CZ281502B6 - Thrombin a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Thrombin lidského nebo zvířecího původu, který je zbaven infekčních látek a může se připravit aktivací prothrombinu, který se podrobil tepelnému zpracování k inaktivaci infekčních látek.ŕ

Description

Způsob výroby thrombinu zabezpečeného proti virům

Oblast techniky

Vynález se týká «způsobu výroby thrombinu lidského nebo zvířecího původu, zabezpečeného proti virům.

Dosavadní stav techniky

Při srážení krve probíhá řada po sobé následujících reakcí, při kterých jsou aktivovány faktory srážení krve a nakonec se účinkem aktivovaného prothrombinu (thrombinu) na fibrinogen vytvoří fibrin. Reakce prothrombinu na thrombin probíhá sama s faktorem Xa a vápníkem velmi pomalu. Tato reakce probíhá optimálně teprve potom, kdy je k dispozici opět komplex několika faktorů (prothrombinázový komplex). K tomuto komplexu kromě faktoru Xa náleží faktor V, fosfolipidy a vápník. Faktor Xa štěpí molekulu prothrombinu (molekulová hmotnost 68 kD) proteolyticky, a tím vytváří aktivní enzym thrombin (molekulová hmotnost 30 kD).

Plasmová proteáza thrombin je vícefunkční enzym, který není koagulován pouze štěpením fibrinogenu na fibrin, ale také aktivován srážecími faktory V, VIII a XIII a štěpen svým vlastním proenzymem (prothrombinem).

V terapii je thrombin sám nebo společně s fibrinogeny používán k zastavení krvácení nebo v chirurgii k spojování tkání lepicí technikou.

Aktivace prothrombinu přes prothrombinázový komplex je ex šitu obtížné napodobitelná, a proto nechyběly pokusy připravit thrombin působením proteázy lidského nebo zvířecího původu. Přitom je známo, že se má vyhnout každému kontaktu produktu s materiálem lidského nebo zvířecího původu, aby se zmenšilo nebezpečí kontaminace látkou způsobující infekci.

Pokusy zpracovat prothrombinové komplexy izolované z plasmy s vápenatými ionty, stejně jako s vápenatými ionty a suspenzí obsahující hovězí thromboplastin ukazují, že zpracování se samotnými vápenatými ionty vede k podstatnému snížení výtěžku a čistoty vzniklého thrombinu, jako při zpracování s vápenatými ionty a thromboplastinem (Cryobiology, 21, 661 až 663 /1984).

Z DE-A 38 43 126 je známo, že z plasmy, která je adsorbována na základní hmotě a zpracována s prothrombinovým aktivátorem, se může dostat thrombin. Jako aktivátor se mohou například uvést vápenaté ionty, a thromboplastin nebo faktor Xa. Během aktivace jsou přítomny všechny biologické kofaktory, které jsou také vázány na základní hmotu.

Při použití plasmatického prothrombinu k získání thrombinu vzniká nebezpečí kontaminace infekčními látkami (například viry hepatitidy nebo HIV). Kromě toho dochází ještě k tomu, že při obecné známém způsobu aktivace je vedle iontu dvojmocného vápníku doporučeno dodatečné použití biologických kofaktorů, čímž jsou dány další zdroje kontaminace.

-1CZ 281502 B6

Nyní je sice známo, že infekční látky v biologických preparátech se mohou spolehlivě inaktivovat působením tepla, zvláště pak v kombinaci s ošetřením parou (AT-B 385 657). Přitom se však ukázalo, že se thrombin na základě své tepelné nestálosti musí zahřívat v přítomnosti stabilizátorů (DE-A 38 09 991), aby se aktivita thrombinu nepoškodila. Použití stabilizátorů je však sporné, protože se během působení tepla ochrání nejen aktivita thrombinu, ale také se stabilizují viry.

Úkol vynálezu je poskytnout thrombin, který je bezpečný proti virům.

Podstata vynálezu

Thrombin bezpečný proti virům se dá získat z virově inaktivované plasmové frakce obsahující prothrombin, výhradní aktivací solemi aktivními při srážení, například vápenatými, strontnatými nebo zinečnatými ionty. Takovéto soli podporují tvorbu thrombinu z odpovídajících srážecích faktorů.

Vynález spočívá na poznatku, že infikující látky, které jsou přítomny v plasmatickém prothrombinu, se mohou stát neškodné zpracováním prothrombinu k inaktivaci virů, aniž by se biologická aktivita thrombinu získaného z prothrombinu podstatně ovlivnila.

S překvapením bylo zjištěno, že aktivace samotné virově inaktivované frakce, obsahující prothrombin, přídavkem solí aktivních při srážení, vede jednoduchým způsobem k vyššímu výtěžku nebo čistotě produktu, bez dalšího přídavku biologického kofaktoru, jako jsou srážecí faktory V, Xa nebo fosfolipidy. Kontaminace během aktivace se tedy zmenší, protože je také připravovaný thrombin, stejné jako výchozí materiál, zabezpečen proti virům.

Jako výhodné se ukázalo připravovat thrombin zabezpečený proti virům z virové inaktivovaného prothrombinového komplexu, obzvláště z virově inaktivovaného aktivovaného prothrombinového komplexu. Aktivace aktivovaného prothrombinového komplexu probíhá přídavkem solí aktivních při srážení překvapivě vyšší reakční rychlostí. Výtěžek thrombinu se také optimalizuje.

Zvláště výhodná je výroba thrombinu zabezpečeného proti virům z Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity, označovaného v následujícím obecně používanou zkratkou FEIBA. Aktivovaný prothrombinový komplex nebo FEIBA se mohou připravit pomocí již známých opatření (AT-B 350 726, AT-B 368 883 a EP-B 0 041 173) z prothrombinového komplexu.

Předmětem předloženého vynálezu je tedy způsob výroby thrombinu zabezpečeného proti virům, který spočívá v tom, že se kombinují opatření, totiž že

- se připraví aktivovaný prothrombinový komplex z plasmové frakce obsahující prothrombin,

- aktivovaný prothrombinový komplex se zpracuje k inaktivaci infekčních látek a

- ke zpracovanému aktivovanému prothrombinovému komplexu se přidají soli aktivující srážení, aby se připravil thrombin.

-2CZ 281502 B6

Thrombin se s výhodou dále čistí iontoméničovou chromatografií a/nebo afinitní chromatografií.

Průmyslové využiti

Thrombin zabezpečený proti virům podle shora uvedeného popisu se hodí zvláště pro použití ve farmaceutických přípravcích a k výrobě diagnostik.

Příklady provedení vynálezu

Dále uvedené příklady ještě blíže objasňují vynález, přičemž příklady 3 a 4 se týkají dalšího čištění thrombinu připraveného podle příkladu 1.

Příklad 1 litrů lidské krevní plasmy, ochuzené o sraženinu odstraněnou kryoskopickým technickým postupem, se uvede do styku s prothrombinem (faktor II) a kromě toho srážecími faktory VII, IX a X na iontoměničové pryskyřici (DEAE-Sephadex). Po eluování frakci obsahujících faktor II pomoci 0,5-molárního roztoku chloridu sodného se sníží, v tomto roztoku koncentrace chloridu sodného na 0,15 mol/1 diafiltrací a nakonec se provede lyofilizace.

Aby se popřípadě obsažený původce nemoci inaktivoval, tato frakce se zahřívá podle návodu daného v AT-B 38-5 657 po dobu 10 hodin na teplotu 60 °C a po dobu jedné hodiny na teplotu 80 ’C.· Aktivita prothrombinu činí 5 250 jednotek. Prothrombin se rozpustí na roztok obsahující 2,5 jednotek na mililitr a pomalu míchá s 2,5 mmol/1 chloridu vápenatého za teploty +30 °C při hodnotě pH 7,0. Po 80 minutách se stanoví aktivita thrombinu (pomoci chromogenního substrátu Th-1 firmy IMMUNO AG, Vídeň/) 48 jednotek na 1 jednotku faktoru II.

Ochlazením na teplotu +4 ’C a přídavkem kyseliny ethylendiaminotetraoctové (EDTA) se zastaví tvorba thrombinu. Pomocí ultrafiltrace a/nebo diafiltrace za použití ultrafiltrační membrány (velikost pórů 10 000) se odstraní vápenatý komplex. Nakonec se koncentrát upraví na farmaceutický přípravek.

Příklad 2 ml roztoku obsahujícího FEIBA ( firmy IMMUNO AG, Vídeň) s aktivitou FEIBA 966 jednotek a 992 jednotkami faktoru II se zředí 0,9% roztokem chloridu sodného na 330 ml a pomalu se míchá s 2,75 mmol/1 chloridu vápenatého za teploty +30 °C. Po 90 minutách dosahuje aktivita thrombinu maxima 51 jednotek na 1 jednotku faktoru II. Aktivace se zastaví ochlazením roztoku na teplotu +4 ’C a přídavkem citronanu sodného.

Přiklad 3

Thrombin o aktivitě 20 000 jednotek, připravený podle přikladu 1, se adsorbuje na sloupci 20 ml S-sefarózy při vodivosti

-3CZ 281502 B6

10,5 mS/cm a při hodnotě pH 6,0. Nakonec se vše promyje 140 ml 150-milimolárního roztoku chloridu sodného, aby se odstranily nevázané proteiny.

Frakce obsahující thrombin se eluují 100 ml 750-milimolárního roztoku chloridu sodného, zkoncentruji, diafiltrují a nakonec upraví na farmaceutický přípravek.

Výtěžek aktivity thrombinu je větší než 90 %.

Příklad 4

Thrombin o aktivitě 10 000 jednotek, připravený podle příkladu 1, se vnese na sloupec 10 ml lysin-sefarózy ekvilibrovaný 150-milimolárním roztokem octanu sodného, o hodnotě pH 6,7. Naplněný sloupec se promyje stejným pufrem a frakce obsahující thrombin se eluují 300-milimolárním roztokem lysinu.

Aktivita thrombinu je 9 400 jednotek a specifická aktivita činí 1 850 jednotek na mg proteinu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (2)

1. Způsob výroby thrombinu zabezpečeného proti virům, vyznačující se tím, že se aktivovaný prothrombinový komplex, získatelný z plasmové frakce obsahující prothrombinový komplex, zpracuje k inaktivaci infekčních látek a ke zpracovanému aktivovanému prothrombinovému komplexu se přidají soli aktivní při srážení.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se thrombin dále čistí iontoméničovou chromatografií a/nebo afinitní chromatografií.