JP2001527451A

JP2001527451A - 細胞結合活性を有するコラーゲン様ポリマー

Info

Publication number: JP2001527451A
Application number: JP54991998A
Authority: JP
Inventors: ジェラードスティール，ジョン; ジョンソン，グラハム; グッドマン，マレー; ヨルググリーザー，ハンス; マイケルマクリーン，キース; ジャンブーメル，ヘリット
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2001-12-25
Also published as: WO1998052620A3; AU8017498A; CA2286687A1; EP0983096A2; WO1998052620A2

Abstract

(57)【要約】本発明は本質的に、その表面に１つ以上のバイオポリマー化合物（該バイオポリマー化合物は、少なくとも１つのペプトイド残基を含む）を共有結合させたバルク材料を含む、生物学的適合性材料に関する。このバイオポリマー化合物は、最も好ましくは式(Ｉ)：−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_(y)−｛式中、（ｙ）は、≧９を意味する｝の配列を含むポリマー化合物である。また、少なくとも１つのペプトイド残基、及び第１級アミン基を含むバイオポリマー化合物を、バルク材料に結合させる方法が開示されており、この方法は、（ａ）該バルク材料の表面上にアルデヒド又はカルボキシル基を調製し；（ｂ）該第１級アミン基をアルデヒド又はカルボキシル基と反応させて、共有結合を形成させる工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】細胞結合活性を有するコラーゲン様ポリマー本発明は、細胞結合活性を示す「コラーゲン様ポリマー」、ここに適用されるポリマーのコーティングを有するバルク材料及びバルク材料にポリマーを共有結合させる方法に関する。詳細には(しかし決して限定するものではなく)、本発明は、本コラーゲン様ポリマーを含む、創傷修復材料のようなインプラント、インプラントのコンタクトレンズ、合成上角膜形成材料、合成皮膚又は結合組織、整形外科用インプラント、人工関節、合成動脈表面、合成神経組織、人工器官又は他の合成生物活性装置若しくは材料に関する。更に本発明は、細胞結合コラーゲン様ポリマーを含むインプラントを伴う治療方法に関する。「コラーゲン」という用語は、ヒトを含む動物の、細胞外マトリックス、及び特に結合組織、靱帯、腱及び骨に存在する天然タンパク質のファミリーに関連している。天然コラーゲンは、反復する三量体アミノ酸配列の一次構造を有する。コラーゲン分子の約９５％を構成するらせん領域内では、アミノ酸グリシン（Ｇｌｙ）がペプチド三量体の第３位毎に出現する。プロリン（Ｐｒｏ）又はヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）のいずれかであるイミノ残基（Ｉ）は、三量体の５６％｛Ｇｌｙ−Ｘ−Ｉとして２０％；Ｇｌｙ−Ｉ−Ｙとして２７％；及びＧｌｙ−Ｉ −Ｉとして９％(ここで、Ｘ及びＹは、Ｐｒｏ又はＨｙｐ以外のアミノ酸残基である)｝に出現する。Ｐｒｏは通常、反復三量体の第２位に出現するが、Ｈｙｐは通常、最終位に出現する。天然コラーゲンの構造の完全な詳細は、Bhatnagar ，R.とRapaka，R．（1976）「コラーゲンの生化学(Biochemistry of Collagen) 」の第１０章，R．Ramachandren編，Plenum Press，ニューヨーク，pp 481-482 （参照することにより本明細書の一部とする）に見出すことができる。トリペプチド配列（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）（ここで、Ｘ及びＹは、プロリン（Ｐｒｏ）又はヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）以外のアミノ酸残基である)は、コラーゲンアミノ酸三量体の４４％を構成する。グルタミン酸、ロイシン及びフェニルアラニンは、多くはＸ位に出現し、そしてトレオニン、グルタミン、メチオニン、アルギニン及びリシンは、多くはＹ位に出現する。Ｘ位に存在することもあるアラニンとセリンを除いて、Ｘ位アミノ酸は嵩高な側鎖を有する。従来は、臨床的応用のための生体材料内に使用することができるコラーゲン様の性質を有する合成ポリマーを開発することに関心が集まっていた。例えば、コラーゲン様合成ポリマーの使用は、薬物送達装置、眼内装置及び創傷治癒材料において企図されてきた。これらの目標を目指して、コラーゲン構造を模倣するために、三量体アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ及びＧｌｙ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘａａは、任意の天然アミノ酸残基である）からなる多くの合成ペプチドが調製されてきた。天然コラーゲンは、特有の三次、二次及び一次構造を有しており、そして反復アミノ酸三量体を含む３つのポリペプチド鎖からなっている。これらの鎖は、３つの延長した１回転当たり約３残基の左巻きのらせん：ポリプロリンII様鎖（Ri dge（1955）Nature 176:915に記載されており、これも参照することによりその全体を本明細書の一部とする）として整列している。このポリプロリンII様鎖は、平行な方向に整列して、絡み合ってスーパーコイル化した右巻き三重らせんコンホメーションをとっている(Bellaら（1994）Science 266:75-81)。合成コラーゲン様ポリマーを開発するに当たって、コラーゲン様活性がこのコンホメーションに依存しているため、この三重らせんコンホメーションを有効に模倣できることが当然重要である。ヒト及び動物の身体用のインプラントは、目下劇的な速さで開発されている。例えば、インプラントは、火傷、創傷の治療又は美容外科患者のための単純な合成皮膚から、整形外科患者のための合成靱帯、関節表面又は人工関節まで様々である。心臓や肺などの機能を果たす人工器官のような、生物活性装置を体内移植することさえ可能である。創傷の修復を助ける材料、移植可能なコンタクトレンズ及び合成上角膜形成材料、更には他の合成結合組織、整形外科用インプラント、合成動脈表面、合成神経組織又は他の合成生物活性装置若しくは材料も、ますますヒト又は動物患者に体内移植されている。しかしながら、これらの移植可能な材料の多くは、細胞がインプラント材料に結合し、そして組織がこれをコロニー化するように、隣接する組織によって許容される必要があるため、問題が生じる。一般に金属若しくは金属合金、プラスチックポリマー又はセラミックから製造されるインプラント材料は、細胞結合及び組織コロニー化を促進しないため、これは従来の問題の領域であった。従来このような問題は、特に角膜アンレーの分野では、移植可能なポリマーの表面上へのタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチン又はラミニンなど）の吸着又は共有結合により対処されてきた。このようなタンパク質の表面コーティングは、ポリマー材料への細胞接着を刺激する。また従来、合成ポリマー又は他のインプラントの表面への細胞接着を、細胞接着分子の断片の共有結合により刺激することも提案されている。このような細胞接着分子の断片又はコラーゲン、フィブロネクチン若しくはラミニンのようなタンパク質は、一般に完全に合成物でなく、この結果として製造の困難性を伴い、しばしば経済コストが高くなり更には移植された患者の安全問題も伴うため、このアプローチもまた、問題を含んでいる。更には、天然ペプチドは、移植可能な材料をコーティングするのに使用されると酵素の攻撃を受けやすいが、このことが、関係するペプチドの細胞結合及び組織付着活性に悪影響を及ぼす。 Goodmanら（Journal of the American Chemical Society，Vol.118，No.28，p p 5156-5157；Vol.118，No.43，pp 10359-10364；Vol.118，No.44，pp 10725-10 732；Vol.118，No.44，pp 10928-10929及びBiopolymers，Vol.39，859-872(1996 )）による最近の数報の論文（これらは参照することによりその全体を本明細書の一部とする）は、ペプトイド（peptoid）残基を含むコラーゲン様ポリマーに関する。ペプトイド残基を含むこのようなコラーゲン様ポリマーの魅力は、これらが完全に合成により調製できることである。合成による調製の結果として、これらは、ヒト又は動物のインプラントに関して使用が安全である。更に、ペプトイド残基含有ポリマーは、酵素の攻撃を受けにくい(これは、細胞結合及び組織コロニー化を刺激するために使用されると、天然ペプチドの活性に不利に影響しうる)。驚くべきことに、本発明者らは、ペプトイド残基を含む幾つかのコラーゲン様ポリマー化合物が、細胞結合及び組織コロニー化を開始させることができることを確認した。詳細には、本発明者らは、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕの少なくとも９つの隣接する反復単位を含むコラーゲン様ポリマーが、細胞結合及び組織コロニー化を開始させる能力を有することを証明した。本明細書において使用されるとき、Ｇｌｙはアミノ酸のグリシンを表し、Ｐｒｏはアミノ酸のプロリンを表し、そしてＮｌｅｕは、Simonら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．1992，89( 20)，9367-9371（参照することによりその全体を本明細書の一部とする）に記載されるペプトイド残基のＮ−イソブチルグリシンを表す。本発明者らはまた、本発明のコラーゲン様ポリマーを、移植可能なバルク材料に結合させることができる手段（すなわちコラーゲン様ポリマー化合物上の末端第１級アミン基と、移植可能なバルク材料の表面上のアルデヒド又はカルボキシル基との共有結合による）を決定した。このような共有結合は、シッフ（Schiff ）塩基、アミン又はアミド結合のいずれかの形態である。コラーゲン様ポリマーのバルク材料に対する不可逆的固定が可能になるため、後者の２つの結合が好ましい。したがって、本発明の目的は、上記先行技術の考察において確認されるような、移植可能な材料について細胞結合及び組織コロニー化を達成することに伴う問題を、克服又は少なくとも実質的に軽減することである。本発明の更に別の目的は、そこへの細胞接着を開始させることができる、コラーゲン様ポリマー化合物を提供することである。本発明の更に別の目的は、バルク材料の生物学的適合性を改善し、そしてこれによって生物学的分解を受けにくくなる、バルク材料に結合したペプトイド含有バイオポリマーを提供することである。本発明のまた別の目的は、顕著な分解なしに周囲温度で保存することができる生物学的適合性材料を提供することである。本発明のまた別の目的は、そこへの細胞接着を開始させる、コラーゲン様ポリマーに結合した移植可能なバルク材料を提供することであり、更にはこのポリマーを移植可能なバルク材料に結合させる方法、及びインプラントを必要とする患者の治療方法を提供することである。本発明の他の目的は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなろう。本発明の１つの実施態様により、そこへの細胞接着を開始させることができるコラーゲン様ポリマー化合物（該ポリマー化合物は１つ以上のペプトイド残基を含む）が提供される。本発明の別の実施態様により、そこへの細胞接着を開始させることができるコラーゲン様ポリマー化合物が提供されるが、該ポリマー化合物は、式（Ｉ）: −(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_(y)− （Ｉ）｛式中、（ｙ）は、≧９を意味する｝で示される配列を含む。本発明の更に別の実施態様により、その表面に共有結合した、上述の１つ以上のコラーゲン様ポリマー化合物を含む、移植可能なバルク材料が提供される。本発明の更に別の実施態様により、バイオポリマー化合物、好ましくはコラーゲン様ポリマー化合物を移植可能なバルク材料に結合させる方法が提供される（ここで、該ポリマー化合物は、細胞接着を開始させることができ、このポリマー化合物は、１つ以上のペプトイド残基、及び第１級アミン基を含む）が、この方法は、（ａ）該移植可能なバルク材料の表面上にアルデヒド又はカルボキシル基を調製し；（ｂ）該第１級アミン基をアルデヒド又はカルボキシル基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む。本発明の更に別の実施態様により、バイオポリマー化合物をバルク材料に結合させる方法が提供される（このバイオポリマー化合物は、１つ以上のペプトイド残基を含むバイオポリマー化合物のケンプ（Kemp）三酸付加物を含む）が、この方法は、（ａ）該移植可能なバルク材料の表面上にアミン基を調製し；（ｂ）該アミン基を該ケンプ三酸付加物上のカルボン酸基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む。本発明の更に別の実施態様により、コラーゲン様ポリマー化合物を移植可能なバルク材料に結合させる方法が提供される（ここで、該ポリマー化合物は、細胞接着を開始させることができ、このポリマー化合物は、式（Ｉ）の配列、更には第１級アミン基を含む）が、この方法は、（ａ）該移植可能なバルク材料の表面上にアルデヒド又はカルボキシル基を調製し；（ｂ）該第１級アミン基をアルデヒド又はカルボキシル基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む。本発明の更に別の実施態様により、１つ以上のペプトイド残基を含むコラーゲン様ポリマー化合物を含むコポリマーをからなる、移植可能なバルク材料が提供される。本発明の更に別の実施態様により、式（Ｉ）の配列を含むコラーゲン様ポリマー化合物を含むコポリマーからなる、移植可能なバルク材料が提供される。本発明のまた別の実施態様により、体内移植を必要とするヒト又は動物患者の治療方法が提供されるが、この方法は、上述の適切な移植可能なバルク材料を得、該移植可能なバルク材料を該患者に移植することを含む。本明細書を通じて、他に記載がなければ、「を含む」という語、又は「を含むことを特徴とする」若しくは「からなる」のような変形は、限定的というよりはむしろ包括的と解釈すべきである。すなわち、これらの語は、述べられる要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の包含を意味するものであり、任意の他の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群の排除を意味するものではないと理解される。本ポリマー化合物の本質的な特徴は、これらがコラーゲン様であり、細胞結合開始の特性を示し、かつ１つ以上のペプトイド単位を含むことである。決して必須ではないが好ましくは、本発明のコラーゲン様ポリマー化合物は、配列「−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ）−」(ここで、Ｇｌｙは、グリシンを表し、Ｐｒｏは、プロリンを表し、そしてＮｌｅｕは、上に引用したSimonらの論文に開示されるような、ペプトイド残基Ｎ−イソブチルグリシンを表す)の少なくとも９つの連続する反復単位を含む。本発明のポリマーの特徴は、これらが天然コラーゲンタンパク質のそれに類似した三重らせん三次元コンホメーションを示すことである。このように、本発明のポリマー化合物は、「コラーゲン様」であると考えられる。ペプトイド残基を含有するコラーゲン様ポリマーは、WO 97/19106に開示されている。これらの明細書の開示は、参照することによりその全体を本明細書の一部とする。本発明のコラーゲン様ポリマー化合物は、更に１つ以上の又は多くの他の化学成分を含んでいてもよい。例えば、他の天然又は非天然アミノ酸若しくはイミノ酸基又は他の合成ポリマー（例えば、ヒドロゲル成分）を、ペプトイド残基を含む本発明のコラーゲン様ポリマー化合物と共重合させることができる。本発明の特に好ましい実施態様では、このコラーゲン様ポリマー化合物は、アミン基又はケンプ三酸（ＫＴＡ）(KempとPetrakis，J．Org．Chem．1981，46，5140-5143（これは参照することによりその全体を本明細書の一部とする）に言及されている、cis，cis−１，３，５−トリメチルシクロヘキサン−１，３，５−トリカルボン酸)が末端になっている。「細胞接着を開始させることができる」という用語によって、本発明のコラーゲン様ポリマー化合物、及びそこにコラーゲン様ポリマー化合物を結合させた移植可能なバルク材料が、ヒト又は動物細胞及び／又は組織を含有する環境に置かれるとき、そこへの細胞結合及び組織コロニー化を促進することを意味するものである。また具体的には、本発明のコラーゲン様ポリマー化合物は、余分の末端第１級アミン基を含んでもよいと考えられるが、この基は、これらコラーゲン様ポリマー化合物を、体内移植目的に使用される材料に結合させる目的に利用することができる。結果として、起こりうることは、移植可能な材料が、そこへの細胞及び組織の付着によりヒト又は動物有機体内に適切に定着できるように、本発明のコラーゲン様ポリマー化合物を含む生体材料表面を、移植可能なバルク材料に適用できることである。適切な組成と長さの３つのコラーゲン様ポリマー化合物のケンプ三酸付加物は、ケンプ三酸がグリシン又はアラニンと縮合すると、便利には結合ポリマーのα らせん性を誘導するための鋳型として作用するため、特に有利である(Mullerら，1993，「医化学における展望(Perspectives in Medicinal Chemistry)」の第３３章、Testaら編，Basel)。ケンプ三酸付加物に、所望のバルク材料の表面上の化学基と反応することができる更に別の化学基を結合させることにより、ケンプ三酸付加物をバルク材料に共有結合させることが可能であり、これによって、表面に固定したコラーゲン様ポリマー化合物又はこれらのケンプ三酸付加物の非存在下では細胞に結合する能力を持たないバルク材料に、このような能力を与えることが可能である。上に言及されるようなＮｌｅｕ残基は、ペプトイド残基の一例である。Simon らの論文に略述されるように、ペプトイド残基は、Ｎ置換グリシン残基を含む比較的新しい種類の非天然イミノ酸である(ここで、窒素原子上の置換基は、アミノ酸のα位側鎖である)。ペプトイド残基が自然に生じないとするならば、ペプトイド残基及びこれらを含むコラーゲン様ポリマーでは、天然アミノ酸及びペプチドに比較して酵素の攻撃に対する抵抗性が改善している。本発明はその範囲内に、１つ以上の同一又は異なるペプトイド残基を含むコラーゲン様ポリマー化合物を含む。任意のペプトイド残基を含むコラーゲン様ポリマー化合物は、これらが必要な細胞結合を示す限り、本発明に包含される。本出願の移植可能なバルク材料は、多数あって変化に富み、そして一例として本明細書にリストされる以下のものを含む：創傷修復材料、合成皮膚又は結合組織、インプラントのコンタクトレンズのような眼用インプラント及び合成上角膜形成材料又は角膜移植片、人工関節のような整形外科用インプラント又は合成動脈表面、外科的処置において骨又は靱帯を確保するために使用されろ合成腱又は靱帯組織又は材料、合成神経組織、心臓、肺などの機能を果たす装置のような人工器官、血液接触装置の構成要素、免疫測定法、抗原／抗体検出キット、親和性マトリックスなど、心臓ペースメーカーのような他の合成生物活性装置又は他の合成の移植可能な材料。上に挙げた例は、本発明の範囲を何ら限定するものではなく、そして本発明は、ヒト又は動物の体内に移植する必要がある全ての型の移植可能なバルク材料に関するものであり、細胞接着を開始させるために本発明のコラーゲン様ポリマーの表面コーティングを必要とすることを理解すべきである。本発明の別の重要な側面は、本発明のコラーゲン様ポリマーを移植可能なバルク材料に結合させることができる方法に関する。前述のように、この結合は、コラーゲン様ポリマー化合物と移植可能なバルク材料の間の永久的相互作用をもたらす共有結合に関係づけられる。すなわち、移植可能なバルク材料に単に物理吸着されたポリマー又はペプチドは、細胞又は組織系内の他の生体分子との交換を受けることがあるのに対して、共有結合したポリマー化合物は、そういう影響は受けない。例えば、時間のたった物理吸着したポリマー又はタンパク質は、移植可能なバルク材料の表面から、アルブミンや免疫グロブリンのような大きなタンパク質によって置換されるが、一方共有結合したポリマー化合物は、こういう影響は受けにくい。本発明のコラーゲン様ポリマー化合物と移植可能なバルク材料の間に共有結合を起こすために、これら両方の本体上の活性基が挿入又は活用される必要がある。好ましくは、移植可能なバルク材料への結合を目的とする活性基は、コラーゲン様ポリマー化合物の末端又は末端付近に存在する。このように、移植可能なバルク材料へのコラーゲン様ポリマー化合物の結合は、コラーゲン様ポリマー化合物のコンホメーションに悪影響を与えることはあまりない。しかしこのことは、移植可能なバルク材料への結合を目的としてコラーゲン様ポリマー化合物鎖内の活性基を活用することが不可能であることを意味するわけではないが、このような場合には、コラーゲン様ポリマー化合物の活性とコンホメーションが不都合に崩壊されないよう保証することが必要であろう。機械的かつ場合により光学的に適切なバルク材料が、その表面上にコラーゲン様ポリマー化合物上の反応性基と反応することができる化学基を本来含有していないならば、当該分野において既知の表面修飾法の適用により、ある範囲の適切な化学基をバルク材料の表面に導入することができる。例えば、アルキルアミン蒸気を用いるプラズマ重合処理によって、表面アミン基を調製することができる (GriesserとChatelier，Journal of Applied Polymer Science，Vol.48，pp 361 -384，1990)。コラーゲン様ポリマー化合物と移植可能なバルク材料の間の化学結合の特に有用な例は、移植可能なバルク材料の表面上のアルデヒド又はカルボキシル基のいずれかと反応することができる、コラーゲン様ポリマー化合物上の末端第１級アミン基の活用を伴う。末端アミン基と表面アルデヒド基の間の結合を使用すると、シッフ塩基結合を生成させることができるが、一方表面カルボキシル基と末端アミン基の間の結合を使用すると、コラーゲン様ポリマーと移植可能なバルク材料の間にアミド結合を形成することができる。当該分野において周知のように、シッフ塩基結合は、可逆性であり、このため例えばシアノホウ水素化物のような適切な還元剤での処理により、有利にはこれらを還元してアミン結合にすることができる。また本発明のコラーゲン様ポリマーは、他の単位と共重合して移植可能なバルク材料を製造することが可能である。当然ながら、これら他の単位は、関係する特定のバルク材料での使用を適切にせしめる性質に基づいて、慎重に選択する必要があろう。例えば、移植可能なコンタクトレンズの場合には、本発明のコラーゲン様ポリマーと結合させるのに選択される単位は、眼内移植のために充分な安定性、透過性、強度、可撓性及び光学的性質を示すことが必要であろう。ここで本発明を、以下の非限定例を参照しながら更に説明する：実施例１：コラーゲン様ポリマー配列の細胞結合活性（ａ）合成コラーゲン様ポリマー配列（ｂ）合成コラーゲン様ポリマー配列の細胞毒性の測定：ウシ角膜から単離した細胞を使用して、一連のコラーゲン様ポリマー配列の生物学的適合性及び細胞毒性を評価した。確立された接着性細胞の培養物へのコラーゲン様ポリマーの添加を伴う、使用した測定法では、可溶化型のコラーゲン様ポリマーの総毒性を試験する。ストローマ繊維芽細胞を９６ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）培養トレーの反復試験ウェルに接種して、３７℃で４時間インキュベートし、これらを接着させた。これをコラーゲン様ポリマーの非存在下で行った。次に接種培地を、コラーゲン様ポリマーのそれぞれの連続希釈液（１．０mg/mlからゼロまでの最終濃度）を含有する新鮮培地で置換した。細胞をコラーゲン様ポリマー含有培地中で３７℃で４０時間インキュベートした。次に培地を除去して、各ウェルにＭＴＳ溶液を加え、更に４時間３７℃でインキュベートして、接着細胞の生存率を求めた。ウェル当たりの細胞の相対数は、比色定量法によりＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０nmの吸収波長で測定した。結果は表１（ａ）〜（ｉ）に示される。コラーゲン様ポリマーを培養下層に既に接着した細胞のため培地に加え、コラーゲン様ポリマーの存在下で４０時間細胞培養を続けたが、明らかな有害作用は検出されなかった。コラーゲン様ポリマーに暴露後なお生存している細胞の相対数は、暴露していない細胞で見られた数（表１（ａ）〜（ｉ）における０mg/mlのヒストグラムの「バー(bars)」）と同等であった。これらの結果は、コラーゲン様ポリマーが何の細胞毒性作用も持たないこと、特に、−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₉−コラーゲン様ポリマー配列が何の細胞毒性も持たないことを示している。この非細胞毒性という結果は、細胞結合活性を探索するために本コラーゲン様ポリマーを細胞培養アッセーにおいて使用できることを示している。表１（ａ）〜（ｉ）は、組織培養ポリスチレン上に接種し、４時間のインキュベーション後、ポリマー＃１〜４及び９５１２０〜９５１２４に暴露した、ウシストローマ繊維芽細胞の付着のアッセーを示している。ポリマー濃度（mg/ml）を４９０nmの吸光度に対してプロットした。（ｃ）細胞接着の阻害による、合成コラーゲン様ポリマー配列の細胞結合活性の検出合成コラーゲン様ポリマー配列は、細胞結合活性を有する特異的配列に一致する細胞表面での特異的結合反応について評価した。このアッセーは、溶液中のコラーゲン様ポリマーを使用し、細胞の接種時にこのコラーゲン様ポリマーを加えることにより、このコラーゲン様ポリマーが、培養下層への細胞の初期接着のインヒビターとして作用するかどうかを求めることを含む。コラーゲン様ポリマーが、細胞膜受容体部位に対する有効な競合を可能にする細胞結合活性を有するならば、コラーゲン様ポリマーは細胞接着を阻害するが、そうして減少した細胞接着は、コラーゲン様ポリマーが細胞結合活性を有する証拠である。これらの研究は、角膜ストローマ繊維芽細胞及び角膜上皮細胞で行った。ストローマ繊維芽細胞を、上の（ｂ）項に記載されたのと同じ連続希釈範囲のコラーゲン様ポリマーを含有する培地中で９６ウェルＴＣＰＳ培養トレーの反復試験ウェルに接種した。細胞を３７℃で２５時間インキュベートし、次に培地を除去して、前述のＭＴＳで置換した。この終了時点で、コラーゲン様ポリマーが存在しないか、又はコラーゲン様ポリマーが存在する状況について、下層に接着した細胞の相対数を上の（ｂ）に記載されたように比色法により測定した。ポリマー＃１〜＃４のセットについて、コラーゲン様ポリマーを含まない対照ウェルで見られる数に比較して、コラーゲン様ポリマーの存在下で検出された細胞の相対数に差はなかった(表２（ａ）〜（ｉ）)。試験した５つのコラーゲン様ポリマー配列の第２のセットでは、しかしながら、コラーゲン様ポリマーの２つが、１mg/ml及び０．５mg/mlの最高濃度で細胞接着を減少させることができた( 表２（ｇ）及び２（ｈ）)。これらの２つのコラーゲン様ポリマーは、ポリマー＃９５１２１（配列Ａｃ−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₉−ＮＨ₂を有する単一鎖）及びポリマー＃９５１２２（ＫＴＡにカップリングした同じ配列のトリプレット）であった。阻害作用は、０．５mg/ml未満のコラーゲン様ポリマー濃度では低下した。代替配列−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ)_n−の長鎖又は短鎖を含有する、試験した他のコラーゲン様ポリマーが細胞接着を減少させなかったため、阻害作用は、この配列に特異的であった。したがって上記アッセー条件下で、試験したどの合成コラーゲン様ポリマーも正常な代謝プロセスを妨害しなかった（上のｂ項を参照のこと）が、これらの２つは、コラーゲン様ポリマー濃度＞０．２５ mg/mlで存在するとき細胞結合活性(ＴＣＰＳ細胞培養基質へのウシ角膜繊維芽細胞の接着を妨害するこれらの能力に基づく）が証明された（これら２つのコラーゲン様ポリマーは配列−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_n−を含有する)。表２（ａ）〜（ｉ）は、ポリマー＃１〜４及び９５１２０〜９５１２４の存在下で組織培養ポリスチレンに接種したウシストローマ繊維芽細胞の接着のアッセーを示している。ポリマー濃度（mg/ml）を４９０nmの吸光度に対してプロットした。また、細胞の初期接着を阻害する配列−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_n−を含有するコラーゲン様ポリマーの能力を角膜上皮細胞について測定した。継代数１のウシ角膜上皮細胞を、連続希釈（１：２）したコラーゲン様ポリマー（最大１mg/ml）濃度の存在下でＴＣＰＳ上に接種して、無血清培地、又は２０％（v/v ）血清を含有する培地（細胞接着性糖タンパク質の、フィブロネクチン及びビトロネクチンを枯渇させた、UnderwoodとBennett，1989）のいずれか中で２４時間培養した。血清からのフィブロネクチン及びビトロネクチンの除去によって、外来の細胞接着因子が、本アッセーにおいて顕著な役割を果たさず、またコラーゲン様ポリマーによる作用を遮蔽しないことを保証した。付着性細胞の数は、ＭＴＳに基づく方法を使用し、次にプレートリーダーで４９０nmの吸光度を測定して、比色法により測定した。角膜上皮細胞の接着は、無血清培地単独に比較して、１．０mg/mlのポリマー＃９５１２１（配列Ａｃ−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₉−ＮＨ₂−を含む単一鎖）を含有する培地では８５％減少した。同様に、２０％（v/v）枯渇血清を含有する培地で培養すると、このコラーゲン様ポリマーは、ＴＣＰＳへの角膜上皮細胞の接着を５０％減少させた(表３(ｂ))。０．５mg/mlのポリマー＃９５１２１を含有する無血清培地は、細胞接着を２０％減少させた。３つの鎖［Ｇｌｙ−( Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₉−ＮＨ₂］に結合したＫＴＡ鋳型よりなる、ポリマー＃９５１２２も、無血清培地中で最高濃度で使用すると、角膜上皮細胞の接着を阻害することが見出された。１．０mg/mlのポリマー＃９５１２２を含有する無血清培地は、角膜上皮細胞接着を２７％減少させたが、一方０．５mg/mlのコラーゲン様ポリマー濃度では、１９％の減少であった。この作用は、これより低い濃度では低減した(表３(ｃ))。単一配列Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ−ＮＨ₂を含有するポリマー＃９５１０６は、他の２つのコラーゲン様ポリマーの短配列対照として試験に加えた。このコラーゲン様ポリマーは、いずれの濃度でも、どちらの培地においても細胞接着の阻害はなかった(表３(ａ))。表３（ａ）〜（ｃ）は、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ−ＮＨ₂(ａ)、Ａｃ −(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₁₀−ＮＨ₂（ｂ）及びＫＴＡ−[Ｇｌｙ−(Ｇｌｙ −Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₉−ＮＨ₂]₃の存在下で接種後の、組織培養ポリスチレンへのウシ角膜上皮細胞の接着のアッセーを示す。ポリマー濃度（mg/ml）を４９０n mの吸光度に対してプロットした。これらの結果は、−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₉−配列を含有するコラーゲン様ポリマーが、血清の存在下と非存在下の両方で、組織培養ポリスチレンへの角膜上皮細胞の接着を有効に阻害したことを示している。したがって、コラーゲン様ポリマー配列は、角膜ストローマ繊維芽細胞と角膜上皮細胞の両方の接着を妨害したが、このことはこの配列が細胞結合活性を有することを示している。更には、代替配列−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)_n−の効力を求めた。この代替配列−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₁₀−コラーゲン様ポリマーは、実験室規模でカリフォルニア大学サンジエゴ校（University of California，San Diego）( ＵＣＳＤ)のグループにより調製し、そして彼らの指導の下商業的規模でサンジエゴのバイオリサーチ（BioResearch of San Diego）により調製した。角膜上皮細胞は、７日間培養し、その後、ＭＴＴテトラゾリウム塩（プロメガ（Promega ）細胞増殖アッセー）への暴露後に細胞が産生するホルマザン生成物の量を比色的に測定することにより培養液中の相対数を求めた。以下の遊離コラーゲン様ポリマーは、コラーゲン様ポリマー含有培地の存在下で細胞を接種したとき、ＴＣＰＳへの上皮細胞の接着を阻害する能力について評価した：２つの市販の「ＲＧＤ」含有ペプチドは、細胞結合活性を有しており、かつ細胞接着を促進することが知られている（PierschbacherとRuoslahti，1984，1987 ）が、これらを接着競合アッセーの対照として使用した：ｉ）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ(ＲＧＤＳＰＣ、カタログ＃Ｐ０１１)、テリオス・ファーマシューティカルズ（Telios Pharma ceuticals）から入手、及び ii）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ(ＲＧＤＳＰＫ、カタログ＃１２１４５−０１７）、ライフ・テクノロジーズ社（Life Technol ogies Inc.）から入手。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）への角膜上皮細胞の接着は、いずれの−( Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)_n−コラーゲン様ポリマーの存在下でも阻害されなかった(表４（ａ）〜(ｃ))。角膜上皮細胞の接着は、短い配列反復単位(Ａｃ−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₃−ＮＨ₂)、ポリマー＃９６１２７、表４(ａ)、又はこれより長い反復単位（Ａｃ−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₁₀−ＮＨ₂）(バイオリサーチ（BioResearch）市販バージョン)、表４（ｂ）のいずれによっても、無血清又は血清含有条件下のいずれでも阻害されなかった。ＧＲＧＤＳＰＫ対照ペプチド（表４(ｃ)；５(ｃ)）だけが、この実験においてＴＣＰＳへの角膜上皮細胞の接着の阻害を示し、血清の非存在下で接着した細胞の数を約３０％減少させた (５９５nmでの吸光度の読みの低下により表される)。細胞接着競合アッセーにおいて使用した代替−（Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ）_n−配列を含むコラーゲン様ポリマーでは、一貫して無血清及び血清含有条件下の両方で角膜上皮細胞の接着を減少させることができなかった。これらのコラーゲン様ポリマーを使用して、ポリマー配列−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ −Ｎｌｅｕ)_n−の反復単位の数が、この配列の存在下で細胞を接種するとき、角膜上皮細胞の接着として明らかな細胞結合活性に影響するかどうかを決定した。ＴＣＰＳへの角膜上皮細胞の接着はまた、更に短い、すなわち＜９の−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_n−配列（ｎ＝２〜ｎ＝７、ポリマー＃９６１１８〜＃９６１２２）の存在下でも影響を受けなかった。代表的ヒストグラム（表５（ａ）〜（ｃ）を参照のこと）は、コラーゲン様ポリマーを含有しない対照ウェルに比較して、コラーゲン様ポリマーの存在下で接着した細胞の数には測定可能な減少がなかったことを示している。表４（ａ）〜（ｃ）は、Ａｃ−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₃−ＮＨ₂(ａ)、Ａｃ−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₁₀−ＮＨ₂（ｂ）及びＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ −Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓの存在下で接種後の組織培養ポリスチレンへのウシ角膜上皮細胞の接着のアッセーを示している。ポリマー濃度（mg/ml）を５９５nmの吸光度に対してプロットした。表５（ａ）〜（ｃ）は、Ｈ−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₃−ＮＨ₂(ａ)、Ｈ− (Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₅−ＮＨ₂（ｂ）及びＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓの存在下で接種後の組織培養ポリスチレンへのウシ角膜上皮細胞の接着のアッセーを示している。ポリマー濃度（mg/ml）を５９５n mの吸光度に対してプロットした。これらの結果は、式（Ｉ）: −(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_(y)− （Ｉ）｛式中、（ｙ）は、≧９を意味する｝で示される配列を有するコラーゲン様ポリマーが、ｉ）−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_n−を含有する配列は、インビトロで細胞接着を阻害するのに有効である(ここで、反復数（「ｎ」）は、少なくとも９である) 。これは、シングレットとＫＴＡ−トリプレットバージョンの両方で起こり、２つの異なる細胞型の上皮細胞と繊維芽細胞について証明された； ii）この作用は、ｎが１０反復長以下である場合を含む代替配列−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)_n−が、インビトロで角膜上皮細胞の接着に何の作用も及ぼさないため、全く−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ）配列に特異的である、ことにより示される、細胞結合活性を有することを示している。この実施例に対応する参考文献は以下の通りである：Pierschbacher，M.D.とR uoslahti，E.，(1984)Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:5985；Pierschbacher， M.D.とRuoslahti，E.，(1987)J．Biol．Chem.，262:17294；Underwood，P.A.とB ennett，F.A．(1989)J．Cell．Sci.，93:641(これらは、参照することによりその全体をそれぞれ本明細書の一部とする)。実施例２：移植可能なバルク材料へのコラーゲン様ポリマーの化学結合コラーゲン様ポリマー又はコラーゲン様ポリマーのケンプ三酸付加物は、当該分野において既知の幾つかの界面共有結合法によって、合成表面上に共有結合的に永久に固定することができる。例えば、末端第１級アミン基を備え付けたコラーゲン様ポリマー分子(構造１)、構造１：アミン末端官能基化コラーゲン様ポリマー分子の構造を利用することが実際的である(なぜならば、このようなアミン官能基化コラーゲン様ポリマー分子は、第１級アミン基と反応することができる種々の化学基を有する表面上に、幾つかの界面共有結合反応スキームにより固定することができるためである)。アミン末端官能基化コラーゲン様ポリマーを共有結合により固定化することができる表面の例は、以下を含む：（ａ）反応性表面アルデヒド基による活性化移植可能なバルク材料が反応性表面アルデヒド基を含有しないならば、このようなアルデヒド基は、確立された表面修飾法（例えば、表面ヒドロキシル基をグルタルアルデヒドと反応させる）(Gotohら，Journal of Membrane Science，41 ，1989，291-303；ZhuangとButterfield，Journal of Membrane Science，66，1 992，247-257)を使用して調製するか、又はガスプラズマ法により表面アルデヒド基を調製することができる。アミン末端コラーゲン様ポリマー分子が表面アルデヒド基と反応して、シッフ塩基結合を形成後、次にこの結合を場合によりシアノ水素化ホウ素ナトリウムで安定化して、−ＮＨ−ＣＨ₂−結合を生成させ、アミンとアルデヒド基への緩慢な熱誘導性の復帰に対する抵抗性を付与する。（ｂ）反応性表面カルボニル基による活性化一例として、第１工程において、機械的及び場合により光学的に適切な移植可能なバルク材料を、アミン基を含有する薄いプラズマポリマーでコーティングし (GriesserとChatelier，Journal of Applied Polymer Science:Applied Polymer Symposium，46，1990，361-384)；少なくとも２つのカルボン酸基、又は例えば加水分解（例えば、塩化スクシニル、ＰＥＧ−ジカルボキシラート、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸、ＰＡＭＡＭ−ＣＯＯＨ星形樹状体）によりカルボン酸基を形成することができる少なくとも２つの官能基を含有する中間体試薬分子を次にアミン表面と反応させて、ＥＤＣ／ＮＨＳ触媒反応により界面アミド結合を形成するが、この触媒反応は、これに続くコラーゲン様ポリマーとバルク材料の間のアミド結合を形成するアミン末端官能基化コラーゲン様ポリマーとの反応のために、遊離カルボン酸及び／又はカルボキシラート基を合成材料から離れるように配向させる。この状況は、上の説明により当業者には既に開示されているが、本発明の優先権書類AU 6862/97の図７及び８に更に例示されており、該図面の開示は参照することにより本明細書の一部とする。同様に、ケンプ三酸付加物を共有結合させるための界面結合反応スキームは、確立された化学反応の一般的知識に基づいて設計することができる。例えば、ＫＴＡ付加物は、アルキルアミンプラズマ修飾表面又はアルデヒド含有表面に結合したビスアミノ−ＰＥＧスペーサーとのアミド結合を形成することができる。コラーゲン様ポリマーとバルク材料の間のこのような結合反応スキームは、本発明の優先権書類AU 6842/97の図１〜８に例示されており、該図面の開示は参照することにより本明細書の一部とする。代表的コラーゲン様ポリマー固定反応の充分な説明、及び固定コラーゲン様ポリマー配列を含有する表面の生物学的活性を説明する結果は、以下に含まれる。実施例３：ＦＥＰへのペプトイド構成コラーゲン様ポリマーのカップリングこの項では、合成コラーゲン様ポリマー配列を、それ自体では細胞コロニー化を支持しない表面（フッ素化エチレンプロピレン、ＦＥＰ）上にカップリングさせるために使用した手順を記載する。コラーゲン様ポリマーを表面上に固定したことを証明する表面分析結果を記載する。７日間にわたって表面上のウシ角膜上皮細胞の接着及び増殖を測定することにより、固定合成コラーゲン様ポリマー配列を含有する表面の生物学的評価を行った。１．方法(ａ)：ＦＥＰ基質への合成コラーゲン様ポリマー配列のカップリングの記述と特性付け以下のコラーゲン様ポリマーをこれらの実験に使用した：ＦＥＰに沈着させたアセトアルデヒドプラズマポリマー（ＡＡｐｐ）又はヘプチルアミンプラズマポリマー（Ｈａｐｐ）を使用して、コラーゲン様ポリマー分子上の遊離アミン基の存在を通しての合成コラーゲン様ポリマー配列の結合を達成した。ａ）アセトアルデヒドプラズマポリマー：ＲＦプラズマ中でアセトアルデヒドモノマーにＦＥＰを暴露することにより、表面活性化に取りかかった。このプロセスによって、表面上にアルデヒド基が形成され、次にこれを反応させてコラーゲン様ポリマー表面結合を形成することができた。過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ₃）を還元剤として使用した。ｂ）ヘプチルアミンプラズマポリマー：ＲＦプラズマ中でへプチルアミンプロセス蒸気を使用する表面活性化によって、表面上にアミン基を生成し、次にこれをスクシニル化して表面上にカルボキシル基を生成した。アミン含有コラーゲン様ポリマーは、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用してカルボキシル基にカップリングした。別のスキームでは、ヘプチルアミンプラズマポリマーで処理したＦＥＰ表面上のアミンを、コラーゲン様ポリマーカップリング法の中間体として星形樹状体に暴露した。各樹状体分子上の多数（３２）のカルボン酸基は、スクシニル化法よりも高いカルボン酸基の表面密度を与え、かつ高度の組み込まれた冗長性を与えた。アセトアルデヒドプラズマポリマー沈着：フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）テフロン（Teflon）１００Ａ型デュポン（DuPont）(幅１２．７mm)は、受領したまま使用し、プラズマポリマーを特注プラズマ装置中で、ジャバック（Java c）ＤＤＬ３００ロータリー高真空ポンプ及びＥＮＩＨＰＧ−２高周波プラズマ発生機を利用してプラズマポリマーを沈着させた。アセトアルデヒドモノマーは、アルドリッチ（Aldrich）(９９％、カタログ＃１１，００７−８、分子量４４．０５)から購入したまま使用した。処理条件（反応器ベース圧力(Ｐ_b)、モノマー圧力(Ｐ_m)、プラズマ点火電力（Ｐ）及びプラズマ周波数(Ｆ)、プラズマ処理継続時間(Ｔ)、処理中のモノマー流量と圧力）は、全て注意深く監視して制御した。Ｐ_b＝０．０２５Torr、Ｐ_m＝０．３００Torr、Ｐ＝５ワット、Ｆ＝１２５ kHz、Ｔ＝６０秒という標準的条件を使用した。ヘプチルアミンプラズマポリマー沈着：ヘプチルアミンモノマーは、アルドリッチ（Aldrich）(９９％、カタログ＃１２，６８０−２、分子量１１５．２)から購入したまま使用した。同様なプラズマ装置を以下の条件（Ｐ_b＝０．０１５T orr、Ｐ_m＝０．１３０Torr、Ｐ＝２０ワット、Ｆ＝２００kHz、Ｔ＝２０秒）で使用した。ＨＡｐｐ表面をスクシニル化するために、新たに調製した試料（＜２時間経過）をアセトン中の塩化スクシニルの１０％（v/v）溶液２５mlに入れて、アセトン中で２回洗浄し、次いでアセトンに１時間浸漬した。次に試料を水中で２回洗浄してミリＱ（MilliQ）水に１時間浸漬した。星形樹状体の付着のために、新たに調製したへプチルアミン表面を、樹状体（ＰＡＭＡＭジェネレーション（Generation）２．５、アルドリッチ（Aldrich）カタログ＃４１２４１−４、分子量６０１１、１樹状体当たり３２個のカルボキシル）の溶液（１mg/ml）に１時間暴露して、カルボキシル含有樹状体を表面上のアミンと反応させた。次にＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド） (シグマ(Sigma)、カタログ＃Ｅ０３８８)及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）(アルドリッチ(Aldrich)、カタログ＃１３０６７−２、分子量１１５．０９)をそれぞれ１９．２及び１１．５mg/l で加えて急速に混合した。続く６０分の間、ＦＥＰの下面に形成される気泡を頻繁に除去した。この反応を室温で一晩進行させた。コラーゲン様ポリマー結合／検出合成コラーゲン様ポリマー配列を、アセトアルデヒド結合には無菌リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７．４に５０μg/mlの最終濃度まで、又はヘプチルアミン結合には無菌ミリＱ（MilliQ）水（リン酸はＥＤＣ／ＮＨＳ反応を妨害する）に溶解することにより、コラーゲン様ポリマーコーティング溶液を調製した。ポリマー＃９６１２３を接着研究のためのモデルポリマーとして使用した。新たに調製したＡＡｐｐ表面（＜２時間経過）を持つＦＥＰ試料をこのコーティング溶液と反応させた(４℃で一晩及び次いで室温で２時間)。過剰のＮａＣＮＢＨ₃（シグマ(Sigma)、９０％、カタログ＃Ｓ−８６２８、ロット＃３３Ｈ３６６９、分子量６２．８４）を加えた。次に試料を無菌ミリＱ水中で洗浄（３×５分）し、ＸＰＳによる分析に備えて空気乾燥した。スクシニル化した表面及び星形樹状体ＨＡｐｐ表面を、コラーゲン様ポリマー含有溶液と１時間反応させた。これによって、アミン含有コラーゲン様ポリマーを表面上のカルボキシル基に吸着させた。次にＥＤＣ及びＮＨＳをそれぞれ１９．２及び１１．５mg/lで加えて急速に混合した。続く６０分の間、ＦＥＰの下面に形成される気泡を頻繁に除去した。この反応を室温で一晩進行させた。ＦＥＰ試料を水で３回洗浄し、次に水に１時間浸漬して、ＸＰＳによる分析に備えて空気乾燥した。コラーゲン様ポリマー−ＦＥＰ結合の強度に及ぼす還元剤の効果を評価するために、ＮａＣＮＢＨ₃又はＥＤＣ／ＮＨＳを使用して、及び使用しないで試料を調製して、オートクレーブ（１５分、１２０PSI）にかける前後に分析（ＸＰＳ）した。試料を調製して以下のコードの下で同定した：コラーゲン（ビトロジェン（Vitrogen）１００、コラーゲン社(Collagen Corp )、パロアルト、カリフォルニアリ州、米国）結合表面は、この組合せが、良好なＢＣＥｐ細胞接着及び増殖を支持することが以前に示されたため、細胞コロニー化測定法において陽性対照として含めた。コーティング手順の特性付けは、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）(クラトス（Kra tos）ＡＸＩＳＨＳｉ、モノクロメータを伴う)を使用して行い、これによって表面元素組成の定量分析を行うことができた。フッ素(ＦＥＰ)、酸素とカルボニル残基（プラズマポリマー）及び窒素（ポリマー及びヘプチルアミンプラズマポリマー）を表面修飾の指標として使用した。１．方法(ｂ)：合成コラーゲン様ポリマー配列を含有する表面の細胞培養評価ＦＥＰに結合したコラーゲン様ポリマーへのウシ角膜上皮（ＢＣＥｐ）細胞接着及び増殖：合成コラーゲン様ポリマー配列は、上記方法を用いてＦＥＰフィルムに共有結合させた。固定化コラーゲン様ポリマーにより与えられる細胞増殖支持体の量を測定するために、ＢＣＥｐ細胞を７日間培養した。この培養期間の後、６日目に³⁵Ｓ−メチオニンで細胞を代謝的に標識して、更に７時間の培養後に取り込まれた³⁵Ｓの量を測定するか、又はＭＴＴテトラゾリウム塩（プロメガ（ Promega）細胞増殖アッセー）に暴露後の細胞が産生するホルマザンの量を比色定量することにより、相対数を求めた。培地には、細胞接着性糖タンパク質のフィブロネクチン及びビトロネクチンを枯渇させた２０％（v/v）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有させた(UnderwoodとBennett，1989)。血清からのフィブロネクチンとビトロネクチンの除去によって、外来の細胞接着因子が、本アッセーにおいて顕著な役割を果たさず、また結合したコラーゲン様ポリマーによる作用を遮蔽しないことを確実にした。２．結果と考察(ａ)：モデル基質へのコラーゲン様ポリマーのカップリングの記述と特性付け：アセトアルデヒドプラズマ：ＦＥＰ上のアセトアルデヒドプラズマポリマーのＸＰＳ分析（表Ａ）は、フッ素シグナルが存在しないことを示しており、このことは、Ａａｐｐフィルムコーティングが少なくとも１０〜１５nmの厚さ（ＸＰＳのサンプリング深度）であることを示している。酸素とカルボニルの取り込みは、ＡＡｐｐ沈着による表面活性化の更なる指標である。これらの表面を、ポリマー＃９６１２３を含有する溶液（５０μg/ml）と接触させると、窒素の取り込み（ポリマーを示す）が検出された。この取り込みは、コーティング溶液におけるＮａＣＮＢＨ₃の存在下及び非存在下の両方で起こった。ポリマー結合の強度を評価するために、ＮａＣＮＢＨ₃を含むコーティングと含まないコーティングをオートクレーブにかけた。還元剤の存在下及び非存在下の両方で、オートクレーブのプロセスにおいて幾らかの窒素シグナルが消失した（未結合ポリマーの除去及びあるいは過酷なオートクレーブ工程の熱作用を示す）が、ＮａＣＮＢＨ₃の存在下ではより高い窒素シグナルが保持されていた；この観察は、アミン界面結合に比較してのシッフ塩基の知られていろ熱安定性の低さと一致している。コラーゲン様ポリマーをＡＡｐｐのないＦＥＰ表面に吸着させると、窒素は表面上に見い出されなかった(表Ａ)；すなわち、物理吸着は非常に無効であり、このため本発明のコラーゲン様ポリマーをＦＥＰに基づくバルク材料上に固定したい場合の選択肢にはならない。表Ａ：アセトアルデヒドプラズマポリマーへのポリマー９６１２３の付着のＸＰＳ分析の結果ＸＰＳの定量分析の結果は、ポリマー付着の密度が１．８〜７．２nm²当たり１モルの範囲にあることを示唆する。この値は、配向した密に詰まった共有結合したポリマー層の形成が起こることを期待してはおらず；むしろ、ポリマー分子の部分的折り畳みを考慮した、付着ポリマーのスケーリング理論の記述がより適していると思われるため、妥当であると考えられる。ヘプチルアミンプラズマ：ヘプチルアミンプラズマポリマー処理後、ＦＥＰからのフッ素シグナルは検出されず、窒素が検出されたが、このことは＞１０nm厚さのヘプチルアミンプラズマポリマーの存在を示している。スクシニル化及びポリマー＃９６１２３の溶液中でのＨＡでコーティングしたＦＥＰのインキュベーション後、ＥＤＣ／ＮＨＳの存在下及び非存在下の両方で窒素シグナルの上昇が観察された(表Ｂ)。オートクレーブ後、ＥＤＣ／ＮＨＳ有りと無しの両方で窒素シグナルは表面から消失した（結合ポリマーの除去）が、ＥＤＣ／ＮＨＳの存在下ではより高い窒素シグナルが保持されていた。これらの結果の解釈は、ヘプチルアミンプラズマポリマーとポリマーの両方で、窒素が存在することにより複雑になった。しかしＸＰＳＮ１ｓシグナルの高精度分析では、コラーゲン様ポリマーの付着後、アミドからアミン窒素シグナルの顕著な上昇があったことが判った。コラーゲン様ポリマー分子は、アミド窒素結合を含有しており、この結果は、ポリマーの共有結合を示している。表Ｂ：ヘプチルアミンプラズマポリマーへのポリマー９６１２３の付着のＸＰＳ分析の結果これらの結果は、合成コラーゲン様ポリマーは、アセトアルデヒド及びヘプチルアミンプラズマ重合の両方を使用した活性化後のＦＥＰ表面上に存在することを示している。オートクレーブ後、コラーゲン様ポリマーは表面に付着したままであった。コラーゲン様ポリマーが付着した表面は、両方の付着方法を使用して調製して、以下に考察されるようにインビトロの細胞コロニー化の支持について評価した。２．結果と考察(ｂ)：細胞培養評価固定化コラーゲン様ポリマー上のＢＣＥｐ細胞増殖：ＢＣＥｐ細胞を、コラーゲン様ポリマーが共有結合により付着したプラズマ修飾ＦＥＰ表面に接種した。細胞を７日間培養して、６日目に³⁵Ｓ−メチオニンで代謝的に細胞を標識して、取り込まれた³⁵Ｓの量を測定するか、又はＭＴＴテトラゾリウム塩（プロメガ（ Promega）細胞増殖アッセー）に暴露後の細胞が産生するホルマザンの量を比色定量することにより、相対数を求めた。表６は、共有結合した合成コラーゲン様ポリマー配列を含有する表面が、陽性対照表面の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）と同様なレベルで細胞コロニー化を支持したことを示している。これらの結果に基づくと、プラズマフィルムの沈着によるＦＥＰ表面の活性化を伴う方法によるＦＥＰ表面へのコラーゲン様ポリマーの固定化によって、ＢＣＥｐ細胞接着が強化された表面を製造できた。実施例４：共有結合で固定化した−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ−及び−Ｇｌｙ− Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ−配列上の角膜上皮細胞の接着及び増殖細胞の接着及び増殖を支持するコラーゲン様ペプトイド配列の能力は、これらの配列を表面に共有結合させるとき、以下の通り試験した。ばらばらのウシ角膜上皮細胞（細胞培養継代数２）を一連の表面上に接種した。これらの表面は、架橋ポリマーの沈着（ヘプチルアミン、ＨＡｐｐ、プラズマ処理中のモノマーを使用する、ＲＦプラズマ処理による）によりフルオロエチレンプロピレン（ＦＥＰ）フィルムの上面に作成した。このプラズマ沈着ポリマー表面上に、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）スペーサー分子及び次に種々の末端残基を共有結合させた。これらの末端残基には、２つのコラーゲン様ペプトイド配列、Ｈ−( Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₁₀−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂（ＧＰＮｌ）及びＨ−( Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₁₀−ＮＨ₂（ＧＮＩＰ）が含まれた。他の表面としては、以下の対照表面を含めた：ウシＩ型コラーゲン、ウシ血漿フィブロネクチン、ポリリシン、ウシ血清アルブミン。中間体表面作成体のＣＭＤ単独表面も対照として含めた。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）表面は、この表面が細胞の接着及び増殖を支持するため、陽性対照表面として使用した。角膜上皮細胞は、２０％（v/v）の処理ウシ胎児血清を補足した培地で培養した。この血清は、細胞接着性糖タンパク質である、フィブロネクチンとビトロネクチンを前もって枯渇させた。この処理プロセスの結果として、この血清は、それ自体では細胞接着を支持せず、そして本試験において観察された細胞接着活性は、細胞と共に材料表面自体の活性に帰すことができる。培地は２日毎に補充し、そうして接着していない細胞を培養２、４及び６日目に除去した。７日培養後、種々の表面に接着した細胞の数は、ホルマザン染料に基づくアッセー（ＭＴＴを使用する）を用いて測定した。細胞数は、ＴＣＰＳ対照表面に接着した細胞の数を１００％として、これの平均百分率（±平均値の標準偏差）として表した。ＣＭＤ単独の表面は、細胞の接着及び増殖の支持が最小であった(４±１％)。同様に、結合ウシ血清アルブミン又は結合ポリリシンを含有する対照表面は、低レベルの活性を支持しただけであった(アルブミン表面では２２±６％；ポリリシン表面では２７±１２％)。結合フィブロネクチンを含有する表面は、期待通り有効な細胞接着及び増殖を支持し(７１±１４％)、そして結合Ｉ型コラーゲン表面は細胞接着及び増殖を支持した(６１±３％)。固定化コラーゲン様ペプトイド配列のＨ−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₁₀−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂は、非常に有効に、ＴＣＰＳ対照表面上の５２±４％のレベルで角膜上皮細胞の接着及び増殖を支持した。しかし代替コラーゲン様ペプトイド配列のＨ−(Ｇｌｙ−Ｎｌｅｕ−Ｐｒｏ)₁₀−ＮＨ₂は、ＴＣＰＳ対照の６±２％の活性で、細胞の接着及び増殖を支持しなかった。固定化コラーゲン様ペプトイド配列のＨ−(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)₁₀−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂が、細胞の接着及び増殖の支持に活性であると結論した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スティール，ジョンジェラードオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2151 ノースロックスザキャリッジウェイ７ (72)発明者ジョンソン，グラハムオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2210 ピークハーストムーンバラアベニュー 10 (72)発明者グッドマン，マレーアメリカ合衆国カリフォルニア 92037 ラホヤブラックゴールドロード 9760 (72)発明者グリーザー，ハンスヨルグオーストラリア国ビクトリア 3792 ザパッチビューロード 20 (72)発明者マクリーン，キースマイケルオーストラリア国ビクトリア 3194 マントンプラマーロード 66 (72)発明者ブーメル，ヘリットジャンオランダ国エヌエル―3927 ベーエーレンスウォーデドルプスストラート 84

Claims

【特許請求の範囲】１．その表面に１つ以上のバイオポリマー化合物（該バイオポリマー化合物は、少なくとも１つのペプトイド残基を含む）を共有結合させたバルク材料を含む、生物学的適合性材料。２．該バルク材料が、金属、金属合金、プラスチックポリマー又はセラミックを含む、請求項１記載の生物学的適合性材料。３．該バイオポリマー化合物が、ペプトイド残基を含むバイオポリマーの多量体付加物を含む、請求項１又は２記載の生物学的適合性材料。４．該多量体付加物が、ケンプ三酸付加物である、請求項３記載の生物学的適合性材料。５．該バイオポリマー化合物が、第１級アミン基を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の生物学的適合性材料。６．そこへの細胞接着を開始させることができるコラーゲン様バイオポリマー化合物であって、１つ以上のペプトイド残基を含むポリマー化合物。７．該ポリマー化合物が、式（Ｉ）: −(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_(y)− （Ｉ）｛式中、（ｙ）は、≧９を意味する｝で示される配列を含む、そこへの細胞接着を開始させることができる、請求項６記載のポリマー化合物。８．請求項６又は７記載のポリマー化合物のケンプ三酸付加物を含む、ポリマー化合物。９．第１級アミン基を含む、請求項６〜８のいずれか１項記載のポリマー化合物。１０．該共有結合が、該表面上のアルデヒド又はカルボキシル基と、該第１級アミン基との間にある、請求項４記載の生物学的適合性材料。１１．該共有結合が、場合により更にアミン結合に還元されている、シッフ塩基結合を含む、請求項１０記載の生物学的適合性材料。１２．該共有結合が、アミド結合を含む、請求項１０記載の生物学的適合性材料。１３．創傷修復材料、コンタクトレンズ、合成上角膜形成材料、合成皮膚又は結合組織、整形外科用インプラント、人工関節又は合成動脈表面、合成神経組織、人工器官、血液接触装置の構成要素、抗原／抗体検出キット、免疫測定法、親和性マトリックス又は他の合成生物活性装置若しくは材料を包含する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の生物学的適合性材料。１４．少なくとも１つのペプトイド残基及び第１級アミン基を含むバイオポリマー化合物を、バルク材料に結合させる方法であって、（ａ）該バルク材料の表面上にアルデヒド又はカルボキシル基を調製し；（ｂ）該第１級アミン基をアルデヒド又はカルボキシル基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む方法。１５．該共有結合が、場合により更にアミン結合に還元されている、シッフ塩基結合を含む、請求項１４記載の方法。１６．該共有結合が、アミド結合を含む、請求項１４記載の方法。１７．移植可能なバルク材料であって、該バルク材料の表面に共有結合させた、請求項８又は９記載の１つ以上のポリマー化合物を含む材料。１８．コラーゲン様ポリマー化合物を、移植可能なバルク材料に結合させる方法（ここで、該ポリマー化合物は、細胞接着を開始させることができ、このポリマー化合物は、１つ以上のペプトイド残基及び第１級アミン基を含む）であって、（ａ）該移植可能なバルク材料の表面上にアルデヒド又はカルボキシル基を調製し；（ｂ）該第１級アミン基をアルデヒド又はカルボキシル基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む方法。１９．コラーゲン様ポリマー化合物を、移植可能なバルク材料に結合させる方法（ここで、該ポリマー化合物は、細胞接着を開始させることができ、このポリマー化合物は、式（Ｉ）: −(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_(y)− （Ｉ）［式中、（ｙ）は、≧９を意味する］で示される配列、及び第１級アミン基を含む）であって、（ａ）該移植可能なバルク材料の表面上にアルデヒド又はカルボキシル基を調製し；（ｂ）該第１級アミン基をアルデヒド又はカルボキシル基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む方法。２０．コラーゲン様ポリマー化合物を、移植可能なバルク材料に結合させる方法（ここで、該ポリマー化合物は、細胞接着を開始させることができ、このポリマー化合物は、式（Ｉ）: −(Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕ)_(y)− （Ｉ）［式中、（ｙ）は、≧９を意味する］で示される配列を含むポリマー化合物のケンプ三酸付加物を含む）であって、（ａ）該移植可能なバルク材料の表面上にアミン基を調製し；（ｂ）該アミン基を該ケンプ三酸付加物上のカルボン酸基と反応させて、共有結合を形成させる、工程を含む方法。