CN114984241B - 一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料及其制备和应用 - Google Patents

一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料及其制备和应用，该纳米复合材料的制备过程如下：(1)该纳米复合材料的制备过程如下：(1)首先采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒子(CS)；(2)以CS纳米粒子和KMnO4为原料制备CS/MnO2纳米粒子，通过静电吸附作用，在CS/MnO2纳米粒子表面负载葡萄糖氧化酶，最终得到产物CS/MnO2‑GOx(CMGOx)。本发明的复合材料可以对pH的可依赖性降解，降低对生物体的毒副作用，抗菌抗肿瘤效果好，人体安全性高，极具应用前景。

Description

一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料及其制备 和应用
技术领域
本发明属于纳米复合粒子制备技术领域，涉及一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料及其制备和应用。
背景技术
糖尿病是一种代谢性疾病，其特征是由于身体组织的胰岛素抵抗或胰腺不能产生胰岛素而导致高血糖，目前影响着全球大量人群的生活质量和健康。流行病学研究表明，糖尿病患者患癌症的风险更高。手术切除是治疗和控制肿瘤进展的主要方法之一。例如，皮肤癌是最常见的恶性肿瘤之一，其主要治疗方法是进行手术。然而，必须去除皮肤肿瘤细胞周围的大部分正常皮肤组织以防止复发，从而导致大面积皮肤缺损、随后的感染和伤口愈合慢。由于糖尿病人血糖浓度较高，组织内含糖量也随之增加，宜于细菌繁殖；而且由于高血糖抑制白细胞的吞噬能力，机体抗感染能力下降；再由于患者不合理应用抗生素，致使细菌对药物的敏感性下降。因此，在手术切除肿瘤后实现肿瘤治疗和抗感染已成为一项重大挑战。如今，传统药物的广泛使用，使得细菌对药物产生耐药性。由于特定的肿瘤微环境，耐药性肿瘤细胞也是一个问题。现在有必要开发一种新的治疗方法，可以替代传统治疗方法，通过纳米药物实现抗肿瘤和抗菌的结合。
酶作为传统的、高度特异性的抗肿瘤和抗菌剂在抗肿瘤和抗菌研究中得到了很好的证实。酶通过底物氧化产生H2O2来实现抗肿瘤和抗菌作用，H2O2可以干扰细胞增殖，降解细菌细胞壁。葡萄糖氧化酶(GOx)是一种需氧脱氢酶，已开发通过消耗葡萄糖用于肿瘤饥饿治疗(ST)。GOx可以与葡萄糖发生特异性反应，生成葡萄糖酸和H2O2。产生的H2O2可用于糖尿病患者的抗肿瘤和控制感染。凭借通过消耗癌细胞和细菌生长所需的O2和葡萄糖产生H2O2的优势，GOx已被广泛用作食品加工中的抗菌剂和肿瘤的抗癌剂。然而，H2O2的氧化能力太弱，无法达到令人满意的抗癌和抗菌作用。
因此，设计多功能纳米材料以提供优异抗癌、抗菌和组织修复效果是非常必要的。然而，这种纳米复合材料没有得到很好的报道，仍然是一个挑战。尤其是糖尿病患者肿瘤手术治疗后创面愈合存在严重问题，需要一种适应高血糖的特定纳米材料才能达到综合效果。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料及其制备和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一提供了一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料，其由壳聚糖纳米微球，以及负载在壳聚糖纳米微球外表面的二氧化锰和葡萄糖氧化酶(即GOx)组成。
进一步的，该复合材料的平均粒径为100-180nm。
本发明的技术方案之二提供了一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备壳聚糖纳米粒子；
(2)以壳聚糖纳米粒子和KMnO4为原料制备CS/MnO2纳米粒子，在CS/MnO2纳米粒子表面负载葡萄糖氧化酶，得到CS/MnO2-GOx NCs，即为目标产物。
进一步的，壳聚糖纳米粒子的制备过程具体为：
将NaOH溶液加入壳聚糖的乙酸溶液中，调节pH至4～5并加热反应，再按照一定比例加入三聚磷酸钠溶液(即TPP溶液)，搅拌，待颜色变为乳白色后，离心，水洗，即得到壳聚糖纳米粒子。此处，NaOH溶液的作用即为了调整溶液pH值。优选的，NaOH溶液浓度为25wt％，TPP浓度为0.5mg/mL。
更进一步的，CS与TPP的质量比为(5-15)mg:(1-2)mg，以溶液体积添加量计，一般设置壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液的添加量体积比为10：3。
更进一步的，加热反应的温度为50～70℃，优选为60℃，时间为5～15min，优选为10min。
进一步的，制备CS/MnO2-GOx NCs的过程具体为：
将KMnO4溶液滴加入壳聚糖纳米粒子中，搅拌，再加入聚丙烯胺盐酸盐，混合，离心洗涤后，得到CS/MnO2纳米粒子，再溶解在去离子水中，加入葡萄糖氧化酶，摇匀，离心，即得到CS/MnO2-GOx NCs。
更进一步的，KMnO4、壳聚糖纳米粒子、聚丙烯胺盐酸盐(PAH)、葡萄糖氧化酶的质量比为(1-2)：5：(0.3-0.4)：(2-4)。
更进一步的，摇匀的时间为4-8h。
本发明首先采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒子(CS)，然后以CS纳米粒子和KMnO4为原料制备CS/MnO2纳米粒子，通过静电吸附作用，在CS/MnO2纳米粒子表面负载葡萄糖氧化酶，最终得到产物CS/MnO2/GOx。本发明的复合材料中的壳聚糖作为天然生物高分子，可生物降解，且降解产物无毒无害，生物相容性好，具有优异的抗菌作用；GOx作为起始酶催化剂可以持续将无毒的葡萄糖转化为葡萄糖酸和H2O2，葡萄糖酸使整个体系的pH降低，活化了MnO2的过氧化物酶活性。随后，MnO2将生成的H2O2催化成高毒性的·OH，最终联合效应导致细菌和肿瘤细胞死亡，在生物医学领域有广阔的临床应用前景。在治疗后，材料的降解性可降低材料对生物体的毒副作用。
本发明的技术方案之三提供了一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的应用，该复合材料用于制备抗菌或抗肿瘤试剂。
本发明的复合材料中的壳聚糖作为天然生物高分子，可生物降解，且降解产物无毒无害，生物相容性好，具有优异的抗菌作用；GOx作为起始酶催化剂可以持续将无毒的葡萄糖转化为葡萄糖酸和H2O2，葡萄糖酸使整个体系的pH降低，活化了MnO2的过氧化物酶活性。随后，MnO2将生成的H2O2催化成高毒性的·OH，最终联合效应导致细菌和肿瘤细胞死亡，在生物医学领域有广阔的临床应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的合成制备方法较为简单，合成的CS/MnO2-GOx纳米复合材料形貌均一且粒径较小。
(2)本发明的方法制备得到的CS/MnO2-GOx纳米复合材料可以实现饥饿治疗和化学动力学双重抗菌抗肿瘤效果。
(3)本发明的方法制备得到的CS/MnO2-GOx纳米复合材料可以对pH的可依赖性降解，降低对生物体的毒副作用，抗菌抗肿瘤效果好，人体安全性高，极具应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中的CS/MnO2纳米复合粒子的透射电镜图；
图2为本发明实施例1中的CS/MnO2纳米复合材料的元素映射图；
图3为本发明实施例1中的CS/MnO2-GOx纳米复合材料的粒径分布图；
图4为本发明实施例1中的CS/MnO2-GOx纳米复合材料在不同pH生成的ROS图；
图5为本发明实施例1中的CS/MnO2-GOx纳米复合材料的降解实验图。
图6为本发明实施例1中的CS/MnO2-GOx纳米复合材料的抗菌效果图；
图7为本发明实施例1中的CS/MnO2-GOx纳米复合材料的抗肿瘤效果图；
图8为不同实验组的肿瘤抑制效果图；
图9为实施例8的复合粒子的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
实施例1：
一种多功能CS/MnO2-GOx NCs纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.25g CS(壳聚糖)溶解在500mL乙酸溶液(0.5mM)中，搅拌过夜。然后将NaOH溶液(20wt％)添加到CS溶液中，直到pH值达到4.7，并加热到60℃持续10分钟。将3mL TPP储备液(0.5mg/mL)滴加到10mL CS溶液中，搅拌60分钟。当颜色变成乳白色时，将产物离心并用水洗涤三遍。
(2)逐滴搅拌加入1mL KMnO4溶液(1mg/mL)，其中含有溶解在10mL水中的5mg CSNP。3分钟后，将300μL PAH(1mg/mL)混合到系统中。离心洗涤得到CS/MnO2。将CS/MnO2 NPs溶解在10mL去离子水中，然后添加2mg GOX，振摇6小时。CS/MnO2-GOx NCs可以通过离心获得。
实施例2：
CS/MnO2-GOx复合纳米材料产生ROS性能测试：取实施例1中得到的CS/MnO2-GOx复合纳米材料分散在PBS7.4或6.5中，然后分别加入0mM或50mM葡萄糖、以及4mL MB溶液(5μgmL-1)。用紫外分光光度计在不同时间测量每组在660nm的吸光度。
实施例3：
CS/MnO2-GOx复合纳米材料降解实验：将实施例1制得的CS/MnO2-GOx纳米复合材料均等的分成两份，分别溶在pH 6.5和7.4的PBS溶液中。在搅拌的情况下，分别在预设的时间离心收集上清液用于ICP测定锰的浓度。离心后的产物继续加入相同量的对应的PBS溶液，继续搅拌，重复该操作步骤。
实施例4：
抗菌实验测试：将(1)PBS，(2)葡萄糖，(3)葡萄糖+CS，(4)葡萄糖+CM，(5)CMGOx，和(6)葡萄糖+GOx，(7)葡萄糖+CMGOx与细菌悬浮液共孵育。5h后，将细菌悬浮液用LB培养基分别稀释10000倍。随后将100uL稀释后的细菌悬浮液通过旋涂扩散的方法涂在固体培养基上，孵育12h后记录菌落个数对于细菌形貌的测定。(此处的CMGOx即实施例1制备的CS/MnO2-GOx复合纳米材料，CM即为实施例1中制备的CS/MnO2)
实施例5：
抗肿瘤实验：裸鼠分为四组，对照组(第1组)、CS(第2组)、CM(第3组)、CMGOx(第4组)，其中黑色素瘤细胞被皮下移植(n＝3)。当肿瘤长到大约4毫米时开始治疗。每组小鼠通过尾静脉注射20mg/kg的剂量。测量小鼠的体重和肿瘤体积以评估治疗效果。相对肿瘤体积计数为Vr＝V/V0×100％(V0：第一天肿瘤体积)。(此处的CMGOx即实施例1制备的CS/MnO2-GOx复合纳米材料，CM即为实施例1中制备的CS/MnO2)
对上述实施例合成的最终产物进行表征，如图1-7所示：
由图1的透射电镜和图2的mapping可知，成功合成CS/MnO2纳米材料，且分散性较好。
由图3的粒径图可知，CS/MnO2的粒径大小均一且粒径大约为100-180nm左右。
由图4可以看出，CS/MnO2-GOx纳米复合材料比较于pH 7.4，在pH为6.5的PBS缓冲溶液里ROS产生的较多，且在高糖下生成的ROS最多，侧面说明该纳米复合材料在高糖和酸性条件下能有效生成大量的ROS以此消灭细菌和肿瘤细胞。
由图5可以看出，相比较于pH 7.4，纳米复合材料CS/MnO2-GOx在pH为6.5的PBS缓冲溶液里锰释放的较多，且随着时间的加长，锰释放的越来越多。侧面说明该纳米复合材料在酸性条件下降解且降解的速度比中性条件下快。
由图6可以看出，葡萄糖组(2)的细菌存活率高于比对照组(1)，证明了在高糖情况下有利于细菌的生长。葡萄糖+CS(3)，葡萄糖+CM(4)与(5)CMGOx组有一定的细菌存活率的降低，证明了壳聚糖的抗菌性能。在单纯葡萄糖氧化酶(6)的存在下，生成的H2O2同样存在抗菌能力。与组(1)—(6)相比，葡萄糖+CMGOx(7)具有显著的抗菌性能，证明了最终材料的可行性。
由图7和图8可以看出，在14天的治疗期间，对照组和所有治疗组的小鼠体重没有明显变化(图7)，表明治疗期间注射CMGOx NCs没有引起明显的毒性。在肿瘤抑制评估中，CMGOx组表现出令人满意的抑制效果(图8)。对每组小鼠的肿瘤进行了比较，这为CMGOx注射后可有效抑制肿瘤生长提供了直观的证据。
实施例6：
一种多功能CS/MnO2-GOx纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.25g CS溶解在500mL乙酸溶液(0.5mM)中，搅拌过夜。然后将NaOH溶液(20wt％)添加到CS溶液中，直到pH值达到4.7，并加热到60℃持续15分钟。将3mL TPP储备液(0.5mg/mL)滴加到10mL CS溶液中，搅拌60分钟。当颜色变成乳白色时，将产物离心并用水洗涤三遍。
(2)逐滴搅拌加入1mL KMnO4溶液(1mg/mL)，其中含有溶解在10mL水中的5mg CSNP。3分钟后，将350μL PAH(1mg/mL)混合到系统中。离心洗涤得到CS/MnO2。将CS/MnO2 NPs溶解在10mL去离子水中，然后添加3mg GOx，振摇6小时。CS/MnO2-GOx NCs可以通过离心获得。
实施例7：
一种多功能CS/MnO2-GOx纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.25g CS溶解在500mL乙酸溶液(0.5mM)中，搅拌过夜。然后将NaOH溶液(20wt％)添加到CS溶液中，直到pH值达到4.7，并加热到60℃持续10分钟。将3mL TPP储备液(0.5mg/mL)滴加到10mL CS溶液中，搅拌60分钟。当颜色变成乳白色时，将产物离心并用水洗涤三遍。
(2)逐滴搅拌加入1mL KMnO4溶液(1mg/mL)，其中含有溶解在10mL水中的5mg CSNP。3分钟后，将300μL PAH(1mg/mL)混合到系统中。离心洗涤得到CS/MnO2。将CS/MnO2 NPs溶解在10mL去离子水中，然后添加3mg GOX，振摇6小时。CS/MnO2-GOx NCs可以通过离心获得。
实施例8：
一种多功能CS/MnO2-GOx纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.25g CS溶解在500mL乙酸溶液(0.5mM)中，搅拌过夜。然后将NaOH溶液(20wt％)添加到CS溶液中，直到pH值达到4.7，并加热到60℃持续10分钟。将3mL TPP储备液(0.5mg/mL)滴加到10mL CS溶液中，搅拌60分钟。当颜色变成乳白色时，将产物离心并用水洗涤三遍。
(2)逐滴搅拌加入1.1mL KMnO4溶液(1mg/mL)，其中含有溶解在10mL水中的5mg CSNP。3分钟后，将300μL PAH(1mg/mL)混合到系统中。离心洗涤得到CS/MnO2。将CS/MnO2 NPs溶解在10mL去离子水中，然后添加3mg GOX，振摇6小时。CS/MnO2-GOx NCs可以通过离心获得。
说明：当PAH过量，则会导致材料的形貌发生变化，即材料破碎，不成形等(图9)。
实施例9：
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整TPP储备液的添加量，使得：壳聚糖与三聚磷酸钠的添加量比为5mg：1mg。
实施例10：
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整TPP储备液的添加量，使得：壳聚糖与三聚磷酸钠的添加量比为15mg：2mg。
实施例11：
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了维持壳聚糖纳米粒子量不变，并调整其它组分，使得KMnO4、壳聚糖纳米粒子、聚丙烯胺盐酸盐、葡萄糖氧化酶的质量比为1：5：0.3：2。
实施例12：
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了维持壳聚糖纳米粒子量不变，并调整其它组分，使得KMnO4、壳聚糖纳米粒子、聚丙烯胺盐酸盐、葡萄糖氧化酶的质量比为2：5：0.4：4。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料，其特征在于，其由壳聚糖纳米微球，以及负载在壳聚糖纳米微球外表面的二氧化锰和葡萄糖氧化酶组成；
该复合材料采用以下方法制备得到：
（1）制备壳聚糖纳米粒子；
（2）以壳聚糖纳米粒子和KMnO4为原料制备CS/MnO2纳米粒子，在CS/MnO2纳米粒子表面负载葡萄糖氧化酶，得到CS/MnO2-GOx NCs，即为目标产物；
壳聚糖纳米粒子的制备过程具体为：
将NaOH溶液加入壳聚糖的乙酸溶液中，调节pH至4~5并加热反应，再加入三聚磷酸钠溶液，搅拌，待颜色变为乳白色后，离心，水洗，即得到壳聚糖纳米粒子；
制备CS/MnO2-GOx NCs的过程具体为：
将KMnO4溶液滴加入壳聚糖纳米粒子中，搅拌，再加入聚丙烯胺盐酸盐，混合，离心洗涤后，得到CS/MnO2纳米粒子，再溶解在去离子水中，加入葡萄糖氧化酶，摇匀，离心，即得到CS/MnO2-GOx NCs；
KMnO4、壳聚糖纳米粒子、聚丙烯胺盐酸盐、葡萄糖氧化酶的质量比为（1-2）：5：（0.3-0.4）：（2-4）。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料，其特征在于，其平均粒径为100-180 nm。
3.如权利要求1或2所述的一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖纳米粒子；
（2）以壳聚糖纳米粒子和KMnO4为原料制备CS/MnO2纳米粒子，在CS/MnO2纳米粒子表面负载葡萄糖氧化酶，得到CS/MnO2-GOx NCs，即为目标产物；
壳聚糖纳米粒子的制备过程具体为：
将NaOH溶液加入壳聚糖的乙酸溶液中，调节pH至4~5并加热反应，再加入三聚磷酸钠溶液，搅拌，待颜色变为乳白色后，离心，水洗，即得到壳聚糖纳米粒子；
制备CS/MnO2-GOx NCs的过程具体为：
将KMnO4溶液滴加入壳聚糖纳米粒子中，搅拌，再加入聚丙烯胺盐酸盐，混合，离心洗涤后，得到CS/MnO2纳米粒子，再溶解在去离子水中，加入葡萄糖氧化酶，摇匀，离心，即得到CS/MnO2-GOx NCs；
KMnO4、壳聚糖纳米粒子、聚丙烯胺盐酸盐、葡萄糖氧化酶的质量比为（1-2）：5：（0.3-0.4）：（2-4）。
4.根据权利要求3所述的一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的制备方法，其特征在于，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为（5~15）：（1-2）。
5.根据权利要求3所述的一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的制备方法，其特征在于，加热反应的温度为50~70℃，时间为5~15min。
6.根据权利要求3所述的一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的制备方法，其特征在于，摇匀的时间为4-8h。
7.如权利要求1或2所述的一种壳聚糖/二氧化锰/葡萄糖氧化酶纳米复合材料的应用，其特征在于，该复合材料用于制备抗菌或抗肿瘤试剂。
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