DE2601372B2 - Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III

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Description

In der Reihe der Antithrombine, die mit den Zahlen I bis VI gekennzeichnet wurden, nimmt das Antithrombin HI (AT HI) eine wichtige Stelle ein. Es wurde rein dargestellt und proteinchemisch charakterisiert als ein «2-Globulin mit dem Molekulargewicht 65 000.
Seine biologische Wirkung als Inhibitor ist nicht auf das Thrombin beschränkt, sondern es inhibiert in besonderem Maße auch Faktor X und die anderen Serinproteasen aus der Reihe der Gerinnungsfaktoren, aber auch das Plasmin.
Die Wechselwirkung des Inhibitors mit Enzymen verläuft langsam in einer zeitabhängigen Reaktion, daher wird das AT III als ein Progressivinhibitor bezeichnet. Durch Heparin wird die Geschwindigkeit der Wechselwirkung zwischen Enzym und Inhibitor beschleunigt, so daß aus dem Progressivinhibitor AT III ein Sofortinhibitor wird.
Durch seine zentrale Stellung im Gerinnungs- und Fibrinolysesystem und wegen der Möglichkeit, seine Reaktionsgeschwindigkeit durch Heparin zu steigern, kommt dem AT III eine große Bedeutung in der Steuerung der Blutgerinnung zu. Relativ geringe Verminderungen des AT III-Gehaltes sollen schon zu einer beträchtlichen Erhöhung des Thromboserisikos führen. Wegen des Zusammenhanges zwischen Thromboserisiko und AT III-Gehalt des Blutes wurde der Bestimmung des ATIII in den letzten Jahren wachsende Aufmerksamkeit geschenkt und neben den immunologischen Bestimmungsmethoden wurde eine Reihe von funktionellen Testen entwickelt. Die meisten biologischen Tests verlaufen in der Weise, daß Thrombin mit dem Probenplasma für eine bestimmte Zeit inkubiert wird und die Aktivität des Thrombins nach der Inkubation anhand einer Eichkurve bestimmt wird. Diese Methode erfordert in vielen Bestimmungsvorschriften wegen der Antithrombin !-Wirkung des Fibrins eine Defibrinierung des Plasmas, was in vielen Fällen durch Erwärmen auf 560C (Thromb. Diath. Haemorrh. 9, Suppl. 1, S. 18-29, 1963) oder durch ein fibrinbildendes Enzym aus Schlangengift, das durch Antithrombin IH nicht gehemmt wird (z. B. Reptilase) (Brit J. HaematoL 25, S. 101 — 110,1973) erreicht wird. Der Defibrinjerungsschritt führt erfahrungsgemäß zu großen Unsicherheiten bei der Bestimmung und ist eine zeitaufwendige Maßnahme. Darüber hinaus erlaubt die Bestimmung keine Differenzierung zwischen AT IH und den anderen aus der Literatur bekannten Pi-ogressiv-Thrombininhibitoren.
Es wurde nun gefunden, daß es Bedingungen gibt,
ίο unter denen man die AT III-Aktivität in verschiedenen Proben wie Plasma, Serum, anderen Körperflüssigkeiten oder sonstigen Flüssigkeiten bestimmen kann, ohne daß Fibrinogen, &rMakroglobulin oder ai-Antitrypsin die Bestimmung stören.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin HI durch Inkubation einer Antithrombin Hl enthaltenden Lösung mit einer Thrombinlösung, Zusatz einer Fibrinogenlösung zu dem Inkubationsgemisch und Bestimmen der Gerinnungszeit
χ und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Antithrombin und Thrombin enthaltenden Lösungen in Gegenwart einer verdünnten Lösung eines sulfatierten organischen Polymeren mit Heparinwirkung inkubiert werden.
Eine Störung der Bestimmung durch die obengenann-
2> ten Substanzen kann vermieden werden, wenn man z. B. im Falle von Plasma oder Serum die zu bestimmende Probe mindestens 1 :50 vorverdünnt. Eine solche Verdünnung ist möglich, weil man das AT III der Probe durch sulfatierte organische Polymere mit Heparinwirkung, wie polyäthylensulfonsaures Natrium mit Molekulargewicht von mehreren Tausend, vorzugsweise Heparin, von einem Progressivinhibitor in einen Sofortinhibitor umwandelt.
Die Umwandlung von AT HI in den Sofortinhibitor kann in einem weiten Konzentrationsbereich mii den sulfatierten Polymeren erfolgen. Auf eine Einheit AT Hl (Aktivität von 1 ml Normalplasma) können 10—500 IE, vorzugsweise 25 IE Heparin oder eines Heparinoids, gegeben werden. Ein höherer Überschuß an Heparin oder entsprechender Mengen der sulfatierten Polymeren wirkt sich auf das Ergebnis der Bestimmung ungünstig aus.
Das Verfahren kann z. B. wie folgt durchgeführt werden: Zu der Mischung aus z. B. 2 Volumenteilen
4) verdünnter Probe und 1 Volumenteil sulfatierter Polymer- bzw. Heparinlösung mit etwa 0,4—20 IE, vorzugsweise 1 IE, wird 1 Volumenteil einer Thrombinlösung der Aktivität 1—40 NIH-Einheiten, vorzugsweise 5—10 NIH-Einheiten, gegeben. Nach einer Inkubation dieses Gemisches bei definierter Temperatur von etwa 4° C bis 45° C, vorzugsweise 37° C, über einen Zeitraum 2—20 Min., vorzugsweise 4 Min., wird ein aliquoter Teil des Inkubationsansatzes zu einer standardisierten Fibrinogenlösung von ca. 0,05 bis 1% (g/v) vorzugsweise 0,4% pipettiert und die Gerinnungszeit gemessen.
Die Bestimmung kann dahingehend vereinfacht werden, daß man Thrombin und das mit AT III reagierende Polymere (z. B. polyäthylensulfonsaures
bo Natrium oder Heparin) zu einem AT HI-Reagenz vereinigt und ggf. gefriergetrocknet.
Gegenstand der Erfindung sind daher ferner Mittel zur Bestimmung von Antithrombin III enthaltend ein sulfatiertes organisches Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin ggf. in gefriergetrockneter Form.
In einer bevorzugten und als Beispiel angeführten Ausführungsform wird die Bestimmung in der Weise durchgeführt, dall man zunächst z. B. Plasma mit einer
Lösung eines alkalischen Puffers vom pH-Wert etwa 7^—10, vorzugsweise 0,1 M! Trishydroxymethylaminomethan-Puffer pH 8,0, der 0,025 M NaCI enthält 1 :25—1 :400, vorzugsweise 1 :100, vorverdünnt. Danach wird 1 Teil der verdünnten Probe mit einem Teil 5 AT HI-Reagenz gemischt Das AT iil-Reagenz besteht aus einer Mischung aus 0,2—10 IE sulfatiertem organischem Polymeren, vorzugsweise 1 IE Heparin und 0,5—20 NIH-Einheiten, vorzugsweise 10 NIH-Einheiten Thrombin in einer Lösung eines mit Diisocyanat vernetzten Gelatinederivates, erhältlich unter dem Warenzeichen Haemaccel, das 1 :2 mit einer physiologischen, die Gerinnung nicht beeinflussenden Salzlösung verdünnt wurde. Der Ansatz wird 4 Minuten bei 37°C inkubiert und mit einem aliquoten Teil des Inkubationsgemisches die Gerinnungszeit an einer standardisierten Fibrinogenlösung bestimmt
Mit einer Thrombinbezugskurve läßt sich ermitteln, wieviel Thrombin durch die Probe gehemmt wurde. Im Vergleich mit einem Standard, z. B. Standard-Humanplasma, wird festgestellt, wieviel Einheiten oder % der Norm AT IH in der Probe enthalten waren, wobei 100% der Norm der Aktivität von 1 ml einer Mischung von Proben des Citratplasmas von mindestens 10 gesunden Normalpersonen entspricht
Die Aktivität kann auch anhand einer Standard-Regressionskurve für AT IH bestimmt werden.
Die beschriebene AT III-Bestimmung erlaubt eine reproduzierbare einfache und schnelle Ermittlung des AT III-Gehaltes einer Probe. Sie wird durch andere Antithrombine, wie «2-Makroglobulin und «i-Antitrypsin nicht gestört, ergibt eine gerade Regressionskurve und stimmt gut mit der immunologischen Bestimmung des ATIII überein.
Thrombineichkurve
20
JO
Einheiten Thrombin Gerinnungszeit
6 NIH-E 31,1 Sek.
5 NIH-E 35,5 Sek.
4 NIH-E 41,3 Sek.
3 NIH-E 51,6 Sek.
2 NIH-E 70,7 Sek.
1 NIH-E 105,4 Sek.
Beispiel
Bestimmung des AT III-Gehaltes in einer Serum- oder Plasmaprobe
Die Bestimmung erfolgt in drei Arbeitsgängen:
Erstellung der Thrombineichk'irve
Eine Thrombinlösung wird auf 6 NIH-Einheiten vorverdünnt. Von dieser Verdünnung ausgehend werden durch Pufferzugabe Lösungen mit den Thrombinaktivitäten 5, 4, 3, 2 und 1 NIH-Einheiten hergestellt. Die Gerinnungszeiten dieser Lösungen in der Mischung mit einer standardisierten Fibrinogenlösung (0,4% Fibrinogen in Trispuffer pH 8,0) — 0,2 ml Fibrinogenlösung und 0,1 ml Thrombinlösung — werden bestimmt. Auf doppeltlogarithmischem Papier werden Gerinnungszeiten (Ordinate) gegen die Einheiten Thrombin (Abszisse) aufgetragen. An einer Thrombineichkurve können die Restaktivitäten Thrombin in den Inkubationsansätzen nach Ermittlung der Gerinnungszeiten abgelesen werden.
1. Vorverdünnung
Probe mit 0,1 M Trispuffer pH 8,0, der 0,025 M NaCI enthält, in zwei Schritten 1 :100 verdünnen (z. B. 1. Schritt: 0,1 ml Probe + 0,9 ml Puffer; 2. Schritt: 0,1 ml der 1 :10 verdünnten Probe + 0,9 ml Puffer).
2. Inkubation
0,2 ml 1 :100 verdünnte Probe aus Arbeitsgang 1 und 0,2 ml AT Ill-Reagenz mischen, 4 Min. bei 37°C inkubieren.
3. Gerinnung
0,2 ml Fibrinogenlösung standardisiert auf Gew.-% und
0,1 ml Inkubationsgemisch aus Arbeitsgang 2 sehen,
Gerinnungszeit bei 37° C bestimmen.
An der Thrombineichkurve liest man die zur Gerinnungszeit korrespondierende Restaktivität des Thrombins im Inkubationsansatz ab und kann damit nach folgender Formel
T- Ty- Ta,
in welcher bedeuten Γ die Zahl der gehemmten Einheiten Thrombin in der Probe, Tv die Zahl der im Inkubationsansatz vorgelegten Einheiten Thrombin und Ta die Zahl der nach der Inkubation wieder gefundenen Einheiten Thrombin, errechnen, wieviel Einheiten.,-Thrombin durch die Probe gehemmt werden. Im Vergleich mit einem Standard läßt sich die AT 111-Menge in der Probe nach der einfachen Formel berechnen:
in der G den AT IIl-Gehalt der Probe, T1 die Zahl der gehemmten Einholen Thrombin einer Standardlösung und Gjden AT IH-Gehalt der Standardlösung bedeuten.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III durch Inkubation einer Antithrombin III enthaltenden Lösung mit einer Thrombinlösung, Zusatz einer Fibrinogenlösung zu dem Inkubationsgemisch und Bestimmen der Gerinnungszeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Antithrombin und Thrombin enthaltenden Lösungen in Gegenwart einer verdünnten Lösung eines sulfatierten organischen Polymeren mit Heparinwirkung inkubiert werden.
2. Mittel zur Bestimmung von Antithrombin III enthaltend ein sulfatiertes organisches Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin ggf. in gefriergetrockneter Form.
3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfatierte organische PoJymer Heparin ist.
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