KR20060020616A - 뇌졸중을 치료하기 위한 플라스미노겐 비-신경독성활성인자의 정맥내 주사 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 대뇌 뇌졸중을 치료학적으로 치료하기 위한 주사 치료제 제조용의, 예를 들면, 데스모두스 로툰두스(Desmodus rotundus)로부터의 플라스미노겐 비-신경독성 활성 인자 (DSPA) 또는 사람 기원의 유전적으로 개질된 플라스미노겐 활성 인자의 용도에 관한 것이다.

Description

뇌졸중을 치료하기 위한 플라스미노겐 비-신경독성 활성인자의 정맥내 주사 방법 {INTRAVENOUS INJECTION OF PLASMINOGEN NON-NEUROTOXIC ACTIVATORS FOR TREATING CEREBRAL STROKE}

본 발명은 사람에 있어서 뇌졸중을 치료하기 위한 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자, 특히 유전적으로 개질된 플라스미노겐 활성인자 및 데스모두스 로툰두스[Desmodus rotundus]의 타액으로부터의 플라스미노겐 활성인자(DSPA)를 정맥내 적용하는 것에 관한 것이다. 이러한 플라스미노겐 활성인자를 사용한 뇌졸중의 치료는, 이의 전문이 참조로 완전히 인용된 국제 특허원 제PCT/EP02/12204호로부터 공지되어 있다.

뇌졸중의 임상적 특성 및 생화학

상이한 임상 사진들을 용어 "뇌졸중"하에 요약하였으며, 뇌졸중은 이들의 임상 증후와 관련된다. 각각의 발병기전에 따르면, 소위 허혈 발작과 출혈 발작에 있어서의 이들 임상 사진간의 첫번째 차별화가 가능하다.

허혈 발작(허혈)은 동맥 혈액 공급의 부족으로 인하여 뇌에서 혈액 순환이 감소하거나 차단되는 것을 특징으로 한다. 종종 이러한 현상은 동맥경화성의 협착된 혈관의 혈전증 또는 동맥 심장 색전증 각각에 의해 유발된다.

출혈 발작은 특히 동맥 근육긴장저하에 의해 손상된 뇌에 공급되는 동맥의 천공을 기초로 한다. 그러나, 모든 대뇌 발작의 대략 20% 만이 출혈 발작에 의해 유발된다. 즉, 색전증으로 인한 뇌졸중이 더욱 많이 관련되어 있다.

다른 조직 허혈과 비교하여, 신경 조직의 허혈은 영향받은 세포의 괴사를 광범위하게 동반한다. 신경 조직에서 괴사의 보다 높은 발생은, 다수의 반응 단계를 포함하는 복잡한 캐스케이드(cascade) "흥분독성" 현상의 새로운 이해로 설명될 수 있다. 캐스케이드는 산소 결핍에 의해 영향받은 허혈성 뉴런에 의해 개시되며, 이후 뉴런은 동시에 ATP를 상실하고 소극화된다. 이는 양이온 채널을 조절하는 막 결합된 글루타메이트 수용체를 활성화시키는 신경전달물질 글루타메이트의 연접 후 방출의 증가를 초래한다. 그러나, 글루타메이트 방출의 증가로 인하여, 글루타메이트 수용체는 과활성화된다.

글루타메이트 수용체는 수용체에 대한 글루타메이트의 결합에 의해 개방되는 전압 의존성 양이온 채널을 조절한다. 이는 Ca²⁺ 의존성 세포 대사를 대규모로 교란시키는 세포내로의 Na⁺ 및 Ca²⁺ 유입을 초래한다. 특히, Ca²⁺ 의존성 이화작용 효소의 활성화는 후속적인 세포 사멸에 대한 원인을 제공한다(참조: Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system").

비록 글루타메이트 매개된 신경독성의 메카니즘이 아직까지 완전하게 이해되지 않았다고 해도, 이러한 메카니즘이 대뇌 허혈에 이은 뉴런 세포 사멸에 크게 기여한다는 사실에는 의견이 일치하고 있다(참조: Jin-Mo Lee, et al.).

뇌졸중의 치료요법

생체 작용을 보호하고 생리학적 매개변수를 안정화시키는 것외에, 폐쇄된 혈관의 재-개방은 급성 대뇌 허혈의 치료요법에 있어 우선권을 가진다. 재-개방은 상이한 수단으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 심장 발작후 PTCA와 같은 단순한 기계적 재-개방은 아직까지 만족할만한 결과를 가져오지 못한다. 단지 성공적인 섬유소용해를 수행하는 경우에만 환자의 물리적 상태의 허용가능한 개선이 이루어질 수 있다. 이는 카테테르(PROCAT, 프로-유로키나제를 사용한 연구)를 사용한 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 일차적인 양성 결과에도 불구하고, 당해 방법은 아직까지 약제학적 치료로서 공식적으로 입증되지 않았다.

천연적으로 존재하는 섬유소용해는 촉매작용(활성화)에 의해 이의 불활성 전구체로부터 기원하는 세린 프로테아제 플라스민의 단백질분해 활성을 기초로 한다. 플라스미노겐의 천연 활성화는 체내에서 천연적으로 발생하는 플라스미노겐 활성인자 u-PA(유로키나제 유형 플라스미노겐 활성인자) 및 t-PA(조직 플라스미노겐 활성인자)에 의해 촉매된다. u-PA와는 대조적으로, t-PA는 피브린 및 플라스미노겐과 함께 소위 활성인자 복합체를 형성한다. 따라서, t-PA의 촉매 활성은 피브린 의존성이며 이의 존재로 대략 550배 향상된다. 피브린외에, 또한 피브리노겐은 플라스미노겐의 플라스민으로의 t-PA 매개된 촉매작용을 심지어 더욱 적은 정도로 자극할 수 있다. 피브리노겐의 존재하에 t-PA 활성은 단지 25배 증가한다. 또한 피브린의 분해 산물(피브린 분해 산물: fibrin degradation products: FDP)은 t-PA를 자극한다.

공지된 치료학적 시도

a) 스트렙토키나제

급성 뇌졸중의 혈전용해 치료의 초기 시도는 1950년대로 거슬러 올라간다. 베타-용혈 스트렙토코커스(beta-haemolysing streptococcus)로부터의 섬유소용해제인 스트렙토키나제를 사용한 최초의 포괄적인 임상 시도는 1995년에서야 시작되었다. 스트렙토키나제는 플라스미노겐과 함께 다른 플라스미노겐 분자를 플라스민으로 촉매화하는 복합체를 형성한다.

스트렙토키나제를 사용한 치료요법은, 당해 효소가 세균 프로테아제이므로 체내에서 알레르기 반응을 유발할 수 있기 때문에 심각한 단점을 지닌다. 게다가, 항체의 생성을 포함하는 스트렙토코커스 감염으로 인하여, 환자는 당해 치료요법을 더욱 어렵게 만드는 소위 스트렙토키나제 내성을 나타낼 수 있다. 이외에도, 유럽[유럽의 멀티센터 급성 뇌졸중 시도(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe(MAST-E), 이탈리아의 멀티센터 급성 뇌졸중 시도(MAST-I)] 및 오스트리아[오스트리아 스트렙토키나제 시도(Australian Streptokinase Trial(AST)]의 임상 시도는, 환자를 스트렙토키나제로 치료한 후 뇌내 출혈(뇌속 출혈: intracerebral bleeding, intracerebral haemorrhage, ICH)의 보다 높은 위험 및 증가된 치사 위험을 나타내었다. 이러한 시도들은 일찍이 종료되어야 했다.

b) 유로키나제

또한, 전통적인 섬유소용해제인 유로키나제도 적용될 수 있다. 스트렙토키나제와는 대조적으로, 이는 각종 체 조직속에 천연적으로 존재하는 효소이기 때문에 항원 특성을 나타내지 않는다. 이는 플라스미노겐 활성인자이며 보조인자와는 독립적이다. 유로키나제는 신장 세포 배양물에서 생산된다.

c) 재조합 t-PA(rt-PA)

치료학적 혈전용해에 있어서의 집중적인 경험으로, 재조합 햄스터 세포에서 생산된 조직형 플라스미노겐 활성인자 -소위 rt-PA-(유럽 특허 제0 093 619호 및 미국 특허 제4,766,075호)가 이용가능하게 되었다. 1990년대에 몇몇 임상 시도가 주요 징조로서의 급성 심근 경색에 대해 t-PA를 사용하여 전세계적으로 행해졌으며, 부분적으로 이해되지는 않는 부정적인 결과가 초래되었다. 소위 유럽 급성 뇌졸중 시도[European Acute Stroke Trial(ECASS)]에서는 환자를 뇌졸중 증상이 발생한 후 6시간의 시간 기간내에 rt-PA로 정맥내 치료하였다. 90일 후 치사율 및 바텔-지표(Barthel-Index)를 환자의 독립된 생존율 또는 장애에 대한 지표로서 시험하였다. 생존율에 있어 현저한 개선은 보고되지 않았을 뿐 아니라, 비록 현저하지는 않지만, 치사율도 증가하였다. 따라서, 뇌졸중이 개시된 직후 환자 개개 경우의 병력에 따라 개별적으로 선택된 환자에서 rt-PA를 사용한 혈전용해 치료가 유리할 수 있다고 결론지을 수 있었다. 그러나, 뇌졸중이 발생한 후 6시간의 시간 기간내에 rt-PA의 일반적인 사용은, 이 시간동안의 적용이 뇌내 출혈(ICH) 위험성을 증가시킬 수 있으므로 추천되지 않았다(참조: C. Lewandowski C and Wiliam Barsan, 2001: Treatment of Acute Stroke; in: Annals of Emergency Medicine 37:2; S. 202 ff.).

뇌졸중의 혈전용해 치료는 미국에서 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 기관(National Institute of Neurologic Disorder and Stroke: 소위 NINDS rtPA 뇌졸중 시도)에 의해 수행된 임상 시도의 대상이었다. 이러한 시도는 증상이 발생한 후 단지 3시간내의 rt-PA의 정맥내 치료 효과에 집중되었다. 환자는 치료후 3개월동안 관찰되었다. 환자의 생존율에 있어서 당해 치료의 관찰된 양성 효과로 인하여, 비록 저자가 ICH의 보다 높은 위험성을 발견하였지만 이러한 제한된 시간 기간내의 rt-PA 치료가 추천되었다.

2개의 추가 연구[ECASS II 시도: 허혈 뇌졸중에 있어서 급성 비-정맥내 치료요법에 대한 알테플라제(Alteplase) 혈전용해(ATLANTIS)]를 시험하여 뇌졸중의 발생후 3시간 내에 rt-PA 치료의 양성 효과가 심지어 6시간 내의 치료를 사용하는 경우에도 반복될 수 있는지를 시험하였다. 그러나, 이러한 의문은, 치사율에 있어서의 어떠한 감소나 임상 증후의 개선이 관측되지 않았기 때문에 확정적으로 해결될 수 없었다. ICH에 대한 보다 높은 위험도가 유지되었다.

1997년 처음 발표되고 2001년 3월에 업데이트된 모든 뇌졸중 시도의 연구에 따라, 혈전용해제(유로키나제, 스트렙토키나제, rt-PA 또는 재조합 유로키나제)를 사용한 모든 치료는 뇌졸중 후 초기 10일내에 현저히 높은 치사율을 초래한 반면 뇌졸중 발생 후 6시간내에 혈전용해제를 적용하는 경우 사망하거나 신체장애된 환자의 총 수가 감소하는 결과를 초래하였다. 이러한 효과는 단지 ICH에 기인하였다. 따라서, 뇌졸중 치료를 위한 혈전용해제의 광범위한 사용은 추천되지 않았다.

이전에는, 이러한 결과는, 다른 저자에게 뇌졸중 환자들은 죽음이나 또는 신체장애자로 생존하는 선택을 가졌다고 하는 빈정거리는 말의 빌미를 제공하였다(참조: SCRIP 1997: 2265, 26).

그럼에도 불구하고, rt-PA를 사용한 치료요법은 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration(FDA)]에 의해 급성 대뇌 허혈의 유일한 치료법으로 승인되었다. 그러나, 이러한 치료요법은 뇌졸중의 발생후 3시간 이내에 rt-PA를 적용하는 것에 한정된다.

재조합 플라스미노겐 활성인자는 현재 유사 약물로서 명칭 알테플라제(Alteplase) 또는 레테플라제(Reteplase)하에 시판되고 있다. 레테플라제는 반감기가 보다 짧은 치료학적으로 활성인 t-PA 단편이다. 알테플라제에 대한 치료학적 용량은 약 70 내지 100mg이고, 레테플라제의 경우에는 2 x 560mg이며, 여기서, 알테플라제는 주로 점적 주입(drip infusion)을 통해 적용되고 레테플라제는 약 30분의 간격으로 2회 반복되는 볼루스 주사(bolus injection)를 통해 적용된다(참조: Mutschler: "Arzneimittelwirkungen", 8^th Edition, pages 512-513).

t-PA의 부작용

신경독성 및 흥분독성

rt-PA에 대한 승인은 1996년에 이루어졌다. 1995년 이전에는, t-PA의 음성 부작용에 대한 최초 발표가 알려지기 시작하면서, 뇌졸중 치료시 3시간의 기간을 벗어나서 적용하는 경우 이의 놀라운 효과에 대한 설명의 기초를 제공하였다. 따라서, 해마의 미세아교 세포 및 신경 세포는 글루타메이트 매개된 흥분독성에 기여하는 t-PA를 생산한다. 이는 글루타메이트 효능제를 t-PA 결핍 마우스 및 야생형 마우스의 해마 각각에 주사하는 경우 이들 마우스에서의 비교 연구로부터 결론지어진다. t-PA 결핍 마우스는 외부(경막내) 적용된 글루타메이트에 대해 현저히 높은 내성을 나타내었다[참조: Tsirka SE et al., Nature, Vol. 377, 1995, "Excitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator"]. 이러한 결과는 왕(Wang) 등이 t-PA를 정맥내 주사하는 경우 t-PA 결핍 마우스에서 괴사 신경 조직의 양이 거의 2배가 되는 것을 입증할 수 있었던 1998년에 확립되었다. 야생형 마우스에서 외부 t-PA의 음성 효과는 단지 대략 33%이었다(참조: Wang et al., 1998, Nature, "Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischaemia in wild type and t-PA deficient mice").

t-PA에 의한 흥분독성의 자극에 있어서 추가의 결과는 2001년 초에 니콜(Nicole) 등에 의해 발표되었다(참조: Nicole O., Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET, Vivien D and Buisson A. 2001: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; in: Nat Med 7, 59-64). 이들은, 소극화된 피질 뉴런에 의해 방출되는 t-PA가 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 소위 NR1 서브유닛과 상호작용하여 NR1을 분해함을 입증할 수 있었다. 이는 글루타메이트 효능제 NMDA를 적용한 후 보다 높은 조직 손상을 초래하는 수용체 활성을 증가시킨다. NMDA 효능제는 흥분독성을 유도하였다. 따라서, t-PA는 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체를 활성화시킴으로써 신경독성 효과를 나타낸다. 혈액-뇌 장벽은 뇌졸중 동안 영향받은 조직 부위에서 분해되므로, 피브리노겐과 같은 가용성 혈장 단백질 및 치료학적으로 적용된 t-PA가 신경 조직과 접촉하며, 여기서, 피브리노겐에 의해 자극받은 t-PA는 글루타메이트 수용체의 활성화를 통해 자체의 흥분독성 효과를 나타낸다.

t-PA의 신경독성 부작용 및 치사율에 있어서 t-PA의 증가된 효과에도 불구하고, t-PA는 FDA에 의해 승인되었다. 이는 무해성 결여 및 효과적인 선택성에 의해 설명될 수 있으므로, 이는 매우 실제적인 비용 이익 분석에 기인한다. 따라서, 안전한 치료요법에 대한 요구가 여전히 지속되고 있다. 그러나, 이들이 여전히 혈전용해제에 기초하는 경우, 즉, 혈전용해에 대한 대안을 발견할 수 없는 경우, 신경독성의 문제가 고려되어야 한다(참조: Wang et al. a.a.O.; Lewandowski and Barson 2001 a.a.O.).

따라서, 뇌졸중에 대한 새로운 약물을 개발하기 위한 DSPA[데스모두스 로툰두스(Desmodus rotundus) 플라스미노겐 활성인자]를 포함하는 공지된 혈전용해제의 추가의 시험은, 원칙적으로 모든 혈전용해제가 잠재적으로 적합하다고 해도, 종결되었다. 특히 DSPA의 경우에 본 의학적 징후에 대한 이의 잠재적인 적합성이 초기에 지적되었다[참조: Medan P; Tatlisumak T; Takano K; Carano RAD; Hadley SJ; Fisher M: Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator(rDSPA) in a rat embolic stroke model; in: Cerebrovasc Dis 1996:6; 175-194(4^th International Symposium on Thrombolic Therapy in Acute Ischaemic Stroke]. DSPA는 t-PA와 상동성이 높은(유사한) 플라스미노겐 활성인자이다. 따라서, 및 t-PA의 신경독성 부작용으로부터 초래된 환멸감외에, DSPA가 뇌졸중 치료용으로 적합한 약물이라는 것에 대한 추가의 예측은 없었다.

대체 치료학적 시도

대체 치료학적 시도의 연구는 예를 들면, 현재 말라얀 피트 독사(Malayan pit viper)의 독으로부터 기원한 활성 물질인 안크로드, 헤파린 또는 아스피린과 같은 항응고제에 관심이 집중되고 있다. 그러나, 헤파린의 효과를 시험하는 2개으 추가 임상적 시도[국제 뇌졸중 시도(International Stroke Trial(IST) 및 급성 뇌졸중 치료(Acute Stroke Treatment(TOAST)에서 ORG 10172의 시도]는 치사율의 현저한 개선 또는 뇌졸중의 예방을 나타내지 않는다.

추가의 새로운 치료는 혈전이나, 또는 혈액 희석 또는 항 응고에 관심이 집중되는 것이 아니라 혈액 공급의 차단에 의해 손상된 세포의 생존율을 증가시키는 시도에 관심이 집중되고 있다(참조: 제WO 01/51613 A1호 및 제WO 01/51614 A1호). 퀴논 그룹으로부터의 당해 항생제를 달성하기 위해, 아미노글리코사이드 또는 클로람페니콜이 적용된다. 유사한 이유로, 뇌졸중의 발생 직후 시티콜린의 적용으로 개시하는 것이 또한 제안된다. 체내에서, 시티콜린은 사이티딘 및 콜린으로 분해된다. 분해 산물은 신경세포막의 일부를 형성하므로 손상된 조직의 재생을 지지한다(참조: 미국 특허 제5,827,832호).

안전한 치료에 있어서 최근 연구는, 뇌졸중의 치명적인 결과의 일부가 차단된 혈액 공급에 의해 간접적으로 유발될 뿐 아니라 과도하게 활성화된 글루타메이트 수용체를 포함하는 흥분독성 또는 신경독성에 직접적으로 유발된다는 새로운 발견에 기초한다. 당해 효과는 t-PA에 의해 증가된다(상기 참조). 따라서, 흥분독성을 감소시키기 위한 개념은 소위 신경보호제를 적용하는 것이다. 이들은 신경독성 효과를 최소화시키기 위하여 섬유소용해제와 함께 또는 별개로 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면 글루타메이트 수용체 길항제로서 직접적으로 또는 전압 의존성 나트륨 또는 칼슘 채널을 억제함으로써 간접적으로 감소된 흥분독성을 초래할 수 있다(참조: Jin-Mo Lee et al. a.a.O.).

NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 경쟁적 억제(길항 작용)은 예를 들면, 2-아미노-5-포스포노발레레이트(APV) 또는 2-아미노-5-포스포노헵타노에이트(APH)를 사용하여 달성시킬 수 있다. 비경쟁적 억제는 예를 들면, 채널의 펜사이클리딘 측쇄에 결합하는 물질에 의해 달성될 수 있다. 이러한 물질은 펜사이클리딘, MK-801, 덱스트로르판 또는 세타민일 수 있다.

지금까지, 신경보호제를 사용한 치료는, 신경보호제가 혈전용해제와 배합되어야 자체의 보호 효과를 나타내기 때문에 예측된 성공을 보여주지 않았다. 이는 다른 물질에도 적용된다 (도 10)

심지어 t-PA 및 신경보호제의 배합은 제한된 손상만을 초래한다. 그럼에도 불구하고, 섬유소용해제 자체로서의 불리한 신경독성은 피할 수 없다.

비-신경독성 플라스미노겐 활성화제

뇌졸중을 치료하기 위한 플라스미노겐 활성인자의 효소 활성이 예를 들면, 650회 이상의 역가로 수회에 걸쳐 피브린에 의해 매우 선택적으로 증가된다는 사실은, 이의 전문이 참조로 완전하게 인용된 국제 특허원 제PCT/EP02/12204호로부터 공지되어 있다.

이들 플라스미노겐 활성인자의 특성 및 투여는, 조직-플라스미노겐 활성인자(t-PA)의 신경독성이, 혈액-뇌 장벽은 뇌졸중에 의해 유발된 뇌내 조직 파괴의 결과로 손상되거나 파괴된다는 사실 및 혈액속에서 순환하는 피브리노겐은 뇌의 신경 조직내로 침투할 수 있다는 사실에 주로 기인한다는 지식에 기초하고 있다. 이는 t-PA를 활성화시키고, 글루타메이트 수용체를 활성화시키거나 플라스미노겐을 활성화시킴에 의해 추가의 조직 손상을 간접적으로 초래한다(상기 참조).

이러한 효과를 방지하기 위하여, 플라스미노겐 활성인자를 적용하는데, 당해 플라스미노겐 활성인자는 피브린에 대한 선택성을 증가시키며, 역 결과로서, 피브리노겐에 의한 활성화 효능을 감소시킨다. 이는, 이들 플라스미노겐 활성인자가 활성화될 수 없거나, t-PA와 비교하여 피브리노겐이 혈액으로부터 손상된 혈액-뇌 장벽의 결과로 신경 조직내로 침투하는 경우 훨씬 낮은 정도로 활성화될 결과를 지니는데, 그 이유는 피브리노겐의 활성인자 피브린이 자체 크기 및 불용성의 이유로 인해 신경 조직에 도입될 수 없기 때문이다. 따라서, 이러한 플라스미노겐 활성인자는 비-신경독성이다.

a) 유전적으로 개질된 플라스미노겐 활성인자

본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 소위 시모겐 트리아드(cymogene triade)라고 불리는 엘리먼트를 하나 이상 포함하는, 비-독성 플라스미노겐 활성인자가 사용된다. 비교되는 트리아드는 3개의 상호작용 아미노산인, 아스파르테이트 194, 히스티딘 40 및 세린 32로 이루어진 키모트립신 과의 세린 프로테아제의 촉매 중심으로부터 알려져 있다. 그러나, 이러한 트리아드는 세린 프로테아제와 유사한 키모트립신 과에 또한 속하는 t-PA에는 존재하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 적합한 위치에서 상기 아미노산중 하나 이상을 도입시킬 목적으로 천연의 t-PA를 직접 돌연변이유발시키는 것은 전-효소(pro-enzyme)(단일 쇄 t-PA)의 감소된 활성을 초래하고 피브린의 존재하에 성숙한 효소(이중 쇄 t-PA)의 증가된 활성을 초래한다. 따라서, 상기 트리아드의 하나 이상의 아미노산 또는 트리아드중 각각의 기능을 가진 아미노산의 도입은 t-PA의 시모겐성(cymogenity) (즉, 성숙한 효소의 활성과 전-효소의 활성 사이의 비)을 증가시킬 수 있다. 그 결과 피브린 특이성이 현저하게 증가된다. 이는 도입된 아미노산 잔기 및/또는 야생형 서열의 아미노산 잔기간의 구조적 상호작용에 기인한다.

Phe305가 His(F305H)로 치환되고 Ala 292가 Ser로 치환된(A292S) 천연의 t-PA의 돌연변이유발로 시모겐성이 20배 증가되는 반면, 변이체 F305H 단독은 이미 5배 높은 시모겐성을 초래한다 (참조: EL Madison, Kobe A, Gething M-J; Sambrook JF, Goldsmith EJ 1993: Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen: A regulatory Triad of Asp-His-Ser; Science: 262, 419-421). 피브린의 존재하에서 이러한 t-PA 돌연변이체는 각각 30,000배(F305H) 및 130,000배(F305H, A292S)의 활성 증가를 나타낸다. 또한 이들 돌연변이체는 Arg275의 R275E로의 치환을 포함함으로써 절단 부위 Aug275-Ile276에서 플라스민에 의한 절단을 방지하고, 이에 의해 단일 쇄 t-PA가 이중 쇄 형태로 전환된다. 돌연변이 부위 R275E 만이 t-PA의 피브린 특이성의 6,900배 증가를 초래한다(참조: K Tachias, Madison EL 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulation by Fibrin, in: Journal of Biological Chemistry 270, 31: 18319-18322).

t-PA의 위치 305 및 292는 키모트립신성 세린 프로테아제의 공지된 트리아드의 위치 His40 및 Ser32와 상동이다. 히스티딘 또는 각각의 세린을 도입시키는 상응하는 치환에 의해, 이들 아미노산을 t-PA의 아스파르테이트477과 상호작용시켜 t-PA 돌연변이체내 작용적 트리아드를 생성시킬 수 있다(참조: Madison et al., 1993).

이들 t-PA 돌연변이체는 이들의 증가된 피브린 특이성으로 인하여 신경독성을 나타내지 않거나, 야생형 t-PA와 비교하여 신경독성을 현저히 감소시키므로 본 발명에 따라 뇌졸중을 치료하는데 사용할 수 있다. 언급한 t-PA 돌연변이체 F305H; F305H; A292S 단독 또는 R275E와의 배합물을 기술할 목적으로, 본 출원인은 본원에 참조로 전문을 인용한 문헌[참조: Madison et al., (1993) and Tachias and Madison (1995)]을 인용한다.

플라스미노겐 활성인자의 피브린 특이성의 증가는 또한 Asp194(또는 동일한 위치에서 아스파르테이트)의 점 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 플라스미노겐 활성인자는 키모트립신 과의 세린 프로테아제 그룹에 속하므로 성숙한 프로테아제의 촉매 활성 구조의 안정성에 관여하는 보존된 아미노산 Asp194를 포함한다. Asp194가 세린 프로테아제의 시모겐 형태의 His40과 상호작용하는 사실은 알려져 있다. 시모겐이 절단에 의해 활성화된 후, 이러한 특이적 상호작용은 차단되고 Asp194의 측쇄는 약 170°회전함으로써 Ile16과의 새로운 염 브릿지를 형성한다. 이러한 염 브릿지는 필수적으로 성숙한 세린 프로테아제의 촉매 중심의 옥시음이온 포켓의 안정성에 기여한다. 이는 또한 t-PA속에 존재한다.

Asp194 주요 외관을 대체하는 점 돌연변이의 도입은 세린 프로테아제의 촉매적 구조의 형성 또는 각각의 안정성을 방해한다. 이럼에도 불구하고 돌연변이된 플라스미노겐 활성인자는 특히 성숙한 야생형과 비교하여 이들의 보조인자 피브린의 존재하에 활성을 현저히 증가시키며, 이는, 피브린과의 상호작용이 구조적 변화로 촉진된 촉매 활성을 허용한다는 방식으로만 설명될 수 있다(참조: L Strandberg, Madison EL, 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin co-factors, in: Journal of Biological Chemistry 270, 40: 2344-2349).

결론적으로, 플라스미노겐 활성인자의 Asp194 돌연변이체는 본 발명에 따라 이들의 사용을 가능하도록 하는 피브린의 존재하에 활성의 높은 증가를 나타낸다.

본 발명에 따른 바람직한 양태에서는, Asp194가 글루타메이트(D194E)에 의해 또는 각각 아스파라긴(D194N)에 의해 치환된 돌연변이체 t-PA가 사용된다. 이들 돌연변이체에서, t-PA의 활성은 피브린의 부재하에서 1 내지 2000배 감소되는 반면, 피브린의 존재하에서, 498,000 내지 1,050,000의 역가에 의해 활성이 증가될 수 있다. 이들 돌연변이체는 또한 Arg15에서 R15E로의 치환을 포함할 수 있으며, 이는 펩티드 결합 Arg15-Ile16에서 단일 쇄 t-PA의 플라스민에 의한 분해를 방지하여 t-PA의 이중 쇄 형태를 초래한다. 이러한 돌연변이만으로 피브린에 의한 t-PA의 활성화가 12,000역가 이상 증가한다. 위치 194 및 15에서 t-PA 돌연변이가 기술되어 있기 때문에 문헌[참조: Strandberg and Madison (1995)]의 전문을 완전히 참조로 인용한다.

플라스미노겐 활성인자의 피브린 의존성의 증가는 또한 소위 "자가분해 루프(autolysis loop)"에서 점 돌연변이의 도입에 의해 달성될 수 있다. 이러한 성분은 트립신으로부터 공지되어 있는데, 이는 또한 세린 프로테아제에서 상동 부분인 것으로 밝혀질 수 있으며 특히 3개의 소수성 아미노산(Leu, Pro 및 Phe)을 특징으로 한다. 플라스미노겐 활성인자내 자가분해 루프는 플라스미노겐과의 상호작용에 관여한다. 당해 부위에서 점 돌연변이는, 플라스미노겐과 플라스미노겐 활성인자간의 단백질-단백질 상호작용이 더이상 효과적으로 형성될 수 없도록 하는 효과를 지닐 수 있다. 이러한 돌연변이체는 피브린의 부재하에서 단지 작용적으로 관련된다. 피브린의 존재하에서, 이들은, 대조적으로, 플라스미노겐 활성인자의 증가된 활성에 관여한다(참조: K Song-Hua, Tachias K, Lamba D, Bode W, Madison EL, 1997: Identification of a Hydrophobic exocite on Tissue Type Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen, in: Journal of Biological Chemistry 272; 3, 1811-1816).

바람직한 양태에서, t-PA는 위치 420 내지 423에서 점 돌연변이를 나타내는데 사용된다. 이들 잔기가 지시된 돌연변이유발에 의해 치환되는 경우, 이는 t-PA의 피브린 의존성을 61,000 이하의 역가로 증가시킨다(참조: K Song-Hua et al.). 송-화(Song-Hua) 등은 점 돌연변이 L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A 및 F423E를 시험하였다. 이들 문헌의 전문은 본 발명에 따른 사용 기술을 위해 참조로 인용한다.

추가의 유리한 양태에 따라, 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열(도 14)을 지닌 개질된 조직 플라스미노겐 활성인자를 사용한다. 이들 개질된 t-PA는 자가분해 루프내 위치 420 내지 423에서 소수성 아미노산의 교환으로 야생형 t-PA와는 다음과 같이 상이하다: His420, Asp421, Ala422 및 Cys423. 이들 t-PA는 바람직하게는 위치 194에서 페닐 알라닌을 함유한다. 또한 위치 275는 글루타민에 의재 점유될 수 있다. 유리하게는 위치 194는 페닐 알라닌에 의해 점유된다.

추가로, 개질된 유로키나제를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 유로키나제는 서열 번호 2(도 13)에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서, 자가분해 루프의 소수성 아미노산은 Val420, Thr421, Asp422 및 Ser423으로 치환된다. 유리하게는, 유로키나제는 Ile275 및 Glu194를 수반한다. 당해 돌연변이체는 야생형 유로키나제와 비교하여 500배 증가된 피브린 특이성을 나타낸다.

돌연변이체-유로키나제 및 t-PA 둘 모두를 반 정량 시험(semi quantitative test)으로 분석하였으며 야생형 t-PA외 비교하여 증가된 피브린 특이성을 나타내었다.

b) 데스모두스 로툰두스로부터의 플라스미노겐 활성인자(DSPA)

뱀파이어 박쥐(데스모두스 로툰두스) 타액으로부터의 플라스미노겐 활성인자(DSPA)는 또한 피브린의 존재하에서 고도로 증가된 활성, 특히 100,000배 증가를 나타낸다. 따라서, 이를 본 발명에 따라 바람직하게 사용할 수 있다. 용어 DSPA는 4개의 상이한 프로테아제를 포함하며, 이는 뱀파이어 박쥐에 필수적인 작용, 즉 먹이의 상처 출혈 기간의 증가를 충족시킨다(참조: Cartwright, 1974). 이들 4개의 프로테아제(DSPAalpha1, DSPAalpha2, DSPAbeta, DSPAgamma)는 서로에 대해서 및 사람 t-PA에 대해서 높은 유사성(상동성)을 나타낸다. 이들은 또한 유사한 생리학적 활성을 나타내며 속명 DSPA하에 일반적으로 분류된다. DSPA는 전문이 기술 목적으로 본원에 참조로 인용된 유럽 특허 제0 352 119 A1호 및 미국 특허 제6,008,019호 및 제5,830,849호에 기술되어 있다.

DSPA알파는 지금까지 이들 그룹 중에서 가장 잘 분석된 프로테아제이다. 이는 공지된 사람 t-PA 아미노산 서열과 비교하여 72% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 지닌다(참조: Kratzschmar et al, 1991). 그러나, t-PA와 DSPA사이에는 2개의 필수적인 차이점이 있다. 첫째로 모든 DSPA는 t-PA와는 대조적으로 이중 쇄 형태로 전환되지 않기 때문에 단일 쇄 분자로서 완전한 프로테아제 활성을 지닌다(참조: Gardell et al., 1989; Kratzschmar et al., 1991). 둘째로, DSPA의 촉매 활성은 피브린에 거의 절대적으로 의존적이다(참조: Gardell et al., 1989; Bringmann et al., 1995; Toschie et al., 1998). 예를 들어, DSPA알파1의 활성은 피브린의 존재하에 100,000배 증가하는 반면, t-PA 활성은 단지 550배 증가한다. 대조적으로, DSPA 활성은 7 내지 9배 증가만을 나타내므로, 피브리노겐에 의해 현저하게 거의 강력하게 유도되지 않는다(참조: Bringmann et al., 1995). 결론적으로, DSPA는 피브린에 현저하게 더욱 의존적이며 피브린에 의해 단지 550배 활성화되는 야생형 t-PA로서 더욱 더 피브린 특이적이다.

이의 섬유소용해 특성 및 t-PA에 대한 강력한 유사성으로 인하여, DSPA는 혈전용해제의 개발을 위한 흥미있는 후보물질이다. 이럼에도 불구하고, 혈전용해제로서 DSPA의 치료학적 용도는 과거에 심근경색의 치료로 한정되었는데, 그 이유는 글루타메이트 유도된 신경독성에 대한 t-PA의 기여로 인하여, t-PA와 관련된 플라스미노겐 활성인자가 급성 뇌졸중의 치료에 충분히 사용될 수 있다는 정당화된 희망이 존재하지 않기 때문이었다.

놀랍게도 DSPA는 t-PA에 대해 높은 유사성(상동성)을 나타내고 당해 분자의 생리학적 효과가 큰 정도로 비교가능하다고 해도 신경독성 효과를 지니지 않음이 밝혀졌다. 상기 결론은, DSPA가 결국 신경 조직 손상의 심각한 위험을 유발하지 않으면서 뇌졸중의 치료요법을 위한 혈전용해제로서 성공적으로 사용될 수 있다는 개념을 이끈다. 가장 흥미있는 것은, DSPA가 또한 뇌졸중 증상의 발생한 지 3시간 이후에 사용될 수 있다는 사실이다.

DSPA의 존재하지 않는 신경독성에 대한 실험적 증명

신규 교시는 NMDA 유도된 선조체 병변을 시험하기 위한 모델 및 소위 카이닌산 모델을 사용하여 수행된, 한편으로는 t-PA의 신경변성 효과 및 다른 한편으로는 DSPA의 신경변성 효과의 생체내 비교 실험을 기초로 한다.

카이닌산 모델(또한 카이닌산 손상 모델)은 카이닌산 유형(KA 유형)의 글루타메이트 수용체, 및 NMDA 및 AMPA 글루타메이트 수용체의 효능제로서 카이닌산(KA)의 외부 적용에 의해 신경독성 글루타메이트 캐스케이드의 자극을 기초로 한다. 실험 모델로서 t-PA 결핍 마우스 줄기세포을 사용하여 외부 t-PA를 보충적으로 적용한 후 카이닌산에 대한 실험실 동물의 민감도만이 야생형 마우스의 수준에 이르는 것을 보여주는 것이 가능하였다. 대조적으로, 동일한 실험 조건하에서 DSPA의 등몰 농도의 주입은 카이닌산(KA)에 대한 민감도를 회복하지 않는다. t-PA의 신경독성 효과는 DSPA에 의해 유도되지 않았음이 결론지어졌다. 이러한 결과의 요약을 도 15(표 1)에 나타낸다.

당해 동물을 기초로 한 정량적 실험은, DSPA 농도의 심지어 10배 증가가 KA 치료에 대해 t-PA 결핍 마우스의 민감도를 회복할 수 없으나 이미 10배 낮은 t-PA 농도는 KA 유도된 조직 손상을 초래함을 나타내었다. 이는, DSPA가 KA 치료후 신경변성의 자극과 관련하여 t-PA와 같이 100배 이상의 낮은 신경독성 효능을 지닌다는 결론을 이끈다(참조: 도 11 및 도 12).

신경변성의 제2 모델에서, NMDA 의존성 신경변성의 자극시 t-PA 및 DSPA의 가능한 효과를 야생형 마우스와 비교하였다. 당해 목적을 위해, NMDA(NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 효능제로서)를 야생형 마우스에게 단독으로, 또는 t-PA 또는 DSPA와 함께 주사하였다. 당해 모델은 혈액-뇌 장벽의 파괴로 인하여 신경변성 및 혈장 단백질의 유입으로 항상 이끄는 조건하에서 이들 프로테아제의 효과를 비교하도록 한다.

당해 모델에서의 작업동안 NMDA의 주사는 마우스 선조체내에서 재생가능한 병변을 유발하였다. 병변의 크기는 t-PA와 NMDA의 배합된 주사에 의해 50% 이상 증가하였다. 대조적으로 DSPAα1과의 동시-주사는 NMDA에 의해 유발된 병변의 증가 또는 확장을 유발하지 않았다. 심지어 NMDA에 의해 유발된 병변 영역내에서 자유롭게 확산할 수 있는 혈장 단백질의 존재하에서조차, DSPA는 신경변성의 증가를 초래하지 않았다. 이들 결과의 요약을 도 16(표 2)에 나타낸다.

임상 시도로부터의 첫번째 결과는 또한 사람에 있어서 뇌졸중의 치료를 위한 이들 결과의 이동성을 나타낸다. 현저한 개선이 성공적인 관류 후의 환자에서 달성될 수 있음이 밝혀졌다(8점 NIHSS 또는 NIHSS 점수 0 내지 1의 증가). 이를 도 17(표 3)에 나타낸다.

추가의 실험에서, t-PA와 DSPA가 정맥내 투여되는 경우 손상된 혈액-뇌 장벽을 침투할 수 있으며 그 결과 뇌내 조직 병변을 증가시킬 수 있는지를 시험하였다. 이러한 의문에 촛점을 맞추어, 선조체내 조직 병변을 생성시키기 위하여 마우스에 NMDA을 정위 주사한 다음 NMDA 주사 후 6 또는 24시간 만에 t-PA 또는 DSPA를 정맥내 적용하였다. 음성 대조군과 비교하여, 실험 동물은 t-PA를 NMDA 주사 후 24시간만에 주입으로 제공하는 경우 약 30%의 조직 부위 손상을 유도하였으며; 대조적으로 DSPA를 사용한 동일한 치료는, 비록 손상된 조직 영역내 이의 침투가 항체 염색의 수단에 의해 양성적으로 검출되었다 하더라도, 이러한 조직 손상의 증가를 생성하지 않았다(참조; 도 18 및 도 19). t-PA 또는 DSPA를 NMDA-주사후 6시간만에 상응하는 방식으로 정맥내 적용하는 경우에, 손상된 조직 영역의 증가는 아직 검출되지 않았다. 이로써, 혈액-뇌 장벽은, t-PA 또는 DSPA 주사 시에도 여전히 충분한 장벽 기능을 제공하였음이 설명될 수 있다.

이러한 결과는, DSPA가 포유동물(및 또한 사람)의 중추신경 시스템내 대부분의 불활성 프로테아제를 구성하며, t-PA와는 대조적으로 KA 또는 NMDA에 의해 유도된 신경독성의 강화 작용을 생성하지 않는다는 것을 나타낸다. 일반적인 예측에 대한 신경독성의 결여는, DSPA를 급성 뇌졸중의 치료를 위한 적합한 혈전용해제가 되도록 한다.

비-신경독성 플라스미노겐 활성인자의 치료 효능

DSPA 및 기타 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자의 신경독성 결여(상기 참조)는, 야생형 t-PA와는 대조적으로 이러한 플라스미노겐 활성인자의 사용이 뇌졸중의 발생 후 단지 3시간의 짧은 최대 기간에 제한되지 않는 뇌졸중 치료의 특수한 장점을 제공한다. 대조적으로, 당해 치료는, 흥분독성 반응을 자극할 위험이 거의 없기 때문에, 예를 들면 6시간 또는 심지어 그 이상 후에도 개시할 수 있다. DSPA를 사용한 첫번째 임상 시도는 심지어 뇌졸중 증상의 발생 후 6 내지 9시간에 걸친 범위의 시간내에서도 환자를 안전하게 치료함을 입증한다.

비-신경독성 활성인자를 사용한, 시간이 제한되지 않는 치료의 이러한 선택은, 진단이 지연되거나 뇌졸중의 발생을 충분히 확신하여 측정할 수 없는 경우에서조차 급성 뇌졸중 증상을 지닌 환자를 처음 치료하도록 하기 때문에, 특히 중요하다. 선행 분야에서, 환자의 이러한 그룹은 불리한 위험 평가로 인하여 플라스미노겐 활성인자를 사용한 혈전용해 치료요법으로부터 제외되었다. 결론적으로, 뇌졸중을 위한 혈전용해제의 공인된 사용을 위한 필수적인 금기가 제거된다.

플라스미노겐 활성인자의 적용

이미 확립된 뇌졸중 치료 rt-PA와는 대조적으로, 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자를 사용한 뇌졸중 치료용의 가능한 적용 모델에 대한 확인된 정도는 아직 유용하지 않다.

따라서, 본 발명의 목적은 이러한 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자에 대한 유리한 적용 모드를 제공하는 것이다.

본 발명에 따라서, 활성이 피브린의 존재하에 650 이상의 역가로 증가된 플라스미노겐 활성인자가 뇌졸중의 치료를 위해 정맥내로 적용된다.

뇌졸중의 치료를 위한 이러한 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자의 정맥내 투여는 임상 시도에서 이미 평가되었는데, 여기서, 섬유소용해제의 이러한 그룹에 대한 예로서 DSPA가 이들 환자에 정맥내 적용됨으로써 단지 약간의 부작용만을 유발하였다.

임상적 연구의 이러한 결과는 잘 알려져 있기 때문에, t-PA 및 기타 일반적인 섬유소용해제의 정맥내 적용이 대뇌 출혈의 심각한 위험과 관련되어 있다는 사실은 예측불가능하였다(상기 참조).

뇌내 출혈을 감소시키기 위하여, 이들 물질은 더 이상의 정맥내 투여없이 동맥내 경로를 통해 카테테르의 수단으로 정맥내 혈전에 직접 근접하기 위한 방법을 개발하기 위한 최근의 노력이 이루어졌다. 이를 위한 실제적인 실험은 재조합적으로 생산된 유로키나제(전-유로키나제를 사용한 연구로서 PROKAT)의 경우 이미 이용가능하다. 이러한 적용 모델은 총 투여량의 현저한 감소를 허용하므로, 투여량 의존적인 부작용에 있어서의 감소, 즉 또한 뇌 출혈의 현저한 감소가 실현된다.

그러나, 동맥내 적용의 이러한 현저한 장점은 2개의 가능한 단점과 모순된다. 첫째로, 이러한 치료는 환자의 시간 소모적인 준비에 필수적인데, 이러한 준비는 뇌졸중 치료에 있어서 단지 3시간 기간의 제공된 시한내에 가능하게 인지되지 않는다. 다른 한편으로 의사는 보다 낮은 총 투여량을 명백히 달성할 수 있다. 그러나, 약물의 보다 높은 농도는 말단 동맥에 국소적으로 도달할 것이다. 뇌졸중의 경우에 혈관 내피의 손상된 장벽 기능의 결과로, 약제학적 물질은 또한 국소적으로 높은 농도에서 주변 조직에 이를 것이다. 이후에 이는 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있다.

이와는 대조적으로, 약제학적 물질의 농도는 정맥내 적용의 경우에 정맥 혈액 흐름에 의해 희석될 것이다. 즉, 동맥내 주사는 t-PA와 같이 조직을 파괴하는 효능을 갖는 약물의 경우에 문제를 유발한다(참조: Forth, Henschler, Rummel, Starke: "Pharmakologie und Toxikologie" 6^th Edition, 1992, page 29).

그러나, 동맥내 적용을 복잡하게 하는 제한, 즉 시간의 협소한 시한 및 조직 손상 부작용은 본 발명에 따라 적용된 플라스미노겐 활성인자의 경우 효과적이지 않다. 즉, 원칙적으로 이의 명백한 장점(상기 참조)의 이유로 동맥내 적용은 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자에 대한 매우 유망한 적용 모드를 구성한다. 따라서, 이들 약물에 대한 바람직한 적용 모드를 찾는 경우에 이러한 경로를 수행하는 것이 명백해질 수 있다.

그럼에도 불구하고, 본 출원인은 또한 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자를오히려 문제가 많은 정맥내 적용에 따라 선택한 후, 놀랄만한 장점이 있음을 입증하였다.

또한, 본 발명에 따른 적용 모드는 아나필락시스 쇼크의 위험을 감소시킬 목적을 갖는, 면역원성 효능이 증가된 단백질을 투여하기 위하여 대부분 근육내 주사 또는 정맥내 점적 주입을 이용하는 일반적인 치료학적 시도를 벗어난다(참조: Mebs: "Gifttiere" 2th Edition, 2000).

천연의 신체 물질로서의 t-PA와는 대조적으로, 본 발명에 따라 적용된 플라스미노겐 활성인자는 동물로부터 기원한 외부 단백질(예를 들면, DSPA와 같은) 또는 구조적 차이의 결과로서 신규한 에피토프를 나타내는 유전적으로 개질된 신체 단백질이다. 특히, 정맥내 적용의 경우에 일반적으로 필수적인 바와 같이 높은 치료학적 용량을 적용하는 경우 아나필락시스 반응의 수반하는 문제는 또한 예를 들어, 스트렙토키나제와 같은 외부 단백질로 이루어진 다른 섬유소용해제에도 적용된다.

특히 유리한 양태에서, 본 발명에 따라 적용된 플라스미노겐 활성인자는 볼루스 주사(bolus injection)(정맥내 빠른 주사)의 수단으로 투여되며, 이는 또한 총 치료학적 용량을 함유하는 1회의 정맥내 빠른 주사로 투여될 수 있다.

임상 연구와 관련하여, 매우 낮은 치료학적 용량의 정맥내 적용조차 유리한 결과를 가져온다는 것이 밝혀졌다. 바람직한 치료학적 결과는 예를 들면 90㎍/kg 내지 230㎍/kg의 용량으로 달성되었다. 본원에서 특히 바람직한 치료학적 결과는 62.5 내지 90㎍/kg의 용량으로 달성되었다. 시험된 환자에서, 뇌졸중과 약물 적용 사이의 기간은 3 내지 9시간 사이였다. 적합한 실험 방법에 의해 치료학적 효과의 개시를 측정하는 것이 가능하였다(참조: 도 20 내지 도 29).

DSPA 및 추가의 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자는 조직 손상 부작용을 나타내지 않는다. 그러나, 사람 체내에 천연적으로 존재하는 글루타메이트에 의해 유발된 조직 손상을 제한하기 위하여 뇌졸중 치료용의 신경보호제와 함께 이들을 적용하는 것이 유리할 수 있다. 글루타메이트 수용체를 경쟁적으로 또는 비경쟁적으로 억제하는 신경보호제를 사용할 수 있다. 유용한 배합은 예를 들면 APV, APH, 펜사이클리딘, MK-801, 덱스트로르판 또는 세타민과 같이, 예를 들면 NMDA 유형, 카이닌산 유형 또는 퀴스쿠알레이트 유형의 글루타메이트 수용체의 공지된 억제제를 사용하는 것이다.

또한 양이온과의 배합이 유리한데, 이는 양이온, 특히 Zn-이온이 글루타메이트 수용체에 의해 조절된 양이온 채널을 차단함으로써 신경독성 효과를 감소시킬 수 있기 때문이다.

추가의 유리한 양태에서, 비-신경독성 플라스미노겐 활성인자는 하나 이상의 추가의 치료학적 제제 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 배합될 수 있다. 세포를 활성화시킴에 의해 조직 손상의 감소를 지지하는 치료제와의 배합이 필수적으로 유리한데, 이는 이러한 배합이 이미 손상된 조직의 재생에 기여하거나 추가의 뇌졸중 발생의 예방을 위해 제공되기 때문이다. 유리한 예는 퀴논과 같은 항생제, 헤파린 또는 히루딘과 같은 항응고제 및 시티콜린 또는 아세틸살리실산과의 배합이다.

하나 이상의 트롬빈 억제제와의 배합이 또한 유리할 수 있다. 바람직하게, 예를 들어, 솔룰린, 트리아빈 또는 팔리디핀과 같은 트롬보모둘린 및 트롬보모둘린 유사체를 사용할 수 있다. 소염 물질과의 추가의 배합은 백혈구에 의한 침윤에 영향을 미치므로 유리하다.

본 발명에 따른 하기 적용 모드 및 제형을 명확한 치료학적 실시예의 수단으로 요약한다.

t-PA와 DSPA의 비교 실험:

A. 방법

1. 동물

야생형 마우스(c57/Black 6) 및 t-PA 결핍 마우스(t-PA-/-마우스) (c57/Black 6) (참조: Carmeliet et al., 1994)는 벨기에 루벤 소재의 피터 카르멜리엣(Peter Carmeliet) 박사에 의해 제공되었다.

2. 뇌 조직으로부터 단백질 추출

뇌 조직내 단백질분해 활성에 이은 t-PA 또는 DSPAα1의 주입에 대한 평가는 지모그래프 분석(zymographic analysis)(참조: Granelli-Piperno and Reich, 1974)으로 수행하였다. 해마내로 7일의 기간에 걸친 주입 후, 마우스를 마취시킨 후 PBS를 명치에 주입하고 뇌를 제거하였다. 해마 부위를 제거하고, 에펜도르프 튜브로 이전시키고 프로테아제 억제제를 함유하지 않는 0.5% NP-40 분해 완충액(0.5% NP-40, 10mM 트리스-HCl pH 7.4, 10mM NaCl, 3mM MgCl₂, 1mM EDTA) 동 용량(w/v)(대락 30 내지 50㎛)속에서 인큐베이션하였다. 뇌 추출물을 수동 유리 균질화기로 균질화시키고 얼음위에 30분 동안 두었다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 존재하는 단백질의 양을 측정하였다(Bio-Rad 시약).

3. 프로테아제의 지모그래프 분석

샘플 및 뇌 조직 추출물에서 단백질분해 활성을 문헌[참조: Granelli, Piperno and Reich (1974)]의 방법에 따른 지모그래프 분석으로 측정하였다. 재조합 단백질을 갖는 샘플(100nM 이하) 또는 뇌 조직 추출물(20 ㎍)을 비-환원 조건하에 (10%) SDS-PAGE에 적용시켰다. 플레이트로부터 겔을 제거하고 1% 트리톤 X 100으로 2시간 동안 세척한 후 중합화된 피브리노겐 및 플라스미노겐을 함유하는 아가로즈 겔위에 덮었다(참조: Granelli, Piperno and Reich, 1974). 겔을 단백질분해된 영역이 나타날때까지 습윤화시킨 챔버속에서 37℃로 인큐베이션하였다.

4. t-PA, DSPA의 해마내 주입 및 후속적인 카이닌산의 주사

카이닌산 손상 모델은 문헌[참조: Tsirka et al. (1995)]의 연구를 기초로 하였다. 동물에 아트로핀(4mg/kg)을 복강내(i.p.) 주사한 후 나트륨 펜토바르비톨(70mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 이후에 마우스를 정위 프레임에 위치시키고 PBS 또는 재조합 사람 t-PA(0.12mg/ml, 1.85μM) 또는 DSPAα1(1.85μM) 중 하나를 100㎕ 함유하는 미세-삼투압 펌프(Alzet model 1007D, Alzet CA. USA)를 견갑골사이에 피하 이식하였다. 펌프를 멸균 튜브를 통해 뇌 캐뉼라로 연결하고 좌 표 정수리점에서 -2.5mm, 중간가쪽 0.5mm 및 배앞쪽 1.6mm에서 두개골을 따라 구멍뚫개 개방을 통해 삽입함으로써 중간선 근처에 액체를 도입시켰다. 캐뉼라를 바람직한 위치에서 고정시키고 펌프로 시간당 0.5㎕의 속도로 각각의 용액을 총 7일동안 주입하였다.

프로테아제를 주입한 후 2일째에 마우스를 재마취시키고 다시 정위 프레임에 위치시켰다. 0.3㎕ PBS중 카이닌산(KA) 1.5nmol을 해마내로 한쪽에 주사하였다. 좌표는 정수리점에서 -2.5mm, 중간가쪽 1.7mm 및 배앞쪽 1.6mm이었다. 흥분독소(KA)를 30초동안 전달하였다. 카이닌산 처리후, 주사 침을 추가로 2분 동안 이러한 좌표로 유지시켜 액체의 역류를 방지하였다.

5. 뇌 처리 과정

KA 주입후 5일째에, 동물을 마취시키고 심장을 통해 30ml의 PBS를 관류시킨 후 4% 파라포름알데하이드 용액 70ml를 관류시키고, 동일한 고정으로 후 고정시킨 다음 30% 수크로스에서 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 뇌의 관상 절편(40㎛)을 동결 박절기상에서 절단하고 티오닌(오스트리아 소재의 BDH 제조원)으로 대조-염색하거나 후술하는 바와 같이 면역조직화학 실험을 위해 가공하였다.

6. 해마내 뉴런 손실의 정량화

CA1-CA3 해마 부분체내 뉴런 손실의 정량화는 앞서 기술한 바와 같이 수행되었다(참조: Tsirka et al., 1995; Tsirka et al., 1996). 모든 처리 그룹으로부터의 등쪽 해마의 5개 연속 부분을 조심스럽게 제조하였으며 당해 부분들은 실제로 CA-주입 부위 및 병변 부위의 부분을 포함하였다. 이들 절편의 해마 부분체(CA1- CA3)를 해마의 전사기 도면으로 추적하였다. 부분체의 전체 길이는 동일한 배율하에 추적한 1mm 표준과 비교하여 측정하였다. 가변적인 모뿔 뉴런을 지닌(정상 형태를 지닌) 조직의 길이와 뉴런이 없는 조직(세포가 존재하지 않고, 티오닌 염색이 안됨)의 길이를 측정하였다. 각각의 해마 부분체에 걸쳐 완전한 뉴런과 뉴런 손실을 나타내는 길이를 절편을 따라 평균을 내고 표준 편차를 측정하였다.

7. t-PA 또는 DSPA를 사용하거나 사용하지 않은 선조체내 NMDA 흥분독성 병변

야생형 마우스(c57/Black 6)를 마취시키고 정위 프레임에 위치시켰다(상기 참조). 이후에 마우스에 좌측 선조체내로 50nmol의 NMDA을 단독으로 또는 46μM rt-PA 또는 46μM DSPAα1과 배합하여 한쪽으로 주사하였다. 대조군으로서 t-PA 및 DSPA를 또한 단독으로(둘 모두 46μM의 농도에서) 주사하였다. 주사 좌표는 정수리점에서 -0.4mm, 중간가쪽 2.0mm 및 배앞쪽 2.5mm였다. 용액(모든 처리에 대해 1㎕의 총 용량)을 0.2㎕/분의 속도로 5분의 기간에 걸쳐 이전시키고 침을 주사 후 추가로 2분 동안 그대로 두어 유체가 유출되는 것을 최소화시켰다. 24시간 후 마우스를 마취시키고 30ml PBS에 이어 70ml의 4% 파라포름알데하이드 용액을 경심 관류시키고 동일한 고정액 속에 24시간 동안 고정시킨 후 추가로 24시간 동안 30% 수크로스에서 인큐베이션하였다. 이후에 뇌를 동결 박절기상에서 절단(40㎛)하고 젤라틴 피복된 유리 슬라이드위에 올려놓았다.

8. NMDA 주사후 병변 크기의 정량

선조체 병변 부피의 정량화를 문헌[참조: Callaway et al. (2000)]에 기술된 방법을 사용하여 수행하였다. 병변 부위에 확장된 10개의 연속된 관상 절편을 제조하였다. 칼라웨이법(Callaway method)을 사용하여 병변 부위를 가시화하고 병변 부피를 마이크로 컴퓨터 영상 장치(MCID, 카나다 온타리오 소재의 Imaging Research Inc., Brock University 제조원)를 사용하여 정량화하였다.

9. 면역조직화학

면역조직화학을 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 관상 절편을 3% H₂O₂ 및 10% 메탄올의 용액속에 5분 동안 침지시킨 후 5% 정상 염소 혈청에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 별아교세포의 검출을 위해 항-GFAP 항체(1:1,000; 미국 캘리포니아주 카르핀테리아소재의 Dako 제조원)와 함께, 미세아교세포의 검출을 위해 항-MAC-1 항체(1:1,000; 미국 노쓰캐롤라이나주 랄라이프소재의 Serotec 제조원)와 함께 또는 폴리클로날 항-DSPA 항체(베를린 소재의 Schering AG 제조원)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 세정한 후, 절편을 적절한 바이오티닐화된 제2 항체(미국 캘리포니아주 부를링가메 소재의 Vector Laboratories 제조원)와 함께 인큐베이션하였다. 이를 3,3'-디아민베브키딘/0.03% H₂O₂를 사용하여 가시화시키기 전 60분동안 아비딘/바이오틴-복합체(미국 캘리포니아주 부를링가메 소재의 Vector Laboratories 제조원)과 함께 최종적으로 인큐베이션하였다. 이후에 절편을 젤라틴 피복된 슬라이즈위에 올려놓고, 건조시키고, 탈수시키고, 투과물질로 덮었다.

10. t-PA 또는 DSPA의 정맥내 투여에 의해 NMDA 주사로 유도된 조직 병변의 증가

선조체내 조직 병변을 유발시키기 위하여, 마우스에 NMDA를 정위 주사하였다. NMDA를 주사한지 6시간 후, t-PA 또는 DSPA(100㎕; 10mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 대조군으로서 100㎕의 0.9% NaCl을 주사한 후 PBS를 주입하였다. 28시간 후 동물을 치사시키고 병변 부피를 측정하였다.

제 2시도에서 15마리 이하의 마우스를 포함하는 동물 세트에 NMDA를 주사한지 24시간 후 t-PA 또는 DSPA를 주입하고 후속적으로 조직 손상을 측정하였다. 뇌속 DSPA의 존재를 입증하기 위해, 관상 절편을 표준 방법에 따라 항-DSPA 항체로 염색하였다.

B. 결과

1. t-PA 또는 DSPA의 주입은 t-PA -/- 마우스의 해마내로 분산되며 단백질분해 활성을 유지한다.

초기 실험을 설계하여 DSPA 및 t-PA가 주입 7일의 기간 동안 단백질분해 활성을 유지하는지를 확인하였다. 말기에 DSPA 및 t-PA의 분취량(100nmmol)을 37℃에서 및 30℃에서 7일동안 수욕 속에서 인큐베이션하였다. 단백질분해 활성을 측정하기 위하여, 프로브의 연속적인 5배 희석물을 비-환원 조건하에서 SPS-PAGE에 적용시키고 지모그래프 분석으로 단백질분해 활성을 평가하였다. 7일의 기간 동안 동결시킨 DSPA 및 t-PA의 분취량을 대조군으로 사용하였다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 당해 기간에 걸쳐 25℃ 또는 37℃로 인큐베이션시 DSPA 또는 t-PA 활성의 단지 약간만이 손실되었다.

2. DSPA 및 t-PA 활성은 주입후 t-PA -/- 마우스로부터 제조된 해마 추출물 에서 회복된다

우선, 주입된 프로테아제가 주입된 동물의 뇌 속에 존재하는지와 당해 구획내 있는 동안 단백질분해 활성을 유지하는지를 확인하여야 했다. 이점에 촛점을 맞추어, t-PA -/-를 7일동안 DSPA 또는 t-PA를 사용하여 주입하였다(상기 참조). 이후에 마우스에 PBS를 경심 관류시키고 뇌를 제거하였다. 같은쪽 및 반대쪽 해마 영역과 소뇌의 영역(음성 대조군으로 취한다)을 분리하였다. 조직 샘플(20㎍)을 SDS-PAGE에 적용시키고 방법 단락의 기술에 따라 지모그래프 분석에 적용시켰다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, DSPA 및 t-PA 활성 둘 모두가 해마의 같은쪽 영역내에서 검출되었으며, 일부 활성이 또한 반대쪽 측면에서 검출되었다. 이는, 주입된 프로테아제가 뇌속에서 이들의 활성을 유지할 뿐만 아니라, 해마 영역내에서 확산됨을 나타낸다. 대조군으로서, 소뇌로부터 제조된 추출물에서는 활성이 검출될 수 없었다.

3. DSPA의 면역조직화학적 평가

DSPA가 해마 영역내로 또한 확산되는지를 추가로 확인하기 위하여, t-PA -/- 마우스의 관상 뇌 절편을 DSPA 주입후 면역화학적으로 분석하였다. DSPA-항원이 해마 영역내에서 주입 부위의 영역내에서 가장 우세하게 염색되면서 검출되었다. 당해 결과는, 주입된 DSPA가 가용성이며 또한 해마내에 존재함을 입증한다.

4. DSPA 주입은 생체내에서 카이닌산 매개된 신경변성을 회복시키지 않는다

t-PA -/- 마우스는 카이닌산(KA) 매개된 신경변성에 특징적으로 내성이다. 그러나, rt-PA의 해마내 주입은 KA-매개된 손상에 대한 민감성을 완전하게 회복한 다. 당해 모델에서 t-PA대신 DSPA를 치환시킬 수 있는지를 측정하기 위하여, t-PA -/- 마우스에 미니-삼투압 펌프를 사용하여 DSPA 또는 t-PA를 해마내로 주입하였다. 그룹 둘 모두에 대해 12마리의 마우스를 시험하였다. 2일 후 동물에 카이닌산을 주사하고 회복되도록 하였다. 5일 후 동물을 치사시키고 뇌를 제거하여 제조하였다(상기 참조). 대조군으로서, t-PA -/- 마우스에 또한 KA 처리하기 전 PBS를 주입하였다(N=3).

관상 뇌 절편을 제조하고 뉴런을 니슬 염색(Nissl staining)으로 검출하였다. 도 4a 및 4b에서 알 수 있는 바와 같이, PBS를 주입한 t-PA -/- 마우스는 KA를 사용한 후속적인 챌린지에 대해 내성이었다. 그러나, 재조합 t-PA의 주입은 KA 처리에 대해 민감성을 회복하였다. 대조적으로, 동일한 농도의 DSPA를 해마 영역내로 주입한 것은 KA에 대한 동물의 민감성을 변경시키지 않았다.

이들 결과의 정량화는 각각의 그룹에서 12마리의 마우스로부터 수득한 데이타에 기초하였다. DSPA를 주입한 12마리의 마우스중 2마리에서, 작은 정도의 신경변성이 관측되었다. 그 이유는 DSPA의 존재와 명백하지 않게 및 가능하게 관련되어 있지 않다. 조합된 데이타는, 이들 2마리의 동물의 경우에 관측된 보다 작은 효과를 고려한다. t-PA로 처리한 모든 12마리의 마우스는 KA 처리에 대해 민감성이었다. 이러한 결과는, 등몰 농도의 t-PA 및 DSPAα1을 주입하는 경우, 단지 t-PA의 투여만이 KA 유도된 신경변성에 대한 민감성을 회복한다는 사실을 나타낸다.

5. DSPA 주입은 미세아교세포 활성화를 초래하지 않는다

t-PA 주입에 의해 유발된 t-PA -/- 마우스의 KA 민감성의 회복은 또한 미세 아교세포 활성화를 초래한다(참조: Rogove et al., 1999). t-PA 또는 DSPA 주입에 이어 KA 처리 후 미세아교세포 활성화의 정도를 평가하기 위하여, 마우스의 관상 절편을 Mac-1 항체를 사용하여 활성화된 미세아교 세포에 대해 면역조직화학 염색에 적용시켰다. t-PA 주입후 KA 민감성의 회복은 Mac-1 양성 세포의 명백한 증가를 초래하였다. 이는 DSPA를 주입한 마우스에서는 관측되지 않았다. 따라서, DSPA의 존재는 KA 처리후 미세아교 세포의 활성화를 초래하지 않는다.

6. 마우스 해마 영역내 DSPA 및 t-PA의 적정

주입을 위해 사용한 t-PA의 농도는 문헌[참조: Tsirka et al. (1995)]에 기술된 농도(100㎕의 0.12mg/ml[1.85μM])를 기초로 하였다. KA-손상 실험을 10배 낮은 t-PA(0.185μM) 및 10배 많은 양의 DSPA(18.5μM)을 사용하여 반복하였다. 낮은 t-PA 농도는 여전히 KA 처리(n=3)에 대한 민감성을 회복할 수 있었다. 가장 흥미있는 것은, 10배 증가된 DSPA 농도의 주입이 KA 처리후 단지 약간의 뉴런 손실을 유발한다는 사실이었다. 이러한 데이터는, DSPA가 KA에 대한 민감성을 증가시키지 않는다는 것을 강력하게 지적한다.

7. 야생형 마우스에서 NMDA-의존성 신경변성에 있어서 t-PA 및 DSPA의 효과

t-PA 및 DSPA의 효과를 야생형 마우스의 신경변성 모델에서 실험하였다. 이들 마우스의 선조체내로 t-PA를 주입하면 글루타메이트 유사체 NMDA에 의해 유발된 신경변성 효과의 증가를 명백히 초래한다(참조: Nocole et al., 2001).

NMDA를 t-PA 또는 DSPA(각각 46μM)의 존재하에 야생형 마우스의 선조체 영역내에 총 1㎕의 부피로 주사하였다. 24시간 후 뇌를 제거하고 병변 크기를 칼라 웨이법[참조: Callaway et al., 2000)(상기 참조)에 따라 정량화하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, NMDA의 단독 주사는 모든 처리한 동물(N=4)에서 회복가능한 병변을 유발하였다. t-PA 및 NMDA를 함게 적용시킨 경우, 병변의 크기는 약 50%(P<0.01, n=4) 증가하였다. 명확히 대조적으로 NMDA 및 동일한 농도의 DSPA의 동시-주입은 NMDA의 단독 주입과 비교하여 병변 크기의 증가를 초래하지 않았다.

t-PA 또는 DSPA의 단독 주사는 검출가능한 신경변성을 초래하지 않았다. 단독으로 투여하는 경우 t-PA의 손실 효과는 니콜(Nicole)의 문헌[참조: Nicole et al. (2001)]의 결과와 일치한다. 이들 데이타는, DSPA의 존재가 심지어 신경변성 사건동안에도 신경변성을 증가시키지 않음을 나타낸다.

DSPA의 주사가 또한 해마 영역내로 확산했는지를 확인하기 위하여, 면역조직화학을 DSPA 항체를 사용함으로써 관상 절편상에서 수행하였다. 당해 실험은, DSPA가 또한 선조체 영역으로 도입되었음을 나타내었다.

간접적인 색소원 시험에 의한 플라스미노겐 활성의 역학적 분석

t-PA 활성의 간접적인 색소원 시험을 기질 Lys-플라스미노겐(American Diagnostica 제조원) 및 스펙트로사이메(spectrocyme) PL(American Diagnostica 제조원)을 사용하여 문헌[참조: Madisan E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.-J., Sambrook J.F. (1989) Nature 339 721-724; Madison E.LO., Goldsmith E.J., Gething M.J., Sambrook J.F. 및 Bassel-Duby R.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 87, 3530-3533, 및 Madison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.J., Sambrook J.F. 및 Gerard R.D. (1990) J. Biol. Chem 265, 21423-21426]에 따라 수행하였다. 시험을 보조-인자 DESAFIB(American Diagnostica 제조원)의 존재 및 부재 둘다하에 수행하였다. DESAFIB는 고순도 사람 피브리노겐을 프로테아제 바트록소빈으로 분해하여 수득한 가용성의 피브린 단량체의 제조물이다. 바트록소빈은 피브리노겐의 Aα-쇄내 Arg¹⁶-Gly¹⁷-결합을 분해함으로써 피브리노펩티드 A를 방출한다. 수득되는, 피브린 1 단량체를 나타내는 데스-AA-피브리노겐은 펩티드 Gly-Pro-Arg-Pro의 부재하에서 가용성이다. Lys-플라스미노겐의 농도는 DESAFIB의 존재하에서 0.0125 내지 0.2 μM로 변하며 보조 인자의 부재하에서 0.9 내지 16μM로 변하였다.

상이한 자극의 존재하에서 간접적인 색소원 시험

간접적인 색소원 표준 시험을 위에서 인용한 문헌에 따라 수행하였다. 0.25 내지 1ng의 효소, 0.2μM Lys-플라스미노겐 및 0.62mM 스펙트로사이메 PL을 함유하는 총 100㎕ 용량의 프로브를 사용하였다. 시험을 완충액, 25㎍/ml의 DESAFIB, 100㎍/ml의 피브리노겐의 시아노겐 브로마이드 단편(American Dianostica 제조원) 또는 100㎍/ml의 자극성 13개 아미노산 펩티드 P368의 존재하에 수행하였다. 분석을 미세역가 플레이트속에서 수행하고 광학 밀도를 "분자 장치 터모막스(Molecular Devices Thermomax)"내에서 1시간 동안 매 30초마다 405nm의 파장에서 측정하였다. 반응 온도는 37℃였다.

8. 정맥내 적용의 경우에 DSPA는 또한 신경 조직 손상의 증가를 유발하지 않는다

마우스의 선조체에서, 조직 병변을 NMDA의 주사에 이어 6 또는 24시간 후 t-PA 또는 DSPA를 정맥내 적용시켜 유발시켰다. 음성 대조군과 비교하여, 실험 동물은 t-PA를 정맥내 주입으로서 NMDA 주사후 24시간만에 제공하는 경우, NMDA 주사에 의해 생성된 손상된 조직 부위의 약 30% 증가를 나타내었으며; 이는 조직 손상의 이러한 증가를 유발하지 않았던 DSPA와는 대조적이었다(참조: 도 18). 항-DSPA-항체를 사용한 관상 절편의 염색에 의해, NMDA를 주사한 지 24시간 후에 정맥내 투여한 DSPA가 손상된 조직 부위내로 침투한 사실은 검출가능하였다(참조; 도 19). NMDA를 주사한지 6시간 후에 t-PA 또는 DSPA를 상응하게 정맥내 적용하는 경우에, 손상된 조직의 증가는 아직 검출되지 않았다. 이는, t-PA 또는 DSPA의 적용 순간에 혈액-뇌 장벽이 여전히 충분한 장벽 기능을 제공한 이유일 수 있다. 따라서, 정맥내 적용의 경우에 DSPA는 또한 신경독성 부작용을 나타내지 않는다.

참조문헌:

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Cys 115 120 125 Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr 130 135 140 Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu Gln Gln 145 150 155 160 Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu Gly Lys 165 170 175 His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr 180 185 190 Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val His Asp 195 200 205 Cys Ala Gly Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Glu Pro Arg Phe 210 215 220 His Ser Thr Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe 225 230 235 240 Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Gly Val Thr Tyr Val 245 250 255 Cys Gly Gly Ser Leu Met Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His 260 265 270 Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly 275 280 285 Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val 290 295 300 Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr His His Asn 305 310 315 320 Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln 325 330 335 Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp 340 345 350 Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn 355 360 365 Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys 370 375 380 Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu 385 390 395 400 Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Glu Ile 405 410 415 Tyr Pro Asn Val Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 420 425 430 Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp 435 440 445 Gly Arg Gly Cys Ala Leu Gly Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val 450 455 460 Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Leu 465 470 475 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated t-PA sequence from desmodus rotundus <400> 2 Met Val Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Val Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Gly Ala Val Phe Ser Leu Pro Arg Gln Glu Thr Tyr Arg Gln Leu Ala 20 25 30 Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly Val Ala Cys Lys Asp Glu Ile Thr Gln 35 40 45 Met Thr Tyr Arg Arg Gln Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser 50 55 60 Lys Arg Val Glu His Cys Gln Cys Asp Arg Gly Gln Ala Arg Cys His 65 70 75 80 Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly 85 90 95 Thr Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro 100 105 110 Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys 115 120 125 Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu 130 135 140 Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys 145 150 155 160 Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn 165 170 175 His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr 180 185 190 Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala 195 200 205 Cys Ser Ser Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Ser Gln Pro Gln Phe His 210 215 220 Ser Thr Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 225 230 235 240 Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys 245 250 255 Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys 260 265 270 Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg 275 280 285 Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu 290 295 300 Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp 305 310 315 320 Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu 325 330 335 Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu 340 345 350 Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala 355 360 365 Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu 370 375 380 Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val 385 390 395 400 Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln 405 410 415 Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 420 425 430 Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly 435 440 445 Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr 450 455 460 Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 465 470 475

Claims (43)

1. 뇌졸중 치료용의 정맥내 적용가능한 약제의 제조를 위한, 피브린의 존재하에서 활성이 650배 이상 증진되는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
2. 제1항에 있어서, 데스모두스 로툰두스(Desmodus rotundus)의 플라스미노겐 활성 인자 (DSPA) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 사용됨을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
3. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 아스파르테이트 잔기와 함께 시모겐 트리아드(cymogene triade)의 일부 또는 전부를 형성하도록 적어도 히스티딘 또는 세린 잔기를 포함함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
4. 제3항에 있어서, 세린 잔기가 t-PA의 위치 292와 적어도 부분적으로 상동인 위치에 위치하고, 히스티딘 잔기가 t-PA의 위치 305와 적어도 부분적으로 상동인 위치에 위치하며 아스파르테이트 잔기가 t-PA의 위치 447과 적어도 부분적으로 상동인 위치에 위치함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
5. 제4항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 t-PA/R275E; t-PA/R275E, F305H; t-PA/R275E, F305H, A292S의 t-PA 돌연변이체 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
6. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 Asp194 또는 상동인 위치에서 아스파르테이트의 점 돌연변이를 지녀서 피브린의 부재하에서 플라스미노겐 활성 인자의 촉매적으로 활성인 구조의 안정성이 감소됨을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
7. 제6항에 있어서, Asp194가 글루타메이트 또는 아스파라긴으로 치환됨을 특징으로 하는 용도.
8. 제7항에 있어서, ASP194의 Glu194 또는 Asn194로의 치환을 포함함을 특징으로 하는 용도.
9. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 피브린의 부재하에 플라스미노겐과 플라스미노겐 활성 인자간의 작용적 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 이의 자가분해 루프내에 포함함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
10. 제8항에 있어서, 자가분해 루프내의 하나 이상의 돌연변이가 야생형 t-PA의 아미노산 위치 420 내지 423 또는 상동인 위치에 영향을 미침을 특징으로 하는 용 도.
11. 제9항에 있어서, 돌연변이가 돌연변이체 L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A 및 F423E로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 용도.
12. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 플라스민에 의한 촉매작용을 억제하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 시모겐임을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
13. 제11항에 있어서, 점 돌연변이가 t-PA의 위치 15 또는 위치 275, 또는 이와 상동인 위치에 위치함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
14. 제12항에 있어서, 글루타메이트가 위치 15 또는 위치 275에 존재함을 특징으로 하는 용도.
15. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 His420, Asn421, Ala422 및 Cys423을 포함하는 자가분해 루프를 포함함을 특징으로 하는 용도.
16. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 피브린의 부재하에 플라스미노겐 활성 인자의 촉매적으로 활성인 구조의 안정성을 감소시키는 위치 194에서의 점 돌연변이를 특징으로 하는 용도.
17. 제15항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 Phe194임을 특징으로 하는 용도.
18. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 플라스민에 의한 촉매작용을 억제하는 하나 이상의 점 돌연변이를 특징으로 하는 용도.
19. 제17항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 Glu275를 포함함을 특징으로 하는 용도.
20. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 용도.
21. 제20항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 Val420, Thr421, Asp422 및 Ser423을 포함하는 자가분해 루프를 지닌 유로키나제임을 특징으로 하는 용도.
22. 제20항에 있어서, 유로키나제가 피브린의 부재하에 유로키나제의 촉매적으로 활성인 구조의 안정성을 감소시키는 위치 194에서의 점 돌연변이를 특징으로 하는 용도.
23. 제21항에 있어서, 유로키나제가 Glu194를 포함함을 특징으로 하는 용도.
24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 유로키나제가 플라스민에 의한 촉매작용을 억제하는 하나 이상의 점 돌연변이를 특징으로 하는 용도.
25. 제1항에 있어서, 플라스미노겐 활성 인자가 서열 번호 2에 따른 서열을 포함함을 특징으로 하는 용도.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 점적 주입(drip infusion)을 특징으로 하는 용도.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 볼루스 주사(bolus injection)를 특징으로 하는 용도.
28. 제26항에 있어서, 단일의 볼루스 주사를 특징으로 하는 용도.
29. 뇌졸중 치료용 약제를 제조하기 위한, ILE275를 포함하며 정맥내 주사되는 유로키나제의 용도.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 사람에서 뇌졸중이 발생한 지 적어도 3시간 후에 뇌졸중을 치료학적으로 처리함을 특징으로 하는 용도.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 사람에서 뇌졸중이 발생한 지 적어도 6시간 후에 뇌졸중을 치료학적으로 처리함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 사람에서 뇌졸중이 발생한 지 적어도 9시간 후에 뇌졸중을 치료학적으로 처리함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌졸중의 발생이 일시적으로 정확하게 측정되지 않는 뇌졸중 환자를 치료학적으로 처리함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 t-PA의 신경독성을 피하면서 뇌졸중을 치료함을 특징으로 하는 플라스미노겐 활성 인자의 용도.
35. 제1항 내지 제34항 중 하나 이상의 항에 따른 플라스미노겐 활성 인자 및 하 나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 성분 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 약제 조성물.
36. 제34항에 있어서, 신경보호제를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
37. 제35항에 있어서, 글루타메이트 수용체 길항제를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
38. 제36항에 있어서, 경쟁적 또는 비경쟁적 길항제를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
39. 제34항에 있어서, 트롬보모둘린, 트롬보모둘린 유사체, 트리아빈, 팔리디핀 또는 솔룰린의 그룹 중에서 우선적으로 선택된 하나 이상의 트롬빈 억제제를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
40. 제34항에 있어서, 히루딘, 헤파린, 아세틸살리실산 또는 안크로드의 그룹 중에서 우선적으로 선택된 하나 이상의 항응고제를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
41. 제34항에 있어서, 소염 물질을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
42. 제34항에 있어서, 항생제를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
43. 제34항에 있어서, 시티콜린을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.

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