FI104378B - Menetelmä trombiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä trombiinin valmistamiseksi 104378

Keksintö liittyy ihmis- tai eläinperäiseen trombiiniin.

5 Etenkin keksintö koskee menetelmää sen valmistamiseksi.

Seuraavassa selityksessä on myös selostettu sen käyttöä.

*

Veren hyytyminen läpikäy useita peräkkäisiä reaktioita, joissa veren hyytymistekijät aktivoidaan ja lopuksi muodostuu 10 fibriiniä aktivoidun protrombiinin (trombiinin) vaikuttaessa fibrinogeeniin. Protrombiinin muunto trombiiniksi tapahtuu hyvin hitaasti yksinään tekijällä Xa ja kalsiumilla. Se tapahtuu vasta silloin optimaalisesti, kun puolestaan esiintyy useiden tekijöiden kompleksi (protrombinaasikompleksi).

15 Tekijän Xa lisäksi tähän kompleksiin kuuluvat tekijä V, fosfolipidit ja kalsium. Tekijä Xa lohkaisee protrombiini-molekyylin (molekyylipaino 68 kD) proteolyyttisesti ja tuottaa siten aktiivisen trombiinientsyymin (molekyylipaino 30 kD) .

20

Plasmaproteaasi trombiini on monitoiminnallinen entsyymi, joka ei vaikuta ainoastaan koaguloivasti lohkaisemalla fib-rinogeenin fibriiniksi, vaan aktivoi myös hyytymistekijät V, VIII ja XIII ja lohkaisee oman proentsyyminsä (protrombii- 25 nin) .

• · «

Terapiassa trombiinia käytetään yksinään tai yhdessä fib- **“. rinogeenin kanssa verenvuotojen pysäyttämiseksi tai kirurgi* giassa kudos liimaukseen.

• · · *·’ 3o

Protrombiinin aktivointi protrombinaasikompleksin kautta on • · ·.*·: vaikeasti jäljiteltävissä ex situ, minkä johdosta on tehty !,! Σ useita kokeita trombiinin tuottamiseksi ihmis- tai eläinpe- räisten proteaasien vaikutuksella. Tällöin on ajateltava, I · 35 että on vältettävä tuotteen jokaista kosketusta ihmis- tai * « . eläinperäisen materiaalin kanssa infektioosisten aineiden aiheuttaman saastumisvaaran johdosta.

• t I

» · < I ·

Kokeet plasmasta eristetyn protrombiinikompleksin käsittele- 104378 2 luiseksi kalsiumioneilla sekä kalsiumioneilla ja naudan trom-boplastiinia sisältävällä suspensiolla ovat osoittaneet, että käsittely yksinomaan kalsiumioneilla johtaa muodostuneen trombiinin olennaisesti vähäisempään saantoon ja puhtauteen 5 kuin käsittely kalsiumioneilla ja tromboplastiinilla [Cryo biology 21 (1984) 661 - 663].

Julkaisusta DE-A - 38 43 126 on tunnettua, että trombiinia voidaan saada plasmasta, joka on adsorboitu matriisiin ja 10 käsitelty protrombiiniaktivaattorilla. Aktivaattorina maini taan esimerkiksi kalsiumionit, kalsiumionit ja tromboplastii-ni tai tekijä Xa. Aktivoinnin aikana ovat läsnä kaikki biologiset kofaktorit, jotka sidotaan samoin matriisiin.

15 Käytettäessä plasmaattista protrombiinia trombiinin talteen- ottamiseksi on vaarana, että se saastuu infektioosisilla aineilla (esim. hepatiittivirukset, HIV). Tämän lisäksi kaikissa mainituissa aktivointimenetelmissä suositellaan kalsium2+-ionien lisäksi biologisten kofaktoreiden käyttämis-20 tä lisänä, mikä muodostaa lisäsaastumislähteen.

Nyt on tosin tunnettua, että biologisten valmisteiden infek- tioosiset aineet voidaan inaktivoida luotettavasti lämpökä-

sittelyllä, etenkin yhdessä höyrykäsittelyn kanssa (AT-B

:':25 385.657). On kuitenkin osoittautunut, että trombiinia on ··· kuumennettava sen lämpölabiiliuden johdosta stabilisaattorei- « · · · .*.j den läsnäollessa (DE-A - 38 09 991) , jotta trombiinin aktii- • visuuteen ei vaikuteta haitallisesti. Stabilisaattoreiden • · · käyttö on kuitenkin kiistanalaista, koska lämpökäsittelyn . 30 aikana ei suojata ainoastaan trombiiniaktiivisuutta, vaan

I I I

myös virukset stabiloidaan.

• · · • # · ·:·· Keksinnön tehtävänä on saada aikaan virusturvallinen trom- ·:··· biini.

*.35 • * * *;;; Keksinnön mukaan virusturvallinen trombiini voidaan saada • · *·* virusinaktivoidusta protrombiinipitoisesta plasmafraktiosta 3 104378 3 aktivoimalla yksinomaan hyytymisaktiivisilla suoloilla, esimerkiksi kalsium-, strontium- tai sinkki-ioneilla. Tällaiset suolat edistävät trombiinin muodostumista vastaavista hyytymistekij öistä.

5

Keksintö perustuu siihen havaintoon, että infektioosiset aineet, jotka esiintyvät plasmaattisessa protrombiinissa, voidaan tehdä vaarattomiksi käsittelemällä protrombiini virusten inaktivoimiseksi vaikuttamatta olennaisesti haital-10 lisesti protrombiinista saatavan trombiinin biologiseen aktiivisuuteen.

On yllättävästi osoittautunut, että virusinaktivoidun pro-trombiinipitoisen fraktion aktivointi yksinään lisäämällä 15 hyytymisaktiivisia suoloja johtaa yksinkertaisella tavalla tuotteen suureen saantoon tai vast, puhtauteen lisäämättä siihen biologisia kofaktoreita, kuten hyytymistekijöitä V, Xa tai fosfolipidejä. Vältetään siis saastuminen aktivoinnin aikana, minkä johdosta myös tuotettu trombiini on lähtömate-20 riaalin tavoin virusturvallinen.

On osoittautunut edulliseksi tuottaa virusturvallinen trom-biini virusinaktivoidusta protrombiinikompleksista, etenkin : virusinaktivoidusta aktivoidusta protrombiinikompleksista.

::25 Aktivoidun protrombiinikompleksin aktivointi lisäämällä hyy- ··· tymisaktiivisia suoloja tapahtuu yllättävän suurella reak- IM» ;\j tionopeudella. Samoin optimoidaan trombiinin saanto.

• M • · · • · ·

Etenkin edullista on virusturvallisen trombiinin valmistus . 30 FEIBAsta. Aktivoitu protrombiinikompleksi tai vastaavasti • « · *,,* FEIBA voidaan valmistaa jo tunnettujen menetelmien avulla : (AT-B -350.726, AT-B - 368.883, EP-B - 0 041 173) protrom- ·:··; biinikompleksista.

I

'.35 Keksintö koskee myös menetelmä virusturvallisen trombiinin ·;;; valmistamiseksi ja se on tunnettu toimenpiteiden siitä yhdis-

• I

’··' telmästä, että 104378 4 - aktivoitu protrombiinikompleksi valmistetaan protrom-biinipitoisesta plasmatraktiosta, - aktivoitu protrombiinikompleksi käsitellään infekti-oosisten aineiden inaktivoimiseksi, ja 5 - käsiteltyyn aktivoituun protrombiinikompleksiin lisätään hyytymisaktiivisia suoloja trombiinin tuottamiseksi.

Trombiini puhdistetaan edullisesti edelleen ioninvaihdinkro-matografiällä ja/tai affiniteettikromatografiällä.

10

Yllä olevan selityksen mukainen virusturvallinen trombiini soveltuu etenkin farmaseuttisten valmisteiden käyttämiseksi tai diagnostisten aineiden valmistamiseksi.

15 Keksintöä selitetään vielä lähemmin seuraavien esimerkkien avulla, jolloin esimerkit 3 ja 4 koskevat esimerkin 1 mukaisesti valmistetun trombiinin edelleenpuhdistusta.

Esimerkki l 20 15 lista ihmisen kryosakkaköyhää veriplasmaa sidottiin pro-trombiini (tekijä II) hyytymistekijöiden VII, IX ja X lisäksi

J · I

: anioninvaihtimeen (DEAE-Sephadex) . Tekijää II sisältävä : fraktio eluoitiin 0,5-molaarisella NaCl-liuoksella, sitten :*:’25 tässä liuoksessa suolakonsentraatiota vähennettiin 0,15 •j. mooliin/1 diasuodattamalla ja tämän jälkeen jäädytyskuivatet- ···· tiin.

• · · • · • · · • « · • « «

Mahdollisten läsnäolevien taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi . ?0 tätä fraktiota kuumennettiin julkaisun AT-B - 385.657 mukai- • · · sesti 10 tunnin ajan 60 °C:ssa ja 1 tunnin ajan 80 °C:ssa.

* · * V ' Protrombiiniaktiivisuus oli 5.250 E (yksikköä). Protrombiini « ·;·: liuotettiin liuokseen suhteessa 2,5 E/ml ja sekoitettiin hitaasti CaCl2:n (2,5 mmoolia/1) kanssa +30 °C:ssa pH-arvossa \35 7; 80 minuutin kuluttua trombiiniaktiivisuudeksi määritettiin 4 · ·

··; (kromogeenisen substraatin Th-1 (Fa. Immuno) avulla) 48 E/l E

i tekijää II.

104378 5

Trombiinituotanto pysäytettiin jäähdyttämällä +4 °C:seen ja lisäämällä etyleenidiaminotetraetikkahappoa (EDTA). Ca-komp-leksi poistettiin ultrasuodatus/diasuodatuksen avulla ultra-suodatuskalvolla (huokoskoko: 10.000). Tämän jälkeen konsent-5 raatti valmistettiin farmaseuttiseksi valmisteeksi.

Esimerkki 2 20 ml FEIBA-pitoista liuosta (IMMUNO AG, Wien), jonka FEIB-10 aktiivisuus oli 966 yksikköä ja 992 yksikköä tekijää II, laimennettiin 0,9 %:sella NaCl-liuoksella 330 ml:aan ja sekoitettiin hitaasti CaCl2:n (2,75 mmoolia/1) kanssa +30 °C:ssa. 90 minuutin kuluttua trombiiniaktiivisuus saavutti maksimin, joka oli 51 yksikköä/yksikkö tekijää II. Aktivointi 15 pysäytettiin jäähdyttämällä liuos +4 °C:seen ja lisäämällä natriumsitraattia.

Esimerkki 3 20 20.000 yksikköä (E) esimerkin 1 mukaisesti'valmistettua trombiinia adsorboitiin pylvääseen, jossa oli 20 ml tuotetta S-Sepharose, 10,5 mS/cm:n johtavuudessa pH-arvossa 6,0. Tämän jälkeen pestiin 140 ml:11a 150-mmolaarista NaCl-liuosta sitoutumattomien proteiinien poistamiseksi.

f < :t: 25 ·;· Trombiinipitoinen fraktio eluoitiin 100 ml: 11a 750-mmolaaris- * · · ta NaCl-liuosta, konsentroitiin, diasuodatettiin ja valmis- • t tettiin lopuksi farmaseuttiseksi valmisteeksi.

• · « . 30 Trombiiniaktiivisuuden saanto oli yli 90 %.

• · · • · · • · *·* * Esimerkki 4 • « < < · ·:·· 10.000 yksikköä (E) esimerkin 1 mukaisesti valmistettua *,35 trombiinia levitettiin pylvääseen, jossa oli 10 ml lysiini- ·;;; Sepharose-yhdistelmää, joka oli tasapainotettu 150 mmoolin • · *·*·' natriumasetaattiliuoksella, pH 6,7. Kuormitettu pylväs pes- 6 104378 tiin samalla puskurilla ja trombiinipitoinen fraktio eluoi-tiin 300-mmolaarisella lysiiniliuoksella; trombiiniaktiivi-suus oli 9400 E ja spesifinen aktiivisuus oli 1850 E/mg proteiinia.

1 » · I

·** 9 4 · · · 9 · • · · • · * • · · • · ·

I I I

f 9 9 « « · • · II· '

I · I

• · I

* :··«»» .

• f I · II·

Claims (2)

1. Menetelmä virusturvallisen trombiinin valmistamiseksi, tunnettu toimenpiteiden siitä yhdistelmästä, että 5. aktivoitu protrombiinikompleksi valmistetaan protrombii- nipitoisesta plasmafraktiosta, - aktivoitu protrombiinikompleksi käsitellään infekti-oosisten aineiden inaktivoimiseksi, ja - käsiteltyyn aktivoituun protrombiinikompleksiin lisätään 10 hyytymisaktiivisia suoloja trombiinin tuottamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiini puhdistetaan edelleen ioninvaihdinkro-matografiällä ja/tai affiniteettikromatografiällä. » I I « I I I ' 1 I • I i I % · ’ I | ··♦ 9 *949 * I I · · • 49 9 9 •99 9 4 9 4 4 · 9 9 • •9 4 · · • · • 444 9 9 4 *99 • t « · · *14 9 9 9 · 8 104378