机纳米材料中以提高酶稳定性的技术，由于这两类无机纳米材料的宏观尺度较大(孔是纳米级和微米级，但是材料的三维尺寸是微米或毫米级)，所以无机纳米材料固载的酶的水相分散性相对较差，酶底物的扩散阻力也较大。本发明中酶纳米胶囊技术通过在酶表面形成一薄层网状的聚合物，其在水相中的分散性更好，酶底物的扩散阻力更小，而且更重要的是该聚合物对酶分子的生物相容性比无机纳米材料更好，所以酶纳米胶囊的热稳定性和有机溶剂耐受性等性能都显著优于之前的文献报道。基于葡萄糖氧化酶的纳米胶囊传感器在人体可穿戴设备、生命健康、分析检测、食品和饮料发酵、酶化工等多个领域具有明显优势和巨大市场应用潜力，尤其是在人体可穿戴设备中对于提高传感器的使用寿命和测量准确可靠性优势非常明显。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为单分子酶纳米胶囊制备的典型流程示意图。
图2为基于葡萄糖氧化酶纳米胶囊的传感器制备典型流程示意图。
图3为(A)天然的葡萄糖氧化酶分子(GOx)和实施例1制备的葡萄糖氧化酶纳米胶囊分子(nGOx)的粒子尺寸分布图，(B)实施例1制备的葡萄糖氧化酶纳米胶囊分子的透射电镜图，(C)天然的葡萄糖氧化酶分子(GOx)和实施例1制备的葡萄糖氧化酶纳米胶囊分子(nGOx)的紫外-可见光谱图，(D)制备nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器使用的N-CNTs的透射电镜图。
图4为(A)不同修饰电极在氮气饱和(除氧的)的0.1M磷酸缓冲液的循环伏安图(扫速：0.1V/s)；(B)葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)的循环伏安图。
图5为(A)葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)的循环伏安图；(B)葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)阴极和阳极峰电流相对扫速的校准曲线图。
图6为(A)葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)在加入1000μM的葡萄糖前后的循环伏安图；(B)葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)对不同浓度葡萄糖的循环伏安响应图。扫速：100mV s-1。
图7为葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)和天然葡萄糖氧化酶修饰电极(GOx/N-CNTs-Chi/GCE)的在不同温度下孵化1小时后保留的相对灵敏度：(A)安培型电流-时间响应曲线(i-t)图：(B)循环伏安(CV)图。
图8为葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)和天然葡萄糖氧化酶修饰电极(GOx/N-CNTs-Chi/GCE)的在65℃下孵化1，2，3，4小时后保留的相对灵敏度：(A)安培型电流-时间响应曲线(i-t)图：(B)循环伏安(CV)图。
图9为葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)和天然葡萄糖氧化酶修饰电极(GOx/N-CNTs-Chi/GCE)的在有机溶剂和缓冲溶液(50:50)的混合体系中孵化1小时后保留的相对灵敏度比较：(A)安培型电流-时间响应曲线(i-t)图：(B)循环伏安(CV)图。
图10为葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)的循环伏安图(CV)。
图11为葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)对葡萄糖溶液的电流-时间响应曲线图(A)，以及对应的响应电流和葡萄糖浓度的校准曲线图(B)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其它未具体注明的实验条件，按照常规或仪器制造厂建议的条件。电化学安培法检测所用仪器为上海辰华电化学工作站CHI440，电化学阻抗检测所用仪器为PGSTAT 302N(Autolab,瑞士)。电化学检测采用三电极体系，以制备的玻碳(GC)修饰电极作为工作电极，以Ag/AgCl(3M KCl)作为参比电极，以铂电极作为对电极。用于制备修饰电极的玻碳电极使用前需经过以下预处理：分别用1.0，0.3，0.05μm的三氧化二铝粉末抛光电极表面，然后在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗3次，每次1.5分钟，然后用高纯氮气吹干玻碳电极备用。实验中使用的三电极体系只是为便于原理和实验结论的验证，实际应用中工作电极(修饰电极)既可以制备集成为血糖试纸，也可以制备成人体可穿戴设备，而不必局限于基于玻碳电极基体的酶修饰电极，也不必局限于三电极体系。实施例中所用的修饰材料(纳米材料、壳聚糖等成膜材料)也只是例举，不作为应用限制。
实施例1
葡萄糖氧化酶分子纳米胶囊(nGOx)的制备
葡萄糖氧化酶分子纳米胶囊(nGOx)的制备可以采用原位自由基聚合等方法，其制备包括两个典型过程。图1中给出了葡萄糖氧化酶分子纳米胶囊制备的典型流程示意图。首先第一步，在合适浓度的葡萄糖氧化酶的缓冲盐水溶液(或有机溶剂)中，通过吸附、共价交联等方式将带双键(烯基)的有机分子单体(如N-丙烯基琥珀酰亚胺)固定到酶分子表面使酶成为带可聚合基团(双键)的酶单分子(被小分子包裹的酶在溶液中呈单分子分布)；然后第二步，加入至少一种带双键的有机单体分子(比如丙烯酰胺等)和/或带两个双键的有机单体分子交联剂(比如N,N’-亚甲基双丙烯酰胺)，最后加入过硫酸氨和四甲基乙二胺等引发剂在合适的反应温度下(室温或低温下等)引发原位自由基聚合反应，使反应产生的聚合物在酶分子表面形成一薄层网状聚合物形成酶单分子(或酶多分子)纳米胶囊。
本实施例具体制备过程如下：在第一步典型的制备过程中，酶分子(大约10mg mL-1)在20mM碳酸氢盐缓冲液(pH8.5)中用管状膜(MWCO＝12000Da)进行透析，透析主要为了消除酶原料中的硫酸铵等。然后用20mM碳酸盐缓冲液(pH8.5)稀释酶溶液到5mgmL-1的目标浓度，再加入适量10％的N-丙烯基琥珀酰亚胺(NAS)溶液(NAS溶解在DMSO溶剂中，加入NAS：酶量摩尔比为20：1)。反应在4℃下进行1h，然后在20mM的pH7.0磷酸缓冲溶液(PBS)中用管状膜(MWCO＝12000Da)对反应产物进行透析，消除未结合的NAS，获得带烯基官能团的酶溶液，保存在4℃的冰箱中。将有机分子单体N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)和丙烯酰胺(AAm)加入上述带烯基官能团的酶溶液中(摩尔比BIS/酶＝1000:1,AAm/酶＝6000:1)，然后酶溶液用50mM PBS(pH 7.0)稀释到1mgmL-1。最后加入过硫酸氨(过硫酸铵/酶＝500:1，摩尔比n/n)和四甲基乙二胺引发剂(四甲基乙二胺/过硫酸铵＝2:1,质量比w/w)到上述溶液中引发原位自由基聚合反应。此聚合反应在室温下(25℃)反应2小时后，反应产生的混合物用50mM PBS(pH 7.0)透析以除去反应副产物和未反应的有机分子单体，然后用水浴加热到37℃保持5分钟。制备的单分子酶纳米胶囊用0.22μm的滤膜过滤，然后使用SPIN-XUF浓缩器(MWCO-10000Da)浓缩到适当浓度，浓缩液存储在-20℃备用。
实验室中使用的有机小分子单体、交联剂、引发剂有很多种类可选，实施例中只是例举一二。反应的温度通常是室温或者大于等于零度的低温下，反应时间可根据需要进行调控。
实施例2
基于nGOx的生物传感器制备
本研究用滴涂法分别制备了基于nGOx和GOx的生物(纳米)传感器(修饰电极)，典型的制备方案如图2所示。图2给出的方案是多种可行方案中的一种，只是示例。实际操作中可采用多种程序、方法和组分制备生物传感器，比如可采用各种组分的混合溶液直接用于修饰电极的制备(可以不用像图2一样采用分步方法制备修饰电极)，或者采用丝网印刷、3D打印等方式制备修饰电极；电极基体可采样玻碳电极、玻璃电极、金属电极、试纸电极等很多材料；采样的纳米材料起到提高灵敏度的作用，可以选择普通碳纳米管、石墨烯、金属氧化物等很多纳米材料或者活性炭等材料，也可以不使用纳米材料；采样的聚合物壳聚糖(寡聚糖)起到固定酶分子使传感器在使用中更稳定的作用，也可以采样其他成膜材料(比如海藻酸钠、Nafion膜等)，也可以不使用成膜材料(但修饰电极牢固性会受到一定影响)。
用于制备生物传感器的玻碳电极(GCE)在使用之前，首先用去离子水清洗，并使用氧化铝粉末(分别为1.0微米、0.3微米和0.05微米)在抛光布上适当抛光。抛光的GCE分别在乙醇和水中进行超声处理，以除去任何附着的氧化铝粉末。然后，用去离子水冲洗玻碳电极并在氮气流下干燥以获得干净的抛光镜面备用。氮掺杂的碳纳米管(N-CNT,4mgmL-1)的原料溶液使用水与二甲基甲酰胺混合溶液(水与二甲基甲酰体积比为80:20)经超声分散制备。壳聚糖水溶液(6mg mL-1)是通过先将壳聚糖溶解在0.1M的醋酸水溶液中，然后用氢氧化钠溶液调节pH值到5.0左右。天然的GOx(10mg mL-1)和酶分子纳米胶囊nGOx(10mg mL-1)分别溶解在50mM的PBS(pH 7.01)中作为原料溶液。将N-CNTs和壳聚糖溶液与超纯水混合，得到最终浓度都为2mg mL-1的N-CNTs和壳聚糖混合溶液，然后将5μL(微升)的溶液小心地滴到GCE上，在倒置烧杯下干燥，得到均匀的涂层，命名为N-CNTs-Chi/GCE。然后，将6μL的nGOx溶液滴注到N-CNTs-Chi/GCE上，在倒置烧杯下再次干燥，得到nGOx/N-CNTs/GCE生物传感器。
为进行性能比较，使用相同的方法制备了基于天然GOx的生物传感器，除了采用天然GOx替代nGOx之外，其他程序相同。所有制备的生物传感器均存储在4℃备用。制备的生物传感器浸渍在10毫升PBS中30分钟，以除去松散附着的电极组分。
实施例3
nGOx的结构和形貌表征
采用动态光散射(DLS)方法测量nGOx和天然GOx分子的粒径分布和电动电势(ζ电位)。天然GOx分子呈现负电荷-9.6mV，粒径分布集中在约10.1nm处。制备得到的nGOx分子的平均粒径分布为15.6nm，证实在每个GOx分子周围成功形成约2-3nm厚度的薄聚合物保护层(图3A)。nGOx分子由于聚合物层的包覆而表现出较少的负电荷为-6.0mV。
图3B透射电子显微照片(TEM)显示了nGOx纳米胶囊具有球形形貌，平均粒径在16nm左右，与DLS方法测试结果一致。此外，图3C中给出了nGOx和GOx紫外可见光谱图。GOx分子在277nm附近呈现特征峰，在372nm和447nm处的峰对应于氧化态黄素基团。nGOx纳米胶囊中GOx的特征吸收峰保持不变，表明纳米胶囊中的酶保持了其二级结构，保留了天然GOx分子的生物活性。
实施例4
nGOx的酶活性表征
近年来，酶分子包封和固定化的多种策略得到了显著的发展。然而，封装/固定化后酶生物活性明显的降低是这些策略遇到的主要问题，这可以归因于空间位阻和底物转运阻力。用紫外-可见光谱法对nGOx纳米胶囊和GOx酶分子的酶活性进行了对比评价。在典型的反应中，纳米胶囊内的酶分子在35℃和pH 5.1(50mM乙酸-乙酸钠缓冲液)的反应温度下在O2存在下氧化葡萄糖。该反应生成H2O2作为副产物，该副产物在过氧化物酶(POD)存在下氧化邻-联二茴香胺(染料)，导致颜色强度增加。在500nm处测量每分钟的吸光度的变化(ΔA/分钟)。典型反应方程式如(I)和(II)所示：
Figure BDA0001982146400000111
Figure BDA0001982146400000112
结果表明，所构建的nGOx纳米胶囊包封后，其葡萄糖氧化活性保持在原有GOx生物活性的86％左右。所合成的nGOx纳米胶囊的主要优势在于，该聚合物薄层具有高度渗透性，提供对酶底物的自由可及性，反应底物可自由扩散进/出酶纳米胶囊，这从所获得的生物催化活性得到了证实。酶分子保留了它们的二级结构，具有良好的催化效率。
实施例5
不同修饰电极的循环伏安表征
图4A给出了不同修饰电极在氮气饱和(除氧的)的0.1M磷酸缓冲液(pH 7.01)中的循环伏安图(CV)以进行比较和表征。从图中可以看出，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE修饰电极在pH7.0PBS中扫描时，在-0.4V附近有一对准可逆的特征氧化还原峰(对应酶活性中心FAD/FADH2氧化还原反应)，说明酶纳米胶囊修饰的电极可以与玻碳电极基底之间进行直接有效的电子传输，酶纳米胶囊的这种固载模式是非常有效的，可以保持酶纳米胶囊的活性。在其他修饰电极上则没有明显的氧化还原峰。图4B给出了nGOx/N-CNTs-Chi/GCE修饰电极在不同pH值(pH 3～9)下0.1M磷酸缓冲液中的循环伏安图。随着PBS溶液pH值的增大，其峰电位发生负移。此外，还研究了nGOx/N-CNTs-Chi/GCE修饰电极在在0.1M磷酸缓冲液(pH 7.01)中不同扫速下(25-300mV s-1)的循环伏安图，如图5所示。随着扫速的增大，其CV峰电流也跟着增大，且阴极和阳极峰电流与扫速呈线性相关，说明是一个表面控制的电化学过程。
实施例6
基于nGOx的生物传感器电催化性能研究
图6A是葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极在氮气和氧气饱和的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH 7.01)中加入1000μM的葡萄糖之前和之后的循环伏安图。从图中可以看出，在氮气饱和的磷酸缓冲溶液中，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE具有一对准可逆的氧化还原峰(对应酶活性中心FAD/FADH2氧化还原反应)。而在氧气饱和的磷酸缓冲溶液中，由于酶电极对氧气具有很好的催化还原活性(氧还原反应)，所以酶电极的阴极峰电流变大(相对于氮气饱和的条件下)而阳极响应变小，显示了酶电极非常好的催化活性。当向氧气饱和的PBS中加入1000μM的葡萄糖(葡萄糖氧化酶的天然底物)时，如图6中所示，酶电极会催化葡萄糖的氧化反应而消耗氧气，导致氧气的还原峰电流(阴极峰电流)明显下降。图6B给出了葡萄糖氧化酶纳米胶囊修饰电极(nGOx/N-CNTs-Chi/GCE)对不同浓度葡萄糖(浓度从低到高依次为0μM，200μM，400μM，600μM，800μM，1000μM，1200μM)的循环伏安响应图。从图6B中可以看出，向PBS中加入的葡萄糖浓度越大，酶电极上阴极峰电流的下降越明显。由于酶电极上阴极峰电流的下降程度与加入的葡萄糖浓度呈正比，据此可用该酶电极(生物传感器)检测葡萄糖的浓度。结果表明，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器能有效地催化葡萄糖的氧化和氧气的还原,并具有天然GOx分子的基本催化功能。本实验证实了nGOx纳米胶囊具有生物催化活性，可作为生物传感器平台的酶活性组分广泛应用于酶传感器的构建。
实施例7
基于nGOx的生物传感器热稳定性研究
利用循环伏安法和安培法分别研究了基于纳米胶囊的nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器的热稳定性能,并与基于天然GOx分子的生物传感器进行了比较。高温容易使天然葡萄糖氧化酶的黄素辅因子(FAD)与酶中心分离，导致构象改变和丧失天然生物活性。此外，在高温下，天然GOx酶分子往往失去其必需的水，导致其生物功能的丧失。因此，热稳定性是nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器在健康监测和医疗诊断领域多重应用的一个重要方面。为了研究其热稳定性，将制备的nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器和天然GOx基生物传感器在不同温度(45℃、55℃和65℃)下孵育1小时(60分钟)，并在孵育前后检测对葡萄糖的响应灵敏度。室温下(25℃)得到的原始催化活性(传感器灵敏度)设定为100％。图7A(i-t方法)和7B(CV方法)显示了制备的生物传感器在不同温度下的失活曲线。所得结果表明由于GOx分子被纳米封装在薄的聚合物层内，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器的生物传感活性的耐热性显著提高。天然GOx基生物传感器随着温度的升高表现出快速而显著的催化活性损失，65℃下分别在电流法(i-t)和循环伏安法(CV)的情况下仅保留了原催化活性的39％和55％。nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器显示出增强的稳定性，分别使用i-t(图7A)和CV(图7B)方法保持了约66％和92％的原始葡萄糖氧化酶催化活性。相对于天然GOx,nGOx即使在高温下酶分子仍然保持了很高的催化活性，说明纳米胶囊可以为酶分子保持其生物活性和功能提供有利的微环境。
此外，将制备的生物传感器在65℃高温下分别孵育1小时、2小时、3小时和4小时，研究其在高温下的工作热稳定性。图8A和8B显示了天然GOx和nGOx催化生物活性的失活曲线。天然GOx基生物传感器显示葡萄糖催化活性快速连续地丧失。在i-t和CV两种方法中都观察到了天然GOx分子基生物传感器在65℃高温下孵育3-4小时后完全失去活性。另一方面，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器由于GOx分子受到纳米胶囊的保护而比较缓慢地降低其催化活性，并且分别在i-t(图8A)和CV(图8B)两种测试方法中在65℃高温下孵育3-4小时后分别保持了约27％和56％的原始催化活性。nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器热稳定性的提高,可归因于聚合物薄壳与酶分子之间的多重共价连接。这种共价连接阻碍了酶纳米胶囊内部的热波动，限制了酶分子的去折叠失活，保护酶分子在高温下不发生变性。该纳米胶囊生物传感器具有较好的生物活性和电催化活性,在高温下具有良好的抗变性、抗失活和稳定性。
实施例8
基于nGOx的生物传感器对有机溶剂的耐受性研究
在极性有机溶剂环境中保持酶催化活性是酶类和酶基生物传感器在工业和生物医学设备中应用的难点和要解决的关键任务。有机溶剂趋向于与酶催化所必需的水竞争，从而与蛋白质结构形成氢键，导致酶解链或者构象变化等，从而使酶分子失去活性。提高的溶剂耐受性可以使用蛋白质工程实现，但该工艺复杂且导致降低的酶催化活性。为了考察对有机溶剂环境(极性有机溶剂)的稳定性，将制备的生物传感器暴露于水-有机溶剂混合物(体积比50:50)，并在所述混合物中孵育1小时。用i-t和CV方法研究了生物传感器在孵育前后对葡萄糖的响应活性(传感器灵敏度)。所制备的nGOx基生物传感器表现出更大的极性溶剂耐受性。如图9A和9B所示，与天然GOx基生物传感器相比，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器显示出增强的酶稳定性，有机溶剂孵育后葡萄糖氧化酶的催化活性仅略有损失。例如，在i-t方法中，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器分别在乙醇(EtOH)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中孵育后保留了约80％和85％的原始活性。与此相反，天然GOx基生物传感器分别在乙醇(EtOH)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中孵育后仅显示其原始催化活性的43％和49％(图9A)。基于nGOx的生物传感器在甲醇(MeOH)和二甲基亚砜(DMSO)中孵育后也显示出比基于天然GOx的生物传感器更好的催化活性。此外，如图9B所示，用CV法也得到了类似的结果。与天然GOx基生物传感器相比，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器在有机溶剂(EtOH、MeOH、DMSO、DMF)中孵育后，对葡萄糖显示出明显的更高的催化生物活性性能。有机溶剂耐受性的显著提高可归因于软聚合物外壳，它有助于保持亲水性环境和保护必需水，使GOx分子能够有效地发挥其生物功能。此外，薄聚合物层和酶分子之间的多重共价连接保护了包封的GOx分子。葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器对有机溶剂的良好耐受性使得该传感器在葡萄糖检测方面的应用，不局限于水溶液体系中葡萄糖浓度或血糖、尿糖、汗液葡萄糖、体液葡萄糖等的检测，在更复杂的体系比如有机溶剂或有机溶剂-水溶液等混合体系中也可以获得广泛的应用。
实施例9
基于nGOx的生物传感器操作稳定性研究
在氮气饱和的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.01)中，以100mV s-1的扫描速率，通过连续循环伏安法测量从循环1到第500个循环的操作稳定性。如图10所示，nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器第300个和第500个循环分别保持了初始峰值电流的97％和95.33％。nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器的这种强操作稳定性能归因于nGOx在修饰电极上的良好负载，说明酶电极上nGOx分子在长期操作中很稳定，不会从修饰电极上浸出。
实施例10
基于nGOx的生物传感器检测葡萄糖研究
分别通过循环伏安方法(CV)和安培型电流时间(i-t)曲线方法研究了nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器对葡萄糖的电流响应特性。CV方法的响应曲线已在前述图6中描述。下面再以i-t方法为例，研制的传感器可以在不同的恒电位下(负电位或者正电位都可以)检测葡萄糖浓度，使用不同的恒电位得到的传感器的响应灵敏度会有差异。图11A给出了该方法在0.6V恒定电位下的空气(氧气)饱和PBS(0.1M，pH7.01)中连续添加葡萄糖浓度为10μM-1740μM的i-t曲线。从图11A中可以明显看出，即使在低浓度下，在每次添加葡萄糖时都产生快速的电流响应信号，响应时间只需要几秒钟。结果表明，葡萄糖底物可以非常畅通的与nGOx的酶活性中心接触，nGOx纳米胶囊对酶活性催化中心没有空间阻碍作用。nGOx/N-CNTs-Chi/GCE生物传感器的电流响应在6s内达到95％的稳态电流，进一步证实了葡萄糖在nGOx/N-CNTs-Chi/GCE电极上的快速响应。
从图11可以清楚地看出，在相对较低浓度范围下(小于1740μM)，电流响应与葡萄糖底物浓度成正比，从而表现出一级反应的特征。然而，当葡萄糖浓度超过1740M时，电流响应开始降低，在较高浓度时，电流响应饱和，并遵循零级反应动力学。这些特征性的酶反应证实了GOx酶分子在纳米胶囊内的生物学功能没有显著降低，而且纳米胶囊进一步增强其在不同工作环境中的稳定性和耐久性。从图11B可以清楚地看出，在10μM-1740μM的浓度范围内，电流响应随葡萄糖浓度增大而线性增加，呈现线性关系，这进一步证明了所制备的生物传感器的高灵敏度。获得的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为6.92μM和23μM。这里，LOD计算为3倍S/M，LOQ计算为10倍S/M，其中S是电流响应的标准偏差，M是电流-浓度响应校准曲线的斜率。nGOx/N-CNTs-Chi/GCE优异的生物电化学性能是由于纳米胶囊提供了良好的微环境以保持酶活性，提高稳定性和环境耐受性。由于其良好的环境耐受性，葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器在葡萄糖检测方面的应用，包括但不限于水溶液或有机溶剂中葡萄糖浓度或血糖、尿糖、汗液葡萄糖、体液葡萄糖等的检测。所述的葡萄糖氧化酶纳米胶囊传感器的应用，包括但不限于传感器在血糖试纸、可穿戴设备、食品发酵、酶化工、分析检测等领域的应用。

Claims (10)

1.一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器使用酶纳米胶囊作为酶电极生物识别分子或者作为酶电极生物识别元件的一部分。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述酶纳米胶囊为酶单分子纳米胶囊或酶多分子纳米胶囊。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述酶纳米胶囊的尺寸小于100nm；所述酶纳米胶囊包含至少一个酶分子作为内核或者作为内核的一部分；所述内核外面包裹了一层网状的聚合物薄膜作为外壳；所述聚合物薄膜的厚度为0.1nm～100nm，所述聚合物薄膜为单体或聚合物通过共价方式形成；所述单体或聚合物含有羧基、氨基、正电荷、负电荷或双键基团中至少一种。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的生物传感器，其特征在于，所述酶纳米胶囊为葡萄糖氧化酶纳米胶囊。
5.一种权利要求4所述传感器的制备方法，其特征在于，所述生物传感器的制备方法包括两个：
方法一：将电极增敏材料和电极成膜材料与超纯水混合，得到混合溶液，然后将所述混合溶液滴加、浇注或打印到电极的表面上，干燥，得到传感器前体；最后，将葡萄糖氧化酶纳米胶囊(nGOx)溶液滴加、打印或浇注到所述传感器前体上，干燥，得到所述生物传感器；所述混合溶液中电极增敏材料和电极成膜材料的浓度均为0.05～20mg mL-1，优选为2mg mL-1；所述混合溶液的滴加量为0.1～3μL/mm2；所述葡萄糖氧化酶纳米胶囊溶液的浓度为0.1～30mg mL-1，优选10mg mL-1；所述nGOx溶液在传感器前体上的滴加、打印或浇注量为0.1～3μL/mm2；
方法二：将电极增敏材料、电极成膜材料、葡萄糖氧化酶纳米胶囊(nGOx)与超纯水混合，得到混合溶液，然后将所述混合溶液滴加、打印或浇注到所述电极的表面上，干燥，得到所述生物传感器；所述混合溶液中，电极增敏材料和电极成膜材料的浓度均为0.0～20mgmL-1，优选为2mg mL-1；所述混合溶液中nGOx的浓度为0.1～30mg mL-1，优选为5mg mL-1；所述混合溶液的滴加量为0.1～3μL/mm2；
所述电极增敏材料为碳纳米材料、石墨粉、惰性金属纳米材料、过渡金属氧化物纳米材料或包含上述任一材料的复合材料；
所述电极成膜材料为壳聚糖、明胶、蚕丝蛋白、海藻酸钠、Nafion乳液、硅的溶胶-凝胶或导电胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法一和方法二中的混合溶液还包括助溶剂，所述混合溶液中，助溶剂与水的体积比为0:100～100:0；所述助溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、亲水性表面活性剂或亲水性离子液体。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述滴加混合溶液的电极表面经过抛光处理和/或清洗处理，然后干燥以获得干净的电极表面备用。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述电极为玻碳电极(GCE)、惰性金属电极、导电玻璃电极、石墨电极、丝网印刷电极、试纸电极、柔性电极；所述金属电极为金属金、铂或银电极。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述碳纳米材料为碳纳米管、石墨烯、介孔碳、碳点或杂原子掺杂的碳纳米材料；所述杂原子为氮、磷、硼、氧、氢、羟基、羧基或醌基；所述惰性金属纳米材料中的惰性金属为金、银或铂；所述过渡金属氧化物纳米材料中过渡金属氧化物为ZnO、Fe3O4、Co3O4、NiO、TiO2、MnO2、ZrO2。
10.一种权利要求4所述的传感器的应用，其特征在于，所述应用为使用所述传感器检测水溶液、有机溶剂或混合溶液中葡萄糖浓度，以及用于检测血糖、尿糖或汗液葡萄糖、体液葡萄糖、食品中葡糖糖的浓度；所述应用为所述传感器在血糖试纸、可穿戴设备、可植入设备、柔性电极、食品发酵、酶化工、分析检测领域的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113390937A (zh) * 2021-06-11 2021-09-14 上海大学 一种可穿戴柔性印刷电极
CN113640258A (zh) * 2021-06-29 2021-11-12 北京农业信息技术研究中心 一种薄膜型荧光传感器及其制备方法和应用
WO2022051891A1 (zh) * 2020-09-08 2022-03-17 三诺生物传感股份有限公司 一种葡萄糖生物传感器

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113960139A (zh) * 2021-07-13 2022-01-21 沈阳师范大学 一种新型脂质体基葡萄糖氧化酶构建的修饰电极、其制备方法及直接电化学应用
CN114191562B (zh) * 2021-12-21 2024-01-16 青岛大学 一种双酶活性抑菌材料的制备方法及其应用
CN114669312B (zh) * 2022-02-23 2023-10-27 东南大学 一种整合酶的制备方法
CN114740071B (zh) * 2022-05-19 2024-02-20 中国石油大学(华东) 酶电极、其制备方法及其应用
CN116285976B (zh) * 2023-03-28 2024-03-26 云南大学 检测葡萄糖的材料及双模式信号检测方法
CN117004389A (zh) * 2023-08-04 2023-11-07 江苏大学 一种基于绿色化学理念的比率型荧光探针的制备方法及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1738906A (zh) * 2002-12-31 2006-02-22 科学与工业研究委员会 酶电极的制备方法
JP2006213678A (ja) * 2005-02-07 2006-08-17 Toray Ind Inc マイクロカプセル組成物および酵素またはタンパク質の表出方法。
US7312040B2 (en) * 2002-09-20 2007-12-25 Agilent Technologies, Inc. Microcapsule biosensors and methods of using the same
US20090053582A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Sony Corporation Method of coating bilirubin oxidase
CN102928488A (zh) * 2011-11-24 2013-02-13 中国科学院大连化学物理研究所 酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法
CN103781905A (zh) * 2011-07-06 2014-05-07 加利福尼亚大学董事会 多酶纳米复合物
CN104740646A (zh) * 2015-03-27 2015-07-01 金晶 一种自交联的纳米胶囊
CN109266639A (zh) * 2018-08-31 2019-01-25 华南协同创新研究院 一种双重固定化酶及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7312040B2 (en) * 2002-09-20 2007-12-25 Agilent Technologies, Inc. Microcapsule biosensors and methods of using the same
CN1738906A (zh) * 2002-12-31 2006-02-22 科学与工业研究委员会 酶电极的制备方法
JP2006213678A (ja) * 2005-02-07 2006-08-17 Toray Ind Inc マイクロカプセル組成物および酵素またはタンパク質の表出方法。
US20090053582A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Sony Corporation Method of coating bilirubin oxidase
CN103781905A (zh) * 2011-07-06 2014-05-07 加利福尼亚大学董事会 多酶纳米复合物
CN102928488A (zh) * 2011-11-24 2013-02-13 中国科学院大连化学物理研究所 酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法
CN104740646A (zh) * 2015-03-27 2015-07-01 金晶 一种自交联的纳米胶囊
CN109266639A (zh) * 2018-08-31 2019-01-25 华南协同创新研究院 一种双重固定化酶及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI, YOUNG-BONG ET AL.: "The electrochemical glucose sensing based on the chitosan-carbon nanotube hybrid", 《BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》 *
DENG, SHENGYUAN ET AL.: "A glucose biosensor based on direct electrochemistry of glucose oxidase immobilized on nitrogen-doped carbon nanotubes", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
GORAN, JACOB M. ET AL.: "Influence of Surface Adsorption on the Interfacial Electron Transfer of Flavin Adenine Dinucleotide and Glucose Oxidase at Carbon Nanotube and Nitrogen-Doped Carbon Nanotube Electrodes", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
ISAO SHITANDA，ET AL.: "Screen-printed Enzyme Electrodes Using Microcapsules Containing Glucose Oxidase and Mediator", 《ELECTROCHEMISTRY》 *
JI, HANXU ET AL.: "Nitrogen-Doped Carbon Dots as A New Substrate for Sensitive Glucose Determination", 《SENSORS》 *
KANG, XINHUANG ET AL.: "Glucose Oxidase–graphene–chitosan modified electrode for direct electrochemistry and glucose sensing", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
KIM, JUNGBAE ET AL.: "Nanobiocatalysis and its potential applications", 《TRENDS IN BIOTECHNOLOGY》 *
LEE, KEUM-JU ET AL.: "Nano-biosensor base on protected glucose oxidase nanoparticles", 《2007 7TH IEEE CONFERENCE ON NANOTECHNOLOGY (IEEE NANO)》 *
LIU, YING ET AL.: "The direct electron transfer of glucose oxidase and glucose biosensor based on carbon nanotubes/chitosan matrix", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
RUST, IAN M. ET AL.: "Amperometric Detection of Aqueous Silver Ions by Inhibition of Glucose Oxidase Immobilized on Nitrogen-Doped Carbon Nanotube Electrodes", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
TSAI, YU-CHEN ET AL.: "Cast Thin Film Biosensor Design Based on a Nafion Backbone, a Multiwalled Carbon Nanotube Conduit, and a Glucose Oxidase Function", 《LANGMUIR》 *
WEI, WEI ET AL.: "Nitrogen-doped carbon nanotubes enhanced laccase enzymatic reactivity towards oxygen reduction and its application in biofuel cell", 《ELECTROCHEMISTRY COMMUNICATIONS》 *
XU, XUAN: "Nitrogen-Doped Carbon Nanotubes: High Electrocatalytic Activity toward the Oxidation of Hydrogen Peroxide and Its Application for Biosensing", 《ACS NANO》 *
YANG WANG，ET AL.: "Preparation of graphene nano-sheet bonded PDA/MOF micro-capsules with immobilized glucose oxidase as a mimetic multi-enzyme system for electrochemical sensing of glucose", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》 *
ZHOU, YI ET AL.: "Direct electrochemistry and reagentless biosensing of glucose oxidase immobilized on chitosan wrapped single-walled carbon nanotubes", 《TALANTA》 *
李艳彩 等: "葡萄糖氧化酶在壳聚糖包埋单壁碳纳米管膜中的直接电化学与电催化研究", 《分析科学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022051891A1 (zh) * 2020-09-08 2022-03-17 三诺生物传感股份有限公司 一种葡萄糖生物传感器
CN113390937A (zh) * 2021-06-11 2021-09-14 上海大学 一种可穿戴柔性印刷电极
CN113640258A (zh) * 2021-06-29 2021-11-12 北京农业信息技术研究中心 一种薄膜型荧光传感器及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020172972A1 (zh) 2020-09-03
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