WO2001073445A2 - Verfahren zur bestimmung von löslichem fibrin - Google Patents

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Roland Hansen
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Schleuning Wolf Dieter
Roland Hansen
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators

Definitions

  • the invention relates to a method for determining soluble fibrin.
  • the method relates to the specific and highly sensitive measurement of soluble fibrin using the Desodus rotundus saliva plasminogen activators (DSPA).
  • DSPA Desodus rotundus saliva plasminogen activators
  • the thrombosis incidence is estimated at 1: 1000 per year with a high mortality rate (Witt I. APC resistance (factor V mutation): clinical significance, pathophysiology and diagnostics. Dt ⁇ videblatt 1998; 95: A 2316-2323) , Timely diagnosis of the prethrombotic condition would allow disease-preventing antithrombotic measures.
  • test methods currently available for activation parameters of blood coagulation such as the detection of prothrobin fragments 1 + 2 or thrombin-antithrombin complexes, are time-consuming ELISA methods whose
  • soluble fibrin Another possible parameter for the detection of an activated coagulation is soluble fibrin. All previously available detection methods for soluble fibrin have serious deficiencies that make their use in routine diagnostics difficult or very complex. Stalten. Methods that detect soluble fibrin by its physical material properties, for example by precipitation or chromatography unge ⁇ are precisely and only poorly automated sierbar for routine diagnostics.
  • the turbidimetric measurement of soluble fibrin by agglutination of latex particles is sensitive and can be automated, but is based on non-specific absorption, which can be disturbed by other plasma proteins.
  • Another method is based on increasing the catalytic activity of tissue-type plasminogen activator (t-PA) in the presence of fibrin.
  • t-PA tissue-type plasminogen activator
  • the invention has for its object to provide a new reliable and automatable method for measuring soluble fibrin as an early diagnostic parameter for the diagnosis of pretrophotic conditions, which is based on a specific biochemical reaction, but which is not disturbed by the presence of fibrinogen.
  • the object is achieved by methods for the determination of soluble fibrin, the plasma sample to be investigated using a plasminogen activator of Saliva-plasminogen activator family (DSPA) incubated.
  • DSPA Saliva-plasminogen activator family
  • the plasma sample to be examined is furthermore in the presence of a for
  • the plasminogen activator of the desodus-saliva-plasminogen activator family is selected from DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gamma or bat-PA.
  • the plasma sample to be examined is incubated in the presence of plasmin, a neutralizing antibody against alpha 2 antiplasmin and a chromogenic substrate specific for plasmin.
  • the plasminogen is glu-plasminogen.
  • the plasmin-specific chromogenic substrate L-pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-lysine-p-nitroaniline hydrochloride or HD-Val-Leu-Lys-pNA hydrochloride or HD-Ile-Pro-Arg-pNA hydrochloride or HD-Pro-Phe-Arg-pNA hydrochloride or pyroGlu-Pro Arg-pNA hydrochloride or HD-Val-Phe-Lys-pNA hydrochloride or HD-Ala-HHT-Lys-pNA.
  • the method according to the invention is advantageous for the determination of soluble fibrin for the detection of prethrombotic and thrombotic conditions, for risk prediction in the case of intiated intravascular coagulopathy as well as thromboses in prosthetic heart valves and functional cardiac assist systems and for monitoring anticoagulant therapies.
  • Another object of the present invention is a test kit for carrying out the method according to the invention for the determination of soluble fibrin consisting of: a) the test material consisting of whole blood or
  • Plasminogen activator family c) plasminogen as a substrate for DSPA, d) a neutralizing antibody against alpha 2 anti-plasmin and e) chromogenic substrates which are specifically cleavable by the plasminogen activator or by plasmin.
  • test kit for the detection of prethrombotic and thrombotic conditions, for risk prediction in the case of disseminated intravascular coagulopathy and thromboses in prosthetic heart valves and functional cardiac assist systems and for monitoring anticoagulant therapies.
  • the task is therefore solved in that a plasminogen activator from the Des odus saliva pias family minogen activators (Krfordschmar J, Haendler B, Langer G, Boidol W, Bringmann P, Alagon A, Donner P Schleuning WD.
  • the invention thus relates to a new method for the quantitative measurement of soluble fibrin in plasma which is based on the selective, specific stimulation of the catalytic activity of the plasminogen activator DSPA by fibrin even in the presence of fibrinogen and the associated conversion of a chromogenic substrate by DSPA itself or based on plasmin.
  • the plasminogen activator from the saliva of the vampire bat (Desodus rotundus) Desodus salivary plasminogen activator is only active in the presence of fibrin.
  • the activation of the plasminogen activator and the conversion of the chromogenic substrate are directly proportional to the amount of soluble fibrin.
  • the measuring method has been optimized so that it can be established on a modern automatic analysis machine.
  • the plasma sample is diluted 1:10 with a Tris-HCL buffer and mixed with a Desodus saliva plasminogen activator.
  • the fibrin-stimulated conversion of a chroogenic substrate is measured for the plasminogen activator directly or for signal amplification for plasmin, which, depending on fibrin, arises from plasminogen.
  • the plasmin inhibitor * 2-antiplasmin contained in the plasma has to be inactivated, for example by adding a neutralizing antibody.
  • the soluble fibrin is then also quantified by cleaving a chromogenic NEN substrate such as L-pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-lysine-p-nitroaniline hydrochloride.
  • test kit consists of: a) the test material consisting of whole blood or
  • Platelet-free plasma that has been anticoagulated with either citrate or EDTA, b) plasminogen activators of the desodus saliva plasminogen activator family, such as, for example, DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gamma, or bat-PA (Gardell SJ et al. Isolation , characterization and cDNA cloning of a vampire bat salivary plasminogen activator.
  • plasminogen activators of the desodus saliva plasminogen activator family such as, for example, DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gamma, or bat-PA (Gardell SJ et al. Isolation , characterization and cDNA cloning of a vampire bat salivary plasminogen activator.
  • plasminogen as a substrate for DSPA, for example glu-plasminogen
  • a neutralizing antibody against alpha 2 anti plasmin for example Rabbit ant i-human Alpha 2 antiplasmin # A0303
  • Chromogenic substrates which are either specifically by the plasminogen activator, such as CH3S02-
  • HHT Gly-Arg-p-nitroaniline acetate or by plasmin, such as L-pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-lysine-p-nitroaniline hydrochloride.
  • Soluble fibrin (DesaFib) is dissolved in a concentration of 4 mg / ml in aqua ad injection.
  • Human citrated plasma is mixed with increasing amounts of DesaFib-X of 1.25 ⁇ g / ml, 2.5 ⁇ g / l, 5 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml and 40 ⁇ g / ml to create a calibration curve , These samples are again diluted with buffer (0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v)) in a ratio of 1:10.
  • 25 ⁇ l of the diluted sample are treated with 50 ⁇ l of reagent solution (Glu-Plasminogen 0.075 g / 1, 0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v)) and 25 ⁇ l of polyclonal rabbit anti -human alpha 2 antiplasmin mixed antiserum. Then 50 ⁇ l of DSPA solution (0.067 g / 1) are added and the mixture is incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction is carried out by adding 50 ⁇ l substrate solution (S2403,
  • Example 2 Comparison of the fibrin specificity of t-PA and DSPA in the soluble fibrin test.
  • Preciclot is mixed with Haemocomplettan (purified human fibrinogen that contains a small amount of soluble fibrin) in increasing amounts (0 mg / dl, 62.5 mg / dl, 125 mg / dl, 250 mg / dl, 500 mg / dl) offset. These samples are again diluted with buffer (0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v)) in a ratio of 1:10.
  • buffer 0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v)
  • 25 ⁇ l of diluted sample are mixed with 50 ⁇ l of reagent solution (Glu-Plasminogen 0.075 g / 1, 0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v)) and 25 ⁇ l of polyclonal rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin antiserum mixed.
  • 50 ⁇ l DSPA solution (5 ⁇ g / ml) or 50 ⁇ l t-PA (5 ⁇ g / ml) are added and the mixture is incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the reaction is started by adding 50 ⁇ l substrate solution (S2403, Chromogenix, 0.6 M arginine 2 M KCl pH 8.2).
  • Haemocomplettan (Centeon) is a lyophilized preparation of fibrinogen. It contains approximately 1% by weight soluble fibrin. Haemocomplettan comes in one
  • the following measurement protocol is programmed on an automatic analyzer, for example a Cobas Fara: 2.5 ⁇ l plasma sample are mixed with 22.5 ⁇ l buffer (0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v)) diluted. Then 75 ⁇ l of reagent solution (2 volume parts of glu-plasminogen 0.075 g / 1, 1 volume part)
  • the plasma samples were provided with soluble fibrin in the form of hemocopletane and heparin as described above.
  • the dilution buffer for the samples was replaced by a tris buffer containing polybren (0.13%). The rest of the protocol was carried out as described above.
  • 2.5 ⁇ l of plasma sample are diluted with 22.5 ⁇ l of buffer (0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 0.02% Triton X 100 (v / v), polybrene 0.13% (w / v)) , Then 75 ⁇ l of reagent solution (2 parts by volume of glu-plasminogen 0.075 g / 1, 1 part by volume of Rabbit anti-human alpha 2 antiplasmin antibody, 0.1 M
  • the heparin-mediated signal decrease could be canceled by the polybrene concentration of (0.13%) used in this assay (FIG. 4).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Messung von löslichem Fibrin in Plasma, das auf der selektiven, spezifischen Stimulation der katalytischen Aktivität des Plasminogenaktivators DSPA durch Fibrin in Anwesenheit von Fibrinogen und dem damit verbundenen Umsatz eines chromogenen Substrats durch DSPA selbst oder durch Plasmin beruht. Die Erfindung dient der Diagnose präthrombotischer oder thrombotischer Zustände und ermöglicht auf Grund Ihrer schnellen automatisierbaren Durchführung die zeitnahe Einleitung therapeutischer Maßnahmen. Ferner kann sie auch zur sensitiven Überwachung antikoagulatorischer Therapien genutzt werden.

Description

Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin. Insbesondere betrifft das Verfahren die spezifische und hochsensitive Messung von löslichem Fibrin mittels Desmodus rotundus Speichel Plasminogenakti- vatoren (DSPA) .
Venöse Thrombosen und die damit einher gehenden Folgeerkrankungen wie das Postthrombotische-Syndrom oder die Lungenembolien, welche akut lebensbedrohend sein können, stellen eine häufige Ursache für Morbidität dar . In der Bundesrepublik wird die Thrombose-Inzidenz auf 1 : 1000 pro Jahr geschätzt mit einer hohen Mortalitätsrate (Witt I . APC-Resistenz ( Faktor V Mutation) : Klinische Bedeutung, Pathophysiologie und Diagnostik . Dt Ärzteblatt 1998 ; 95 : A 2316-2323 ) . Die rechtzeitige Diagnose des präthrombotischen Zustandes würde krankheitsverhütende antithrombotische Maßnahmen erlauben .
Es ist aber immer noch eine ungelöste Aufgabe in der klinischen und laboratoriumsmedizinischen Diagnostik, den Aktivierungszustand der Gerinnungskaskade vor der Gerinn- selpräzipitation zu quantifizieren . Bei den im Augenblick verfügbaren Testverfahren für Aktivierungsparameter der Blutgerinnung wie zum Beispiel der Nachweis der Prothro - binf ragmente 1 + 2 oder von Thrombin-Antithrombin Komplexen handelt es sich um zeitaufwendige ELISA-Methoden , deren
Durchführung mehrere Stunden in Anspruch nimmt . Ein weiterer möglicher Parameter zur Detektion einer aktivierten Gerinnung ist lösliches Fibrin . Alle bisher verfügbaren Nachweisverfahren für lösliches Fibrin sind mit gravierenden Mängeln behaftet, die ihren Einsatz in der Routine Diagnostik schwierig oder sehr aufwendig ge- stalten. Verfahren, die lösliches Fibrin anhand seiner physikalischen Stoffeigenschaften nachweisen, zum Beispiel durch Präzipitation oder Chromatographie sind unge¬ nau und für die Routinediagnostik nur schlecht automati- sierbar.
Die turbidimetrische Messung von löslichem Fibrin durch Agglutination von Latex Partikeln (EP-AI 0 139 885) ist zwar sensitiv und automatisierbar, basiert jedoch auf un- spezifischer Absorption, die durch andere Plasmaproteine gestört werden kann. Ein weiteres Verfahren beruht auf der Steigerung der katalytischen Aktivität von tissue- type Plasminogenaktivator (t-PA) in Anwesenheit von Fibrin. Der wesentliche Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch in seiner ünspezifität, da die enzy atische Aktivität von t-PA auch durch Fibrinogen stimuliert wird. Dies stellt vor allem deshalb ein Problem dar, weil viele Krankheitsbilder, bei denen die Bestimmung von löslichem Fibrin von diagnostischer Bedeutung ist, im Rahmen einer Akut-Phase-Reaktion mit einem Anstieg der Plasma Fibrinogen Konzentration einher gehen, wie zum Beispiel Venenentzündungen, Sepsis, instabile Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt oder der Schlaganfall.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue zuverlässige und automatisierbare Methode zur Messung von löslichem Fibrin als frühem diagnostischen Parameter zur Diagnose von präthro botischen Zuständen, bereitzustellen, die auf einer spezifischen biochemischen Reaktion beruht, die aber nicht durch Anwesenheit von Fibrinogen gestört wird.
Die Aufgabe wird durch Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin gelöst, wobei man die zu untersuchende Plasmaprobe mit einem Plasminogenaktivator der Desmodus- Speichel-Plasminogen-Aktivatoren-Familie (DSPA) inkubiert .
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die zu untersu- chende Plasmaprobe weiterhin in der Gegenwart eines für
Plasminogenaktivatoren spezifischen chromogenen Substrats inkubiert und man die Menge an löslichem Fibrin mittels Messung des abgespaltenen Chromophors bestimmt.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist es, daß das für Plasminogenaktivatoren spezifische chromogene Substrat CH3S02-D- HHT-Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder Bz-Ile-Glu- (γ-OR) - Gly-Arg-pNA oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Gly-Arg-pNA-Hydrochlorid ist .
Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, daß der Plasminogenaktivator der Desmodus-Speichel-Plasminogen- Aktivatoren-Familie aus DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gam- ma oder bat-PA ausgewählt ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die zu untersuchende Plasmaprobe in der Gegenwart von Plasmino- gen, einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 An- tiplasmin sowie eines für Plasmin spezifischen chromoge- nen Substrats inkubiert.
Vorteilhaft ist es, daß das Plasminogen Glu-Plasminogen ist..
Vorteilhaft ist ferner, daß man einen neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin verwendet.
Vorteilhaft ist gleichermaßen, daß das für Plasmin spezifische chromogene Substrat L-Pyroglutamyl-L-Phenylalanyl- L-Lysin-p-Nitroanilinhydrochlorid oder H-D-Val-Leu-Lys- pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Pro-Phe-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Pro- Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Val-Phe-Lys-pNA- Hydrochlorid oder H-D-Ala-HHT-Lys-pNA ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorteilhaft zur Bestimmung von löslichem Fibrin zum Nachweis präthromboti- scher und thro botischer Zustände, zur Risikovorhersage bei disse inierter intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei prothetischen Herzklappen und funktionel- len cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoa- gulatorischer Therapien.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testbesteck zur erfindungsgemäßen Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung von löslichem Fibrin bestehend aus : a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder
Plättchen freiem Plasma, welches mit Zitrat oder EDTA an- tikoaguliert ist, b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus-Speichel-
Plasminogen-Aktivator-Familie, c) Plasminogen als Substrat für DSPA, d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Anti- plasmin und e) Chromogenen Substraten, welche spezifisch durch den Plasminogenaktivator oder durch Plasmin spaltbar sind.
Erfindungsgemäß ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Testbestecks zum Nachweis präthrombotischer und thrombo- tischer Zustände, zur Risikovorhersage bei disseminierter intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei prothetischen Herzklappen und funktioneilen cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien.
Die Aufgabe wird also dadurch gelöst, daß ein Plasminogenaktivator aus der Familie der Des odus Speichel Pias- minogenaktivatoren (Krätzschmar J, Haendler B, Langer G, Boidol W, Bringmann P, Alagon A, Donner P Schleuning WD. The plas inogen activator family from the salivary gland of the va pir bat Desmodus rotundus: cloning and expres- sion. Gene, 1991; 105: 229-237) verwandt wird, um in einer zu untersuchenden Blut- oder Plasmaprobe die Menge an löslichem Fibrin zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit ein neues Verfahren zur quantitativen Messung von löslichem Fibrin in Plasma, das auf der selektiven, spezifischen Stimulation der kataly- tischen Aktivität des Plasminogenaktivators DSPA durch Fibrin auch in Anwesenheit von Fibrinogen und dem damit verbundenen Umsatz eines chromogenen Substrats durch DSPA selbst oder durch Plasmin beruht. Der Plasminogenaktivator aus dem Speichel der Vampir Fledermaus (Desmodus rotundus) Desmodus salivary plasminogen activator ist nur in Anwesenheit von Fibrin aktiv. Die Aktivierung des Plasminogenaktivators und der Umsatz des chromogenen Substrates sind direkt der Menge an löslichem Fibrin proportional .
Erfindungsgemäß wurde das Messverfahren so optimiert, daß es auf einem modernen Analyse-Automaten etabliert werden kann. Die Plasmaprobe wird 1:10 mit einem Tris-HCL Puffer verdünnt und mit einem Desmodus Speichel Plasminogenaktivator versetzt.
Gemessen wird der fibrinstimulierte Umsatz eines chro o- genen Substrates für den Plasminogenaktivator direkt oder zur Signalverstärkung für Plasmin, das Fibrin-abhängig aus Plasminogen entsteht. Im zweiten Verfahren muß der im Plasma enthaltene Plasmin Inhibitor *2-Antiplasmin inaktiviert werden, zum Beispiel durch Zugabe eines neutra- lisierenden Antikörper. Die Quantifizierung des löslichen Fibrins erfolgt dann auch durch Spaltung eines chromoge- nen Substrates wie zum Beispiel L-Pyroglutamyl-L- Phenylalanyl-L-Lysine-p-Nitroanilinhydrochlorid .
Messungen von löslichem Fibrin mit diesem neuen Testver- fahren in humanem mit Hemokomplettan substituierten Plasma haben gezeigt , daß DSPA wie erwartet eine größere Spe- zifität für Stimulation seiner katalytischen Aktivität durch Fibrin in Anwesenheit von Fibrinogen besitzt als Tissue-type Plasminogenaktivator. Darüber hinaus hat sich überraschenderweise auch gezeigt, daß das neue Testverfahren weniger störanfällig gegenüber Plasminogenaktivator Inhibitor 1 ist .
Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus : a ) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder
Plättchen-freiem Plasma , die entweder mit Zitrat oder EDTA antikoaguliert wurden, b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus Speichel Plasminogenaktivator Familie, wie zum Beispiel DSPA alpha 1 , al- pha 2 , beta , gamma , oder bat-PA (Gardell SJ et al . Isolation , characterization and cDNA cloning of a Vampire bat salivary plasminogen activator . ( 1989) J Biol Chem 264 : 17947-17952 ) , c ) Plasminogen als Substrat für DSPA, zum Beispiel Glu- Plasminogen, d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Anti- plasmin , zum Beispiel Rabbit ant i-human Alpha 2 antiplas- min #A0303 , e ) Chromogene Substrate , welche entweder spezifisch durch den Plasminogenaktivator, wie zum Beispiel CH3S02-
HHT . Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder durch Plasmin, wie zum Beispiel L-Pyroglutamyl-L-Phenylalanyl-L-Lysine-p- Nitroanilinhydrochlorid gespalten werden .
Das Wesen der Erfindung liegt in einer Kombination bekannter Elemente und neuer Lösungswege , die sich gegen- seitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, daß nunmehr eine neue zuverlässige Methode zur Messung von löslichem Fibrin und damit ein Ver- fahren zur frühen Diagnose präthrombotischer Zustände, bereitgestellt wird.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiele
Beispiel 1: Kalibrationskurve für lösliches Fibrin
Lösliches Fibrin (DesaFib) wird in einer Konzentration von 4 mg/ml in Aqua ad injectionem gelöst. Humanes Zi- tratplasma wird zur Erstellung einer Kalibrationskurve mit ansteigenden Mengen DesaFib-X von 1,25 μg/ml, 2,5 μg/ l, 5 μg/ml, 10 μg/ml , 20 μg/ml und 40 μg/ml gemischt. Diese Proben werden nochmals mit Puffer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) im Verhältnis 1:10 verdünnt. 25μl verdünnte Probe werden mit 50 μl Rea- genzienlösung (Glu-Plasminogen 0,075 g/1, 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) und 25 μl polyklonalem Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antiserum gemischt. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 μl DSPA Lösung (0,067 g/1) und eine Inkubation bei 37 °C für 10 Minuten. Die Re- aktion wird durch Zugabe von 50 μl Substratlösung (S2403,
Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Zur Bestimmung der Reaktionsrate [mOD/min] wird die Absorption bei 405 n nach 5 und 10 min gemessen (Figur 1) .
Beispiel 2: Vergleich der Fibrin Spezifität von t-PA und DSPA im löslichen Fibrin Test.
Pool Plasma (Preciclot) wird mit Haemocomplettan (gereinigtes humanes Fibrinogen, daß einen geringen Anteil an löslichem Fibrin enhält) in aufsteigenden Mengen (0 mg/dl, 62,5 mg/dl, 125 mg/dl, 250 mg/dl, 500 mg/dl) versetzt. Diese Proben werden nochmals mit Puffer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) im Verhältnis 1:10 verdünnt. 25μl verdünnte Probe werden mit 50 μl Reagenzienlösung (Glu-Plasminogen 0,075 g/1, 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) und 25 μl polyklonalem Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antiserum gemischt. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 μl DSPA Lösung (5 μg/ml) oder 50 μl t-PA (5 μg/ml) und eine Inkubation bei 37 °C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Zur Bestimmung der Reaktionsrate [mOD/ in] wird die Absorption bei 405 nm nach 5 und 10 min gemessen (Figur 2). Der deutlich höhere OD-Anstieg der mit t-PA gemessenen Proben zeigt, daß auch in diesem Assay DSPA eine größere Fibrinspezifität besitzt als t- PA. Dies erlaubt in den folgenden Anwendungsbeispielen den Einsatz höherer Konzentrationen von DSPA zum Nachweis von löslichem Fibrin.
Beispiel 3:
Untersuchung über den Einfluß von Heparin und Polybren auf den Nachweis von löslichem Fibrin mit Hilfe von DSPA.
Effekte von Heparin und Polybren auf den Fibrin-Nachweis mit DSPA :
Haemocomplettan (Centeon) ist eine lyophilisierte Präparation von Fibrinogen . Es enthält zu circa 1% Gewichts- prozent lösliches Fibrin . Haemocomplettan wird in einer
Konzentration von 100 mg/ml in Aqua ad inj ectionem ge- löst. Um vergleichbare Proben mit einem reproduzierbaren Anteil an löslichem Fibrin zu erhalten, wird humanes Zi- trat-Plasma, in diesem Beispiel Fresh-Frozen-Plasma, mit aufsteigenden Konzentrationen (0 mg/dl, 125 mg/dl, 250 mg/dl, 500 mg/dl Haemocomplettan) dieser Stammlösung substituiert. Der Einfluß von Heparin auf das neue Verfahren zur Messung von löslichem Fibrin wird untersucht, indem das Plasma zusätzlich noch mit unterschiedlichen Heparin- konzentration von 0 bis 3 internationalen Einheiten pro ml versetzt wird. Auf einem Analysenautomaten, zum Beispiel ein Cobas Fara, wird das folgende Messprotokoll programmiert: 2,5 μl Plasmaprobe werden mit 22,5 μl Puffer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) verdünnt. Es werden dann 75 μl Reagenzienlosung (2 Volu- men Anteile Glu-Plasminogen 0,075 g/1 , 1 volu en Anteil
Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmm Antikörper , 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) hinzu pipet- tiert. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 μl DSPA Lösung (0,067 g/1) und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl Substratlosung
(S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Es werden insgesamt 15 Messungen im Abstand von 20 Sekunden durchgeführt. Die Berechnung der Konzentration erfolgt an Hand einer Kalibrationskurve. Es wird, wie in Figur 3 dargestellt, deutlich, daß es in Anwesenheit von Heparin zu einer starken Abnahme des Meßsignals kommt, die bei hohen Konzentrationen von loslichem Fibrin dosis-abhängig zu sein scheint.
Antagonisierung der Heparinef fekte durch Polybren:
Um die Möglichkeit zu untersuchen, die durch Heparin hervorgerufene Abnahme des Meßsignals durch Zugabe von Polybren zu antagonisieren, wurden die Plasmaproben wie oben beschrieben mit löslichem Fibrin in der Form des Haemo- co plettans und Heparin versehen. Im automatisierten Messprotokoll wurde der Verdünnungspuffer für die Proben durch einen Polybren- (0, 13%) haltigen Trispuffer ersetzt. Das restliche Protokoll wurde wie oben bereits beschrieben durchgeführt.
2,5 μl Plasmaprobe werden mit 22,5 μl Puffer (0,1 M Tris- HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v), Polybren 0,13% (w/v) ) verdünnt. Es werden dann 75 μl Reagenzienlösung (2 Volumemanteile Glu-Plasminogen 0,075 g/1, 1 Volumenanteil Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antikörper, 0,1 M
Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v), Polybren 0,13% (w/v)) hinzu pipettiert. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 μl DSPA Lösung (0,067 g/1) und eine Inkubation bei 37 °C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0, 6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Es werden insgesamt 15 Messungen im Abstand von 20 Sekunden durchgeführt. Die Berechnung der Konzentration erfolgt an Hand einer Kalibrationskurve .
Die Heparin vermittelte Signalabnahme konnte durch die in diesem Assay benutzte Polybrenkonzentration von (0,13%) aufgehoben werden (Figur 4).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin, wobei man die zu untersuchende Plasmaprobe mit einem Plasminogenaktivator der Desmodus-Speichel-Plasminogen- Aktivatoren-Familie (DSPA) inkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Plasmaprobe weiterhin in der Gegenwart eines für Plasminogenaktivatoren spezifischen chromogenen Substrats inkubiert und man die Menge an löslichem Fibrin mittels Messung des abgespaltenen Chro ophors bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogenaktivator der Desmodus- Speichel-Plasminogen-Aktivatoren-Familie aus DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gamma oder bat-PA ausgewählt ist.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Plasmaprobe in der Gegenwart von Plasminogen, einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin sowie eines für Plasmin spezifischen chromogenen Substrats inkubiert.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasminogen Glu- Plasminogen ist.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen neutralisieren- den Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin verwendet.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das für Plasminogenaktivatoren spezifische chromogene Substrat CH3S02-D-HHT- Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder Bz-Ile-Glu- (γ-OR) - Gly-Arg-pNA oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Gly-Arg-pNA-Hydrochlorid ist.
8. Verfahren nach gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für Plasmin spezifi- sehe chromogene Substrat L-Pyroglutamyl-L-
Phenylalanyl-L-Lysin-p-Nitroanilinhydrochlorid oder H-D-Val-Leu-Lys-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ile-Pro- Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Pro-Phe-Arg-pNA- Hydrochlorid oder pyroGlu-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Val-Phe-Lys-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ala- HHT-Lys-pNA ist.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche zum Nachweis präthrombotischer und thrombotischer Zustän- de, zur Risikovorhersage bei disseminierter intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti- schen Herzklappen und funktioneilen cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien .
10. Testbesteck zur Bestimmung von löslichem Fibrin bestehend aus : a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, welches mit Zitrat oder EDTA antikoaguliert ist, b) Plasminogenaktivatoren der Des odus-Speichel- Plasminogen-Aktivator-Familie, c) Plasminogen als Substrat für DSPA, d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin und e) Chromogenen Substraten, welche spezifisch durch den Plasminogenaktivator oder durch Plasmin spaltbar sind.
11. Verwendung des Testbestecks nach Anspruch 10 zum Nachweis präthrombotischer und thrombotischer Zustände, zur Risikovorhersage bei disseminierter intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti- schen Herzklappen und f nktionellen cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien.
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