NO312125B1 - Virussikkert trombin, farmasöytisk preparat inneholdende dette samt anvendelse ved fremstilling av et farmasöytisk preparateller et diagnostisk preparat - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører virussikkert trombin av human eller animalsk opprinnelse, som kan oppnås ved en fremgangsmåte som omfatter de trekk som er angitt i krav 1. Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte ved fremstilling av et slikt trombin som angitt i krav 6 samt anvendelse av et slikt trombin ved fremstilling av et farmasøytisk preparat til behandling av koaguleringsrelaterte sykdommer eller for å danne et diagnostisk preparat relatert til slike sykdommer.

Blodkoagulering gjennomgår en serie etterfølgende reaksjon-er hvor blodkoaguleringsfaktorene aktiveres og til slutt danner fibrin på grunn av virkningen av aktivert protrombin (trombin) på fibrinogen. Omvandlingen av protrombin til trombin skjer meget langsomt med faktor Xa og kalsium alene. Den skjer først optimalt når det igjen foreligger et kompleks av flere faktorer (protrombinase-kompleks). Ved siden av faktor Xa tilhører til dette komplekset faktor V, fosfolipider og kalsium. Faktoren Xa spalter protrom-binmolekylet (molekylvekt 68 kD) proteolytisk og genererer således det aktive enzym trombin (molekylvekt 3 0 kD) .

Plasmaproteasen trombin er et multifunksjonelt enzym som virker koagulerende ikke bare ved spalting av fibrinogenet til fibrin, men aktiverer også koaguleringsfaktorene V, VIII og XIII og spalter sitt eget proenzym (protrombin).

I terapien anvendes trombin alene eller sammen med fibrinogen for å stoppe blødninger eller ved vevsammenklebing innen kirurgien.

Aktiveringen av protrombin via protrombinasekomplekset er ex situ meget vanskelig å etterligne, og det er således in-gen mangel på forsøk på å generere trombin ved innvirkning av proteaser av human eller animalsk opprinnelse. Her må man ta i betraktning at hver kontakt av produktet med humant eller animalsk materiale må unngås på grunn av kon-taminasjonsfaren med infeksiøse agenser.

Forsøk ved behandling av et protrombinkompleks, isolert fra plasma, med kalsiumioner samt med kalsiumioner og en sus-pensjon som inneholder bovint trombinplastin har vist at behandlingen med kalsiumioner alene fører til vesentlig mindre utbytte og renhet av det dannede trombin enn behandlingen med kalsiumioner og tromboplastin (Cryobiology 21, 661-663 (1984)) .

Fra DE-A-38 43 126 er det kjent at det kan dannes trombin fra plasma som er adsorbert på en matriks og behandlet med en protrombinaktivator. Som aktivator kan det nevnes for eksempel kalsiumioner, kalsiumioner og tromboplastin eller faktor Xa. Under aktiveringen er samtlige biologiske kofaktorer som på samme måten er bundet til matriksen til-stede .

Ved anvendelse av plasmatisk protrombin ved dannelse av trombin foreligger faren for en kontaminasjon med infek-siøse agenser (f.eks. hepatitt-virus; HIV). I tillegg kom-mer at det ved alle kjente aktiveringsfremgangsmåter anbe-fales å anvende biologiske kofaktorer ved siden av kalsium<2+->ioner, hvorved det gis en ytterligere kontamina-sjonskilde.

Nå er det riktignok kjent at infeksiøse agenser i biologiske preparater trygt kan inaktiveres ved hjelp av varmebehandling, spesielt i kombinasjon med en dampbehandling (AT-B-385.657) . Imidlertid har det vist seg at trombin på grunn av sin varmelabilitet må oppvarmes i nærvær av stabilisatorer (DE-A-38 09 991) for ikke å påvirke trombinets aktivitet. Anvendelsen av stabilisatorer er imidlertid om-stridt fordi det under varmebehandlingen ikke bare beskyt-ter trombinaktivitetenm men også virus stabiliseres.

Oppfinnelsen har som oppgave å tilveiebringe et virussikkert trombin.

Det virussikre trombin ifølge oppfinnelsen kan oppnås fra en virusinaktivert protrombinholdig plasmafraksjon ved ute-lukkende aktivering med koaguleringsaktive salter, f.eks. med kalsium-, strontium- eller sinkioner. Slike salter fremmer dannelsen av trombin fra de tilsvarende koaguler-ingsfaktorer.Oppfinnelsen beror på den erkjennelse at inr feksiøse agenser som foreligger i plasmatisk protrombin kan gjøres uskadelige ved behandling av protrombinet. for virus-aktivering uten vesentlig å påvirke den biologiske aktivitet av trombinet som oppnås fra protrombinet.

Det har overraskende vist seg at aktiveringen av en virusinaktivert protrombinholdig fraksjon alene ved tilsetning av koaguleringsaktive salter på en enkel måte kan føre til et høyt utbytte, henholdsvis renhet av produktet uten ytterligere tilsetning av biologiske kofaktorer så som koaguleringsfaktorene V, Xa eller fosfolipider. En kontaminasjon under aktiveringen vil således unngås, hvorved også det genererte trombin likt utgangsmaterialet anses som virussikkert.

Det har vist seg som fordelaktig å generere det virussikre trombin fra virusinaktivert protrombinkompleks, spesielt virusinaktivert aktivert protrombinkompleks. Aktiveringen av aktivert protrombinkompleks ved tilsetning av koaguleringsaktive salter skjer med overraskende høy reaksjonshas-tighet. Trombinutbyttet optimeres derfor på samme måte.

Spesielt fordelaktig er fremstillingen av virussikkert trombin fra FEIBA. Et aktivert protrombinkompleks, henholdsvis FEIBA kan fremstilles ved allerede kjente forholdsregler (AT-B-350.726, AT-B-368.883, EP-B-0 041 173) fra et protrombinkompleks.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte ved fremstilling av et virussikkert trombin, hvor fremgangsmåten omfatter en kombinasjon av de forholdsregler at det fremstilles et aktivert protrombinkompleks fra en

protrombinholdig plasmafraksjon,

det aktiverte protrombinkompleks behandles for inaktivering av infeksiøse agenser, og hvor fremgangsmåten ytterligere er særpreget ved at

det tilsettes koaguleringsaktive salter til det be handlede aktiverte protrombinkompleks for å generere trombin.

Trombin kan regnes fordelaktig ytterligere ved ionebytterkromatografi og/eller affinitetskromatografi.

Et virussikkert trombin som beskrevet ovenfor egner seg spesielt under farmasøytiske preparasjoner og ved fremstilling av diagnostika.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av de etter-følgende eksempler hvorved eksemplene 3 og 4 vedrører den ytterligere rensing av trombinet fremstilt ifølge eksempel 1.

Eksempel 1

Fra 15 1 humant kryopresipitat-fattig blodplasma ble protrombin (faktor II) ved siden av koaguleringsfaktorene VII, IX og X bundet på en anionebytter (DEAE-Sephadex) . Etter eluering av den faktor II-inneholdende fraksjon ved hjelp av 0,5 molar NaCl-oppløsning, ble saltkonsentrasjonen ved denne oppløsning redusert ved diafiltrering til 0,15 mol/l og deretter frysetørket.

For å inaktivere eventuelle foreliggende sykdomskilder ble denne fraksjonen ifølge AT-B-385.657 oppvarmet i 10 timer ved 60°C og i 1 time ved 80°C. Protrombinaktiviteten ut-gjorde 5.250 E. Protrombinet ble oppløst i en oppløsning til 2,5 E/ml og rørt langsomt med 2,5 mmol/1 CaCl2 ved 30°C ved en pH-verdi på 7,0; etter 80 min. ble trombinaktiviteten bestemt (ved hjelp av kromogent substrat Th-1 (fa. Immuno)) med 48 E pr. 1 E faktor II.

Ved nedkjøling til 4°C og tilsetning av etylendiaminotetra-eddiksyre (EDTA) ble trombingenereringen stoppet. Ved hjelp av ultrafiltrering/diafiltrering med en ultrafiltrer-ingsmembran (porestørrelse: 10.000) ble Ca-komplekset fjer-net. Deretter ble konsentratet ferdigstilt til en farma-søytisk preparasjon.

Eksempel 2

20 ml av en FEIBA-holdig oppløsning (IMMUNO AG, Wien) med en FEIBA-aktivitet på 966 enheter og 992 enheter faktor II, ble fortynnet med en 0,9% NaCl-oppløsning til 330 ml og rørt langsomt med 2,75 mmol/1 CaCl2 ved 30°C. Etter 90 min. oppnådde trombinaktiviteten et maksimum på 51 enheter pr. enhet faktor II. Aktiveringen ble stoppet ved avkjøl-ing av oppløsningen til 4°C og tilsetning av natriumcitrat.

Eksempel 3

20.000 E trombin, fremstilt ifølge eksempel 1, ble adsorbert på en søyle av 20 ml S-sepharose ved en ledeevne på 10,5 mS/cm ved en pH-verdi på 6,0. Deretter ble det vasket med 14 0 ml av en 150-mmolar NaCl-oppløsning for å fjerne de ikke-bundne proteiner.

Den trombinholdige fraksjon ble eluert med 100 ml av en 750-mmolar NaCl-oppløsning, oppkonsentrert, diafiltrert og til slutt ferdigstilt for en farmasøytisk preparasjon.

Utbytte på trombinaktivitet var mer enn 90%.

Eksempel 4

10.000 E trombin, fremstilt ifølge eksempel 1, ble lagt på en søyle på 10 ml lysin-sepharose, ekvilibrert med en 150 mmol natriumacetatoppløsning, pH 6,7. Den anrikede søyle ble vasket med den samme buffer, og den trombinholdige fraksjon ble eluert med en 3 00 mmolar lysin-oppløsning;

Claims (9)

1. Virussikkert trombin av human eller animalsk opprinnelse som kan oppnås ved en fremgangsmåte som omfatter, ved å gå ut fra en virusinaktivert protrombinholdig plasmafraksjon som utgangsmateriale, tilsats av farmasøytisk aksep-table kalsiumioner til et slikt utgangsmateriale uten nærvær av fosfolipider og uten festing av utgangsmaterialet til en fast fase.

2. Trombin ifølge krav 1, karakterisert ved at det oppnås fra en plasmaf raks jon som inneholder et protrombinkompleks.

3. Trombin ifølge krav l, karakterisert ved at det oppnås fra en plasmafraksjon som inneholder et aktivert protrombinkompleks .

4. Trombin ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det oppnås fra en plasmafraksjon som inneholder FEIBA.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder et trombin ifølge ethvert av kravene 1 til 4.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av et virussikkert trombin ifølge ethvert av kravene 1 til 4, hvor det fremstilles et aktivert protrombinkompleks fra en protrombinholdig plasmafraksjon, - det aktiverte protrombinkompleks behandles for inaktivering av infektiøse agenser, karakterisert ved at fremgangsmåten ytterligere omfatter trinnet - å tilsette koaguleringsaktive salter til det behandlede aktiverte protrombinkompleks for å generere trombin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at trombinet renses ytterligere ved ionebytterkromatografi og/eller affinitetskromatografi .

8. Anvendelse av trombin ifølge ethvert av kravene 1 til 4 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat til behandling av koaguleringsrelaterte sykdommer eller for å danne et diagnostisk preparat relatert til slike sykdommer.

9. Anvendelse av trombin ifølge ethvert av kravene 1 til 4 ved fremstilling av et diagnostisk preparat.