DE19741287A1 - Verfahren zur Erfassung der funktionellen Wirkung des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) für die Diagnostik von Blutgerinnungsstörungen - Google Patents
Verfahren zur Erfassung der funktionellen Wirkung des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) für die Diagnostik von BlutgerinnungsstörungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein laboratoriumsdiagnostisches Verfahren zur Erfassung der
Verminderung der funktionellen Wirkung des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) als
Ursache für eine idiopathische thrombophile Diathese.
Die Prävalenz einer Thrombose wird in der Gesamtbevölkerung durchschnittlich auf ca. 0,1%
pro Jahr geschätzt. Dabei steht fest, daß das Thromboserisiko das Resultat einer Summe
dispositioneller und expositioneller Faktoren ist. Überschreitet diese Summe einen kritischen
Wert, die Manifestationsschwelle, entsteht eine Thrombose. Das Risiko einer
thromboembolischen Komplikation ist besonders bei Malignomen, entzündlichen
Erkrankungen, Schwangerschaft, Diabetes mellitus (Malm, J.; Laurell, M.; Nilsson, I. M.;
Dahlbäck, B.: Thromboembolic disease - critical evaluation of laboratory investigation. In:
Thromb. Haemost. 68 (1992), S. 7-13), aber auch durch Immobilisation, Operationen sowie
durch Medikamente (orale Kontrazeptiva) gegeben.
Für die Manifestation einer Thrombose werden zunehmend genetische Defekte verantwortlich
gemacht, die Fett- und Kohlenhydratstoffwechsel und vor allem die Hämostase betreffen.
Gesichert ist der Zusammenhang mit dem Mangel an Antithrombin III, Protein C und Protein
S, deren Prävalenz mit 2 bis 5% der jüngeren Patienten mit Thromboembolien jedoch niedrig
ist (Mathonnet, F.; de Mazancourt, P.; Denninger, M. H.; Morot, M.; Benattar, N.; Giudicelli,
Y.: Role of factor VIII on activated protein C resistance ratio in inflammatory diseases. In:
Br. J. Haematol. 95 (1996), S. 423-425. Pabinger, I.; Brücker, S.; Kyrle, P. A.; Schneider, B.;
Korninger, H. C. ; Neissner, H.; Lechner, K.: Hereditary deficiency of antithrombin III, protein
C and protein S: prevalence in patients with a history of venous thrombosis and criteria for
rational patient screening. In: Blood Coagul. Fibrinolysis 3 (1992), S. 547-553).
Dahlbäck beschrieb 1993 erstmalig einen bis dahin unbekannten Defekt im
antikoagulatorischen System Thrombomodulin - Protein C - Protein S, welcher sich
phänotypisch als funktionelle Verminderung des Ansprechens auf aktiviertes Protein C
darstellte (Dahlbäck, B.; Carlsson, M.; Svensson, P. J.: Familial thrombophilia due to a
previously unrecognized mechanism charaterized by poor anticoagulant response to activated
protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
(1993), S. 1004-1008).
Epidemiologische Studien konnten nachweisen, daß die Verminderung des Ansprechens auf
aktiviertes Protein C, die in ihrer ausgeprägtesten Form auch als APC-Resistenz bezeichnet
wird, ein anerkannter Risikofaktor für die Entwicklung von venösen Thromboembolien ist
(Svensson, P. J.: Dahlbäck, B.: Resistence to activated protein C as a basis for venous
thrombosis. In: N. Engl. J. Med. 330 (1994), S. 517-522).
Bertina et al. konnten 1994 bei Patienten mit einer APC-Resistenz eine Punktmutation im
Faktor V-Gen identifizieren (Bertina, R. M.; Koeleman, B. P. C. ; Koster, T.; Rosendahl, F. R.;
Dirven, R. J.; de Ronde, H.; van der Velden, P. A.; Reitsma, P. H.: Mutation in blood
coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. In: Natur 369 (1994),
S. 64-67).
In den letzten Jahren rückte ein weiterer Inhibitor in den Mittelpunkt des Interesses: Der
Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI). Dieser bildet zunächst einen hemmenden Komplex mit
dem aktivierten Faktor X. In einen zweiten Schritt, durch eine Bindung des aktivierten Faktor
VII-Tissue Faktor-Komplexes, verstärkt sich die antikoagulatorische Wirkung des
physiologischen Inhibitors. Ein angeborener oder erworbener Mangel von TFPI konnte bei
einzelnen Patienten mit idiopathischem venösen Thromboembolien nachgewiesen werden
(Sandset. P. M; Bendz, B.: Tissue Factor Pathway Inhibitor: Clinical deficiency states. In:
Throm. Haemost. 78 (1997), S. 467-470).
Bei Patienten mit idiopathischen venösen Thrombosen sind hereditäre Veränderungen im
Gerinnungssystem als häufigste prädisponierende Faktoren identifiziert worden. Dazu gehören
die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C, angeborene Defekte der Inhibitoren der
Gerinnung (Antithrombin III, Protein C und Protein S), sowie weitere Einzelfaktordefekte
(z. B. Faktor XII-Mangel, C1-Esterase-Inhibitor-Mangel). Dies betrifft jedoch nur etwa 50%
aller Patienten, der Rest wird durch bisher nicht identifizierte Defekte verursacht. So muß z. B.
nach großen Hüftoperationen trotz Antikoagulation mittels Heprin mit einer Thromboserate
von bis zu 34% gerechnet werden (Eriksson, B. I.; Ekman, S.; Kälebo, P.; Zachrisson, B.;
Bach, D.; Close, P.: Prevention of deep-vein thrombosis after total hip replacement: direct
thrombin inhibition with recombinant hirudin, CGP 39393. In: Lancet 347 (1996), S. 635).
Seit der Aufklärung der Funktion von TFPI sind erst wenige Jahre vergangen (Holst, J.;
Lindblad, B.; Bergqvist, D.; Nordfang, O., Ostergaard, P. B.; Petersen, J. L.; Nielsen, G.;
Hedner, U.: Antithrombotic properties of truncated recombinant tissue factor pathway
inhibitor in an experimental venous thrombosis model. In: Haemostasis 23 (1993), Suppl. 1,
S. 112-117).
Es liegen keine Erkenntnisse über funktionelle Beeinträchtigungen der antikoagulatorischen
Wirkung des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) als Ursache für eine venöse
Thrombosebildung vor, da eine Möglichkeit des Nachweises derzeit fehlt.
Die erfinderische Aufgabe besteht darin, daß zur Erfassung der Verminderung der
funktionellen Wirkung des TFPI ein Verfahren zum Nachweis erarbeitet werden soll.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Bestimmung in Anlehnung an andere
Gerinnungsuntersuchungen in Citrat-antikoaguliertem Plasma, welches nach standardisierten
Bedingungen gewonnen wird (DIN 58 905). Diesem Citratplasma werden Reagenzien
zugesetzt, welche über eine Aktivierung des Stuart-Prower-Faktor (Faktor X) eine
Umwandlung von Prothrombin (Faktor II) zu Thrombin bewirken. Thrombin wandelt
Fibrinogen in Fibrin um, welches den Endpunkt der Reaktionszeit darstellt (z. B. DIN 58 908
oder DIN 58 910). Diesem Ansatz wird eine definierte Menge TFPI oder eines funktionell
aktiven Fragmentes zugesetzt. Das TFPI oder das funktionell aktive Fragment kann aus
tierischem oder humanem Plasma extrahiert oder rekombinant gentechnisch synthetisiert
werden.
Unter physiologischen Bedingungen kommt es zu einer Verlangsamung der Fibrinbildung, zu
einer Verlängerung der Reaktionszeit. Zum Ausschluß anderer Einflußfaktoren, wie z. B.
unterschiedliche Fibrinogenkonzentrationen, Fibrin(ogen)spaltprodukte, Heparinwirkung,
erfolgt in einem zweiten Ansatz die Bestimmung der Reaktionszeit ohne Zusatz von TFPI und
die Bildung eines Quotienten mit der Reaktionszeit mit Zusatz von TFPI als Dividend und der
Reaktionszeit ohne Zusatz von TFPI als Divisor.
Der Normalbereich dieses Quotienten ist an einer entsprechend großen Gruppe von gesunden
Blutspendern zu erstellen. Bei Patienten mit idiopathischen venösen Thromboembolien, bei
denen keine klassischen Defekt (s. o.) des hämostaseologischen Systems nachgewiesen werden
konnten, sind signifikant niedrigere Quotienten als Ausdruck einer gestörten
antikoagulatorischen Funktion von TFPI zu erwarten.
Im Anschluß soll ein Beispiel für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
angegeben werden:
Das Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemäße Verfahren soll lediglich die Erfindung
erläutern, jedoch die Ansprüche in keiner Weise einschränken und gilt für den Thrombolyser
Chrom (Fa. Organon Teknika) unter Verwendung der folgenden Reagenzien:
- - Dade® Aktin® FS, Dade Diagnostika GmbH
- - CaCl2 0,02 mol/l, Dade Diagnostika GmbH
- - NaCl-Lösung, 0,9%
- - human Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI).
Es ist bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach dem nachfolgenden
Pipetierschema in vier Schritten unter Verwendung der in der Tabelle angegebenen Volumina
der Reagenzien vorzugehen:
- 1. Pipetieren der in nachfolgender Tabelle angegebenen Volumina in je eine Küvette.
- 2. Inkubation der Proben für 2 Minuten bei 37°C.
- 3. Zugabe von je 60 µl CaCl2 (0,02 mol/l) und Start der Zeitmessung.
- 4. Messung der Zeit bis zum Einsetzen der Gerinnung.
- 5. Berechnung des Quotienten zur Erfassung der Verminderung der funktionellen Wirkung des TFPI: Reaktionszeit für Küvette a geteilt durch Reaktionszeit für Küvette b.
Claims (4)
1. Verfahren zur Erfassung der funktionellen Wirkung des Tissue Factor Pathway Inhibitor
(TFPI) für die Diagnostik von Blutgerinnungsstörungen unter Verwendung eines üblichen
Verfahrens zur Bestimmung der Gerinnungsaktivität mit Zugabe eines exogenen Reagenz,
welches die Gerinnungsfaktoren des Blutgerinnungssystems der humanen Plasmaprobe
mindestens teilweise aktiviert, der Inkubation des Reaktionsansatzes, dem Start des
Gerinnungsablaufes durch Zugabe von Kalziumionen und die Bestimmung der
Gerinnungsaktivität durch die Messung des Substanzumsatzes bzw. der
Substanzumsatzrate eines Gerinnungsfaktors, gekennzeichnet dadurch, daß bei Patienten
mit Thrombophilie oder einem erhöhten Risiko für eine Thrombose zum Zwecke des
Screenings auf eine verminderte antikoagulatorische Antwort auf TFPI zusätzlich zur
Plasmaprobe exogenes TFPI zugesetzt wird und die Messung der Aktivität eines
Gerinnungsfaktors, welcher direkt oder indirekt aktiviert wurde und dessen Aktivität
direkt oder indirekt durch TFPI beeinflußt wird, erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein exogenes chromogenes
Substrat für ein Enzym, dessen Aktivität direkt oder indirekt durch TFPI beeinflußt wird,
eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubation der
menschlichen Plasmaprobe mit humanem oder tierischem TFPI oder einem funktionell
aktiven Fragment erfolgt, welches aus tierischem oder humanem Plasma extrahiert oder
rekombinant gentechnisch synthetisiert wurde.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das exogene Reagenz
- a) das Blutkoagulationssystem der Probe über den intrinsischen Weg aktiviert, wie ein APTT-Reagenz, ein Kontaktaktivator, Faktor IXa, Faktor XIa, Faktor XIIa und/oder Kallikrein und/oder
- b) das Blutkoagulationssystem der Probe über den extrinsischen Weg aktiviert, wie ein Gewebe-Thromboplastin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997141287 DE19741287A1 (de) | 1997-09-19 | 1997-09-19 | Verfahren zur Erfassung der funktionellen Wirkung des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) für die Diagnostik von Blutgerinnungsstörungen |
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Publications (1)
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-
1997
- 1997-09-19 DE DE1997141287 patent/DE19741287A1/de not_active Withdrawn
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