CN109030802B - 一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器及其制备方法和应用，本发明利用Hdetz、亚铜离子与酶在温和条件下共反应，构建了同时具有光学氧气传感性能以及高效酶催化活性的一体化固定化酶生物传感器Enzyme@MAF‑2。该传感器具有固定化酶高稳定性，良好的选择性和可重复使用性的优点。而且，其一体化的传感形式可以直接响应底物，无需添加其他辅助试剂，极大地简化了检测步骤以及降低了检测成本，是首例将具有光学传感性能的MOF作为固定化酶载体的一体化生物传感器。

Description

一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及金属有机框架(MOF)材料领域以及生物传感器领域，具体涉及一例一体化的MOF固定化酶生物传感器的制备方法和应用。

背景技术

基于颗粒型的生物传感器将酶固定于微/纳米材料中，在许多领域发挥着重要作用。游离酶的稳定性差，极易失活，并且在均相反应中难以与底/产物分离，导致产物不易回收和难以连续生产，在实际应用中受到限制。而基于颗粒型的生物传感器具有比游离酶更好的稳定性、可回收性以及催化活性。由于它们粒径小，有利于实现注射型活体检测手段以及避免人体免疫作用。虽然颗粒型生物传感器具有许多优势，但目前仍面临着严峻的挑战。以葡萄糖的生物传感器为例——其因高发的糖尿病需要严格的血糖控制而被迫切需要——其通过非共价键或共价键合方法固定葡萄糖氧化酶(GOx)，大多利用GOx-辣根过氧化物酶(HRP)-2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)偶联反应体系，通过ABTS的变色反应检测酶反应生成的过氧化氢从而检测固定化GOx的活性。除了HRP的联用会增加测定成本外，显色底物或多种酶的添加会极大限制生物传感的应用，特别是体内测定。

在固定化酶中，常规固相载体包括无孔无机及高分子材料，多孔载体如溶胶凝胶、多孔高分子、介孔二氧化硅、分子筛等。这些载体大多存在一定缺陷，比如无孔材料酶负载能力低，多孔材料酶易溶出，酶活损失较高，传质受阻等。研究者多使用后合成法(post-synthetic method)来构建MOF-酶生物传感器，其中酶分子被物理吸附或共价连接到预先合成的MOF中。这类方法受到MOF的孔径限制，需要精确调控酶和MOF之间的相互作用。相反，共沉淀方法将酶与合成MOF的反应母液一同反应，在合成过程中通过在MOF晶体内部产生缺陷而将酶原位固定在其内部而更容易实现。这种方法是MOF特有的，比其他三种方法更简便快速，但是要求MOF的合成条件更温和且对酶无损伤，以便在合成MOF-酶复合物的过程中保持酶的活性和稳定性。几乎所有报道的共沉淀法都使用ZIFs作为载体，因为它们在水溶液中的合成条件非常温和。然而，由于Zn²⁺以及具有小π共轭体系的配体的发光性能差，ZIFs的发光传感性质很少被报道。除了成本高，制备工艺复杂之外，其他物质(如联酶、显色底物)会粘附在MOF上而影响测定，并且这些物质的添加将极大地限制此类生物传感器的应用，特别是体内测定。为了研发理想的颗粒型生物传感器——其应该制备简单，具有良好的生物相容性以及能对分析物直接响应而无需添加任何其它试剂——急需合适的、多功能的MOF作为载体。且现有的MOF-酶体系仅使用MOF作为酶的保护层和选择性透过层，而很少利用MOF可设计的响应特性，例如荧光传感、化学催化、导电性、结构变化等。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明发现3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)(代号MAF-2)具有优异的光学氧气传感性能，并且相比于其他需在高温高压下使用溶剂热方法合成的氧传感MOF材料(通常含贵金属钌，铂或铱)，MAF-2不含贵金属且合成条件较为生物友好。本发明设计了一种原位生长法生成MOF-酶复合物的方法，将酶固定于MAF-2结构中，形成名为Enzyme@MAF-2的一体化颗粒型固定化酶生物传感器。

本发明的目的在于提供一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器及其制备方法和应用。

本发明所采取的技术方案是：

3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)、或者Hdetz和亚铜离子在制备固定化酶生物传感器中的应用。

进一步的，所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

进一步的，所述酶为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-α-羟基酸氧化酶、过氧化物酶以及这些酶带有荧光标记的形式。

一种固定化酶生物传感器，其含有3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)和酶，其中酶被固定在3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)的框架内；或者其由酶、含亚铜离子的化合物和Hdetz制成；所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

进一步的，所述含亚铜离子的化合物包括Cu₂O。

一种固定化酶生物传感器的制备方法，将酶、含亚铜离子的化合物与Hdetz在溶剂中溶解，且一同在无氧条件下搅拌反应，取反应产物中的固体，洗涤冻干，即得固定化酶生物传感器；所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

进一步的，所述酶、含亚铜离子的化合物与Hdetz的用量比为10～100mg：0.01～1mmol：0.4～40mmol。

进一步的，所述含亚铜离子的化合物包括纳米颗粒的Cu₂O。

进一步的，无氧条件下搅拌反应体系中还含有水合肼或/和抗坏血酸。

上述任一项所述方法制备的固定化酶生物传感器。

上述任一项所述固定化酶生物传感器在检测该酶底物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明方法利用MAF-2与酶在温和条件下共反应，构建了同时具有光学氧气传感性能以及高效酶催化活性的一体化固定化酶生物传感器Enzyme@MAF-2。

(2)本发明制备的固定化酶生物传感器Enzyme@MAF-2较现有的MOF-Enzyme传感器，具有以下优点：

1)与电化学和比色检测法相比，本发明荧光传感器具有无损检测，无需植入复杂装置以及不消耗底物等优点。

2)本发明Enzyme@MAF-2为亚微米颗粒型(粒径约为500nm)，有利于实现注射型活体检测手段，以及避免人体免疫作用。

3)本发明Enzyme@MAF-2在检测底物时，无需额外加入联用酶以及显色底物，极大地简化了以往的检测步骤以及降低了检测成本。

4)本发明Enzyme@MAF-2展现出低成本，高稳定性，良好的选择性和可重复使用性的优点。

5)本发明Enzyme@MAF-2可以实时动态地检测固定化酶的酶活性，并直接、实时地响应葡萄糖，可以揭露离线方式未能得到的内在酶动力学机理。

(3)本发明Enzyme@MAF-2是一种响应性固定化酶载体，同时起到固定化酶的载体和直接获取反应信号的传感部件作用。是一种结构简单、传感机理简化的一体化颗粒型生物传感器。也是首次公开的具有光学传感性能的MOF固定化酶生物传感器。

(4)本发明为了制作简单、低成本，且能对分析物直接响应而无需额外引入其他试剂的一体化MOF-酶颗粒型生物传感器，本方案利用氧敏感MAF-2对酶(如GOx)进行原位固定化，构建一种对氧气灵敏、同时具有酶催化活性的多功能固定化酶纳米传感器(简称Enzyme@MAF-2)。该传感器具有固定化酶高稳定性，良好的选择性和可重复使用性的优点。而且，其一体化的传感形式可以直接响应底物(如葡萄糖)，无需添加其他辅助试剂(如显色底物、联酶等)，极大地简化了检测步骤以及降低了检测成本。这是首例将具有光学传感性能的MOF作为固定化酶载体的一体化生物传感器。

附图说明

图1为本发明方法的实验原理图；

图2为激光共聚焦显微镜分析不同组中酶在MAF-2中的分布；

图3为GOx@MAF-2、MAF-2和GOx的热重曲线；

图4为GOx@MAF-2、模拟的MAF-2、合成的MAF-2的PXRD图；

图5为GOx@MAF-2以及MAF-2的SEM图；

图6为GOx@MAF-2在不同溶解氧下的发光强度变化曲线；

图7为GOx@MAF-2对葡萄糖的酶活性检测结果；

图8为GOx@MAF-2的选择性、酶解稳定性、对热稳定性以及可重复实用性检测结果；

图9为GOx@MAF-2对不同浓度葡萄糖的响应曲线。

具体实施方式

本发明的原理示意图如图1所示。本发明为了提高生物相容性，改用新制Cu₂O纳米颗粒来替代[Cu(NH₃)₂]⁺的氨水溶液。然后将酶(如GOx)，Cu₂O纳米颗粒与配体Hdetz(3,5-diethyl-1,2,4-triazole，3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑)一同在室温及水/乙醇相下反应过夜，经过滤洗涤干燥后得到与酶(如GOx)共沉淀的MAF-2复合材料(GOx@MAF-2)，即固定化酶生物传感器(如GOx@MAF-2)。MAF-2可以保证固定化酶生物传感器(如GOx@MAF-2)的选择性和稳定性。本发明固定化酶生物传感器(如GOx@MAF-2)是一种氧敏感的磷光载体，能够在低氧环境下被激发光激发发出较强绿色磷光。将GOx@MAF-2分别悬浮在无氧和空气饱和的水溶液中，在手持式紫外灯(辐照波长为254nm)照射下，其发光强度有明显差异，表明GOx@MAF-2能够灵敏地响应溶解氧浓度的变化。当GOx@MAF-2中的GOx在催化葡萄糖氧化反应并消耗氧气时，溶解氧浓度降低从而导致GOx@MAF-2的发光强度随之增强。根据其发光强度变化，可以实现GOx酶反应动力学测定以及葡萄糖检测而无需额外引入任何其它试剂。目前为止，尚未有将具有光学传感性能的MOF作为固定化酶载体实现一体化生物传感器的先例。

本发明的实施方式：

3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)、或者Hdetz和亚铜离子在制备固定化酶生物传感器中的应用。

优选的，所述固定化酶生物传感器同时具有酶催化性能和光学氧气传感性能。

优选的，所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

更优选的，所述酶为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-α-羟基酸氧化酶、过氧化物酶以及这些酶带有荧光标记的形式。

优选的，所述过氧化物酶包括过氧化氢酶和辣根过氧化物酶。

优选的，所述固定化酶生物传感器为颗粒型。

一种固定化酶生物传感器，其含有3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)和酶，其中酶被固定在3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)的框架内；或者其由酶、含亚铜离子的化合物和Hdetz制成；所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

优选的，所述含亚铜离子的化合物包括Cu₂O。

一种固定化酶生物传感器的制备方法，将酶、含亚铜离子的化合物与Hdetz在溶剂中溶解，且一同在无氧条件下搅拌反应，取反应产物中的固体，洗涤冻干，即得固定化酶生物传感器；所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

优选的，所述溶剂为乙醇溶液。

优选的，所述含亚铜离子的化合物包括纳米颗粒的Cu₂O。

优选的，所述酶、含亚铜离子的化合物与Hdetz的用量比为10～100mg：0.01～1mmol：0.4～40mmol。

更优选的，所述酶、含亚铜离子的化合物与Hdetz的用量比为18～30mg：0.08～0.5mmol：1mmol。

优选的，所述搅拌转速为200～1000rpm。

优选的，搅拌反应时间为10～18h。

优选的，无氧条件下搅拌反应体系中还含有水合肼或/和抗坏血酸；且每1～50ml的反应体系滴加1～2滴水合肼或/和抗坏血酸。

优选的，所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

更优选的，所述酶为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-α-羟基酸氧化酶、过氧化物酶以及这些酶带有荧光标记的形式。

优选的，所述过氧化物酶包括过氧化氢酶和辣根过氧化物酶。

上述一项所述方法制备的固定化酶生物传感器。

上述任一项所述固定化酶生物传感器在检测该酶底物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器的制备方法

室温下向含有0.25mmol Cu(NO₃)₂和0.25mmol抗坏血酸的20mL溶液中加入1gNaOH，迅速生成Cu₂O纳米颗粒，离心后洗涤。将生成的纳米颗粒溶解在20mL乙醇中，加入一滴水合肼或抗坏血酸。在氮气保护下，将混合物加入含有25mg GOx(葡萄糖氧化酶)和1mmolHdetz(3,5-diethyl-1,2,4-triazole，3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑)的15mL水溶液中。室温下以800转/分钟搅拌过夜(12h)后，以9000rpm离心3分钟收集产物，并用去离子水洗涤三次后冻干成粉末，即得固定化酶生物传感器GOx@MAF-2。

实施例2一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器的制备方法

方法同实施例1，唯一不同之处为将实施例1中的GOx替换成罗丹明B异硫氰酸酯(RhB)标记的GOx(记为RhB-GOx)。将实施例2最终制得的固定化酶生物传感器记为RhB-GOx@MAF-2。

上述RhB-GOx的具体制备方法为：将9mg罗丹明B异硫氰酸酯(RhB)溶解在4mL DMSO中，逐滴滴加到2mL GOx溶液(10mg mL^-1，0.5M pH 9.5碳酸盐缓冲液)中。溶液在室温下以300rpm避光搅拌6小时。过量的RhB通过丙酮沉淀法在-80℃下放置1小时后离心除去，将标记上荧光分子的酶干燥，即得RhB-GOx。

实施例3一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器的制备方法

本实施方法同实施例1，唯一不同之处为将实施例1中的GOx替换成尿酸氧化酶(UAO)。将实施例3最终制得的固定化酶生物传感器记为UAO@MAF-2。

对比例1吸附在晶体表面的MAF-2复合物(GOx/MAF-2)的制备方法

1)MAF-2粉末的制备：室温下向含有0.25mmol Cu(NO₃)₂和0.25mmol抗坏血酸的20mL溶液中加入1g NaOH，迅速生成Cu₂O纳米颗粒，离心后洗涤。将生成的纳米颗粒溶解在20mL乙醇中，加入一滴水合肼。在氮气保护下，将混合物加入含有1mmol Hdetz的15mL水溶液中。室温下搅拌过夜后，以9000rpm离心3分钟收集产物，并用去离子水洗涤三次后冻干成MAF-2粉末备用。

2)将合成好的MAF-2粉末与GOx分子进行简单混合，然后经过与合成GOx@MAF-2过程相同的离心洗涤步骤，制得GOx仅吸附在晶体表面的MAF-2复合物(GOx/MAF-2)。

对比例2吸附在晶体表面的MAF-2复合物(RhB-GOx/MAF-2)的制备方法

1)MAF-2粉末的制备：同对比例1。

2)RhB-GOx的制备：将9mg罗丹明B异硫氰酸酯(RhB)溶解在4mL DMSO中，逐滴滴加到2mL GOx溶液(10mg mL^-1，0.5M pH 9.5碳酸盐缓冲液)中。溶液在室温下以300rpm避光搅拌6小时。过量的RhB通过丙酮沉淀法在-80℃下放置1小时后离心除去，将标记上荧光分子的酶干燥，即得RhB-GOx。

3)将合成好的MAF-2粉末与RhB-GOx分子进行简单混合，然后经过与合成GOx@MAF-2过程相同的离心洗涤步骤，制得RhB-GOx仅吸附在晶体表面的MAF-2复合物(RhB-GOx/MAF-2)。

下面对本发明制备的固定化酶生物传感器作进一步的效果检测。

一、固定化酶生物传感器中酶的分布及含量

(1)酶的释放情况

方法：将上述制备的GOx/MAF-2和GOx@MAF-2分别快速搅拌，机械破坏MAF-2框架，将GOx释放到溶液中。通过蛋白质电泳检测上清液的GOx分子。

电泳检测结果显示，GOx@MAF-2样品可以观察到与阳性对照样品GOx与相似位置的条带，GOx/MAF-2则没有。表明GOx@MAF-2中的GOx分子是嵌入晶体框架内部的。若GOx只是简单吸附在MAF-2表面，则其可以通过简单的离心洗涤步骤后从GOx/MAF-2上洗脱下来。

(2)酶在MAF-2中的分布情况

方法：将RhB-GOx@MAF-2和RhB-GOx/MAF-2在543nm波长下进行激光扫描共聚焦显微镜图像拍摄。

结果：共聚焦结果如图2所示，在543nm处激发RhB，经过彻底洗涤的RhB-GOx@MAF-2样品依然显示出均匀且较强的荧光，但是RhB-GOx/MAF-2样品没有明显的荧光。该结果表明，在本发明制备的RhB-GOx@MAF-2中RhB-GOx分子可以均匀且密集地分布在晶体框架内部，而RhB-GOx/MAF-2中几乎没有RhB-GOx分子可以分布在晶体框架内部。

(3)GOx@MAF-2的热重曲线

利用热重分析法分析GOx@MAF-2、MAF-2粉末和GOx，分析结果如图3所示。在150℃之前，GOx@MAF-2、MAF-2和GOx分子均有小于2％的重量损失，这是由于晶体以及酶分子中的水分子或其他有机小分子的蒸发引起。GOx@MAF-2的第二个分解阶段从180℃开始，并在280℃左右结束，而MAF-2晶体在此温度范围内几乎没有什么重量损失。这一约14wt％的质量损失可以推测是由GOx@MAF-2内含的GOx降解引起的。

二、固定化酶生物传感器的基本表征

(1)X射线粉末衍射表征(PXRD)

X射线粉末衍射图如图4所示，从中可以看出，本发明GOx@MAF-2的粉末X射线衍射(PXRD)图与模拟的MAF-2，以及合成的MAF-2相同。

(2)扫描电子显微镜检测

扫描电子显微镜检测图如图5所示，从中可以看出，本发明制备的GOx@MAF-2的扫描电子显微镜(SEM)图(图5-a)与MAF-2晶体SEM图(图5-b)具有相同的形态和结构，平均粒径约为500nm。

上述PXRD(图4)和SEM(图5)结果均表明，固定了GOx后的MAF-2保持了原有的晶体结构和结晶度。

三、固定化酶生物传感器的性能测试

(1)光学氧气传感性能

方法：将1mg GOx@MAF-2粉末分散在1mL水中，加到3mL比色皿中，在室温下用一定比例的氮气和氧气混合气体通入反应液10分钟获得不同浓度的溶解氧。混合气的比例使用Alicat质量流量控制器调控，密封后在荧光仪中进行荧光强度测试，发光强度与氧气浓度之间的关系用Stern-Volmer方程来拟合。

结果：检测结果如图6所示，在270nm激发下，随着溶解氧浓度的增加，GOx@MAF-2悬浊液的发光强度被显著猝灭。GOx@MAF-2对溶解氧的磷光淬灭行为符合线性Stern-Volmer方程。

(2)酶活性检测

方法：在含有0.3mg GOx@MAF-2的50μL醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5.5)中加入20mM的葡萄糖，然后加入到100μL比色皿中，用封口膜密封。在25℃的恒定温度下，用荧光仪实时监测(EX:270nm，EM:500nm)复合物的发光强度随时间的变化，反应3500秒后停止。同时将0.3mg GOx@MAF-2的50μL醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5.5)离心后取上清液作为对照组。

结果：检测结果如图7所示，GOx@MAF-2对底物葡萄糖表现出很强的反应，在反应3500秒过程中发光强度逐渐上升；而上清液对葡萄糖无响应，这表明GOx@MAF-2发光强度的增加是由于固定在内部的GOx催化葡萄糖氧化所致，而不是GOx@MAF-2中未除去的游离的GOx作用所致(图7)。

上述结果说明，本发明制备的固定化酶生物传感器Enzyme@MAF-2，以GOx为例，当GOx@MAF-2中的GOx在催化葡萄糖氧化反应并消耗氧气时，溶解氧浓度降低从而导致GOx@MAF-2的发光强度随之增强。根据其发光强度变化，可以实现GOx酶反应动力学实时测定以及直接的葡萄糖检测，而无需额外引入任何其它试剂。

(3)选择性、热稳定性、酶水解稳定性以及重复性检测

在酶活性测试后，离心反应液以除去底物，将回收的Enzyme@MAF-2重新分散在水中用于下一次酶促反应，多次重复该步骤(4次以上)。

方法：

选择性检测：通过分别在300mM乳糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖和20mM葡萄糖溶液中检测氧气消耗来评估GOx@MAF-2的选择性。

热稳定性检测：将GOx@MAF-2和游离酶分别在40℃反应6小时，每隔一段时间检测酶活性。

酶活性检测：在蛋白酶水解的稳定性测试中，GOx@MAF-2和游离酶分别在含有1mgmL^-1胰蛋白酶的PBS(1×PBS，pH 7.4)中37℃温育30分钟后，测试酶活性。

重复性检测：当进行重复使用性测试时，将反应液以9000rpm离心3分钟并洗涤除去葡萄糖。将回收的酶复合物重新分散在水中用于下一次酶促反应。为了测试该复合物的可重复使用性，重复该步骤7次。

结果：如图8显示，GOx@MAF-2具有高选择性(图8-a)、高的酶水解稳定性(蛋白酶水解30分钟后仍具有很好的酶活性，图8-b)、很好的热稳定性(40℃反应6h仍具有很好的酶活性，图8-c)以及可重复使用性(循环使用7次仍具有很好的酶活性，图8-d)。

四、固定化酶生物传感器的实际应用

(1)对不同葡萄糖浓度的响应

配制一系列不同底物浓度的待测溶液，加入一定量的GOx@MAF-2后在荧光仪中进行荧光强度测试，得到底物浓度与荧光强度之间的关系。具体操作如下：在含有0.3mg GOx@MAF-2的50μL醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5.5)中加入不同浓度的葡萄糖，然后加入到100μL比色皿中，用封口膜密封。在25℃的恒定温度下，实时监测复合物的发光强度(EX:270nm，EM:500nm)随时间的变化，采样间隔为1秒，反应3500秒后停止。

检测结果如图9所示，加入葡萄糖后GOx@MAF-2发光强度增加。随着葡萄糖浓度的增加，溶解氧的消耗速度加快，光强上升速度也随之变快。

(2)实际样品中底物水平的分析

检测人血清中葡萄糖浓度：在50μL人血清样品中加入0.3mg GOx@MAF-2，通过标准曲线法测量血清中葡萄糖的含量。

测定结果如表1所示，用GOx@MAF-2测得的结果与医院的血糖仪检测结果非常吻合，验证了所构建的葡萄糖传感器在实际临床样品中具有潜在的应用价值。

表1 GOx@MAF-2葡萄糖传感器的检测性能

上述本发明固定化酶载体的一体化生物传感器，不仅限于GOx，其他能够生成氧气或消耗氧气的酶也可以用此方法进行固定化和一体式传感，甚至可以根据MOF的其他性能(如电催化、化学催化、导电性等)对其他类型的酶进行固定化从而应用到各种类型的传感器中。因此，这种一体化生物传感器的概念将会在生物、工业分析用途中有着广泛的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种固定化酶生物传感器的制备方法，其特征在于，将酶、含亚铜离子的化合物与3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑在溶剂中溶解，且一同在无氧条件下搅拌反应，取反应产物中的固体，洗涤冻干，即得固定化酶生物传感器；所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶、含亚铜离子的化合物与3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑的用量比为10～100 mg：0.01～1 mmol：0.4～40 mmol。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含亚铜离子的化合物包括纳米颗粒的Cu₂O。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，无氧条件下搅拌反应体系中还含有水合肼或/和抗坏血酸。

5.3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)、或者3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑和亚铜离子在制备权利要求1～4中任一项所述的固定化酶生物传感器中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酶为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-α-羟基酸氧化酶、过氧化物酶以及这些酶带有荧光标记的形式。

7.一种固定化酶生物传感器，其特征在于，其含有3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)和酶，其中酶被固定在3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑铜(I)的框架内；所述酶为催化反应过程中生成氧气或消耗氧气的酶。

8.权利要求1～4任一项所述方法制备的固定化酶生物传感器。

9.权利要求7或8所述固定化酶生物传感器在检测酶底物中的应用。

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