CH626919A5 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antithrombin III in wässrigen Lösungen, insb. in Körperflüssigkeiten wie Plasma oder Serum über die Komplexbildung mit Heparin durch Bestimmung der Gerinnungszeit.
In der Reihe der Antithrombine, die mit dén Zahlen I bis VI gekennzeichnet wurden, nimmt das Antithrombin III (ATIII) eine wichtige Stelle ein. Es wurde rein dargestellt und proteinchemisch charakterisiert als ein a2-Globulin mit dem Molekulargewicht 65 000.
Seine biologische Wirkung als Inhibitor ist nicht auf das Thrombin beschränkt, sondern es inhibiert in besonderem Masse auch Faktor X und die anderen Serinproteasen aus der Reihe der Gerinnungsfaktoren, aber auch das Plasmin.
Die Wechselwirkung des Inhibitors mit Enzymen verläuft langsam in einer zeitabhängigen Reaktion, daher wird das AT III als ein Progressivinhibitor bezeichnet. Durch Heparin wird die Geschwindigkeit der Wechselwirkung zwischen Enzym und Inhibitor beschleunigt, so dass aus dem Progressivinhibitor AT III ein Sofortinhibitor wird.
Durch seine zentrale Stellung im Gerinnungs- und Fibrino-lysesystem und wegen der Möglichkeit, seine Reaktionsgeschwindigkeit durch Heparin zu steigern, kommt dem AT III eine grosse Bedeutung in der Steuerung der Blutgerinnung zu. Relativ geringe Verminderungen des AT III-Gehaltes sollen schon zu einer beträchtlichen Erhöhung des Thromboserisikos führen. Wegen des Zusammenhanges zwischen Thromboserisiko und AT III-Gehalt des Blutes wurde der Bestimmung des AT III's in den letzten Jahren wachsende Aufmerksamkeit geschenkt und neben den immunologischen Bestimmungsmethoden eine Reihe von funktionellen Testen entwickelt. Die meisten biologischen Tests verlaufen in der Weise, dass Thrombin mit dem Probenplasma für eine bestimmte Zeit inkubiert wird und die Aktivität des Thrombins nach der Inkubation anhand einer Eichkurve bestimmt wird. Diese Methode erfordert in vielen Bestimmungsvorschriften wegen der Antithrombin I-Wir-kung des Fibrins eine Defibrinierung des Plasmas, was in vielen Fällen durch Erwärmen auf 56 °C oder durch ein fibrinbildendes Enzym aus Schlangengift, das durch AT III nicht gehemmt wird (z.B. Reptilase), erreicht wird. Der Defibrinierungsschritt führt zu grossen Unsicherheiten bei der Bestimmung und ist eine zeitaufwendige Massnahme. Darüber hinaus erlaubt die Bestimmung keine Differenzierung zwischen AT III und den anderen aus der Literatur bekannten Progressiv-Thrombininhi-bitoren.
Wir haben nun gefunden, dass es Bedingungen gibt, unter denen man die AT III-Aktivität in verschiedenen Proben wie Plasma, Serum, anderen Körperflüssigkeiten oder sonstigen
Flüssigkeiten bestimmen kann, ohne dass Fibrinogen, a2-Ma-kroglobulin oder arAntitrypsin die Bestimmung stören.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von AT III in dessen wässrigen Lösungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man verdünnte Lösungen von AT III, sulfatiertem organischem Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin mischt und nach Zusatz zu einer Fibrinogenlösung die Gerinnungszeit bestimmt.
Eine Störung der Bestimmung durch die oben genannten Substanzen kann vermieden werden, wenn man z.B. im Falle von Plasma oder Serum die zu bestimmende Probe mindestens 1:50 vorverdünnt. Eine solche Verdünnung ist möglich, weil man das AT III der Probe durch sulfatierte organische Polymere mit Heparinwirkung, wie z.B. polyäthylensulfonsaures Natrium mit Molekulargewichten von mehreren Tausend, vorzugsweise Heparin, von einem Progressivinhibitor in einen Sofortinhibitor umwandelt.
Die Umwandlung von AT III in den Sofortinhibitor kann in einem weiten Konzentrationsbereich mit den sulfatierten Polymeren erfolgen. Auf eine Einheit AT III (Aktivität von 1 ml Normalplasma) können 10-500 IE, vorzugsweise 25 IE Heparin oder eines Heparinoids, gegeben werden. Ein höherer Über-schuss an Heparin oder entsprechender Mengen der sulfatierten Polymeren wirkt sich auf das Ergebnis der Bestimmung ungünstig aus.
Das Verfahren wird in der Regel wie folgt durchgeführt: Zu der Mischung aus z. B. 2 Volumenteilen verdünnter Probe und 1 Volumenteil sulfatierter Polymer- bzw. Heparinlösung mit etwa 0,4-20 IE, vorzugsweise 1 IE, wird 1 Volumenteil einer Thrombinlösung der Aktivität 1—40 NIH-Einheiten, vorzugsweise 5-10 NIH-Einheiten, gegeben. Nach einer Inkubation dieses Gemisches bei definierter Temperatur von etwa 4 °C bis 45 °C, vorzugsweise 37 °C, über einen Zeitraum 2—20 Min., vorzugsweise 4 Min., wird ein aliquoter Teil des Inkubationsansatzes zu einer standardisierten Fibrinogenlösung von ca. 0,05 bis 1 % (g/ v), vorzugsweise 0,4%, pipettiert und die Gerinnungszeit gemessen.
Die Bestimmung ist erfindungsgemäss dahingehend zu vereinfachen, dass man Thrombin und das mit AT III reagierende Polymere (z.B. polyäthylensulfonsaures Natrium oder Heparin) zu einem AT III-Reagenz vereinigt und ggf. gefriertrocknet.
Gegenstand der Erfindung sind daher ferner Mittel zur quantitativen Bestimmung von Antithrombin III in dessen wässrigen Lösungen enthaltend ein sulfatiertes organisches Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin in einer geeigneten Zubereitung.
In einer bevorzugten und als Beispiel angeführten Ausführungsform wird die Bestimmung in der Weise durchgeführt, dass man zunächst z.B. Plasma mit einer Lösung eines alkalischen Puffers vom pH-Wert etwa 7,5-10, vorzugsweise 0,1 M Trishy-droxymethylaminomethan-Puffer pH 8,0, der 0,025 M NaCl enthält 1:25-1:400, vorzugsweise 1:100, vorverdünnt. Danach wird 1 Teil der verdünnten Probe mit einem Teil AT III-Reagenz gemischt. Das AT III-Reagenz besteht aus einer Mischung aus 0,2-10 IE sulfatiertem organischem Polymeren, vorzugsweise 1 IE Heparin und 0,5-20 NIH-Einheiten, vorzugsweise 10 NIH-Einheiten Thrombin in einer Lösung eines mit Diisocyanat vernetzten Gelatinederivates, erhältlich unter dem Warenzeichen Haemaccel, das 1:2 mit einer physiologischen, die Gerinnung nicht beeinflussenden Salzlösung verdünnt wurde. Der Ansatz wird 4 Minuten bei 37 °C inkubiert und mit einem aliquoten Teil des Inkubationsgemisches die Gerinnungszeit an einer standardisierten Fibrinogenlösung bestimmt.
Mit einer Thrombinbezugskurve lässt sich ermitteln, wieviel Thrombin durch die Probe gehemmt wurde. Im Vergleich mit einem Standard, z.B. Standard-Humanplasma, wird festgestellt, wieviel Einheiten oder % der Norm AT III in der Probe enthal5
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ten waren, wobei 100% der Norm der Aktivität von 1 ml einer Mischung von Proben des Citratplasmas von mindestens 10 gesunden Normalpersonen entspricht.
Die Aktivität kann auch anhand einer Standard-Regres-sionskurve für AT III bestimmt werden.
Die beschriebene AT III-Bestimmung erlaubt eine reproduzierbare, einfache und schnelle Ermittlung des AT III-Gehaltes einer Probe. Sie wird durch andere Antithrombine, wie a2-Makroglobulin und arAntitrypsin nicht gestört, ergibt eine gerade Regressionskurve und stimmt gut mit der immunologischen Bestimmung des AT III's überein.
Erstellung der Thrombineichkurve:
Eine Thrombinlösung wird auf 6 NIH-Einheiten vorverdünnt. Von dieser Verdünnung ausgehend werden durch Pufferzugabe Lösungen mit den Thrombinaktivitäten 5,4, 3, 2 und 1 NIH-Einheiten hergestellt. Die Gerinnungszeiten dieser Lösungen in der Mischung mit einer standardisierten Fribinogenlö-sung (0,4% Fibrinogen in Trispuffer pH 8,0) - 0,2 ml Fibrinogenlösung und 0,1 ml Thrombinlösung — werden bestimmt. Auf doppeltlogarithmischem Papier werden Gerinnungszeiten (Ordinate) gegen die Einheiten Thrombin (Abszisse) aufgetragen. An einer Thrombineichkurve können die Restaktivitäten Thrombin in den Inkubationsansätzen nach Ermittlung der Gerinnungszeiten abgelesen werden.
Thrombineichkurve
Einheiten Thrombin
Gerinnungszeit
6 NIH-E
31,1 Sek.
5 NIH-E
35,5 Sek.
4 NIH-E
41,3 Sek.
3 NIH-E
51,6 Sek.
2 NIH-E
70,7 Sek.
1 NIH-E
105,4 Sek.
Beispiel
Bestimmung des AT III-Gehaltes in einer Serum- oder Plasmaprobe.
Die Bestimmung erfolgt in drei Arbeitsgängen: 5 1. Vorverdünnung
Probe mit 0,1 M Trispuffer pH 8,0, der 0,025 M NaCl enthält, in zwei Schritten 1:100 verdünnen (z.B. 1. Schritt: 0,1 ml Probe + 0,9 ml Puffer; 2. Schritt: 0,1 ml der 1:10 verdünnten Probe + 0,9 ml Puffer).
10 2. Inkubation
0,2 ml 1:100 verdünnte Probe aus Arbeitsgang 1 und 0,2 ml AT III-Reagenz mischen,
4 Min. bei 37 °C inkubieren.
3. Gerinnung
15 0,2 ml Fibrinogenlösung standardisiert auf 0,4 Gew.- % und 0,1 ml Inkubationsgemisch aus Arbeitsgang 2 mischen, Gerinnungszeit bei 37 °C bestimmen.
An der Thrombineichkurve liest man die zur Gerinnungszeit korrespondierende Restaktivität des Thrombins im Inkuba-20 tionsansatz ab und kann damit nach folgender Formel
T—T —T
*• lv Aa'
in welcher bedeuten T die Zahl der gehemmten Einheiten 25 Thrombin in der Probe, Tv die Zahl der im Inkubationsansatz vorgelegten Einheiten Thrombin und Ta die Zahl der nach der Inkubation wieder gefundenen Einheiten Thrombin, errechnen, wieviel Einheiten Thrombin durch die Probe gehemmt werden. Im Vergleich mit einem Standard lässt sich die AT III-Menge in 30 der Probe nach der einfachen Formel berechnen:
in der G den AT III-Gehalt der Probe, Ts die Zahl der gehemm-35 ten Einheiten Thrombin einer Standardlösung und Gs den AT III-Gehalt der Standardlösung bedeuten.
C
Claims (4)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antithrombin III in wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Antithrombin III enthaltende Lösung,
b) eine verdünnte Lösung eines sulfatierten organischen Polymers mit Heparinwirkung und c) eine verdünnte Thrombinlösung mischt, die Mischung einer Fibrinogenlösung zusetzt und die Gerinnungszeit bestimmt.
2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein sulfatiertes organisches Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin enthält.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das sulfatierte organische Polymer Heparin ist.
4. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in gefriergetrockneter Form vorliegt.
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