CN113318272B - 基于纳米酶药物修饰的骨植入材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米酶修饰的骨植入材料及其制备方法和应用，所述基于纳米酶修饰的骨植入材料是将纳米酶或纳米酶的前驱体（可原位制备纳米酶）对骨植入材料进行修饰得到，骨植入材料作为一类高效的骨科治疗方式，其对骨组织代谢平衡的影响和调控作用直接关乎治疗效果。本发明利用纳米酶在特定环境中ROS的消除能力和ALP水解活性，以增强骨植入材料的骨整合能力和抑制骨溶解作用；另外，利用纳米酶的ROS产生能力以及多水解活性抑制细菌粘附或生长，同时破坏细菌生物膜以增强联合抗生素的抗感染作用。通过这种高效互补的设计使得本发明具有多方面治疗特性，可实现治疗、缓解和/或预防骨植入材料相关的骨代谢失衡疾病。

Description

基于纳米酶药物修饰的骨植入材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于涉及生物医学与材料工程的交叉领域，具体涉及基于纳米酶药物修饰的骨植入材料及其制备方法和应用。
背景技术
骨组织作为人类最重要的器官之一。随着人们生活水平的提高和老龄化的增加，越来越多的骨科疾病困扰却未得到较好的解决。其中通过植入材料来充当或(和)增强骨组织功能的治疗手段已成为高效治疗手段，但是随着植入群体的年轻化、患者运动量增加化、以及骨质疏松群体比例的上升化，同时也面临植入物感染的极大风险，造成术后愈合不理想或者翻修的问题依旧存在。
骨组织通过成骨作用和破骨作用的动态调节维持代谢平衡(即，骨代谢平衡)。成骨细胞通过成骨作用构建羟基磷灰石和相应有机质；破骨细胞则通过形成特有细胞形态分泌氢离子(H+)和溶解酶，吸收羟基磷灰石和相关组织，所以一个健康、稳态的骨代谢作用至关重要。健康的骨代谢平衡作用受多种机制的共同调节，如相关酶(碱性磷酸酶、抗氧化酶、组织蛋白酶K等)、小分子以及金属离子等。当疾病和/或外力损伤对骨代谢平衡产生影响时，通常通过自身调节作用即可恢复而达到新的平衡状态。如果受到并发症和/或微环境(植入物炎症爆发或细菌感染)的干扰，骨代谢平衡无法恢复甚至失衡作用被扩大，最终将造成严重的临床问题，因此调控骨代谢平衡对治疗骨组织相关疾病尤为重要。
从上述骨代谢失衡疾病的主要致病原因考虑，可将其可分为两大类：细菌感染型和非细菌感染型。
首先，骨植入物感染引起的内固定失败会导致骨科翻修手术量的增加，虽然目前临床通过抗生素药物进行治疗，但由于骨科植入物表面容易产生细菌荚膜(生物膜)，致密生物膜抑制药物的递送作用导致杀伤细菌效果降低，所以开发具有减少和/或抑制细菌黏附以及生物膜生成的新型骨植入材料意义明显。研究表明一定量的ROS(reactive oxygenspecies)可以杀死细菌或抗菌，所以当植入物表面被细菌感染时，具有促进ROS产生的植入物可以起到一定抗菌作用。另外，植入材料表面细菌生物膜的产生已成为植入手术失败的重要诱因，如何减少生物膜的生长和/或主动破坏生物膜结构以增加药物的递送成为治疗骨植入感染的重要方法。综上，同时具有在细菌感染时产生ROS以及抑制细菌黏附和/生物膜生成或对生物膜进行破坏的植入材料，将成为治疗由细菌感染所导致的相关骨植入失败的新策略。
其次，全球每年有超过200万患者进行关节置换治疗，其中10-15％的患者在术后10-20年内需要进行翻修，而48％的翻修病例是由于假体非菌性松动造成。非菌性松动是由于植入物磨损颗粒释放，激活单核巨噬细胞(bone marrow macrophages，BMMs)系统，从而启动特定的炎症级联反应，通过过度活化破骨细胞导致骨溶解。因此，现阶段解决骨溶解最常见的策略是提高材料耐磨性以减少磨损颗粒的产生。然而，尽管临床关节材料已有较好的抗疲劳性能和耐磨性，但随着关节置换群体的年轻化、患者运动量增加化、以及骨质疏松群体比例上升，需要进一步提高假体的使用寿命。
目前治疗非菌性松动有两方面的策略：一方面，减少假体磨损颗粒的产生和抑制巨噬细胞与磨损颗粒的过激炎症反应。尽管减少磨损颗粒可直接减缓骨溶解现象，但磨损颗粒产生的原因具有复杂性和不确定性，所以抑制磨损颗粒对巨噬细胞的激活和破骨细胞分化被视为一种更为有效的策略。磨损颗粒造成骨溶解分为两个阶段：首先，长时间接触或吞噬异物的巨噬细胞会明显上调ROS表达水平，最终增强宿主炎症反应；其次，过量的ROS会进一步促进骨髓单核巨噬细胞分化为破骨细胞并造成骨溶解。另一方面，骨溶解作为一种局部病变，虽然双磷酸盐药物可通过抑制破骨细胞吸收羟基磷灰石的功能从而抑制骨溶解，但由于其对骨组织的过强吸附作用，会增加骨组织的脆性，且全身性副作用明显，不利于术后患者的长期服用。此外，借鉴骨代谢平衡机制，上调假体周围磷酸根离子浓度，促进羟基磷灰石的沉积以增强成骨作用，也被视为解决非菌性松动的有效方法之一。
研究表明，患者假体置换术后可一定程度上通过自身的抗氧化应激系统(抗氧化剂和抗氧化酶等)调节由于过多ROS引起的炎性刺激，抑制骨溶解的产生。其中，维生素C、谷胱甘肽和抗氧化剂等通过发挥还原剂的作用清除ROS。另外，天然酶虽可通过非化学计量依赖的形式高效催化清除ROS，但其单一的酶活性以及不稳定性限制了同时对多种ROS的消除。与此同时，体内碱性磷酸酶可以提高假体周围的磷酸根离子浓度，增强羟基磷灰石的沉积，但关节置换患者大多伴随自身成骨作用不足的现象，借助药物辅助术后治疗成为必需手段。
受机体自身骨代谢平衡调节作用的启发。一方面，可产生ROS的天然酶以及可水解生物膜分子结构的酶类(蛋白质水解酶、糖类分子水解酶以及DNA水解酶等)可以减弱细菌感染的致病性；另一方面，参与成骨和破骨过程的生物酶(抗氧化酶、碱性磷酸酶等)可以对成骨过程和破骨过程进行调节。基于纳米酶的高稳定和多类酶活性，一方面，可实现特定环境产生ROS以抑制植入材料表面的细菌存活，同时利用纳米酶的多水解酶活性主动抑制和/或破坏生物膜的结构协同增强药物治疗效果；另一方面，纳米酶可以消除过量ROS以抑制骨溶解、并表现碱性磷酸酶水解活性提高磷酸根浓度以促进成骨作用，最终实现缓解非菌性松动的作用。据报道，许多纳米酶具有清除ROS和/或磷酸酯键水解能力，例如C60、Mn3O4、Au、Ce-MOF、Zr-MOF、普鲁士蓝和氧化铈基纳米酶等(部分兼具两类甚至多类酶活性)，选用纳米酶利用其一种或多种纳米酶活性，如类HRP、SOD、CAT活性和碱性磷酸酶水解等活性，以及良好的生物相容性等特点，结合植入物对骨植入材料的骨代谢失衡疾病进行治疗、缓解和/或预防是一种具备临床应用前景的骨科疾病治疗思路，但要制备出满足临床要求的纳米酶修饰修饰的骨植入材料难度巨大。
现阶段骨植入材料，面临困境大概有三点：
第一、现有骨植入材料大多不具备主动促进骨整合的作用，基于大部分患者都是骨量生成不足的老年人，所以主动促进成骨很重要。
第二、现有骨植入材料，如钛合金、骨水泥以及聚乙烯等，长时间服役之后会产生磨损颗粒，而这些磨损颗粒会增强局部炎症以及ROS，最终造成骨溶解并带来非菌性松动。而现有方法为增加材料的耐磨性减少颗粒产生，但没有或很少有可减弱炎症刺激和主动消除ROS的材料。
第三、关节置换和骨科植入材料表面为易于细菌生长和生物膜的形成的环境，另外，材料植入部位为供血不足环境，极大地限制了药物的递送，而致密生物膜的阻挡阻碍了抗菌药物的穿透，造成低浓度药物无法起到有效的杀菌效果，这也是现阶段骨植入材料感染后难修复的重要原因。另外，抗生素的大量使用本身存在极大的副作用。
现阶段骨植入材料的研究现状概述(主要实例)：
第一、如钛合金材料表面的羟基磷灰石处理，虽可增强骨整合能力，但其不具备主动消炎的作用，另外无法防御长时间植入所带来的骨溶解问题。
第二、关于聚乙烯磨损颗粒产生问题，增加聚乙烯分子量、对聚乙烯进行交联处理和向聚乙烯中添加维生素E制备的骨植入材料为当下临床主要产品。增加聚乙烯分子量和对聚乙烯进行交联处理可增强其力学性能和耐磨性，但没有降低磨损颗粒本身的炎症诱导作用。而维生素E作为一种还原剂，其通过抗氧化的方式保护聚乙烯，但作为消耗类分子，骨植入材料长时间的植入(10-15年)，会存在保护能力下降的问题。
第三、对于骨植入材料感染，直接使用抗生素或者使用负载抗生素的骨水泥等成为现阶段主要临床治疗方法，但药物释放难以控制，长时间的使用副作用明显。
为了解决现阶段骨植入材料的不足，理想新型骨植入材料的设计要求如下：(1)纳米酶药物通过非化学剂量比的形式，利用类酶催化作用进行调控和治疗，极大减轻多次、大剂量的药物摄取，以及过多药物副作用的影响，同时可减轻患者经济负担；(2)所用治疗药物应减少或者放弃抗生素、抗体等价格昂贵且副作用明显的药物；(3)纳米酶修饰的骨植入材料，其作用方式为纳米酶对微环境的调节作用，从而对局部进行治疗并避免常规用药的全身毒性；(4)充分利用骨组织和植入材料的特殊环境，利用这种骨组织系统与体内循化系统的区别，增强纳米酶的安全性；(5)可同时实现促骨整合、抑制骨溶解以及可增强抗菌作用的产品设计。
纳米酶修饰骨植入材料现阶段的难点：(1)需要制备水解活性和ROS消除活性同时增强的纳米酶，并探寻将纳米酶固定修饰在骨植入材料表面或均匀分散其中的方法；(2)现阶段没有发现有制备出纳米酶修饰的聚乙烯和骨水泥骨植入材料，可预防骨溶解所带来的的非菌性松动；(3)现阶段还没有纳米酶修饰的骨植入材料，利用纳米酶水解生物膜作用，增强抗生素的抗菌作用的骨植入材料。
所以，针对临床现实状况，充分考虑骨植入材料的特殊性以及对新型治疗手段需求的满足，急需一类用于治疗、缓解和/或预防骨植入材料相关的骨代谢失衡疾病的药物、植入体以及方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，本发明首先提出通过调控磨损颗粒的物理化学性质，减弱其对巨噬细胞的刺激以降低ROS产生并清除微环境中过量的ROS；同时，实现对局部磷酸根浓度的原位上调以增强羟基磷灰石的沉积，这种协同治疗通过减弱破骨细胞吸收作用和提高成骨作用，将会成为治疗非菌性松动的理想方法。因此，本发明首次提出利用纳米酶修饰骨植入材料，在维持该植入材料本身力学性能不变的情况下，利用纳米酶的多种类酶活性(ROS的产生活性、ROS的消除活性、类碱性磷酸酶活性以及水解活性)，对骨植入材料局部微环境进行调控实现相关疾病的治疗、缓解和/或预防。基于纳米酶本身的性能特性和特定的修饰方式，纳米酶长入的骨植入材料中不存在扩散的问题，同时由于骨组织系统循环的特殊性，颗粒磨损会长时间滞留在骨组织中，保证了安全性。另外，纳米酶的作用是类酶催化，不同于传统的药物，纳米酶修饰的骨植入材料只是在局部发挥作用且具有持久性。本发明的纳米酶修饰骨植入材料，避免了纳米酶的扩散问题，以及随之而来的纳米毒性问题。
对于植入骨材料的患者，患处的骨代谢失衡是其翻修的根本原因，不论是细菌感染还是其它病变，临床常表现为骨整合能力的不足和过度骨溶解作用。一方面，利用纳米酶修饰的骨植入材料的ROS产生能力以及对生物膜有机质的水解能力，可实现对植入物的细菌感染以及生物膜产生一定的抑制和破坏作用；另外，纳米酶修饰的骨植入物具有类碱性磷酸酶活性和ROS消除作用，可分别对植入材料周围的成骨作用和破骨作用进行调控，最终实现局部骨整合能力增强和骨溶解减弱使得骨植入材料具有更好的疗效。因此，本发明还提供了基于纳米酶修饰的骨植入材料在治疗、缓解和/或预防由骨代谢失衡所引起的相关疾病中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了多种基于纳米酶修饰的骨植入材料，所述基于纳米酶修饰的骨植入材料是将纳米酶或纳米酶的前驱体(可原位制备纳米酶)对骨植入材料进行修饰得到，所述纳米酶的前驱体为无机金属盐、有机金属盐、贵金属前驱体或MOF有机配体中的一种或几种，所述骨植入材料包含金属材料或其合金、高分子材料、无机陶瓷材料中的一种或几种，所述修饰方法为碱活化处理、阳极氧化处理、磁控溅射处理、原位合成处理、纳米酶物理共混处理、电化学沉积处理、纳米酶与材料共混烧结处理、纳米酶与材料共混热压处理的一种或多种。
其中，所述纳米酶包括但不仅限于氧化物纳米酶、贵金属纳米酶、MOF基纳米酶或碳基纳米酶，所述氧化物纳米酶包括氧化铈基纳米酶、氧化锰基纳米酶、氧化铜基纳米酶、氧化铁基纳米酶、氧化镍基纳米酶、氧化钴基纳米酶、氧化锆基纳米酶、氧化铪基纳米酶的一种或几种；所述贵金属纳米酶药物包括金纳米酶、铜纳米酶、银纳米酶、铂纳米酶、钯纳米酶、铑纳米酶、钌纳米酶或合金纳米酶中的一种或几种；所述MOF基纳米酶药物包括铁基MOF纳米酶、锌基MOF纳米酶、铜基MOF纳米酶、锆基MOF纳米酶、铪基MOF纳米酶、钒基MOF纳米酶、金属掺杂的MOF米酶、碳基纳米酶的一种或几种。
其中，所述无机金属盐包括但不仅限于铈离子、锰离子、锆离子、铁离子、镍离子、铜离子或者铪离子中的一种或多种的组合；优选地，所述纳米酶无机前驱体为硝酸铈、氯化锰、硝酸氧锆、硝酸锰、氯化铁、硝酸铁、氯化镍、硝酸镍、氯化铜、硝酸铜、氯化铪或者氯化锆中的一种或更多种的组合；优选地，所述铈盐为硝酸铈。
其中，所述有机金属盐包括但不仅限于铈离子、锰离子、锆离子、铁离子、镍离子、铜离子、铪离子或者钴离子中的一种或更多种的组合；优选地，所述纳米酶有机前驱体为乙酰丙酮铈、乙酰丙酮锰、乙酰丙酮锆、乙酰丙酮铁、乙酰丙酮镍、乙酰丙酮铜、乙酰丙酮铪或者乙酰丙酮钴中的一种或更多种的组合；优选地，所述铈盐为乙酰丙酮铈。
其中，所述贵金属前驱体包括但不仅限于金离子、银离子、铂离子、钯离子、铑离子一种或多种的组合；优选地，所述贵金属纳米酶前驱体为氯金酸、氯铂酸、硝酸银的一种或多种的组合；优选地，所述贵金属前驱体为氯金酸。
在一个实施方案中，所述纳米酶包括但不限于氧化铈基纳米酶、氧化锰基纳米酶、普鲁士蓝基纳米酶、贵金属及其合金中的一种或多种。
其中，所述的骨植入材料包括但不仅限于金属材料及其合金、高分子材料、无机陶瓷材料，所述金属材料及其合金为钛及其合金、铁及其合金、镁及其合金、锌及其合金、钴及其合金、钽及其合金、铌及其合金的一种或更多种的组合；优选地，所述金属材料及其合金为钛及其合金为钛及其合金；所述高分子材料为不同分子量的聚乙烯、骨水泥、生物可降解高分子一种或更多种；优选地，所述无机陶瓷材料为所氧化锆、氧化铪、氧化钽、氧化铌、碳酸钙和/或羟基磷灰石一种或更多种；优选地，所述无机陶瓷材料为氧化锆；
其中，所述骨植入材料包括但不仅限于钛基材料、不锈钢、聚乙烯、生物可降解高分子、氧化锆基材料、骨水泥中的一种或多种。
本发明内容还包括所述的基于纳米酶药物修饰的骨植入材料的制备方法，所述制备方法为将纳米酶的前驱体对骨植入材料进行修饰获得，所述修饰方法为碱活化处理、阳极氧化处理、磁控溅射处理、原位合成处理、纳米酶物理共混处理、电化学沉积处理、纳米酶与材料共混烧结处理，纳米酶与材料共混热压处理的一种或多种。
在一个实施方案中，所述骨植入材料的预处理包括但不限于阳极氧化、碱活化、电化学修饰、磁控溅射、化学气相沉积、喷涂、热喷涂中的一种或更多种的组合。
在一个实施方案中，所述纳米酶对骨植入材料的修饰包括但不限于原位生长、磁控溅射、化学气相沉积、电化学沉积、热压成型、热喷涂中的一种或更多种。
其中，所述制备方法包括但不仅限于以下方法中的任意一种：
1)将纳米酶的前驱体与反应物质同时加入预处理后的骨植入材料，在材料表面或内部原位形成的固定纳米酶对材料进行修饰即得；
2)使用电沉积法将纳米酶或者纳米酶的前驱体原位形成纳米酶沉积到骨植入材料表面即得。
方法1)，包括以下步骤：
将纳米酶的前驱体与反应物质同时加入预处理后的骨植入材料，在材料表面或内部原位形成固定纳米酶对材料进行修饰；优选地，所述反应物质为碱性物质，所述碱性物质为浓氨水、氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；纳米酶前驱体为硝酸铈、醋酸锰、硝酸氧锆和/或醋酸钴；预处理的基材为碱活化的钛基材料、食人鱼溶液处理的不锈钢、氧化钛纳米管修饰的钛基材料、羟基磷灰石和/或氧化锆。
在一个实施方案中，利用氧化铈纳米酶对经碱活化预处理的钛基材料进行修饰；碱活化处理可用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铯、氢氧化铷和/或碳酸钠溶液中进行；优选地，在氢氧化钠溶液中进行。氢氧化钠溶液的浓度可以为0.1-10摩尔每升，优选3-6摩尔每升，更优选3摩尔每升，反应温度60-120℃，反应时间6-24小时，例如在利用3摩尔每升氢氧化钠溶液80℃反应12小时。
在一个实施方案中，本发明的纳米酶对骨植入材料的修饰方法具体包括以下步骤：
(1)将钛和/或钛基片材经无水乙醇和丙酮超声清洗3次，每次10分钟，以去除材料表面的油脂污染物，干燥备用；
(2)碱活化预处理：将(1)所得基材加入3摩尔每升氢氧化钠溶液80℃反应12小时，随后利用纯水和乙醇分别浸泡超声清洗3次，每次10分钟，干燥备用；
(3)纳米酶前驱体溶液的配制：溶剂优选为乙二醇、丙三醇、水和/或乙醇的一种或更多种；纳米酶前驱体优选为硝酸铈、醋酸锰、硝酸氧锆和/或醋酸钴的一种或更多种；
(4)将(2)所得基材加入步骤(3)纳米酶前驱体溶液中，充分搅拌加大前驱与预处理材料的接触；
(5)将所述碱性物质(如浓氨水)加入步骤(4)所得溶液中反应；
(6)降温并收集产物；
(7)利用(5)中游离的纳米酶溶液对(6)所收集的钛基进行修饰，通过浸泡和/或喷涂法增加纳米酶在钛表面的负载量；
(8)将(7)样品置于马弗炉中退火处理，优选地退火温度可以是200-500℃，最优选的温度为400℃，2小时；
(9)将(8)样品置于水中超声处理，清除表面未固定的纳米酶，优选地超声时间30秒-10分钟，最优选的超声时间为1-3分钟；
(10)将(9)样品先后置于柠檬酸和柠檬酸钠溶液中，对材料表面进行修饰；
方法2)，包括以下步骤：
使用电沉积法将纳米酶前驱体原位形成纳米酶沉积到不锈钢表面，制备纳米酶修饰的不锈钢、钛合金骨植入物，并可用于后期的修饰功能化处理；优选地，所述纳米酶为四氧化三锰纳米酶；纳米酶前驱体为乙酰丙酮铈、乙酰丙酮锰、乙酰丙酮锆和/或乙酰丙酮钴(或者相应的醋酸盐)；高分子材料为聚乙烯(分子量100-500万)、PLGA、PLA、PTMC、和/或骨水泥；氧化物可为氧化锆、氧化铪、氧化钽、氧化铌、碳酸钙和/或羟基磷灰石。
具体地，所述聚乙烯原位氧化铈纳米酶的修饰制备方法可以包含以下步骤：
(1)取氧化铈纳米酶前驱体(例如190.55mg乙酰丙酮铈)溶解于15毫升的无水乙醇中；
(2)取高分子材料(例如1500mg聚乙烯)置于有机溶剂(例如100毫升二甲苯)中，110℃搅拌6小时，得聚乙烯溶解溶液；
(3)将(1)中所得前驱体溶液利用注射泵缓慢滴加到(2)体系中，剧烈搅拌24小时，制备得到氧化铈原位固定的聚乙烯材料；
(4)将(3)所得溶液缓慢滴加到60℃的无水乙醇中，并剧烈搅拌至降为室温，去除混合溶剂，再利用大量60℃无水乙醇多次清洗，重复本步骤操作3次；
(5)将(4)所得固体真空干燥，温度100-150℃；处理6-24小时；
(6)将(5)所得氧化铈原位生长的聚乙烯颗粒用于后期聚乙烯植入材料的加工成型。
本发明还包括所述的基于纳米酶药物修饰的骨植入材料在制备治疗、缓解和/或预防骨代谢失衡疾病的药物或植入体中的应用。
其中，所述骨代谢失衡疾病为细菌感染、骨整合不足、骨溶解、非菌性松动、局部骨质疏松、骨肿瘤、骨肿瘤术后填充、自身免疫疾病和/或炎症。
在一个实施方案中，所述在骨植入材料病灶部位具有骨代谢失衡引起的疾病包括但不限于细菌感染、骨整合不足、骨溶解、非菌性松动、局部骨质疏松、骨肿瘤、骨肿瘤术后填充、自身免疫疾病和/或炎症。
优选地，所述疾病为假体置换术后非菌性松动、假体置换骨整合不足、种植体(牙齿种植)种植失败；优选假体置换术后非菌性松动。
在一个实施方案中，所述疾病在病灶部位还具有过高ROS疾病；优选地，所述疾病为骨质疏松、骨溶解、牙周炎、种植体松动；优选为非菌性松动。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下显著优点：
1、减少用药量和药物种类：本发明通过纳米酶对骨植入材料进行修饰，一方面，利用纳米酶的类酶催化活性调控骨组织的代谢平衡，最终起到相关治疗作用。例如纳米酶修饰的骨植入材料具有减少细菌黏附和/或水解生物膜的作用，可以提高抗生素的治疗效果；另一方面，纳米酶的多类酶活性可以同时进行多途径的调控，即可实现多种药物的治疗效果。这种不用药或少用药的辅助治疗方式可实现对疾病，如关节置换修复的长期调控，减少传统治疗中长期、大剂量用药所带来的的并发症和经济负担。
2、使用安全，满足临床需要：纳米酶与已临床化的植入材料或药物组合使用，例如钛及钛合金以作为一种成熟的关节置换材料被广泛使用，具有较高的安全性。更重要的是，本发明利将纳米酶修饰于其表面，在赋予钛基材料纳米酶活性同时，稳定的纳米酶和骨组织的独特结构可避免纳米粒被吸收的风险，减少纳米毒性，为纳米酶材料的生物医用提供了安全保障。
3、高效的多类酶活性：
(1)高效的ROS产生或消除能力：由于纳米酶产生ROS和消除ROS作用的类酶活性具有可调性以及pH依赖性(微环境依赖性)，在细菌感染区域由于微环境呈现弱酸性，此时纳米酶会表现出具有ROS产生作用性质。另外，与传统抗氧化药物分子不同，抗氧化剂作为一种高消耗性的药物分子消除ROS，所维持ROS消除能力的前提是足够的摄取。本发明中所用的ROS消除纳米酶，是一类具有SOD和CAT类活性以及清除羟自由基的酶模拟物，这种类酶催化作用使纳米酶通过消除ROS治疗骨组织炎症相关疾病，作用高效且副作用低。
(2)高效的类碱性磷酸酶活性：与传统促骨整药物不同，纳米酶通过模拟体内成骨过程中促进磷酸根产生的碱性磷酸酶的作用，高效调控植入材料周围的磷酸根浓度，增强羟基磷灰石的沉积能力提高局部的骨整合能力，疗效好且副作用低。
(3)纳米酶多类酶水解活性：与传统的抗生素药物不同，纳米酶的多类酶水解作用可以水解并破坏细菌生物膜的结构，对细菌的生长造成抑制，同时生物膜的破坏可以促进抗生素的递送和药效，提高骨植入材料的抗菌作用，减少抗生素的服用，避免副作用。
4、制备工艺简单、原料等成本低，便于工业化生产和临床转化。
附图说明
图1为本发明纳米酶修饰的骨植入材料用于治疗、缓解和/或预防骨代谢失衡疾病的示意图；
图2本发明实施例1的不同温度合成氧化铈纳米酶的透射电镜照片；
图3本发明实施例1的不同温度合成氧化铈纳米酶的XRD结果；
图4本发明实施例1不同温度合成氧化铈纳米酶的类ALP活性结果；
图5本发明实施例1中60℃反应温度制备的氧化铈纳米酶和实施例2负载锆掺杂氧化铈纳米酶的透射电镜照片；
图6本发明实施例1中60℃反应温度制备的氧化铈纳米酶和实施例2负载锆掺杂氧化铈纳米酶的粒径大小；
图7本发明实施例1中60℃反应温度制备的氧化铈纳米酶和实施例2负载锆掺杂氧化铈纳米酶的X射线衍射(XRD)结果；
图8本发明实施例1中60℃反应温度制备的氧化铈纳米酶和实施例2负载锆掺杂氧化铈纳米酶的超氧自由基(·O2 -)消除结果(类SOD活性)；
图9本发明实施例1中60℃反应温度制备的氧化铈纳米酶和实施例2负载锆掺杂氧化铈纳米酶的类碱性磷酸酶活性结果(类ALP活性)；
图10本发明实施例2钛表面阳极氧化氧化钛纳米管修饰的扫描电镜照片；
图11本发明实施例2钛表面氧化钛纳米管修饰锆掺杂氧化铈纳米酶的扫描电镜照片；
图12本发明实施例2锆掺杂氧化铈纳米酶修饰的钛棒的骨植入实验结果；
图13本发明实施例2锆掺杂氧化铈纳米酶的破骨细胞分化抑制结果；
图14本发明实施例2锆掺杂氧化铈纳米酶修饰的钛颗粒的骨溶解实验结果；
图15本发明实施例3氧化铈原位修饰的聚乙烯的透射电镜照片；
图16本发明实施例3氧化铈原位修饰的聚乙烯的XRD结果；
图17本发明实施例4Ce-MOF纳米酶的透射电镜照片；
图18本发明实施例4Ce-MOF纳米酶体外对细菌生物膜的水解扫描电镜照片；
图19本发明实施例5钛表面碱活化预处理的扫描电镜照片；
图20本发明实施例6的油胺/油酸调控合成的氧化铈纳米酶的XRD结果；
图21本发明实施例6的油胺/油酸调控合成的氧化铈纳米酶的透射电镜照片；
图22本发明实施例7铪掺杂的氧化铈纳米酶的透射电镜照片；
图23本发明实施例7铪掺杂的氧化铈纳米酶的XRD结果。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1钛表面碱活化预处理负载氧化铈纳米酶的骨植入材料的制备
钛表面碱活化预处理负载氧化铈纳米酶的骨植入材料按照以下方法制备：
(1)钛表面碱活化预处：
①取纯钛片或钛丝，利用无水乙醇、丙酮以及纯水超声清洗3次，每次10分钟，晾干备用；
②将①中钛片或钛丝，利用3摩尔每升的氢氧化钠溶液，80摄氏度处理12小时后，使用无水乙醇、水浸泡超声清洗3次，每次10分钟，晾干备用；
(2)氧化铈纳米酶对(1)中预处理钛片或钛丝的表面修饰：
①称取504mg的硝酸铈(Ce(NO3)3·6H2O)溶解于20mL乙二醇/水(1∶1)溶液中得到纳米酶前驱体溶液，备用；
②将(1)中预处理的钛片或钛丝置入①中搅拌5-10分钟，使纳米酶前驱体溶液充分接触和填充钛表面微结构；
③将4.0mL的浓氨水快速注入②中，搅拌3个小时即制备得到修饰有氧化铈纳米酶的钛材料以及氧化铈纳米酶溶液，反应温度是-30℃、0℃、30℃、60℃和90℃；
(3)对氧化铈纳米酶修饰的钛材料的再处理：
①取出反应溶液，10000转/分钟离心，并用无水乙醇和水离心清洗3次，每次5分钟，最终配置成10mg/mL的氧化铈纳米酶溶液，备用；
②取出原位氧化铈修饰的钛片或者钛丝，利用水清洗后分为两类：第一类，继续利用水超声清洗，并干燥备用；第二类，利用氧化铈纳米颗粒再修饰处理；
③将②中氧化铈初步修饰钛片或钛丝，利用①中氧化铈纳米酶溶液，通过浸泡、浸涂和/喷涂的方法使其表面完全覆盖氧化铈纳米酶，干燥备用；
④将③氧化铈纳米酶修饰钛片或钛丝，每10℃/分钟，400℃处理2小时后，降温备用；
⑤将④样品置于水中超声处理，清除表面未固定的纳米酶，超声30秒；
⑥将⑤样品置于先后置于柠檬酸和柠檬酸钠溶液中，对材料表面进行修饰即得氧化铈纳米酶修饰的碱活化钛基骨植入材料。
以上方法即得氧化铈纳米酶修饰的碱活化预处理的钛基骨植入材料。
实施例2钛表面氧化钛纳米管预处理负载锆掺杂氧化铈纳米酶的骨植入材料的制备
钛表面氧化钛纳米管预处理负载锆掺杂氧化铈纳米酶的骨植入材料按照以下方法制备：
(1)钛表面氧化钛纳米管阵列预处理：
①取纯钛片或钛丝，利用无水乙醇、丙酮以及纯水超声清洗3次，每次10分钟，晾干备用；
②配制阳极氧化电解液：0.9128g NH4F、4.5mL H3PO4(95-98％)、62.5mL水和62.5mL乙二醇，备用；
③阳极氧化处理：
i反应参数：利用①中的钛片或钛丝，②中配制的阳极氧化电解液置于100mL塑料烧杯中，恒压(30V)直流体系。阳极为纯钛片或钛丝，阴极为铂电极(与钛片面积相近)，电极间距为2cm左右，反应温度20-25℃，磁力搅拌搅速为300转/分；
ii反应过程：第一步，反应2小时后，将钛片或钛丝置于水中超声处理15分钟，去除初次形成的氧化钛膜，如果不能完全清除，可用电解液辅助浸泡超声30秒，再置于水中超声处理，并清洗三遍，烘干备用；第二步，将第一步所得钛片或钛丝继续采用第一步体系和参数继续反应，2小时后用大量水温和清洗，干燥备用；
iii再处理：将ii所得钛片或钛丝置入坩埚中以5℃/分钟加热至450℃，保温2小时，自然冷却至室温；之后置入水中常温超声处理5分钟(40KHz)，并用水清洗数遍，干燥备用，记为Ti-OH，备用。
(2)锆掺杂氧化铈纳米酶对(1)中预处理钛片或钛丝的表面修饰：
①称取硝酸铈六水合物(252mg)和硝酸氧锆(IV)水合物(155mg)依次加入20mL水/乙二醇溶液(体积1∶1)中超声溶解得前驱体溶液，备用；
②将(1)中制备的Ti-OH加入到前驱体溶液中(裁剪为小片状和棒)，充分浸润并抽气处理10分钟，使前驱体充分进入纳米管中；
③将②体系置入60℃水浴并剧烈搅拌，5分钟后快速注入4.0mL氨水(25-28％)，继续搅拌3小时，冷却；最后，清洗晾干，备用。
(3)取(2)中溶液中的产物，10000转/分钟离心，并用无水乙醇和水离心清洗3次，每次5分钟，最终配置成10mg/mL的锆掺杂的氧化铈纳米酶溶液(CeZrO)，备用；
(4)将(2)中所得CeZrO初步修饰的Ti-OH进行两类处理：
①取(2)中所得CeZrO初步修饰的Ti-OH，加入柠檬酸溶液(60mg/mL)浸泡15分钟并超声30秒，之后清洗多次；为了得到与CeZrO-NPs相同的理化性质，再次置于水中，加入过量柠檬酸钠溶液(60mg/mL)浸泡15分钟并超声30秒；最后清洗去除游离的CeZrO-NPs，即得到表面原位生长固定CeZrO-NPs的钛片或棒(记为Ti-OH@CeZrO)。
②取(2)中所得CeZrO初步修饰的Ti-OH，浸涂或喷涂(3)中制备的CeZrO纳米溶液(过量)与其表面，干燥后加入坩埚中5℃/分钟加热至400℃，保温2小时，自然冷却至室温；随后将其置入柠檬酸溶液(60mg/mL)浸泡15分钟并超声30秒，之后清洗多次；为了得到与CeZrO-NPs相同的理化性质，再将其置于水中，加入过量柠檬酸钠溶液(60mg/mL)浸泡15分钟并超声30秒；最后清洗去除游离的CeZrO-NPs，即得到表面原位固定CeZrO-NPs的钛片或棒(记为Ti-OH@CeZrO(HT))。
以上方法即得锆掺杂氧化铈纳米酶修饰的氧化钛纳米管预处理的钛基骨植入材料。
实施例3原位氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料的制备
原位氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料按照以下方法制备：
(1)合成制备氧化铈原位负载聚乙烯颗粒：
①取氧化铈纳米酶前驱体，乙酰丙酮铈190.55mg溶解于15mL无水乙醇中，备用；
②取200万分子量的聚乙烯1500mg置于100mL二甲苯中，110℃度搅拌6小时，得聚乙烯溶解溶液，备用；
③将①中所得前驱体溶液利用注射泵缓慢滴加到②体系中，剧烈搅拌24小时，制备得到氧化铈原位掺杂固定的聚乙烯材料；
④将③所得溶液缓慢滴加到60℃的无水乙醇中，并剧烈搅拌至降为室温，去除混合溶剂，再利用大量60℃无水乙醇多次清洗，重复本步骤操作3次；
⑤将④所得固体真空干燥，温度100-150℃；处理6-24小时；
⑥将⑤中氧化铈负载的聚乙烯粉末，利用液氮浸泡12小时，之后在液氮环境研磨，干燥后，筛选不同粒径颗粒，备用；
(2)将(1)所得氧化铈原位生长的聚乙烯颗粒用于后期聚乙烯骨植入材料的成型加工即得氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料。
实施例4负载Ce-MOF骨水泥骨植入材料的制备
负载Ce-MOF骨水泥骨植入材料按照以下方法制备：
(1)Ce-MOF合成：
①分别称取硝酸铈铵(Ce(NH4)2(NO3)6)和富马酸(C4H4O4)各1g；
②将①中粉末溶解于20mL的纯水中，25℃，800转/分钟，24小时；
③将②产物使用10000转/分钟，离心得初产物，随后利用水和乙醇离心清洗3次，60℃干燥备用；
④将③干燥粉末研磨成均匀粉末，筛选不同粒径颗粒，备用，记为Ce-MOF；
(2)将(1)所得Ce-MOF粉体用于制备纳米酶骨水泥：
①分别称取聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA粉剂)和Ce-MOF粉体，PMMA/Ce-MOF的质量比为40∶2，充分混合，备用；
②将①中粉末与单体丙烯酸甲脂(液剂)按一定质量比例(如1∶1，可按照具体需要调整)混合搅拌均匀，备用；
③将②产物植入骨缺损处或用于辅助其他骨植入材料，即得负载Ce-MOF骨水泥骨植入材料。
实施例5钛表面碱活化预处理负载四氧化三锰纳米酶的骨植入材料的制备
所用操作与工艺与实施例1相同，本实施例中不同点在于：钛片或钛丝表面原位合成制备四氧化三锰纳米酶，具体体现如下：
四氧化三锰纳米酶对实施例1第(1)步中预处理钛片或钛丝的表面修饰：
①称取504mg的醋酸锰((CH3COO)2Mn·4H2O)(作为合成四氧化三锰纳米酶的原料)溶解于20mL乙二醇/水(1∶1)溶液中，备用；
②将(1)中预处理的钛片或钛丝置入①中搅拌5-10分钟，使纳米酶溶液充分接触和填充钛表面微结构；
③将3.2mL的浓氨水快速注入②中，搅拌3个小时；
④取出③原位四氧化三锰修饰的钛片或者钛丝，利用水清洗后，干燥备用。
即得钛表面碱活化预处理负载四氧化三锰纳米酶的骨植入材料。
实施例6油相氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料的制备
油相氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料按照以下方法制备：
(1)合成油相分散性较好的氧化铈纳米酶：
①取0.5g乙酰丙酮铈(含有两个结晶水)溶解于油胺和油酸的15毫升混合溶液中，油胺/油酸为9∶1(体积比)，超声完全溶解，备用；
②将①体系每5℃/分钟加热到80℃，24小时后，加入过量的丙酮，并10000转/分钟离心清洗3次，将油酸和油胺修饰的氧化铈纳米酶溶解于二甲苯中，配置成2mg/mL的溶液，备用；
(2)油相氧化铈混合制备氧化铈纳米酶掺杂的聚乙烯颗粒：
①取500万分子量的聚乙烯4750mg置于100mL二甲苯中，120℃搅拌12小时，得聚乙烯溶解溶液，备用；
②将(1)中所得25mL的2mg/mL油相氧化铈二甲苯溶液滴加到②体系中，③剧烈搅拌12小时，制备得到油相氧化铈共混的聚乙烯材料；
④将③所得溶液缓慢滴加到60℃的无水乙醇中，并剧烈搅拌至降为室温，去除混合溶剂，再利用大量60℃无水乙醇多次清洗，重复本步骤操作3次；
⑤将④所得固体真空干燥，温度100-150℃；处理6-24小时得到油相氧化铈共混的聚乙烯粉末；
⑥将⑤中氧化铈负载的聚乙烯粉末，利用液氮浸泡12小时，之后在液氮环境研磨，干燥后，筛选不同粒径颗粒，备用；
(3)将(2)所得油相氧化铈共混的聚乙烯颗粒用于后期聚乙烯骨植入材料的成型加工，即得油相氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料。
实施例7负载铪掺杂氧化铈纳米酶生物玻璃骨植入材料的制备
负载铪掺杂氧化铈纳米酶生物玻璃骨植入材料按照以下方法制备：
(1)铪掺杂氧化铈纳米酶的制备：
①称取硝酸铈六水合物(352.8mg)和氯化铪(209.45mg)依次加入20mL水/乙二醇溶液(体积1∶1)中超声溶解得前驱体溶液，备用；
②将①体系置入60℃水浴并剧烈搅拌，5分钟后快速注入4.0mL氨水(25-28％)，继续搅拌3小时，冷却；最后，清洗晾干，备用；
③取②中溶液中的产物，10000转/分钟离心，并用无水乙醇和水离心清洗3次，每次5分钟，得铪掺杂的氧化铈纳米酶溶液(Ce0.7Hf0.3O2)，配置10mg/mL过滤净化，备用；
(2)将(1)所得Ce0.7Hf0.3O2纳米酶用于制备纳米酶骨水泥：
①分别称取羟基磷灰石(Hydroxylapatite bone cement，HAC粉剂)和Ce0.7Hf0.3O2纳米酶溶液(100mg/mL)，HAC/Ce0.7Hf0.3O2溶液的质量比为50∶2，充分混合，备用；
②将①中产物植骨缺损处或辅助其他骨植入材料。
实施例8
将实施例1-7制备的纳米酶修饰骨植入材料开展进一步应用。所有纳米酶修饰骨植入材料都具有一种或多种类酶活性，并且表现出较好的稳定性和生物安全性。对骨植入材料周围的骨代谢平衡调节作用体现在如下三方面(如图1)：①通过纳米酶的ROS消除活性抑制破骨细胞的激活，从而减少局部骨溶解增强；②通过ROS消除作用和/或碱性磷酸酶活性增强植入材料的促成骨能力；③利用纳米酶特定环中ROS产生能力以及多水解活性(水解蛋白质和多糖)对细菌生物膜的破坏，可联合抗生素增强其抗感染效果。
实施例1中，通过调节氧化铈纳米酶的合成温度，成功制备不同粒径大小的氧化铈纳米酶(图2和图3)，纳米酶的粒径随着温度的降低而变小，低温还表现出较好的分散性(图2)。测试结果表明，小粒径的纳米酶类ALP的活性较差，60℃合成的氧化铈纳米酶的类ALP活性是-30℃的6倍左右，表现出明显的ALP活性提高(图4)。
实施例2中的基于全水相反应Zr4+掺杂合成调控、柠檬酸修饰的纳米酶，并优化筛选得到CeZrO-NPs纳米酶(Zr4+的掺杂约31％-34％)。透射电子显微镜(TEM)图像显示CeZrO-NPs纳米粒子明显小于未掺杂的CeO-NPs纳米酶(CeO2)(图5)，CeZrO-NPs大小约为3.2nm，而CeO-NPs粒径约为5.5nm，二者都表现出较好的分散性(图6)，CeZrO-NPs纳米粒子小尺寸化分布归因于Zr4+的引入提供了异质形核位点。如图7，X射线衍射(XRD)谱图所示，CeZrO-NPs的(111)面特征峰出现高角度偏移现象，出现晶格畸变，其它特征峰没有明显变化表明CeZrO-NPs粒子仍然维持固溶体相。CeZrO-NPs整体维持与CeO-NPs纳米粒子相似的萤石结构，而部分晶体结构的变化源于尺寸较小Zr4+的掺杂(图7a)。另外，调控不同活性晶面也是调控纳米酶类酶活性的重要手段，实验还对CeZrO-NPs(100)晶面的变化进行了研究，结果发现Zr4+的掺杂明显增加(100)晶面的比例。如图7b所示，(200)/(111)的比例从0.26增长到0.56，显著提高了活性晶面的占比。
随后，我们对实施例2制备的纳米酶的类酶活性进行了考察。不同于H2O2，·O2 -是一种具有不对称电子的自由基。由于电子构型的不对称性，·O2 -相比于H2O2具有更高活性，其对生物系统造成的损害明显高于H2O2。纳米酶对·O2 -的消除率可通过WST-1和·O2 -相互作用形成的甲臜染料来检测，当纳米酶对·O2 -产生消除作用时其吸光度降低。如图8所示，CeO-NPs和CeZrO-NPs对·O2 -的消除率都表现出明显的浓度依赖性，低浓度CeZrO-NPs(2.5μg/mL)就具有59.97％的消除率，当CeZrO-NPs浓度增长到20μg/mL其消除率增长到89.46％，与之对应同浓度的CeO-NPs则表现出33.54％和71.84％的消除率。
氧化铈纳米酶通过水解磷酸酯键释放无机磷酸盐发挥类碱性磷酸酶活性，此过程可模拟生物体成骨过程中碱性磷酸酶的作用，释放无机磷酸盐与钙离子沉积形成羟基磷灰石。虽然磷酸根缓冲体系对氧化铈纳米酶的水解活性具有抑制作用，但考虑纳米酶在体内生理环境的应用，实验依然选择PBS(pH 7.4)为缓冲体系。另外，通过对实施例2的纳米酶进行吸光度定量分析(图9)可知，当纳米酶浓度为500和1000μg/mL时，CeZrO-NPs纳米酶的水解活性分别是CeO-NPs的2.2和2.3倍。尽管有研究表明，氧化铈中Ce4+含量的增加会促进其水解活性，但CeZrO-NPs相比于CeO-NPs却具有更高的Ce3+/Ce4+比例，而CeZrO-NPs纳米酶的水解活性明显优于CeO-NPs。
随后，实施例2利用阳极氧化法和实施例5利用碱活化法分别对纯钛材料进行预处理，得到纳米管结构(图10)以及钛表面明显变的粗糙且有明显的片状结构(图19)，通过这两种预处理方法可明显增强钛表面的比表面积，可增强纳米酶的负载量。如图10所示，利用二步法在钛表面成功制备TiO2纳米管阵列(锐钛矿)其纳米管孔径约为147nm，这个尺寸的孔径可提高CeZrO-NPs纳米酶的原位合成及固定效率，同时可保留部分纳米管特性。原位固定纳米酶的Ti-OH@CeZrO表面出现CeZrO-NPs纳米酶的填充；若通过浸泡或喷涂可增强CeZrO-NPs纳米酶对钛基材料的固定效率，结果发现Ti-OH@CeZrO(HT)表面可固定更多CeZrO-NPs纳米酶，但仍然有部分TiO2纳米管暴露，但纳米管孔径变小(图11)。有研究表明TiO2纳米管阵列的孔径在70-100nm时对间充质干细胞具有一定的促成骨分化作用。所以，147nm孔径的纳米管经纳米酶修饰后其孔径的适当减小，可体现形貌对成骨作用的积极影响。
图12所示，利用Micro-CT三维图像处理技术对各组材料表面的新生骨生成情况进行了考察，发现经过改性的材料表面新生成骨量皆高于未改性的Ti棒，其中Ti-OH@CeZrO(HT)具有最好的促成骨效果(箭头所指)。原因可能如下：一方面，Ti-OH、Ti-OH@CeZrO和Ti-OH@CeZrO(HT)都经过TiO2纳米管阵列的表面改性，其纳米管形貌对干细胞具有一定的促成骨分化的作用；另一方面，Ti-OH@CeZrO和Ti-OH@CeZrO(HT)表面CeZrO-NPs纳米酶的修饰，可赋予其类碱性磷酸酶的活性以促进局部成骨，最终形成较多新生骨组织；另外，CeZrO-NPs纳米酶的存在可以消除局部炎症，对血管生成的促进作用也会增强骨整合能力。
在M-CSF和RANKL细胞因子的刺激下可诱导BMMs定向分化为破骨细胞，对刺激过程中加入不同浓度CeZrO-NPs纳米酶的破骨细胞分化过程进行了考察，以TRAP的胞浆染色观察破骨细胞。如图13所示，CeZrO-NPs纳米酶对破骨细胞的分化具有明显的抑制作用且具有浓度依赖性，当纳米酶浓度达10和20μg/mL时，破骨细胞生成的数量和面积都明显减少(图13)；同时实验发现没有分化的单核巨噬细胞数量与破骨细胞数量成反比，如20μg/mL处理组可观察到最多数量的单核巨噬细胞(图13)，也表明CeZrO-NPs纳米酶具有优异的生物安全性。
最后，对CeZrO-NPs纳米酶修饰的钛颗粒进行小鼠颅骨骨溶解验证。如图14a所示，为了模拟接近临床的骨溶解状况，将各种钛颗粒直接涂撒于小鼠颅骨中缝处连续刺激。14天后，如图14b所示，假手术组小鼠的颅骨表面光滑且颅缝正常；而钛颗粒诱导组小鼠颅骨出现明显骨溶解，颅面显得粗糙；而经CeZrO-NPs纳米酶修饰的钛颗粒组都表现出一定的治疗效果。
同时，实施例3中通过原位合成法，在聚乙烯中原位合成制备得到氧化铈纳米酶掺杂聚乙烯材料。如图15所示，明显可以观察到均匀分在聚乙烯中的氧化铈纳米颗粒，同时利用XRD对其进行检测进一步验证了氧化铈纳米酶成功制备(图16)。通过氧化铈负载可以降低含有氧化铈纳米酶的聚乙烯磨损颗粒对巨噬细胞的刺激作用，同时可赋予磨损颗粒主动消除微环境ROS的作用，减弱破骨细胞的分化和其所带来非菌性松动。
另外，实施例4中合成了Ce-MOF，其整体表现为50-90nm的球形(图17)。随后，通过金黄色葡萄球菌的生物膜水解实验，结果发现Ce-MOF孵育组其生物膜表现出不完整性，细菌间的缝隙明显增大(图18)，这是由于Ce-MOF表现出的多水解活性，利用水解作用将细菌生物膜中蛋白质和多糖成分。所以Ce-MOF添加或修饰的骨植入材料可表现出抑菌作用，同时可以提高抗生素杀菌作用。
同时，实施例6中通过调节油胺和油酸的不同比例，成功制备得到超小粒径的氧化铈纳米酶，随着油酸的增加氧化铈纳米酶粒子的分散性增强，其大小约为2nm(图21)，当OM/OA大于7∶3时，氧化铈仍为萤石结构(图20)。这种油相氧化铈可作为高分子量聚乙烯、骨水泥、以及PLGA骨植入材料的添加剂，最终增强其抑制骨溶解的效果。
实施例7中，通过调节掺杂元素调控合成氧化铈纳米酶，成功制备铪掺杂的氧化铈纳米酶(图22和图23)，Ce0.7Hf0.3O2纳米酶的粒径明显小于CeO2纳米酶，XRD同样验证了这一结果。
综上，利用本发明制备的一类纳米酶修饰骨植入材料，可赋予骨植入材料不同的类酶活性，如消除过量的ROS用于减弱非菌性松动的产生；利用碱性磷酸酶活性和ROS消除能力促进骨植入材料的骨整合能力；利用纳米酶特定环中ROS产生能力以及多水解活性(水解蛋白质和多糖)破坏细菌生物膜，增强抗生素药物的抗感染作用。通过这种互补高效的设计使得本发明具有多方面的治疗特性，可实现治疗、缓解和/或预防骨植入材料相关的骨代谢失衡疾病，且具有临床转化的可能。

Claims (8)

1.一种基于纳米酶修饰的骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1.1）、钛表面碱活化预处理：
1.1.1、取纯钛片或钛丝，利用无水乙醇、丙酮以及纯水超声清洗3次，每次10分钟，晾干备用；
1.1.2、将1.1.1中钛片或钛丝，利用3摩尔每升的氢氧化钠溶液，80摄氏度处理12小时后，使用无水乙醇、水浸泡超声清洗3次，每次10分钟，晾干备用；
（1.2）、氧化铈纳米酶对（1.1）中预处理钛片或钛丝的表面修饰：
1.2.1、称取504 mg的Ce(NO3)3•6H2O溶解于20 mL乙二醇/水溶液中得到纳米酶前驱体溶液，备用；
1.2.2、将（1.1）中预处理的钛片或钛丝置入1.2.1中搅拌5-10分钟，使纳米酶前驱体溶液充分接触和填充钛表面微结构；
1.2.3、将4.0 mL的浓氨水快速注入1.2.2中，搅拌3个小时即制备得到修饰有氧化铈纳米酶的钛材料以及氧化铈纳米酶溶液，反应温度是60 ℃；
（1.3）、对氧化铈纳米酶修饰的钛材料的再处理：
1.3.1、取出反应溶液，10000转/分钟离心，并用无水乙醇和水离心清洗3次，每次5分钟，最终配置成10 mg/mL的氧化铈纳米酶溶液，备用；
1.3.2、取出原位氧化铈修饰的钛片或者钛丝，利用水清洗后分为两类：第一类，继续利用水超声清洗，并干燥备用；第二类，利用氧化铈纳米颗粒再修饰处理；
1.3.3、将1.3.2中的氧化铈初步修饰钛片或钛丝，利用1.3.1中氧化铈纳米酶溶液，通过浸泡、浸涂和/喷涂的方法使其表面完全覆盖氧化铈纳米酶，干燥备用；
1.3.4、将1.3.3中的氧化铈纳米酶修饰钛片或钛丝，每10 ℃/分钟，400 ℃处理2小时后，降温备用；
1.3.5、将1.3.4中的样品置于水中超声处理，清除表面未固定的纳米酶，超声30秒；
1.3.6、将1.3.5中的样品先后置于柠檬酸和柠檬酸钠溶液中，对材料表面进行修饰即得氧化铈纳米酶修饰的碱活化钛基骨植入材料。
2.一种基于纳米酶修饰的骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（2.1）、钛表面氧化钛纳米管阵列预处理：
2.1.1、取纯钛片或钛丝，利用无水乙醇、丙酮以及纯水超声清洗3次，每次10分钟，晾干备用；
2.1.2、配制阳极氧化电解液：0.9128 g NH4F、4.5 mL H3PO4 、62.5 mL水和62.5 mL乙二醇，备用；
2.1.3、阳极氧化处理：
i反应参数：利用2.1.1中的钛片或钛丝，2.1.2中配制的阳极氧化电解液置于100 mL塑料烧杯中，恒压30 V直流体系，阳极为纯钛片或钛丝，阴极为铂电极，电极间距为2 cm左右，反应温度20-25℃，磁力搅拌搅速为300转/分；
ii反应过程：第一步，反应2小时后，将钛片或钛丝置于水中超声处理15分钟，去除初次形成的氧化钛膜，如果不能完全清除，用电解液辅助浸泡超声30秒，再置于水中超声处理，并清洗三遍，烘干备用；第二步，将第一步所得钛片或钛丝继续采用第一步体系和参数继续反应，2小时后用大量水温和清洗，干燥备用；
iii再处理：将ii所得钛片或钛丝置入坩埚中以5 ℃/分钟加热至450 ℃，保温2小时，自然冷却至室温；之后置入水中常温超声处理5分钟，超声频率为40 KHz，并用水清洗数遍，干燥备用，记为Ti-OH，备用；
（2.2）、锆掺杂氧化铈纳米酶对（2.1）中预处理钛片或钛丝的表面修饰：
2.2.1、称取硝酸铈六水合物252 mg和硝酸氧锆IV水合物155 mg依次加入20 mL体积比为1:1的水/乙二醇溶液中超声溶解得前驱体溶液，备用；
2.2.2、将（2.1）中制备的Ti-OH加入到前驱体溶液中裁剪为小片状和棒，充分浸润并抽气处理10分钟，使前驱体充分进入纳米管中；
2.2.3、将2.2.2的体系置入60 ℃水浴并剧烈搅拌，5分钟后快速注入4.0 mL的25-28%氨水，继续搅拌3小时，冷却；最后，清洗晾干，备用；
（2.3）取（2.2）中溶液中的产物，10000转/分钟离心，并用无水乙醇和水离心清洗3次，每次5分钟，最终配置成10 mg/mL的锆掺杂的氧化铈纳米酶溶液CeZrO，备用；
（2.4）将（2.2）中所得CeZrO初步修饰的Ti-OH进行两类处理：
2.4.1、取（2.2）中所得CeZrO初步修饰的Ti-OH，加入60 mg/mL的柠檬酸溶液浸泡15分钟并超声30秒，之后清洗多次；为了得到与CeZrO-NPs相同的理化性质，再次置于水中，加入过量的60 mg/mL柠檬酸钠溶液浸泡15分钟并超声30秒；最后清洗去除游离的CeZrO-NPs，即得到表面原位生长固定CeZrO-NPs的钛片或棒记为Ti-OH@CeZrO；或
2.4.2、取（2.2）中所得CeZrO初步修饰的Ti-OH，浸涂或喷涂（2.3）中制备过量的CeZrO纳米溶液于其表面，干燥后加入坩埚中5 ℃/分钟加热至400 ℃，保温2小时，自然冷却至室温；随后将其置入60 mg/mL柠檬酸溶液浸泡15分钟并超声30秒，之后清洗多次；再将其置于水中，加入过量的60 mg/mL柠檬酸钠溶液浸泡15分钟并超声30秒；最后清洗去除游离的CeZrO-NPs，即得到表面原位固定CeZrO-NPs的钛片或棒。
3.一种基于纳米酶修饰的骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（3.1）、合成制备氧化铈原位负载聚乙烯颗粒：
3.1.1、取氧化铈纳米酶前驱体，乙酰丙酮铈190.55 mg溶解于15 mL无水乙醇中，备用；
3.1.2、取200万分子量的聚乙烯1500 mg置于100 mL二甲苯中，110 ℃搅拌6小时，得聚乙烯溶解溶液，备用；
3.1.3、将3.1.1中所得前驱体溶液利用注射泵缓慢滴加到3.1.2的体系中，剧烈搅拌24小时，制备得到氧化铈原位掺杂固定的聚乙烯材料；
3.1.4、将3.1.3所得溶液缓慢滴加到60 ℃的无水乙醇中，并剧烈搅拌至降为室温，去除混合溶剂，再利用大量60 ℃无水乙醇多次清洗，重复本步骤操作3次；
3.1.5、将3.1.4所得固体真空干燥，温度100-150 ℃；处理6-24小时；
3.1.6、将3.1.5中氧化铈负载的聚乙烯粉末，利用液氮浸泡12小时，之后在液氮环境研磨，干燥后，筛选得到不同粒径的氧化铈原位生长的聚乙烯颗粒，备用；
（3.2）、将（3.1）所得氧化铈原位生长的聚乙烯颗粒用于后期聚乙烯骨植入材料的成型加工即得氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料。
4.一种基于纳米酶修饰的骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（4.1）、Ce-MOF合成：
4.1.1、分别称取硝酸铈铵Ce(NH4)2(NO3)6和富马酸C4H4O4粉末各1 g；
4.1.2、将4.1.1中粉末溶解于20 mL的纯水中，25 ℃，800转/分钟，24小时；
4.1.3、将4.1.2的产物使用10000转/分钟，离心得初产物，随后利用水和乙醇离心清洗3次，60 ℃干燥备用；
4.1.4、将4.1.3的干燥粉末研磨成均匀粉末，筛选不同粒径颗粒，备用，记为Ce-MOF；
（4.2）将（4.1）所得Ce-MOF粉体用于制备纳米酶骨水泥：
4.2.1、分别称取聚甲基丙烯酸甲酯PMMA粉剂和Ce-MOF粉体，PMMA/Ce-MOF的质量比为40:2，充分混合，备用；
4.2.2、将4.2.1中的粉末与单体丙烯酸甲酯液体按一定质量比例混合搅拌均匀，备用；
4.2.3、将4.2.2的产物用于辅助其他骨植入材料，即得负载Ce-MOF骨水泥骨植入材料。
5.一种基于纳米酶修饰的骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（5.1）、采用权利要求1中步骤（1.1）的方法预处理钛片或钛丝；
（5.2）、称取504 mg的醋酸锰(CH3COO)2Mn•4H2O溶解于20 mL乙二醇/水溶液中，备用；
（5.3）、将（5.1）中预处理的钛片或钛丝置入（5.2）中搅拌5-10分钟，使纳米酶溶液充分接触和填充钛表面微结构；
（5.4）、将3.2 mL的浓氨水快速注入（5.3）中，搅拌3个小时；
（5.5）、取出（5.4）中原位四氧化三锰修饰的钛片或者钛丝，利用水清洗后，干燥备用；即得钛表面碱活化预处理负载四氧化三锰纳米酶的骨植入材料。
6.一种基于纳米酶修饰的骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（6.1）、合成油相分散性较好的氧化铈纳米酶：
6.1.1、取0.5 g含有两个结晶水的乙酰丙酮铈溶解于油胺和油酸的15毫升混合溶液中，油胺/油酸体积比为9:1，超声完全溶解，备用；
6.1.2、将6.1.1的体系每5 ℃/分钟加热到80 ℃，24小时后，加入过量的丙酮，并10000转/分钟离心清洗3次，将油酸和油胺修饰的氧化铈纳米酶溶解于二甲苯中，配置成2 mg/mL油相氧化铈二甲苯溶液，备用；
（6.2）、油相氧化铈混合制备氧化铈纳米酶掺杂的聚乙烯颗粒：
6.2.1、取500万分子量的聚乙烯4750 mg置于100 mL二甲苯中，120 ℃搅拌12小时，得聚乙烯溶解溶液，备用；
6.2.2、将（6.1）中所得25 mL 的2 mg/mL油相氧化铈二甲苯溶液滴加到6.2.1的体系中，
6.2.3、剧烈搅拌12小时，制备得到油相氧化铈共混的聚乙烯材料；
6.2.4、将6.2.3中所得溶液缓慢滴加到60 ℃的无水乙醇中，并剧烈搅拌至降为室温，去除混合溶剂，再利用大量60 ℃无水乙醇多次清洗，重复本步骤操作3次；
6.2.5、将6.2.4所得固体真空干燥，温度100-150 ℃；处理6-24小时得到油相氧化铈负载的聚乙烯粉末；
6.2.6、将6.2.5中氧化铈负载的聚乙烯粉末，利用液氮浸泡12小时，之后在液氮环境研磨，干燥后，筛选不同粒径颗粒，备用；
（6.3）、将（6.2）所得油相氧化铈共混的聚乙烯颗粒用于后期聚乙烯骨植入材料的成型加工，即得油相氧化铈纳米酶掺杂的高分子量聚乙烯骨植入材料。
7.权利要求1~6任一项所述的方法获得的基于纳米酶修饰的骨植入材料在制备治疗、缓解和/或预防骨代谢失衡疾病的药物或植入体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述骨代谢失衡疾病为细菌感染、骨整合不足、骨溶解、非菌性松动、局部骨质疏松、骨肿瘤、骨肿瘤术后填充、自身免疫疾病和/或炎症。
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